Phloretin Menindas Neuroinflammation Dengan Pengaktifan Nrf2 yang dimediasi Autophagy dalam Makrofaj

Hubungi:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrak

Latar belakang: Makrofaj memainkan dua peranan dalam gangguan neuroinflamasi seperti multiple sclerosis (MS). Mereka terlibat dalam permulaan dan perkembangan lesi tetapi juga boleh menggalakkan penyelesaiankeradangandan pembaikan tisu yang rosak. Dalam kajian ini, kami menyiasat jika dan bagaimanafloretin, flavonoid yang banyak terdapat dalam epal dan strawberi, merendahkan fenotip keradangan makrofaj dan menyekatkeradangan saraf.

Kaedah: Perubahan transkrip dalam makrofaj yang berasal dari sumsum tulang tikus apabila pendedahan phloretin dinilai oleh penjujukan RNA pukal. Laluan asas yang berkaitan dengan keradangan, tindak balas tegasan oksidatif dan autophagy telah disahkan oleh PCR kuantitatif, ujian pendarfluor dan penyerapan, tikus kalah mati faktor erythroid 2-faktor nuklear 2 (Nrf2), tompok barat dan imunofluoresensi. Model eksperimen autoimun encephalomyelitis (EAE) digunakan untuk mengkaji kesan phloretin pada neuroinflammation dalam vivo dan mengesahkan mekanisme asas.

Keputusan: Kami menunjukkan bahawa phloretin mengurangkan fenotip keradangan makrofaj dan dengan ketara menyekat neuroinflammation dalam EAE. Phloretin mengantara kesannya dengan mengaktifkan laluan isyarat Nr2. Pengaktifan Nrf2 dikaitkan dengan pengaktifan autophagy yang bergantung kepada 5'AMP-activated protein kinase (AMPK) dan degradasi protein 1 (Keap1) yang berkaitan dengan ECH seperti kelch.

Kesimpulan: Kajian ini membuka perspektif masa depan untuk phloretin sebagai strategi terapeutik untuk gangguan neuroinflamasi seperti MS.

Pendaftaran percubaan: Tidak berkaitan.

Kata kunci: Phloretin, Makrofaj, Neuroinflammation, Multiple sclerosis, Autoimunity

Klik di sini untuk mengetahui maklumat lanjut

Latar belakang

Lesi sklerosis berbilang aktif (MS) dicirikan oleh kehadiran banyakmakrofaj[1-5]. Kajian awal menunjukkan bahawa makrofaj menggunakan fenotip pro-radang dalam lesi MS, dengan itu menggalakkankeradangan saraf, demielinasi, dan degenerasi saraf. Fungsi effector yang menggalakkan penyakit termasuk pembentangan antigen yang berasal dari sistem saraf pusat (CNS) kepada sel T autoreaktif dan penghasilan mediator inflamasi seperti sitokin pro-radang, spesies oksigen reaktif (ROS), dan nitrik oksida (NO)[ 6,7]. Baru-baru ini, didapati bahawa makrofaj juga mempunyai fungsi yang bermanfaat dalam lesi MS kerana mereka boleh membentuk semula fenotip mereka kepada satu yang biasanya dikaitkan dengan imunosupresi dan pembaikan CNS. Fenotip pelindung ini dicirikan oleh pengurangan pengeluaran mediator pro-radang, pengeluaran mediator anti-radang dan faktor pertumbuhan, dan pengaktifan laluan anti-oksidatif seperti laluan faktor nuklear erythroid 2-faktor 2(Nrf2) [8-14]. Memandangkan status keradangan makrofaj telah dikaitkan dengan perkembangan MS dan perkembangan lesi aktif kronik, memacu makrofaj kepada fenotip yang bermanfaat dianggap sebagai strategi yang menjanjikan untuk mengehadkan perkembangan MS [15].

Komponen diet memacu fungsi makrofaj dan neuroinflammation [16]. Khususnya, keluarga flavonoid semakin diakui mengandungi sebatian yang menjanjikan yang mempengaruhi laluan patogen dan memodulasi fenotip sel imun seperti makrofaj [17,18]. Flavonoid membentuk salah satu keluarga fitonutrien terbesar yang mengandungi lebih 8000 sebatian fenolik dengan bioaktiviti yang pelbagai. Beberapa ahli keluarga flavonoid memaparkan kesan anti-radang dan anti-oksidatif pada makrofaj [19-21]. Floretin flavonoid adalah ahli dihydrochalcones dan terdapat dalam buah-buahan yang biasa dimakan seperti epal dan strawberi. Phloretin diketahui mempunyai ciri imunomodulator dan digunakan secara meluas untuk penjagaan kulit kerana ciri anti-oksidatifnya [22-24]. Selain itu, phloretin ialah perencat pengangkut glukosa (GLUT), satu ciri yang mempengaruhi fenotip makrofaj kerana pengaktifan makrofaj didorong oleh GLUT [25, 26]. Secara keseluruhan, ciri-ciri ini menjadikan phloretin sebagai sebatian yang menjanjikan untuk memodulasi fenotip makrofaj dan neuroinflammation. Dalam kajian ini, kami menunjukkan bahawa phloretin memacu makrofaj ke arah fenotip yang kurang keradangan dan mengurangkan keradangan saraf dalam model encephalomyelitis autoimun eksperimen (EAE). Penjujukan RNA dan eksperimen berfungsi mengenal pasti laluan Nrf2 sebagai hab dan pemacu fenotip makrofaj pelindung ini yang disebabkan oleh phloretin. Pengaktifan jentera autophagy yang bergantung kepada AMPK dan pengantara SQSTMl/p62-yang seterusnya (selepas ini dirujuk sebagai p62) degradasi Keapl, penyesuai yang memudahkan degradasi Nrf2 proteasomal, didapati mendasari pengaktifan Nrf2 dalam makrofaj. Penemuan ini menunjukkan bahawa phloretin mempunyai potensi untuk digunakan dalam strategi terapeutik untuk gangguan neuroinflamasi.

