Analisis Proteome Dan In Vitro Antiviral, Antikanser dan Antioksidan Kapasiti Ekstrak Berair Lentinula Edodes Dan Pleurotus Ostreatus Cendawan Boleh Dimakan

Untuk butiran lanjut, sila hubungitina.xiang@wecistanche.com

Abstrak: Dalam kajian ini, kami mengkaji ekstrak akueus cendawan boleh dimakan Pleurotus ostreatus (cendawan tiram) dan Lentinula edodes (cendawan shiitake). Analisis proteome telah dijalankan menggunakan LC-Triple TOF-MS dan menunjukkan ekspresi 753 protein oleh Pleurotus ostreatus dan 432 protein oleh Lentinula edodes. Peptida bioaktif: Perencat pemisahan KDNK Rab, superoxide dismutase, thioredoxin reductase, serine proteinase, dan lektin, telah dikenal pasti dalam kedua-dua cendawan. Ekstrak juga termasuk sebatian bioaktif yang menjanjikan termasuk fenolik,flavonoid, vitamin, dan asid amino. Ekstrak menunjukkan menjanjikanaktiviti antivirus, dengan indeks selektiviti(SI) 4.5 untuk Pleurotus ostreatus terhadap adenovirus(Ad7), dan sedikit aktiviti untuk Lentinula edodes terhadap herpes simplex-II(HSV-2). Ekstrak tersebut bukan sitotoksik kepada sel mononuklear darah periferal manusia biasa (PBMC). Sebaliknya, mereka menunjukkan sitotoksisiti sederhana terhadap pelbagai garisan sel kanser. Di samping itu, aktiviti antioksidan dinilai menggunakan DPPHpemusnahan radikal, penghapusan kation radikal ABTS, dan ujian ORAC. Kedua-dua ekstrak menunjukkan potensiaktiviti antioksidan, dengan aktiviti maksimum dilihat untuk Pleurotus ostreatus (IC50 ug/mL)=39.46 ± 1.27 untuk DPPH;11.22±1.81 untuk ABTS; dan 21.40±2.20 untuk ujian ORAC. Kajian ini menggalakkan penggunaan cendawan ini dalam perubatan memandangkan sitotoksisitinya yang rendah pada PBMC biasa berbanding dengan keupayaan antivirus, antitumor dan antioksidannya.

Kata kunci: kulat reput putih; Pleurotus ostreatus; Lentinula edodes; shiitake; antioksidan; antitumor; antivirus

1. Pengenalan

Cendawan mempunyai prospek yang hebat dalam bidang perubatan dan pengeluaran nutraseutikal. Selain mempunyai ciri organoleptik yang baik dan nilai pemakanan yang tinggi, banyak cendawan dilaporkan mempunyai pelbagai aktiviti farmakologi [1-3]. Antara cendawan yang paling banyak ditanam ialah Lentinula edodes (cendawan shiitake) dan Pleurotus ostreatus (cendawan tiram). Shiitake menduduki tempat kedua selepas Agaricus bisporus sebagai cendawan yang boleh dimakan yang paling banyak digunakan di seluruh dunia [4]. Cendawan ini mempunyai kesan antibakteria, antikulat, antivirus, hepatoprotektif, antihiperglisemik dan imunomodulator yang menjanjikan [5-7]. Ia kaya dengan molekul bioaktif, yang paling banyak dikaji ialah "lentinan", polisakarida dengan kesan terhadap bakteria, virus, dan tumor, sebagai tambahan kepada "lentinan", yang menunjukkan bantuan dalam mengawal dislipidemia dan hiperglisemia [8]. Pleurotus ostreatus, spesies paling biasa dari genus Pleurotus [9], juga dikenali sebagai cendawan tiram, adalah pengurai kayu dan mempunyai pelbagai aktiviti biologi [10]. Berbanding dengan cendawan terapeutik lain, cendawan tiram menjadi lebih popular sebagai penggalak kesihatan [11]. Kehadiran sejumlah besar komponen berkhasiat seperti lektin, polisakarida, vitamin, dan mineral dalam cendawan tiram menjadikannya mampu memiliki potensi antikanser,antioksidan, ciri-ciri antidiabetik, antimikrob dan anti-hiperkolesterolemik [12,13]. Berbanding dengan cendawan lain yang boleh dimakan, tiram dan cendawan shiitake mempunyai tempoh pertumbuhan yang singkat dan boleh dituai sepanjang tahun 14. Hasil daripada kemudahan penanaman dan ujian, nilai pemakanan yang tinggi, dan manfaat perubatan yang menjanjikan, cendawan ini mempunyai potensi yang sangat besar. dalam industri makanan dan farmaseutikal [4,15]. Sesungguhnya, Basidiomycetes yang lebih tinggi boleh menjanjikan sumber makanan pelbagai fungsi.

Banyak sebatian bioaktif, termasuk gula, protein aktif secara fisiologi, asid lemak tak tepu, fenolik (asid fenolik dan polifenol), flavonoid, terpenoid, glikoprotein, polyketides, steroid, dan alkaloid, ditemui dalam kedua-dua cendawan ini [16,17]. Sebatian ini bertindak semata-mata atau secara sinergi untuk membawa tindakan farmakologi luas kulat ini. Cendawan Shiitake dan tiram dilaporkan mempunyai aktiviti antibakteria, antivirus, antihipertensi, imunomodulator, dan antioksidan [1,18,19]. Seo et al. [20] meringkaskan mekanisme aktiviti antiviral biomolekul cendawan, menunjukkan bahawa pengurangan jangkitan virus adalah terutamanya melalui mengganggu pengambilan virus ke dalam sel perumah, replikasi, dan sintesis protein dan enzimnya, di samping merangsang tindak balas imun hos [21]. Antioksidan adalah molekul penting dalam menghadapi spesies oksigen reaktif yang berada di sebalik banyak masalah kesihatan. Oleh kerana banyak bendera merah dinaikkan terhadap penggunaan antioksidan sintetik, kajian semula jadi telah menjadi wajib [22]. Kesan antitumor produk cendawan ini berkaitan dengan biomolekul termasuk glukan, ergosterol, proteoglikan, dan asid amino (arginine dan glutamin)[23]. Mekanisme postulat yang mendasari kesan ini mungkin termasuk rangsangan T-limfosit, penindasan neovaskularisasi, dan induksi kematian sel kanser, selain mencetuskan tindak balas imun terhadap sel kanser [24,25].