Kaedah

Antibodi dan reagen kimia

Phloretin(Sigma Aldrich) telah dilarutkan dalam 50 mM KOH kepada larutan stok 15 mM dan disimpan pada -20 darjah . Pencairan selanjutnya dibuat dalam medium RPMI1640 (Gibco). Untuk rawatan in vivo, phloretin telah dibubarkan dalam 1 N NaOH, kemudian pH diselaraskan semula kepada 7.2 dengan 1 N HCL, dan larutan itu dicairkan lagi dalam air fisiologi untuk mendapatkan kepekatan 50 mg/kg. BML-275（1 μM, Santa Cruz Biotechnology）ditambah 1 jam sebelum rawatan phloretin untuk menghalang pengaktifan AMPK. Bafilomycin A1（BAF, 0.1 μM, InvivoGen） telah ditambah 2 jam sebelum pengumpulan untuk menyekat gabungan autofagosom dan lisosom. Lipopolysaccharide (LPS, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) telah digunakan untuk merangsang sel untuk fenotaip keradangan. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) telah digunakan untuk mendorong pengeluaran ROS. Antibodi berikut digunakan untuk western blot: anti- -aktin tetikus (1:10,000;sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), anti-GAPDH tetikus (1:{{29 }};AB_2537659, Invitrogen), anti-AMPK arnab (1:1000;5831S, Teknologi Isyarat Sel), AMPK anti-fosforilasi arnab(1:1000; 2535S, Teknologi Isyarat Sel), arnab anti-LC3 (1:1000;L7543,Sigma-Aldrich),anti-p62 arnab(1:1000; 23214, Teknologi Isyarat Sel). Antibodi berikut digunakan untuk imunofluoresensi: tikus anti-CD3(1:150; MCA500G, Bio-Rad), tikus anti-F4/80(1:100; MCA497G, Bio-Rad), arnab anti-LC3(1:1000 ;L7543, Sigma-Aldrich), arnab anti-p62 (1:500;23214,Teknologi Isyarat Sel), arnab anti-Keap1(1:500;60027-1-Ig,Proteintech Europa), arnab anti-TMEM119(1 :100, ab209064, Abcam). Antibodi sekunder yang sesuai telah dibeli daripada Invitrogen.

tikus

Tikus jenis liar(WT) C57BL/6JOlaHsd telah dibeli daripada Envigo. Haiwan diberi makanan biasa dan ditempatkan di kemudahan haiwan Institut Penyelidikan Bioperubatan Universiti Hasselt. Semua eksperimen telah dilakukan mengikut garis panduan institusi dan telah diluluskan oleh jawatankuasa etika untuk eksperimen haiwan Universiti Hasselt.

Kultur sel

Diperolehi sumsum tulangmakrofaj(BMDM) telah diasingkan daripada tikus WT dan Nrf2 kalah mati (KO) C57BL/6JOlaHsd, dibeli daripada Envigo dan disediakan oleh RIEN BRC mengikut MTA kepada Prof S. Kerdine-Römer masing-masing [27,28]. BMDM diperolehi seperti yang diterangkan sebelum ini [29]. Dalam sel sumsum tulang tibial dan femoral pendek daripada 12-tikus WT dan Nrf2 KO C57BL/6JOlaHsd berusia seminggu telah dikultur dalam 10-sm plat Petri pada kepekatan 10×106 sel/ plat, dalam medium RPMI1640 ditambah dengan 10 peratus serum anak lembu janin (FCS, Gibco), 50U/ml penisilin (Invitro-gen), 50 U/ml streptomycins (Invitrogen) dan 15 peratus L929-medium terkondisi (LCM ). Selepas pembezaan, BMDM telah dipisahkan pada 37 darjah dengan 10 mM EDTA dalam PBS (Gibco) dan dikultur (0.5 × 10 darjah sel/ml) dalam RPM1640 ditambah dengan 10 peratus FCS, 50U/ml penisilin, 50U/ml streptomycin dan 5 peratus LCM ( 37 darjah C,5 peratus CO2). Kultur mikroglia telah diasingkan daripada otak anak anjing P1-3 C57BL/6/OlaHsd selepas bersalin. Selepas batang otak, plexus choroid, dan meninges dikeluarkan, otak dipisahkan secara mekanikal dan dicerna secara enzimatik selama 15 minit dengan 1 × trypsin (Gibco) pada 37 darjah. Selepas itu, penggantungan sel telah disemai dalam DMEM medium glukosa tinggi(Sigma) ditambah dengan 30 peratus LCM, 10 peratus FCS, 50U/ml penisilin, dan 50U/ml streptomycin dalam kelalang kultur T75. Dua hingga 3 hari kemudian, perubahan sederhana lengkap dilakukan. Kultur glial bercampur digoncang (230rpm,3j, 37 darjah ) selepas 6-7 hari untuk mendapatkan kultur mikroglia tulen.

Penjujukan RNA

Sel telah dirawat terlebih dahulu dengan phloretin （50 μM） selama 20 jam dan LPS-stimulated (100 ng/ml) selama 6 jam. Lisis sel dilakukan menggunakan reagen Qiazol Lysis (Qiagen). RNA diekstrak daripada sel menggunakan kit mini RNeasy (Qiagen). Sampel kemudiannya diproses oleh Genomics Core Leuven (Belgium). Penyediaan perpustakaan dilakukan dengan kit QuantSeq Lexogen untuk menjana perpustakaan yang serasi dengan Illumina. Perpustakaan disusun pada sistem penjujukan Illumina HiSeq4000. Penjajaran sedar sambatan telah dilakukan dengan STAR v2.6.1b[30]. Kuantifikasi bacaan bagi setiap gen dilakukan dengan HT-seq Count v2.7.14. Analisis ungkapan pembezaan berasaskan kiraan telah dilakukan dengan pakej Biokonduktor DESeq2 berasaskan R(The R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria). Senarai gen yang dinyatakan secara berbeza telah dipilih pada ap<0.05 and="" used="" as="" an="" input="" for="" the="" core="" analysis="" by="" qiagen's="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa).="" all="" rna="" sequencing="" (rna-seq)="" data="" discussed="" in="" this="" publication="" have="" been="" deposited="" in="" ncbi's="" gene="" expression="" omnibus(edgar="" et="" al,="" 2002)="" and="" are="" accessible="" through="" geo="" series="" accession="" number="">

PCR transkripsi terbalik kuantitatif

Sel telah dirawat terlebih dahulu dengan phloretin（50 μM）selama 20 jam dan LPS dirangsang(100 ng/ml) selama 6 jam. Lysis dilakukan dengan menggunakan reagen Qiazol Lysis (Qiagen). RNA diekstrak menggunakan kit mini RNeasy(Qiagen). Kepekatan dan kualiti RNA ditentukan dengan spektrofotometer titisan Nano (Sains Hayat Isogen). Sintesis cDNA telah dijalankan menggunakan Quanta qScript cDNA SuperMix(Quanta Biosciences) mengikut arahan pengilang. qPCR dilakukan pada sistem PCR Masa Nyata StepOne-Plus (Biosistem Gunaan) menggunakan campuran hijau SYBR yang mengandungi 1× hijau SYBR (Biosistem Gunaan), primer 0.3 μM (Teknologi DNA Bersepadu), cDNA 12.5ng dan air bebas nuklease . Kaedah Ct perbandingan digunakan untuk mengukur ekspresi gen. Data telah dinormalisasi kepada gen rujukan paling stabil cyclin A dan hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1. Urutan primer tersedia atas permintaan.

Penentuan spesies oksigen reaktif

Sel telah dirawat terlebih dahulu dengan phloretin (50 uM) selama 2 jam. Selepas itu, sel telah dirangsang dengan PMA (15 min, 100 ng/ml) dan pengeluaran ROS diukur menggunakan probe pendarfluor 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate pada 10 μM dalam PBS selama 30 minit. Pendarfluor diukur menggunakan pembaca plat mikro FLUOstar optima pendarfluor (BMG Labtech, Ortenberg, Jerman) (pengujaan: 495 nm, pelepasan: 529 nm).

Pengukuran nitrik oksida

Sel telah dirawat terlebih dahulu dengan phloretin （50 μM） selama 2 jam. Selepas itu, sel telah dirangsang dengan LPS (24 jam, 100 ng/ml). NO dipantau secara tidak langsung menggunakan kit ukuran nitrit reagen Griess (Abcam). Secara ringkas, nitrat bertindak balas dengan sulfanilamide dan N-(1-naphthyl)ethylene-diamine dihydrochloride untuk menghasilkan pewarna azo merah jambu. Penyerapan derivatif azo ini kemudiannya diukur pada 540 nm menggunakan pembaca plat mikro (iMark, Bio-Rad).

penghapusan Barat

Sel telah dirawat dengan phloretin（5{{10}} μM） dan LPS（100 ng/ml) selama 1 jam atau 24 jam untuk menentukan pengaktifan AMPK atau tahap protein p62, LC3, dan Keapl masing-masing. Sel-sel telah dilisekan menggunakan penampan RIPA(150 mM NaCl, 1 peratus Triton X-100, 0.5 peratus natrium deoksikolat, 1 peratus SDS, 50 mM Tris), dan diasingkan melalui elektroforesis gel poliakrilamida natrium dodesil sulfat. Gel telah dipindahkan ke membran PVDF(VWR) dan tompok disekat selama 1 jam dalam 5 peratus albumin serum lembu dalam salin penampan Tris yang mengandungi 0.1 peratus Tween-20(TBS-T). Membran telah disiasat dengan antibodi primer semalaman pada suhu 4 "C, dibasuh dengan TBS-T, dan diinkubasi dengan antibodi berlabel peroksidase lobak pedas sekunder yang sepadan selama 1 jam pada suhu bilik(RT). Isyarat imunoreaktif dikesan dengan chemiluminescence yang dipertingkatkan (ECL Plus, Thermo Fisher)menggunakan Amersham Imager 680(GE Healthcare Life Sciences). Ketumpatan jalur ditentukan menggunakan ImageJ.

Imunofluoresensi

Krioseksi saraf tunjang dikeringkan dengan udara dan difiksasi dalam aseton sejuk ais selama 10 minit pada - 20 darjah . BMDM tetikus telah dikultur pada slaid penutup kaca dan dibetulkan dalam metanol ais sejuk selama 10 minit pada -20 darjah . Bahagian dan BMDM disekat selama 30 minit menggunakan blok protein Dako (Agi-lent). Selepas itu, mereka diinkubasi semalaman pada suhu 4"C dengan antibodi primer, dibasuh dan diinkubasi dengan antibodi sekunder yang sesuai selama 1 jam di RT. Imej tisu saraf tunjang diambil menggunakan mikroskop Nikon Eclipse 80i (objektif 10x) dan NIS Perisian Elements BR 3.10 (Nikon). Imej BMDM yang diwarnakan untuk p62, LC3 dan Keapl telah diambil menggunakan mikroskop confocal Zeiss LSM 880 dan telah dibetulkan Airyscan (objektif 63x).P62-dan LC3- puncta positif ditentukan oleh analisis puncta separa automatik imejJ. Ringkasnya, selepas imej dibuat binari dan sel dipilih dengan tangan, puncta dianalisis setiap sel. Kolokalisasi P62 dan Keapl dilakukan menggunakan saluran paip pengkolokalisasi dalam perisian CellProfiler [31]. Imej yang ditunjukkan dalam angka dipertingkatkan secara digital.