Proteomik telah membuktikan dirinya sebagai salah satu alat berharga dalam penyelidikan bio, terutamanya penyelidikan pertanian [26]. Lindequist et al. [27] adalah kumpulan pertama yang menjelaskan kepentingan menggunakan proteomik dalam penyelidikan cendawan yang boleh dimakan. Mereka menekankan keperluan untuk menggunakan "omics" untuk kajian molekul bioaktif kulat. Proteomik jarang digunakan dalam penyelidikan cendawan yang boleh dimakan berbanding kulat patogenik [28]. Sehubungan itu, tujuan kajian ini adalah untuk menganalisis proteom dua cendawan yang boleh dimakan, Pleurotus ostreatus dan Lentinula edodes, dan untuk menyiasat potensi mereka.antivirus, aktiviti antitumor dan antioksidan.

2. Keputusan

2.1.Analisis Proteom1e

Analisis proteome telah dijalankan menggunakan analisis LC-Triple TOF-MS dengan kadar penemuan palsu (FDR) sebanyak<5% and="" a"95%="" confidence="" of="" identification".="" for="" p.ostreatus,="" a="" total="" of="" 753="" proteins="" were="" identified,34="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" a="" total="" of="" 432="" proteins="" were="" detected="" in="" ledodes,="" 48="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" the="" recorded="" accession="" numbers="" of="" the="" proteins="" are="" included="" in="" tables="" s1="" and="" s2="" for="" p.="" ostreatus="" and="" l.edodes,="" respectively.="" in="" tables="" s1="" and="" s2,="" the="" ms-triple="" tof="" data="" were="" analyzed="" by="" proteinpilot="" with="" the="" paragon="" algorithm.="" proteins="" were="" identified="" with="" peptides="" that="" gave="" more="" than="" a="" 95%="" confidence="" of="" identification.="" bioactive="" proteins:="" rab="" gdp="" dissociation="" inhibitor,="" superoxide="" dismutase,="" thioredoxin="" reductase,="" serine="" proteinase,="" and="" lectin,="" were="" expressed="" in="" both="" p.ostreatus="" and="" l.edodes="" extracts="" [29-35].="" p.="" ostreatus="" also="" expressed="" osteolysis="" and="" pleurotolysin,="" whereas="" latch="" pin="" and="" valosin-containing="" protein="" were="" expressed="" by="" l.edodes.="" lc-triple="" tof-ms="" spectra="" of="" the="" mushroom="" extracts="" analyzed="" by="" analyst="" tf1.7.1="" (sciex="" software)="" are="" shown="" in="">

2.2. Jumlah Sebatian Bioaktif Jumlah Kandungan

Dalam menilai jumlah kandungan, ini termasuk penilaian jumlah karbohidrat, protein, fenolik, dan flavonoid. Ekstrak P. ostreatus mengandungi hampir tiga kali ganda bilangan karbohidrat dan dua kali ganda bilangan protein yang terdapat dalam ekstrak L.edodes; namun begitu, lebih banyak flavonoid dikesan dalam ekstrak L.edodes berbanding ekstrak P. ostreatus (Jadual 1).

2.3. Molekul Fenolik dan Flavonoid

Kedua-dua ekstrak cendawan mengandungi catechin (dikesan pada masa pengekalan 26.48min). P.ostreatus juga termasuk kaempferol dan apigenin (dikesan pada masa pengekalan 59.13 min dan 59.56 min, masing-masing), manakala L.edodes juga mengandungi quercetin (masa pengekalan=56.86 min; Jadual 2; Rajah S1).

2.4.Vitamin

Kandungan vitamin larut air serta larut lemak ditentukan melalui HPLC (Jadual 3 dan Rajah S2 dan S3). Kedua-dua cendawan kaya dengan vitamin C, dengan jumlah vitamin B3, B6 dan D yang boleh dikesan. Tiada perbezaan yang ketara antara kedua-dua cendawan dalam jumlah vitamin yang mereka miliki. Sebaliknya, vitamin B1, B2, B9, A, dan E tidak dapat dikesan dalam kedua-dua cendawan.

2.5. Analisis Asid Amino

Penganalisis Asid Amino Sykam digunakan untuk analisis asid amino. Jumlah kandungan asid amino masing-masing adalah 5.14 dan 4.35 dalam P.ostreatus dan L.edodes, seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 4, dan kedua-dua cendawan itu kaya dengan asid glutamat. Walaupun prolin dikesan dalam kepekatan yang besar (0.57 g/100g protein) dalam ekstrak P. ostreatus, ia tidak dikesan dalam ekstrak L.edodes. Histidine dan asid aspartik tidak dikesan dalam kedua-dua cendawan.

2.6. Aktiviti Biologi

2.6.1.Aktiviti Antiviral

Aktiviti antivirus dinilai terhadap dua virus: adenovirus dan herpes simplex-II. Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 5, ekstrak P.ostreatus menunjukkan aktiviti antivirus yang berkesan terhadap adenovirus, dengan indeks selektiviti setinggi 4.5. Kesan antivirus yang menjanjikan juga direkodkan untuk ekstrak P. ostreatus terhadap herpes simplex-II dan untuk ekstrak L.edodes terhadap kedua-dua virus. Angka S4 dan S5 mewakili lengkung tindak balas dos.

2.6.2. Aktiviti Sitotoksik Terhadap PBMC Manusia Biasa

Sitotoksisiti minimum （IC50 ug/mL; 66.41±3.7 dan 82.81± 2.72, masing-masing untuk P.ostreatus dan L. edodes) telah direkodkan terhadap PBMC manusia biasa.

Menentang Talian Sel Kanser

Barisan sel kanser yang pelbagai telah digunakan dalam ujian ini termasuk kanser prostat(DU-145 dan PC3); karsinoma hepatoselular (HepG2); karsinoma kolorektal (Colo-205); karsinoma sekum (LS-513); kanser serviks(HeLa); dan adenokarsinoma payudara(MDA-MB-231 dan MCF-7). Doxorubicin digunakan sebagai kawalan positif (menyebabkan penurunan daya maju kepada 53 peratus dalam HepG2;44 peratus dalam MDA-MB-231;39 peratus dalam PC3;35 peratus dalam DU-145; 29 peratus dalam MCF -7:25 peratus dalam LS-513;23 peratus dalam HeLa; dan 19 peratus dalam sel Colo-205). Keputusan dalam Rajah 2 menunjukkan bahawa ekstrak Ledodes dan P. ostreatus mengurangkan daya maju barisan sel kanser yang diuji LS-513, HepG2, DU-145 dan PC-3 sebanyak lebih kurang 20 peratus .