Experimental autoimmune encephalomyelitis model Eleven-week-old C57BL/6JOlaHsd mice were immunized subcutaneously with 200 ng of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide(MOG35-55)emulsified in 100 ul complete Freund's supplemented with 4 mg/ml of Mycobacterium tuberculosis(EK2110, Hooke Laboratories). Im-mediately after MOG immunization and after 24 h, mice were intraperitoneally injected with 50 ng pertussis toxin (EK2110 kit, Hooke Laboratories) to induce EAE.EAE animals were treated daily with phloretin or vehicle(50 mg/kg, intraperitoneal (ip)) after 6 days of immunization (prophylactic setup)or after disease onset(clinical score>1, persediaan terapeutik). Tikus ditimbang dan diberi markah setiap hari untuk tanda-tanda neurologi penyakit mengikut panduan pemarkahan EAE tetikus pengeluar:0:tiada gejala klinikal,0.5:hujung ekor lembik, 1:ekor lemas , 1.5: perencatan ekor lembik dan kaki belakang 2: ekor lembik dan kelemahan kaki belakang, 2.5: ekor lembik dan menyeret kaki belakang,3: ekor lembik dan lumpuh lengkap kaki belakang, 3.5: ekor lembik dan lumpuh lengkap belakang. kaki dan tetikus tidak dapat membetulkan dirinya apabila diletakkan di sisinya,4: lumpuh pada diafragma, 5: kematian oleh EAE.

Analisis statistik

GraphPad Prism digunakan untuk menganalisis data secara statistik, yang diwakili sebagai min±sem D'Agostino dan ujian normaliti omnibus Pear-son digunakan untuk menguji taburan normal. Ujian t Pelajar tidak berpasangan dua ekor (dengan pembetulan Welch jika perlu) digunakan untuk data taburan normal. Analisis Mann-Whitney digunakan untuk data yang tidak melepasi ujian normaliti.p-nilai<0.05 were="" considered="" to="" demonstrate="" significant=""><><0.01,><0.001 and="" *p=""><>

Keputusan

Perubahan transkrip yang berkaitan dengan rawatan phloretin makrofaj

Untuk mewujudkan kesan anti-radang yang berpotensi dan mengenal pasti mekanisme asas rawatan phloretin pada makrofaj, kami melakukan penjujukan RNA pukal (tambahan Rajah 1). Analisis laluan makrofaj diaktifkan yang dirawat dengan phloretin menunjukkan bahawa gen yang dinyatakan secara berbeza telah diwakili secara berlebihan dalam laluan kanonik yang berkaitan dengankeradangan, seperti iNOS(z-skor:-2.449), reseptor seperti tol(z-skor:-2.236), isyarat interferon (z-skor:- 2), dan laluan tindak balas fasa akut (skor z:- 1.633)(Gamb.1A, B). Sama seperti analisis laluan kanonik, analisis huluan data RNA-seq meramalkan bahawa phloretin mengurangkan pengaktifan pengawal selia transkripsi pro-radang utama seperti IRF7 (z-skor:2.229), IRF1(z-skor:-2. 025) dan STAT1(z-skor:-2.022)(Gamb. 1D). Di sebelah merendahkan laluan pro-radang makrofaj, analisis RNA-seq bagi makrofaj yang dirawat phloretin menunjukkan bahawa, antara laluan lain, phloretin mengaktifkan laluan Nrf2 dengan kuat (z-skor:1.897), dibuktikan oleh pengawalseliaan Nrf2-yang berkaitan gen seperti mafG dan proksi (Rajah 1A, C). Lebih-lebih lagi, Nrf2 (NFE2L2) telah dikenal pasti sebagai pengawal selia transkrip huluan yang paling diaktifkan (z-skor: 2.801), dan pengawalan tahap ROS dikenal pasti sebagai salah satu fungsi biologi yang paling dikawal dalam BMDM yang dirawat phloretin (z-skor: 2.008 )(Gamb. 1D, E). Secara kolektif, penemuan menunjukkan bahawa phloretin mengaktifkan Nrf2 dan menyekat fenotip keradangan makrofaj.

Laluan Nrf2 mengawal fenotip makrofaj yang dirawat phloretin

Seterusnya, kami mengesahkan kesan anti-radang phloretin dan menentukan sama ada ia memodulasi fenotip keradangan makrofaj dengan bertindak pada Nrf2. Tahap ROS yang berkurangan diperhatikan dalam BMDM WT yang dirawat phloretin yang dirangsang dengan PMA (Rajah 2A). Selain itu, pengurangan pengeluaran NO dan tahap mRNA gen pro-radang NOS2, I-6, COX2 dan I-12 diperhatikan dalam BMDM WT yang dirawat dengan phloretin yang dirangsang dengan LPS(Rajah 2B, C). berkaitan dengan peranan penting Nrf2 dalam mendorong fenotip kurang keradangan, data kami menunjukkan bahawa phloretin mengaktifkan Nrf{13}}gen tindak balas HO1 dan NQO1 dalam WT tetapi bukan Nrf2 KO BMDM yang dirangsang dengan LPS(Gamb. 2D). Tambahan pula, rawatan phloretin mengurangkan pengeluaran ROS dalam WT tetapi tidak dalam Nrf2 KO BMDMs (Rajah 2E). Selain daripada mengawal tindak balas anti-oksidatif, Nrf2 dilaporkan dapat menyekat fenotip keradangan makrofaj [12]. Sebagai menyokong yang terakhir, phloretin tidak dapat mengurangkan ekspresi gen pro-radang NOS2, IL-6, COX2 , dan IL-12 dalam BMDM kekurangan Nrf2-yang diaktifkan (Rajah 2F). Secara keseluruhannya, keputusan ini menunjukkan bahawa Nrf2 memacu anjakan fenotip keradangan yang dimediasi oleh phloretin makrofaj.

Phloretin menggalakkan pengaktifan AMPK

Phloretin adalah perencat GLUT yang jelas dan kajian baru-baru ini menyerlahkan kepentingan pengambilan glukosa pengantara GLUT untuk pengaktifan makrofaj [26,32]. Oleh itu, kami menentukan sama ada phloretin boleh mengaktifkan AMPK sensor tenaga, yang diaktifkan pada tahap tenaga/glukosa yang rendah. Keputusan kami menunjukkan bahawa rawatan phloretin membawa kepada fosforilasi dan pengaktifan AMPK (Rajah 3A, B). Selain itu, penambahan perencat AMPK BML-275 sebahagian besarnya menghalang pengaktifan AMPK dalam BMDM yang dirawat dengan phloretin(Rajah 3A, B). Lebih-lebih lagi, penemuan kami menunjukkan bahawa pengaktifan AMPK adalah penting untuk phloretin untuk menyekat pengeluaran ROS, seperti yang ditunjukkan oleh tahap ROS yang lebih tinggi dalam BMDM yang dirawat dengan kedua-dua phloretin dan perencat AMPK berbanding dengan BMDM yang dirawat dengan phloretin sahaja (Rajah 3C). Secara keseluruhan, data kami mencadangkan bahawa pengaktifan AMPK yang disebabkan oleh phloretin adalah penting untuk memacu makrofaj ke arah fenotip yang kurang keradangan.

Phloretin merangsang autophagy dengan cara yang bergantung kepada AMPK

Oleh kerana pengaktifan AMPK berkaitan dengan pengaktifan proses katabolik sebagai tindak balas kepada kekurangan nutrien [33], kami seterusnya menyiasat sama ada phloretin boleh mengaktifkan autophagy. Autophagy ialah proses katabolik terpelihara yang disebabkan oleh kebuluran dan tindak balas tekanan lain, yang menggalakkan degradasi lisosom kargo intraselular yang diasingkan dalam vesikel yang dipanggil autofagosom. Analisis RNA-seq meramalkan autophagy sebagai salah satu proses biologi hiliran yang menunjukkan peningkatan aktiviti dalam BMDM yang dirawat dengan phloretin(z-skor: 0.779)(Rajah 4A). Selain itu, analisis imunositokimia BMDM yang dirawat dengan phloretin dan perencat autophagy bafilomycin Al menunjukkan peningkatan pengumpulan penanda autophagy MAP1LC3/LC3(rantai ringan 1 protein berkaitan mikrotubulus 3) dan p62 berbanding dengan bafilomycin A1-yang dirawat BMDMs (Fig). . 4B-D), menunjukkan peningkatan fluks autofagik apabila rawatan phloretin [34]. Apabila induksi autophagy, LC3 ditukar daripada bentuk LC3I kepada bentuk LC3I lipidated, yang berkorelasi dengan bilangan autofagosom. Selaras dengan ini, paras protein LC3II dan p62 yang lebih tinggi ditentukan dalam BMDM yang dirangsang phloretin oleh western blot (Rajah 4E, F). Menariknya, peningkatan p62 dan LC3II oleh phloretin ini telah dihalang dengan merawat BMDM dengan perencat AMPK BML-275(Gamb.4E-F). Secara kolektif, data kami menunjukkan bahawa phloretin merangsang autophagy dalam cara yang bergantung kepada AMPK.

Phloretin mengaktifkan laluan Nrf2 melalui degradasi Keap1 yang dimediasi autophagy

Data kami menunjukkan bahawa phloretin mengaktifkan Nrf2 dan merangsang autophagy dalam makrofaj. Menariknya, reseptor autophagy p62 boleh bersaing dengan Nrf2 untuk mengikat Keapl, penyesuai yang memudahkan Nrf2 ubiquitination dan degradasi dalam keadaan biasa. Oleh itu, p62-penyisihan pengantara Keap1/Nrf2 ini akan menghalang kemerosotan Nrf2 dan akhirnya membawa kepada pengaktifan Nrf2 [35]. Atas sebab ini, kami menentukan sama ada phloretin menggalakkan interaksi p62/Keapl, dengan itu mengaktifkan laluan Nrf2. Di sini, kami menunjukkan bahawa phloretin mengaktifkan laluan Nrf2 melalui p{13}}pengantaraan degradasi Keapl dalam makrofaj. Dengan menggunakan mikroskop con-focal Airyscan resolusi tinggi digabungkan dengan analisis kolokalisasi, kami menunjukkan bahawa phloretin merangsang interaksi p62 dan Keapl, seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan nilai parameter kolokalisasi (pekali Pearson) dalam BMDM yang dirawat phloretin (Rajah 5A). , B). Selain itu, penemuan kami menunjukkan bahawa tahap protein Keapl yang lebih rendah terdapat dalam BMDM yang dirawat dengan phloretin, mengesahkan kemerosotan Keapl (Rajah 5C). Untuk mengesahkan bahawa degradasi adalah bergantung kepada autophagy, kami menambah perencat autophagy bafilomycin A1 kepada yang dirawat phloretin. BMDM. Menariknya, pengurangan Keapl ini telah diterbalikkan oleh rawatan bafilomycin Al (Rajah 5C). Keputusan ini disahkan oleh western blot, menunjukkan pengurangan paras protein Keapl dalam BMDM yang dirawat phloretin yang dihalang oleh bafilomycin A1 (Rajah 5D, E).