Menentang Garis Sel Leukemia dan Limfoma

Ekstrak cendawan P.ostreatus dan L.edodes telah diuji untuk sitotoksisiti terhadap leukemia (CCR-CEM, NB-4, THP-1) dan sel limfoma (U937). Doxorubicin ialah piawaian positif, menyebabkan penurunan daya maju sel masing-masing kepada 29 peratus , 25.5 peratus , 20.3 peratus dan 19.1 peratus dalam sel U937, NB4, CCRF-CEM dan THIP1. Ekstrak L.edodes mengurangkan daya maju sel THP1 kepada 66.02 peratus , manakala ekstrak P.ostreatus mengurangkan daya maju sel CCRF-CEM kepada 70.64 peratus (Rajah 3).

2.6.3. Aktiviti Antioksidan

Keputusan kesan antioksidan telah dikaji melalui tiga kaedah penilaian iaitu, DPPHpemusnahan radikal, penghapusan kation radikal ABTS, dan ujian ORAC, berbanding dengan piawaian antioksidan, Trolox, ditunjukkan dalam Jadual 6 dan Rajah S6a,b. Keputusan menunjukkan bahawa ekstrak P. ostreatus mempunyai kapasiti antioksidan yang lebih kuat daripada ekstrak L.edodes, seperti yang ditunjukkan oleh tiga ujian antioksidan yang digunakan. Rajah 4 menunjukkan pereputan isyarat fluorescein yang disebabkan oleh ekstrak dalam ujian ORAC.

3. Perbincangan

Kulat reput putih telah membangkitkan minat komuniti saintifik kerana sifat perubatannya, yang termasuk modulasi sistem imun, aktiviti hipoglisemik dan antitrombotik, dan sifat antihipertensi, anti-radang, antimikrob dan antitumor, serta keupayaan untuk menurunkan paras kolesterol darah. 24,36-38]. Dua kulat reput putih P. ostreatus dan L.edodes adalah dua cendawan boleh dimakan yang paling banyak digunakan di banyak negara [39]. Banyak protein bioaktif dihasilkan oleh kedua-dua cendawan ini, dan analisis proteom kini merupakan alat yang paling berkesan untuk profil protein [40]. Dalam kajian semasa, analisis proteom menunjukkan ekspresi protein bioaktif termasuk perencat disosiasi KDNK Rab, thioredoxin reductase, serine proteinase, superoxide dismutase, dan lektin dalam dua cendawan ujian. Rab GDP dissociation inhibitor (Rab GDI) mengawal fungsi Rab GTPases yang memainkan peranan penting dalam pemerdagangan membran dalam sel tumor. Sehubungan itu, menggunakan Rab GDI adalah strategi antikanser yang menjanjikan [29].

Serine proteinase menyumbang kepadaantivirusaktiviti cendawan yang boleh dimakan [30,31]. Selain itu, Yap et al. (2018) melaporkan sitotoksisiti terpilih serin proteinase yang kuat dalam menghadapi garisan sel adenokarsinoma payudara manusia (MCF7) dan mencadangkan mekanisme itu melibatkan kesan kolaboratif kedua-dua mekanisme kematian sel ekstrinsik dan intrinsik, sebagai tambahan kepada rangsangan caspase{{ 4}} dan-9 dan perencatan Bcl-2 [41].

Pengambilan daripadaantioksidanadalah strategi profilaksis bertuah terhadap patofisiologi pengantara spesies oksigen reaktif (ROS) [22]. Keputusan kami menunjukkan ekspresi enzim sistem pertahanan antioksidan oleh Pleurotus ostreatus dan Lentinula edodes. Enzim ini termasuk superoksida dismutase, katalase, dan glutathione peroksidase, yang mengimbangi pengeluaran ROS [32]. Superoksida dismutase bermula dengan menukar superoksida kepada hidrogen peroksida, yang seterusnya, ditukar oleh katalase dan glutation peroksidase ke dalam air [33].

Ekspresi lektin juga dikesan dalam kedua-dua cendawan itu. Ramai penyelidik melaporkan profil biologi lektin yang sangat pelbagai dengan pelbagai aktiviti yang merangkumi aktiviti anti-radang, antidepresan, antikonseptif dan vasodilator [34,35,42]. Lektin ialah protein pengikat karbohidrat dengan pelbagai fungsi selular termasuk penindasan in vitro dan in vivo pertumbuhan tumor melalui pengikatan terpilih pada membran sel tumor atau reseptornya, mengakibatkan pengaktifan protein kinase, atau modulasi tindak balas imun melalui pengeluaran interleukin. [43]. Selain itu, lektin cendawan juga mempunyai peranan dalam mencetuskan laluan kematian sel yang berbeza, termasuk apoptosis, nekrosis, dan/atau autophagy [42].

Data kami menunjukkan ekspresi kedua-dua osteolisis dan pleurotolysin dalam Pleurotus ostreatus. Ini adalah protein pembentuk liang dengan aktiviti antikanser yang sangat selektif [44,45]. Ostreolysin ialah protein sitolitik 15 kDa dengan keupayaan untuk meresap eritrosit dan sel lain pada kepekatan sub-mikromolar. Ia bertindak melalui mekanisme osmosis koloid dan mendorong pembentukan liang membran lebar |46,47I. Nimri et al. menghasilkan pleurotolysin rekombinan dengan aktiviti antitumor yang kuat terhadap sel tumor kolon manusia dan tikus [48].

Dalam L.edodes, protein yang mengandungi valosin dan pin selak telah dinyatakan. Protein yang mengandungi Valosin sebelum ini dilaporkan mempunyaiantioksidansifat yang boleh membantu dalam sindrom neuron seperti penyakit Alzheimer, sklerosis sisi dan demensia [49-51]. Latcripin adalah agen antikanser yang berpotensi [50]. Riaz Ud Din et al.(2020)menyiasat mekanisme antikanser pin selak terhadap garisan sel kanser payudara. Mereka melaporkan keupayaannya untuk mendorong kematian sel serta autophagy, sebagai tambahan kepada kesan perencatannya pada penghijrahan dan pencerobohan [52].

Pelbagai sebatian bioaktif dikira dalam ekstrak P.ostreatus dan L.edodes. TPN sebanyak 19.37 ± 0.39 dan 24.14 ± 1.01 mg/g ekstrak untuk P.ostreatus dan L.edodes, masing-masing dikesan dalam kajian semasa. Nilai tersebut adalah lebih tinggi daripada yang direkodkan oleh Rahimah et al., yang menggunakan ujian ammonium dan Shinoda untuk mengukur jumlah kandungan flavonoid P. ostreatus sebagai 6.67 mg/g ekstrak [53]. Selain itu, keputusan kami adalah lebih tinggi daripada yang ditemui oleh Montibus et al., yang menguji TPC dalam ekstrak L edodes menggunakan kaedah Folin-Ciocalteu dan menemui 0.8-1.5 peratus berat kering (DW) dalam topi dan 0.8-1.1 peratus dw dalam stipes [54].

Catechin dikesan dalam kedua-dua ekstrak P. ostreatus dan L.edodes. Catechin adalah metabolit fenolik sekunder tumbuhan, dengan sifat pemusnah radikal bebas yang kuat [55]. Ekstrak L.edodes didapati mengandungi flavonoid quercetin. Kesan antioksidan quercetin dimediasi melalui pengawalan paras glutation dan peningkatan dalam pengeluaran enzim antioksidan termasuk glutathione transferase dan Aldo-keto reductase [56]. Di samping itu, quercetin dilaporkan mempunyai aktiviti antitumor melalui mengganggu kitaran sel dan menggalakkan apoptosis [57,58]. Lee et al. melaporkan bahawa quercetin menyebabkan penangkapan sel dalam talian sel kanser PC3, Du145, dan U937 [59]. Keputusan kami juga mendedahkan bahawa kaempferol dan apigenin ditemui dalam P.ostreatus. Kaempferol dan apigenin telah terbukti mempunyai aktiviti antioksidan dan anti-proliferatif [60-62]. Asid glutamat didapati merupakan asid amino yang paling banyak dalam kedua-dua ekstrak cendawan. Dalam nada yang sama, Chirinang et al.menganalisis kandungan asid amino P. ostreatus dan P. major-caju dan mendapati kandungan asid glutamat adalah yang tertinggi, diikuti oleh asid aspartik dan kemudian arginin [63].

P.ostreatus dan L. edodes menunjukkan aktiviti antivirus yang menjanjikan terhadap adenovirus dan herpes simplex virus-II, dengan SI mencapai 4.5 untuk ekstrak P. ostreatus terhadap adenovirus. SI digunakan untuk menilai keberkesanan dan keselamatan ekstrak kerana ia menganggarkan tingkap antara aktiviti sitotoksik dan antivirus. Lebih tinggi SI, lebih selamat dan lebih cekap kompaun [64,65]. Data berkaitan baru-baru ini ditunjukkan oleh Urbancikova et al., di mana suplemen berasaskan pleuran (tidak larut -1,3/1,6-D-glucan yang diasingkan daripada P. ostreatus) memendekkan tempoh virus herpes simplex dengan ketara. -Simptom-I, dengan keterukan gejala pernafasan yang lebih rendah, pada pesakit herpes simplex virus-I-positif daripada kumpulan plasebo, tanpa kesan sampingan yang ketara, mencadangkan pleura untuk kegunaan masa depan yang mungkin dalam rawatan virus herpes simplex akut-I [66].

Kesan antivirus cendawan kebanyakannya disebabkan oleh mengganggu pengambilan virus, replikasi, aktiviti enzim, dan peptida yang berfungsi serta mempotensikan sistem imun perumah [67]. Seo dan Choi (2021) mencadangkan bahawa -glukan dalam pecahan polisakarida P.ostreatus dan L.edodes mungkin bertanggungjawab untuk kesan antiherpetiknya melalui kesan sebelum dan selepas rawatan [20]. Kesan anti-HIV daripada ekstrak akueus P. ostreatus dan L.edodes mungkin disebabkan oleh perencatan enzim transkripase terbalik oleh protein seperti ubiquitin dan leptin, masing-masing [68,69].

Ekstrak akueus cendawan kami telah ditunjukkan untuk menghalang daya maju garisan sel kanser yang diuji sebanyak kira - kira 20 peratus . Kami juga melihat kesan yang sama terhadap garis sel leukemia dan limfoma, dengan penurunan daya maju kepada 66 peratus dengan ekstrak L.edodes terhadap sel THP1leukemia, dan kepada 70.6 peratus dengan ekstrak P.ostreatus terhadap sel leukemia CCRF-CEM. Ekstrak miselial berair dan badan buah L.edodes sebelum ini dilaporkan memberikan tindakan anti-proliferatif dan apoptosis pada sel kanser payudara-7 MCF[70]. Pecahan etil asetat dan -glukan L.edodes kebanyakannya bertanggungjawab untuk tindakan ini[71,72]. Dalam konteks yang sama, ekstrak P. ostreatus dapat menunjukkan aktiviti anti-proliferatif terhadap MCF-7 dan MDA-MB-231 sel adenokarsinoma payudara [73], dan 6-glucan yang dipautkan daripada ekstrak itu mempotensikan sitotoksisiti pembunuh semulajadi terhadap sel-sel kanser payudara dan paru-paru [74]. Baru-baru ini, Jakopovic et al. mendapati bahawa penyediaan cendawan perubatan yang terdiri daripada 6 dan 10 cendawan termasuk L.edodes dan P. ostreatus mempamerkan kesan anti-proliferatif dan pro-apoptosis yang ketara pada sel-sel tumor kolorektal (HCT-116, SW620) [75]. Sebaliknya, pengarang mendapati bahawa kesan pada garisan sel fibroblas manusia (WI-38) adalah proliferatif, menunjukkan kekhususan sediaan cendawan ini terhadap garisan sel tumor. Begitu juga, kami mengesan sitotoksisiti minimum yang dikeluarkan oleh cendawan kami terhadap PBMC manusia biasa. Penemuan ini juga mencadangkan penggunaan selamat cendawan kita.

Sitotoksisiti cendawan telah dikaitkan dengan pelbagai molekul termasuk x- dan -glukan, protein, glikoprotein, asid lemak, antagonis nukleosida, terpenoid, dan sebatian fenolik [76]. Abdalla et al. (2012) mencadangkan bahawa ekstrak cendawan menindas percambahan sel kanser payudara dengan menghalang aktiviti aromatase [77]. Imam et al. (2021) mengasingkan indole-3-asid laktik daripada Ledodes yang menghalang pembahagian sel adenokarsinoma paru-paru [78]. Yukawa et al. (2012) mencadangkan bahawa kesan apoptosis langsung L edodes mycelia pada sel HepG2 adalah melalui pengaktifan caspase-3 dan -8 laluan reseptor kematian [79]. Wu et al.(2011) mengkaji kesan sitotoksik ekstrak protein P. ostreatus pada sel adenokarsinoma kolorektal manusia (SW480) dan leukemia monositik manusia, THP-1(sel), dan melaporkan penjanaan ROS, keletihan. glutathione, perubahan potensi membran mitokondria dan perpecahan DNA oligonukleosomal, mengakibatkan apoptosis sel SW480 [80].