Phloretin reduces neuroinflammation in the EAE model To validate our findings in vivo, we investigated the impact of phloretin on the EAE model, the most commonly used animal model of MS, that is characterized by a pronounced macrophage-mediated inflammatory response in the CNS 5]. EAE animals treated with phloretin before disease onset showed reduced clinical scores compared to vehicle-treated animals (Fig. 6A). Importantly, even in a therapeutic setup, in which phloretin treatment was started after disease onset (clinical score>1), phloretin mengurangkan keterukan penyakit (Rajah 6B). Keterukan penyakit yang dikurangkan dalam haiwan yang dirawat phloretin disejajarkan dengan penurunan ekspresi gen radang MHCI,

CD86,Nos2,TNFa,IL-6,CCL4, CCL5 dan CXCL2 dalam saraf tunjang (Gamb.6C). Selain itu, jumlah sel F4/80t yang dikurangkan ditemui dalam saraf tunjang haiwan yang dirawat dengan phloretin (Rajah 6E, F). Memandangkan kedua-dua makrofaj F4/80*microglia dan F4/80* menyumbang kepada neuroinflammation, analisis yang lebih mendalam menggambarkan bahawa phloretin telah mengurangkan dengan ketara jumlah F480 ditambah TMEMl19-

makrofaj dalam tikus EAE (tambahan Rajah 2 DF) manakala arah aliran tidak ketara diperhatikan ke arah pengurangan semula dalam F480 ditambah TMEMl19 ditambah mikroglia. Selaras dengan penemuan ini, phloretin menyekat pengeluaran mediator radang dalam mikroglia tetapi penindasan ini kurang ketara berbanding makrofaj (tambahan Rajah 2 AC). Penemuan ini menunjukkan bahawa peningkatan EAE oleh phloretin terutamanya didorong oleh makrofaj. Selain mengurangkan ekspresi gen radang, phloretin meningkatkan ekspresi faktor anti-radang dan neurotropik, iaitu IL-4, CNTF dan IGF-1 dalam saraf tunjang haiwan EAE(Rajah 6D ). Penemuan ini sangat mencadangkan bahawa phloretin mengurangkan keterukan penyakit EAE dengan memacu makrofaj ke arah fenotip penyelesaian penyakit. Selaras dengan penemuan in vitro kami yang terdahulu, kami juga mengesan isyarat Nrf2 yang tinggi dalam CNS haiwan EAE yang dirawat phloretin seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan ekspresi mRNA Nrf2 dan sasaran hilirannya NQO1 dan GPX1 (Rajah 6G). Secara keseluruhannya, data ini menunjukkan bahawa phloretin menghalang keradangan saraf dalam kedua-dua tetapan profilaksis dan terapeutik. Tambahan pula, penemuan kami menunjukkan bahawa phloretin boleh mengurangkan neuroinflammation dengan menekan ciri-ciri keradangan makrofaj melalui pengaktifan Nrf2.

Perbincangan

Dalam kajian ini, kami menunjukkan bahawa phloretin memacu makrofaj ke arah fenotip yang kurang keradangan dalam2-cara bergantung kepada Nrf. Pengaktifan autophagy yang bergantung kepada AMPK dan degradasi Keapl seterusnya didapati mendasari pengaktifan Nrf2 oleh phloretin. Tambahan pula, kami mengesahkan kesan anti-radang phloretin dalam model EAE di mana ia mengurangkan keterukan penyakit dan mengurangkan bergantung kepada makrofaj.keradangan saraf.

Kami menunjukkan bahawa phloretin menindas fenotip keradangan makrofaj. Ini selari dengan penemuan Wei-Tien Chang et al. yang menunjukkan bahawa phloretin mempunyai ciri anti-radang dalam garisan sel makrofaj [36]. Kami menunjukkan bahawa induksi anjakan fenotip ini bergantung kepada Nrf2. Nrf2 ialah pengawal selia induk tindak balas antioksidan dan pengaktifannya diketahui memacu makrofaj ke arah fenotip anti-radang [1l, 12, 37]. Selain itu, beberapa kajian mentakrifkan bahawa pengaktifan Nrf2 melemahkan keradangan saraf dan neurodegenerasi dalam gangguan CNS [{{10]. }}]. Walau bagaimanapun, walaupun penemuan kami menunjukkan bahawa Nrf2 mendasari anjakan fenotip makrofaj yang dirawat phloretin, data penjujukan RNA menggambarkan bahawa, antara pengaktifan Nrf2, laluan lain telah dikawal selia. Khususnya, pengawalseliaan laluan PPAR menarik kerana ciri anti-radang dan perbincangan silang dengan Nrf2 [41-45]. Di samping itu, kerana phloretin adalah perencat GLUT yang jelas dan beralih kepada glikolisis adalah peristiwa metabolik yang penting untuk pengaktifan makrofaj, perubahan fenotip mungkin juga sebahagiannya disebabkan oleh kesan metabolik langsung phloretin pada pengangkut glukosa ini [46,47]. Lebih banyak penyelidikan diperlukan untuk menentukan kaitan PPAR dalam pengaktifan Nrf2 yang disebabkan oleh phloretin dan sejauh mana imunomodulasi yang disebabkan oleh phloretin dipengaruhi oleh perubahan metabolik langsung. Secara keseluruhannya, penemuan kami dengan jelas menunjukkan bahawa pengaktifan Nrf2 memainkan peranan penting dalam suis fenotip pengantara phloretin.