Oleh kerana antioksidan tidak bertindak melalui satu mekanisme, penilaian kapasiti antioksidan biasanya dilakukan melalui lebih daripada satu kaedah [81]. Dalam kajian ini, tiga kaedah penilaian telah digunakan iaitu, ujian DPPH, ABTS, dan ORAC. Mekanisme antioksidan SET (pemindahan elektron tunggal) dinilai melalui ujian DPPH, manakala ujian ABTS dan ORAC digunakan untuk tindak balas HAT (pemindahan atom hidrogen) [81]. Ujian ORAC memberikan anggaran tepat yang lebih tepat kerana ia menggabungkan masa perencatan dan tahap perencatan dalam satu istilah [82]. Walaupun ujian phosphomolybdate biasanya digunakan untuk menyatakan jumlah kapasiti antioksidan (TAC), ketiga-tiga kaedah digunakan

dalam manuskrip ini telah dilaporkan untuk menilai TAC. Munteanu dan Apetrei (2021), dalam tinjauan mereka tentang kaedah yang digunakan dalam menentukan aktiviti antioksidan, menyifatkan ujian penghapusan radikal ABTS sebagai "kaedah yang mudah dan mudah digunakan untuk mengukur jumlah kapasiti antioksidan (TAC)" [83]. Dalam kajian perbandingan mereka, Cseregi et al. (2016) membandingkan empat kaedah yang digunakan untuk penilaian TAC, iaitu kapasiti antioksida setara Trolox (TEAC), potensi antioksidan penurun ferik (FRAP), 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil(DPPH) ujian scavenging radikal, dan kereaktifan reagen Folin-Ciocalteu(FCR)[84].Pada tahun 2013, Ou et al.memperkenalkan ORAC sebagai kaedah baru untuk penilaian TAC[85].Dalam nada yang sama, Rubio et al.(2016). )mengklasifikasikan ujian ORAC sebagai antara kaedah langsung untuk penentuan TAC, bersama dengan TEAC [86]. Keputusan ujian ABTS dan ORAC menunjukkan bahawa ekstrak P. ostreatus dan L.edode mempunyai kapasiti antioksidan yang lebih tinggi daripada antioksidan standard, Trolox.

Kesan antioksidan kedua-dua cendawan mungkin dikaitkan dengan kehadiran banyak komponen bioaktif termasukflavonoid, fenolik, peptida bioaktif, dan vitamin C[87]. Gaber et al. membandingkan ABTS, DPPH, kuasa antioksidan penurun ferik (FRAP), dan ujian ORAC untuk menilai kapasiti antioksidan ekstrak jambu batu dan melaporkan korelasi positif antara kuasa antioksidan, seperti yang ditentukan oleh empat kaedah, dan kandungan vitamin C dan TPN. Sebaliknya, mereka merekodkan korelasi negatif dengan kandungan karotenoid [88]. DPPH(1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl) ialah radikal bebas yang stabil yang mempunyai elektron valens tidak berpasangan pada satu atom jambatan nitrogen; oleh itu, penghapusan radikal DPPH adalah asas ujian antioksidan DPPH yang popular[89]. Kation radikal 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS) kehilangan warna birunya apabila dikurangkan oleh antioksidan, dan perubahan warna boleh dikira secara spektrofotometri [90]. Ujian ORAC mengukur degradasi oksidatif probe pendarfluor oleh radikal bebas yang diganggu oleh bahan antioksidan. Sehubungan itu, lebih kuat kapasiti antioksidan, lebih singkat masa yang diperlukan untuk memadamkan pendarfluor [91]. Selain itu, memandangkan ekstrak yang diuji menunjukkan kesan antioksidan yang menjanjikan apabila diuji melalui kaedah yang disebutkan di atas, dapat disimpulkan bahawa ia bertindak melaluipenghapusan radikal bebas. Walau bagaimanapun, cendawan yang diuji mengandungi jumlah kandungan flavonoid yang banyak, dan kerana flavonoid telah dikaitkan dengan pengaktifan faktor transkrip Nrf2 (2017), ini boleh ditambah sebagai mekanisme putatif [92].

4. Bahan dan Kaedah

4.1.Penyediaan Spesies Cendawan dan Penkulturan Kecil

Cendawan P. ostreatus dan L.edodes yang dikenal pasti sebelum ini diperoleh, sebagai benih dan/atau badan berbuah, daripada koleksi kultur Pusat Penyelidikan Pertanian, Kaherah, Mesir [93,94]. Bilah pembedahan digunakan untuk memotong buah secara aseptik untuk subkultur dari badan buah cendawan. Miselia dalam dituai menggunakan jarum steril dan subkultur dalam plat Potato Dextrose Agar (PDA) steril (Merck, Darmstadt, Jerman)95]. Untuk membiakkan benih kulat, forsep steril digunakan untuk memetik benih dan memindahkannya secara aseptik ke plat PDA steril, yang kemudiannya diinkubasi pada suhu 28 darjah selama 7 hari, dan badan berbuah setiap strain dibasuh secara berasingan. Setiap pencilan (500 g) dibiarkan selama 48 jam pada suhu bilik untuk mengeringkan udara, dikisar secara manual dalam pengisar dapur, dan disimpan pada suhu bilik di kawasan berudara baik untuk kegunaan masa hadapan.

4.2. Pengekstrakan Berair Pleurotus Ostreatus dan Lentinus Edodes

Setiap buah kering pengasingan dikisar menjadi serbuk 500 g menggunakan pengisar domestik, kemudian dimaserasi tiga kali dalam air suling 7Lof pada suhu bilik selama tiga hari, ultrasonicated(pembersih ultrasonik, England, UK), dan kemudian ditapis. Proses maserasi dan penapisan diulang sehingga cecair habis. Etanol digunakan untuk menyimpan hasil. Selepas penyejatan etanol pada 45 darjah, sejumlah 500 mL setiap pencilan telah dikeringkan beku untuk menghasilkan kira-kira 20 g sisa kering setiap ekstrak [96].

4.3. Analisis Proteomik

Analisis proteomik telah dijalankan dalam unit proteomik dan metabolomik di Hospital Kanser Kanak-kanak Mesir 57,357(CCHE), Kaherah, Mesir. Kira-kira 600 uL daripada 8 M urea dalam 500 mM Tris (pH8.5) dan 60 uL ultra-protease lengkap (Roche , Mannheim, Jerman) telah ditambahkan pada setiap sampel, dan kemudian sampel digoncang dengan kuat dan disentrifugasi pada 10,000 RPM selama 30 minit. Supernatan dikumpul, dan pecahan（1 ug/10 μL）disuntik menggunakan sistem NanoLC. Sistem TOF tiga kali ganda spektrometri jisim (Sciex TripleTOF 5600 plus , AB SCIEX, Concord) digabungkan dengan kromatografi cecair (LC)(3 um, ChromXP C18 CL, 120 A, 150 × 0.3 mm), yang terdiri daripada Eksigent nanoLC400 autosampler yang dipasang pada autosampler pam Ekspert nanoLC425, dengan kadar aliran 10 μL/min selama 55 minit, untuk setiap sampel [97]. Analisis data dilakukan oleh ProteinPilot (versi 5.0.1.0,4895) dan Algoritma Paragon (versi 5.0.1.0,4874). Jujukan protein diselaraskan dengan jujukan dalam Swiss-Prot dan pangkalan data TrEMBL (Pleurotus sp. mengandungi 14,792 entri untuk P. ostreatus, dan Lentinula sp. yang mengandungi 12603 entri untuk L.edodes)[98]. Protein yang dikenal pasti antara spesies cendawan digambarkan menggunakan perisian Venny2.1.0.BioinfoGP [99] (Kingston upon Hull, England, UK).

4.4. Pencirian Sebatian Bioaktif

Seperti yang dilaporkan sebelum ini, jumlah kandungan karbohidrat larut ditentukan menggunakan teknik asid sulfurik fenol [100]. Data dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai (SD), dan eksperimen dilakukan dalam tiga kali ganda.

Jumlah kandungan fenolik (TPC) dan jumlah kandungan flavonoid (TFC) ditentukan seperti yang dilaporkan oleh Ryan et al. [101]. Sampel disediakan pada kepekatan 20 mg/mL dalam air. Asid Gallic (larutan stok 1 mg/mL) disediakan dalam metanol. Rutin (larutan stok 1 mg/mL) disediakan dalam metanol. Piawaian dan sampel asid Gallic telah dipipet di dalam telaga plat dalam enam ulangan dan diukur pada 630 nm. Setiap satu daripada 10 piawaian rutin dan sampel dalam enam ulangan diukur pada 420 nm.

Analisis HPLC bagi jumlah fenolik dan flavonoid telah dijalankan mengikut kaedah Singh et al. [102]. Setiap sampel dan 1{14}} larutan piawai berbeza telah dilarutkan dalam metanol dan ditapis menggunakan penapis picagari 0.22 um, kemudian 100 μL setiap sampel dan 10 uL setiap piawai disuntik menggunakan lajur HPLC, Waters 2690 Alliance HPLC sistem dilengkapi dengan pengesan tatasusunan fotodiod Waters 996. Lajur C18 Inertsil ODS3:4.6×250 mm,5 um; fasa mudah alih: penimbal (0.1 peratus asid fosforik dalam air); mod elusi metanol adalah kecerunan dengan kadar alir 1 mL/min pada panjang gelombang 280 nm.

Untuk analisis vitamin larut air, ekstrak cendawan yang diuji (50 mg/mL), piawai rujukan(10 mg dalam 10 mL0.05 M natrium hidroksida) setiap tujuh vitamin larut air (tiamin HCl, asid askorbik, riboflavin, asid nikotinik, nikotinamida, piridoksin HCl dan asid folik)[103] dan vitamin larut lemak, larutan (50 mg/mL) daripada tiga ekstrak cendawan dan larutan piawai dalam metanol daripada tiga vitamin lemak: E, D3, dan A, masing-masing pada 806.2, 114 dan 400 IU/mL, telah disediakan. Penyelesaian kemudiannya dicairkan kepada 100 ug/mL, ditapis menggunakan penapis picagari 0.22 um, dan 100 μL disuntik pada lajur HPLC, sistem HPLC Waters 2690 Alliance (Milford, CT, USA) yang dilengkapi dengan pengesan tatasusunan fotodiod Waters 996. Lajur Inertsil ODS 3∶4.6×250 mm,5 μm; fasa mudah alih: penimbal(0.85 g heksana asid sulfonik garam natrium dalam 1000 mL air dan pH dilaraskan kepada 3 dengan asid ortofosforik); elusi metanol adalah kecerunan pada kadar aliran 1 mL/min pada panjang gelombang 210 nm [104].

4.5. Analisis Protein dan Asid Amino

Komposisi asid amino ekstrak cendawan dinilai menggunakan Sykam Amino Acid Analyzer (Sykam GmbH, Jerman) yang dilengkapi dengan sistem penghantaran pelarut, S 2100 (pam kuaternari dengan julat aliran {{ 24}}.01 hingga 10.00 mL/min dan tekanan maksimum sehingga 400 bar), autosampler, S5200, modul tindak balas asid amino, S4300(dengan dwi-penapis terbina dalam fotometer pada 570 nm), dan penganjur reagen yang disejukkan, S4130. Satu gram setiap ekstrak cendawan dicampur dengan 5 mL heksana dan dibiarkan memerah selama 24 jam, dan kemudian campuran itu ditapis menggunakan Whatman no. 1 kertas penapis. Sisa dimasukkan ke dalam tabung uji yang mengandungi 10mL6N HCl dan diinkubasi dalam ketuhar pada suhu 110 darjah selama 24 jam. Selepas pengeraman, penapisan dijalankan menggunakan Whatman no. 1 kertas turas, diikuti dengan penyejatan dalam penyejat berputar. Sisa telah dibubarkan sepenuhnya dalam 2 mL penimbal pencairan(tri-natrium sitrat dehidrat 0.06 M, asid sitrik 0.03 M, fenol 0.02 M, thiodiglycol1.4 peratus , HCL 32 peratus ), dicairkan 1000-kali ganda dalam penimbal yang sama dan kemudian dimuatkan pada lajur penapis ammonia (LCA, K04/Na, 4.6×100 mm, Sykam GmbH, Erasing, Jerman) yang dilengkapi dengan penganalisis asid amino automatik (Sykam) [105].