Penemuan kami menunjukkan bahawa pengaktifan Nrf2 oleh phloretin dimediasi oleh pengaktifan AMPK. AMPK memainkan peranan penting dalam memulihkan homeostasis tenaga selular dalam kes tekanan yang menghabiskan ATP yang mengakibatkan peningkatan nisbah ADP: ATP, dengan itu menghidupkan laluan katabolik ganti yang menjana ATP, sambil mematikan laluan anabolik yang menggunakan ATP [48]. Sejajar dengan itu, phloretin ialah perencat GLUT yang mantap dan merendahkan paras glukosa selular [49-51]. Beberapa kajian menunjukkan bahawa pengaktifan AMPK dalam makrofaj mendorong fenotip imunosupresif, yang menyokong keputusan kami menunjukkan bahawa pengaktifan AMPK adalah penting untuk phloretin untuk mengurangkan keradangan [52,53]. Data kami juga konsisten dengan kajian terdahulu di mana phloretin telah ditunjukkan untuk mengaktifkan AMPK dalam jenis sel lain termasuk adiposit dan sel endothelial [50, 54-56]. Phloretin boleh mengaktifkan AMPK secara tidak langsung dengan meningkatkan AMP dan menurunkan tahap ATP, kerana AMP dan ATP secara allosterik merangsang atau menghalang pengaktifan AMPK, masing-masing [48, 57]. Walau bagaimanapun, CaMKK, yang merupakan kinase hulu AMPK, boleh menggalakkan pengaktifan AMPK sebagai tindak balas kepada peningkatan tahap Ca2 tambah selular tanpa sebarang perubahan dalam tahap AMP/ATP [58]. Di samping itu, memandangkan rangkaian luas interaksi antara AMPK dan laluan atas dan hiliran, penyelidikan lanjut diperlukan untuk menjelaskan mekanisme asas pengaktifan AMPK yang disebabkan oleh phloretin.

Data kami mencadangkan bahawa pengaktifan AMPK yang dimediasi phloretin merangsang autophagy dalam makrofaj. Seperti yang dinyatakan di atas, pengaktifan AMPK adalah proses perlindungan diri yang bertujuan untuk memulihkan keseimbangan tenaga sel [48]. Walaupun tiada kajian pernah menunjukkan bahawa phloretin dapat merangsang fenotip makrofaj dengan mempromosikan autophagy, beberapa kajian telah menunjukkan kesan phloretin pada laluan autophagy dalam sel kanser dan hepatosit [59-61]. Selain itu, pelbagai kajian menunjukkan bahawa proses katabolik hiliran pengaktifan AMPK boleh mengaktifkan autophagy [60, 62, 63]. Menariknya, sebagai tindak balas kepada kebuluran glukosa, autophagy pengantara AMPK diinduksi oleh fosforilasi pemula autophagy import-ant unc-51 seperti kinase mengaktifkan autophagy [64,65]. Berkenaan dengan ini, kami membuat spekulasi bahawa AMPK merangsang autophagy untuk memulihkan ATP daripada komponen selular sebagai tindak balas kepada pengurangan glukosa yang disebabkan oleh phloretin. Walau bagaimanapun, kebuluran glukosa juga boleh mengaktifkan autophagy dalam cara bebas AMPK [66-68]. Oleh itu, lebih banyak penyelidikan diperlukan untuk menentukan sama ada pengaktifan autophagy oleh phloretin juga berlaku sebahagiannya secara bebas daripada AMPK.

Kajian terkini menunjukkan kepentingan autophagy untuk memacu fenotip makrofaj berfungsi. Dalam konteks ini, disregulasi autophagy dalam makrofaj telah dikaitkan dengan permulaan aterosklerosis dan penyakit neurologi [69-72]. Di sini, kami menyediakan pautan antara rawatan phloretin, induksi autophagy dan pengaktifan Nrf2 dengan menunjukkan bahawa phloretin menggalakkan pengaktifan Nrf2 melalui p62-degradasi pengantara Keap1. Sehingga baru-baru ini, peningkatan dalam p62 puncta dianggap sebagai tanda penurunan autophagy kerana p62 terdegradasi dalam autofagosom apabila pengaktifan autophagy [34]. Sehubungan dengan ini, pengumpulan p62 telah dikaitkan dengan disfungsi autophagy dalam lesi aterosklerotik [73]. Walau bagaimanapun, tanggapan ini telah dicabar dalam beberapa tahun kebelakangan ini dan kini dianggap bahawa p62 diperlukan untuk pembentukan autofagosom dan peningkatan tahap p62 selari dengan peningkatan LC3Il puncta boleh menjadi tanda induksi autophagy [74]. Oleh itu, bersama dengan kapasiti phloretin untuk mengaktifkan AMPK dan peranannya yang diketahui dalam pengaktifan autophagy, keputusan kami menunjukkan bahawa pengumpulan P62 dan LC3 pada rawatan bafilomycin A1 dalam makrofaj yang dirangsang phloretin adalah disebabkan oleh fluks autofagik yang berkedut dan bukan disebabkan oleh gangguan. autophagy. Menariknya, Lee Y et al. baru-baru ini menunjukkan bahawa, selain mengaktifkan Nrf2, p62 mengikat kepada Keapl juga terlibat dalam pembentukan autophagosome, menunjukkan bahawa pengaktifan autophagy yang dimediasi phloretin dikaitkan secara langsung dengan peningkatan aktiviti p62 di satu pihak, tetapi juga kepada lebih banyak interaksi Keapl-p62 di sisi lain [ 75]. Keapl ialah penyesuai ligase ubiquitin berasaskan Cullin-3-yang membentuk homodimer dengan Nrf2 pada keadaan homeostatik, dengan itu menggalakkan ubiquitination Nrf2 dan degradasi proteasomal [76]. Gangguan kompleks Keapl-Nrf2 membawa kepada penstabilan Nrf2 dan translokasi ke nukleus [77, 78]. Telah didokumenkan dengan baik bahawa gangguan kompleks ini berlaku melalui sama ada pengubahsuaian sisa sistein Keapl oleh molekul elektrofilik, interaksi langsung molekul kecil dengan Keapl, atau p62-pengantaraan degradasi Keapl [35]. Ying Y et al.mencadangkan interaksi langsung phloretin dan Keapl berdasarkan eksperimen silico, yang kemudiannya membawa kepada pengaktifan laluan Nrf2 dalam garisan sel kardiomiosit [79]. Di sini, kami menubuhkan mekanisme berkaitan autophagy tambahan yang mana phloretin mengaktifkan Nrf2.

Dengan menggunakan model EAE, kami menetapkan bahawa phloretin mengurangkan keradangan saraf dalam vivo. Data kami sangat mencadangkan bahawa phloretin memperbaiki EAE dengan menekan tindak balas keradangan yang dimediasi oleh makrofaj dan mengaktifkan laluan Nrf2. Dalam model penyakit lain, phloretin juga dilaporkan mempunyai ciri neuroprotektif dan modulasi imun. Khususnya, phloretin didapati mengaktifkan laluan Nrf2 dalam otak apabila iskemia serebrum dan mengurangkan pengumpulan beta amiloid dalam model penyakit Alzheimer tikus [80-84]. Phloretin mungkin juga menjejaskan sel imun lain dalam vivo, kerana sebatian ini didapati menghalang sel T dan pengaktifan sel dendritik secara in vitro [85, 86]. Memandangkan neuroinflammation dalam model EAE bukan semata-mata bergantung kepada makrofaj, adalah menarik untuk menentukan sejauh mana pengurangan neuroinflammation dimediasi oleh sel imun yang lain. Berkenaan dengan ini, walaupun data kami mencadangkan bahawa pemulihan EAE terutamanya didorong oleh makrofaj dan kurang bergantung kepada modulasi mikroglia, eksperimen lanjut diperlukan untuk menjelaskan sejauh mana phloretin mempengaruhi mikroglia dalam penyakit neuroinflamasi. Secara keseluruhan, penemuan kami menunjukkan bahawa phloretin mengurangkan neuroinflammation dengan menjejaskan fenotip makrofaj, menunjukkan potensi terapeutik phloretin untuk gangguan neuroinflamasi.

Kesimpulan

Kajian kami menunjukkan bahawa phloretin adalah agen imunomodulator yang kuat yang memodulasi sifat keradangan makrofaj dalam gangguan neuroinflamasi. Pengaktifan laluan Nrf2, yang dimediasi oleh pengaktifan autophagy yang bergantung kepada AMPK dan degradasi Keapl seterusnya, telah ditubuhkan untuk memacu anjakan fenotip ini. Oleh itu, phloretin adalah agen semulajadi yang menjanjikan yang boleh digunakan untuk mengurangkan beban keradangan penyakit neuroinflamasi seperti MS.

Rujukan

1. Zeng Y, Peng Y, Tang K, Wang YQ, Zhao ZY, Wei XY, et al. Dihydromyricetin memperbaiki pembentukan sel buih melalui LXRalpha-ABCA1/ABCG{3}}efluks kolesterol yang bergantung kepada makrofaj. Biomed Pharmacother. 2018;101:543–52. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2018.02.124.

2. Xia M, Hou M, Zhu H, Ma J, Tang Z, Wang Q, et al. Antosianin mendorong pengeluaran kolesterol daripada makrofaj peritoneal tikus: peranan reseptor diaktifkan proliferator peroksisom {gamma}-reseptor X hati {alpha}- ABCA1. J Biol Chem. 2005;280(44):36792–801. https://doi.org/10.1 074/jbc.M505047200.

3. Chang YC, Lee TS, Chiang AN. Quercetin meningkatkan ekspresi ABCA1 dan efluks kolesterol melalui laluan38-bergantung pada makrofaj. J Lipid Res. 2012;53(9):1840–50. https://doi.org/10.1194/jlr.M024471.

4. Grajchen E, Hendriks JJA, Bogie JFJ. Fisiologi fagosit berbuih dalam pelbagai sklerosis. Acta Neuropathol Commun. 2018;6(1):124. https://doi. org/10.1186/s40478-018-0628-8.

5. Bogie JF, Stinissen P, Hendriks JJ. Subset makrofaj dan mikroglia dalam pelbagai sklerosis. Acta Neuropathol. 2014;128(2):191–213. https://doi.org/1 0.1007/s00401-014-1310-2.

6. Baecher-Allan C, Kaskow BJ, Weiner HL. Sklerosis berbilang: mekanisme dan imunoterapi. Neuron. 2018;97(4):742–68. https://doi.org/10.1016/j. neuron.2018.01.021.

7. Bogie JFJ, Grajchen E, Wouters E, Corrales AG, Dierckx T, Vanherle S, et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 merosakkan sifat reparatif makrofaj dan mikroglia dalam otak. J Exp Med. 2020;217(5).

8. Bogie JF, Stinissen P, Hellings N, Hendriks JJ. Makrofaj myelin-phagocytosing memodulasi percambahan sel T autoreaktif. J Neuroinflammation. 2011;8(1):85. https://doi.org/10.1186/1742-2094-8-85.

9. Bogie JF, Timmermans S, Huynh-Thu VA, Irrthum A, Smeets HJ, Gustafsson JA, et al. Lipid yang berasal dari myelin memodulasi aktiviti makrofaj dengan pengaktifan reseptor X hati. PLoS One. 2012;7(9):e44998. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0044998.

10. Bogie JF, Jorissen W, Mailleux J, Nijland PG, Zelcer N, Vanmierlo T, et al. Myelin mengubah fenotip keradangan makrofaj dengan mengaktifkan PPAR. Acta Neuropathol Commun. 2013;1(1):43. https://doi.org/10.1186/2 051-5960-1-43.