4.6. Kultur Sel

Kanser serviks (HeLa), leukemia monocytic akut (Thpl), karsinoma kolorektal (Colo-205), dan sel karsinoma sekum (LS-513) telah dikekalkan dalam medium Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Lonza, Cologne, Jerman) ditambah dengan 100 mg/mL streptomycin, 100 unit/mL penisilin dan 10 peratus serum lembu janin yang tidak diaktifkan haba. Talian sel lain: leukemia manusia (CCRF-CEM); leukemia promyelocytic akut (NB-4); limfoma manusia (U937); kanser prostat (DU-145 dan PC3); karsinoma hepatoselular (HepG2); adenokarsinoma payudara (MCF-7 dan MDA-MB-231); Vero; dan sel Hep{15}}, telah disubkultur pada Medium Helang Modified Dulbecco (DMEM; Invitrogen, California, Amerika Syarikat) dan pengeraman dijalankan pada 37 darjah dalam suasana lembap dengan 5 peratus CO2. Talian sel diperoleh daripada Nawah Scientific Inc. (Mokatam, Kaherah, Mesir), manakala sel mononuklear darah periferi primer (PBMC) dan sel manusia normal (ATCC PCS-800-011}TM) dibeli dari Viscera, Kaherah, Mesir. Kerja ini telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penyelidikan Etika Fakulti Farmasi, Universiti Ain Shams(No.294 Kelulusan).

4.7.Aktiviti Antioiral

Aktiviti antivirustelah diuji terhadap adenovirus jenis 7(Ad7) dan virus herpes simplex jenis-II (HSV-2)(Nawah Scientific, Mokattam, Mesir). Aktiviti antivirus dinilai seperti yang diterangkan sebelum ini [106]. Sel Vero dan Hep-2 telah disemai ke dalam 96-plat kultur telaga pada ketumpatan 2× 10* sel/telaga sehari sebelum jangkitan. Medium kultur sel (Bahagian 4.6) telah dikeluarkan pada hari berikutnya, dan garam penampan fosfat (PBS) digunakan untuk mencuci sel. Infektiviti adenovirus manusia dan virus herpes simplex jenis-II ditentukan menggunakan kaedah sulforhodamine B(SRB), yang memantau kesan sitopatik (CPE) dan mengira peratusan daya maju sel [107]. Aktiviti antivirus dikira berdasarkan keupayaan ekstrak cendawan untuk menghalang CPE virus, di mana kepekatan sitotoksik 50 peratus (CC5o) dan kepekatan perencatan 50 peratus (IC50) ditentukan menggunakan perisian GraphPad PRISM (Perisian Graph-Pad, San Diego , CA, Amerika Syarikat). Indeks selektiviti (SD) dikira seperti yang dinyatakan oleh Dogan et al. [108] mengikut persamaan (1)Indeks Pemilihan (SI)=CC50/IC50

4.8. Sitotoksisiti terhadap PBMC Menggunakan Ujian MTT

Sitotoksisiti dinilai menggunakan ujian MTT【109】. Aliquot （100 μL） ampaian sel (ketumpatan sel 1.2-1.8×10* sel/telaga) disalut dalam 96-plat perigi, medium lengkap ditambah dan sel diinkubasi selama 24 jam. Kemudian, sel dirawat dengan pencairan bersiri ekstrak cendawan selama 48 jam. Larutan MTT (5 mg/mL) dalam PBS telah ditambah ke dalam telaga dan diinkubasi selama 4 jam, dan penyerapan pada 570 nm dibaca menggunakan pembaca plat mikro. Sel yang tidak dirawat digunakan sebagai kawalan negatif, dan sel yang dirawat dengan doxorubicin (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Jerman) berfungsi sebagai kawalan positif.

4.9.Eoaluasi Aktiviti Sitotoksik Menggunakan SRB terhadap Talian Sel Kanser

Sitotoksisiti terhadap kanser prostat(DU{{0}} dan PC3); karsinoma hepatoselular (HepG2); karsinoma kolorektal(Colo-205); karsinoma sekum(LS-513); kanser serviks (HeLa); dan garisan sel adenokarsinoma payudara (MDA-MB-231 dan MCF-7) telah dinilai menggunakan ujian kolorimetrik sulforhodamine B (SRB) [110]. Suspensi sel dalam media lengkap(4.6) diinkubasi dalam 96-plat perigi selama 24 jam. Kemudian, pelbagai kepekatan (0 hingga 100 ug/mL dalam media lengkap） ekstrak cendawan telah ditambah dan diinkubasi selama 72 jam. Sel yang tidak dirawat digunakan sebagai kawalan negatif, dan sel yang dirawat dengan doxorubicin berfungsi sebagai kawalan positif.

4.10. Daya maju Talian Sel Leukemia dan Limfoma Menggunakan Ujian WST-1

Sitotoksisiti terhadap leukemia manusia (CCRF-CEM), leukemia promyelocytic akut (NB4), leukemia monositik akut (THP1), dan limfoma manusia (U937) ditentukan oleh ujian garam tetrazolium larut air (WST-1) menggunakan Abcamkit ( ab155902 WST-1 Reagen Percambahan Sel, United Kingdom). Suspensi sel diinkubasi selama 24 jam dan kemudian dirawat dengan kepekatan berbeza (0 hingga 100 ug/mL dalam media lengkap) ekstrak cendawan selama 48 jam. Sel kemudiannya dirawat dengan reagen 10 μL WST-1 selama 1 jam dan A450 dibaca menggunakan pembaca plat mikro [111]. Sel yang tidak dirawat digunakan sebagai kawalan negatif dan sel yang dirawat dengan doxorubicin (Sigma-Aldrich, Jerman) berfungsi sebagai kawalan positif.

4.11.Aktiviti Antioksidan

4.11.1.Aktiviti Penghapusan Radikal DPPH

Ujian penghapusan radikal DPPH telah dijalankan mengikut kaedah Lu et al. [112]. Pengurangan warna DPPH yang terhasil diukur pada 540 nm.Aktiviti antioksidandinyatakan sebagai peratusan perencatan dengan merujuk kepada lengkung penentukuran (R2=0.9903). Data diwakili sebagai min± SD mengikut Persamaan (2):(Peratus aktiviti antioksidan=[(abs-blank-abs-sample)/abs-blank]×100)

(2) di mana abs-blank dan abs-sample merujuk kepada penyerapan kosong dan sampel, masing-masing. Kepekatan sampel yang diperlukan untuk menghalang separuh daripada radikal bebas (IC50) telah dianggarkan.

4.11.2.ABTS (2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazolin-6-Asid sulfonik))Aktiviti Penghapusan Kation Radikal

Ujian telah dijalankan seperti yang diterangkan sebelum ini 【113】. Ekstrak cendawan（10 μL larutan 0 hingga 100 ug/mL）dicampurkan dengan 190μL ABTS yang baru disediakan （Sigma-Aldrich Germany) dalam 96-plat perigi dan diinkubasi dalam gelap pada suhu bilik selama 2 jam Setiap sampel telah diuji dalam empat replika, dan penyerapan diukur pada 734 nm. Aktiviti antioksidan dinyatakan sebagai peratusan perencatan (Persamaan (1)) dengan merujuk kepada lengkung penentukuran (R2=0.9948).

4.11.3. Ujian Kapasiti Penyerapan Radikal Oksigen (ORAC).

Analisis telah dijalankan seperti yang ditentukan sebelumnya [62], dengan pengubahsuaian kecil. Secara ringkas, 12.5 μL ekstrak cendawan, dalam tiga kali ganda, diinkubasi dengan 75 μL fluorescein (10 nm) selama 30 minit pada 37 darjah . Pengukuran pendarfluor (485 EX, 520 EM, nm）) telah dijalankan selama tiga kitaran （masa kitaran=90 s）. Selepas itu, 12.5 μL larutan 240 mm 2,2'-Azobis 2- yang baru disediakan amidinopropane dihydrochloride(AAPH)(Ab-cam, Cambridge, UK) telah ditambah kepada setiap telaga serta-merta dan pengukuran pendarfluor diteruskan selama 2.5 jam (85 kitaran, setiap 90 s). Ujian mengukur kehilangan pendarfluor pendarfluor dari semasa ke semasa sebagai hasilnya. pembentukan peroksil-radikal melalui pecahan AAPH. Trolox(6-hidroksi-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-asid karboksilik), vitamin E larut air analog, berfungsi sebagai kawalan positif yang menghalang pereputan fluorescein dalam cara yang bergantung kepada dos. Aktiviti antioksidan dinyatakan sebagai peratusan perencatan (Persamaan(1)dengan merujuk kepada lengkung penentukuran (R2= 0.9957).

4.12.Analisis Statistik

Ujian kimia tiga kali ganda telah dijalankan, dan hasilnya dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai. Analisis statistik dilakukan dengan ANOVA sehala.

Kepentingan perbezaan antara min dinilai dengan ujian perbandingan berbilang Tukey-Kramer. Nilai-p Kurang daripada atau sama dengan 0.05 dianggap signifikan secara statistik. Penilaian statistik ditentukan menggunakan perisian GraphPad PRISM (Graph-Pad Software, San Diego, CA, USA).

5. Kesimpulan

Cendawan P. ostreatus dan L.edodes mengandungi pelbagai sebatian bioaktif. Analisis proteome menunjukkan ekspresi pelbagai molekul bioaktif dengan pelbagai aktiviti biologi. Ekstrak berair daripada cendawan mempunyai menjanjikanantivirusaktiviti terhadap adenovirus type7 dan herpes simplex virus type-II.CPEs dikesan terhadap saluran sel kanser tetapi tidak terhadap PBMC manusia biasa. Kajian ini menggalakkan penggunaan cendawan ini untuk tujuan farmakologi memandangkan sitotoksisiti rendahnya pada PBMC biasa, sebagai tambahan kepada keupayaan antivirus, antitumor dan antioksidannya.

Rujukan

1. Bertéli, MBD; Oliveira Filho, OBQ; Freitas, JDS; Bertolucci, WC; Silva, GR; Gazim, ZC; Lívero, FAR; Lovato, ECW; Valle, JS; Linde, GA; et al. Lentinus crinitus basidiocarp stipe dan pileus: Komposisi kimia, sitotoksisiti dan aktiviti antioksidan. Eur. Makanan Re. Technol. 2021, 247, 1355–1366. [CrossRef]

2. Ragupathi, V.; Stephen, A.; Arivoli, D.; Kumaresan, S. Aktiviti antibakteria, potensi antioksidan in vitro dan pencirian GC-MS bagi ekstrak metanol Gymnopilus Junius, cendawan liar dari Ghats Barat Selatan, India. Eur. J. Biomed. 2018, 5, 650–657.

3. Atila, F.; Owaid, MN; Shariati, MA Faedah pemakanan dan perubatan Agaricus bisporus: Kajian semula. J. Mikrobiol. Bioteknol. Sains Makanan. 2017, 7, 281–286. [CrossRef]

4. Gaitán-Hernández, R.; Cortés, GMN Penambahbaikan hasil cendawan yang boleh dimakan dan perubatan Lentinula edodes pada jerami gandum dengan menggunakan benih tambahan. Braz. J. Mikrobiol. 2014, 45, 467–474. [CrossRef] [PubMed]

5. Smânia, A.; Delle Monache, F.; Smânia, E.; Gil, M.; Benchetrit, L.; Cruz, F. Aktiviti antibakteria bahan yang dihasilkan oleh kulat Pycnoporus sanguineus (Fr.) Murr. J. Ethnopharmacol. 1995, 45, 177–181. [CrossRef]

6. Ishikawa, NK; Kasuya, MCM; Vanetti, MCD Aktiviti antibakteria edodes Lentinula yang ditanam dalam medium cecair. Braz. J. Mikrobiol. 2001, 32, 206–210. [CrossRef]

7. Hwang, H.-J.; Kim, SW; Lim, J.-M.; Joo, J.-H.; Kim, H.-O.; Kim, H.-M.; Yun, J.-W. Kesan hipoglisemik eksopolysaccharides mentah yang dihasilkan oleh cendawan perubatan Phellinus baumii dalam tikus diabetes yang disebabkan oleh streptozotocin. Life Sci. 2005, 76, 3069–3080. [CrossRef] [PubMed]

8. Hearst, R.; Nelson, D.; McCollum, G.; Millar, BC; Maeda, Y.; Tukang emas, CE; Rooney, PJ; Loughrey, A.; Rao, J.; Moore, JE Pemeriksaan sifat antibakteria dan antikulat bagi juzuk cendawan Shiitake (Lentinula edodes) dan Oyster (Pleurotus ostreatus). Pelengkap. Di sana. Clin. Berlatih. 2009, 15, 5–7. [CrossRef]

9. Zervakis, G.; Philippoussis, A.; Ioannidou, S.; Diamantopoulou, P. Kinetik pertumbuhan miselium dan keadaan suhu optimum untuk penanaman spesies cendawan yang boleh dimakan pada substrat lignoselulosa. Mikrobiol Folia. 2001, 46, 231–234. [CrossRef]

10. Sánchez, C. Penanaman Pleurotus ostreatus dan cendawan lain yang boleh dimakan. Appl. mikrobiol. Bioteknol. 2009, 85, 1321–1337. [CrossRef]