Quercetin Melemahkan Perubahan Oksidatif Otak yang Dicetuskan Oleh Nanopartikel Oksida Besi dalam Tikus

Hubungi:tina.xiang@wecistanche.comuntuk lebih terperinci

Abstrak: Terapi nanopartikel besi oksida (IONP) mempunyai pelbagai manfaat kesihatan tetapi dos yang tinggi atau terapi berpanjangan mungkin menyebabkan kecederaan selular oksidatif, terutamanya di otak. Oleh itu, kami menjalankan kajian semasa untuk menyiasat peranan perlindunganquercetinsuplemen terhadap perubahan oksidatif yang disebabkan dalam otak tikus akibat IONP. Empat puluh tikus albino jantan dewasa telah diperuntukkan kepada lima kumpulan yang sama; kawalan menerima diet asas biasa, kumpulan IONP disuntik secara intraperitoneal dengan IONP 50 mg/kg berat badan (BW) dan kumpulan yang dirawat kuersetin mempunyai IONP ditambah Q25, IONP ditambah Q50, dan IONP ditambah Q100 yang digantikan secara lisan dengan kuersetin dengan dos 25, 50 dan 100 mg quercetin/kg BWdaily, masing-masing, ditadbir dengan dos IONP yang sama selama 30 hari. IONP menyebabkan peningkatan ketara dalam malondialdehid (MDA) dan penurunan ketara glutation terkurang (GSH) dan glutation teroksida (GSSG). Akibatnya, IONP menyebabkan kecederaan tisu otak yang teruk akibat pemendapan besi yang membawa kepada perubahan oksidatif dengan peningkatan ketara dalam kreatin fosfokinase(CPK) dan acetylcholinesterase (AChE) otak yang ketara. Tambahan pula, IONP menyebabkan pengurangan ketara dalam epinefrin otak, serotonin dan melatonin dengan penurunan regulasi peroksisom proliferator-diaktifkan reseptor-gamma coactivator 1-alfa (PGC-1a) dan faktor transkripsi mitokondria A (mtTFA)mRNA ungkapan. IONP menyebabkan apoptosis dalam otak dipantau oleh peningkatan dalam caspase 3 dan penurunan dalam tahap ekspresi limfoma sel B 2(Bcl2). Suplemen Quercetin terutamanya mengalahkan otakkerosakan oksidatifdalam cara yang bergantung kepada dos. Oleh itu, suplemen kuersetin semasa IONP sangat disyorkan untuk mendapatkan manfaat IONP dengan bahaya kesihatan yang lebih sedikit.

Kata kunci: nanozarah oksida besi; tekanan oksidatif; quercetin; anti-oksida

1. Pengenalan

Nanopartikel besi oksida (IONP) digunakan untuk penyasaran dadah, penghantaran gen, pelabelan sel, agen kontras dalam pengimejan resonans magnetik, dan terapi hipertermia[1]. Ia juga digunakan sebagai bahan tambahan makanan dalam minuman dan bijirin yang diperkaya dengan besi untuk kegunaan manusia [2] selain banyak kegunaan industri dalam rawatan air sisa, penderiaan gas, dan pelincir sorben semikonduktor, pigmen, dan salutan [3]. Walau bagaimanapun, penggunaan IONP yang pelbagai menyebabkan lebihan besi dan permulaan tekanan oksidatif seterusnya dalam pelbagai organ[4]. Pengingesan, penyedutan, dan penembusan kulit adalah laluan utama untuk kemasukan IONP[5]. Dalam aliran darah, IONP terikat kepada protein plasma dan diedarkan ke dalam badan yang berbeza

organ termasuk hati, limpa, buah pinggang, paru-paru, dan jantung, dan menembusi penghalang darah-otak (BBB), mendorong kecederaan oksidatif [6,7]. Besi yang dibebaskan daripada IONP menyebabkan penjanaan spesies oksigen reaktif (ROS) membawa kepada perubahan oksidatif yang serius dalam lipid, protein, dan DNA [8,9].

Quercetin(3,3',4',5,7-pentahydroxyflavone) ialah aflavonoidterdapat dalam buah-buahan (epal, beri, ceri, dan anggur merah) dan sayur-sayuran (bawang dan brokoli) sebagai tambahan kepada banyak biji, soba, kacang, bunga, kulit kayu, teh hijau dan minyak zaitun[10]. Quercetin mempunyai banyak kesan berharga yang terdiri daripada kesan anti-radang, anti-oksidan, anti-mutagenik, anti-iskemia, anti-virus dan anti-penuaan [11-17]. Quercetin adalah lipofilik dan boleh menembusi penghalang darah-otak (BBB)[18]. Tambahan pula, kuersetin mempamerkan peranan anti-oksidan yang berpotensi dengan peningkatan pengurangan glutation (GSH) dan penyelarasan kuprum-zink superoksida dismutase (SOD1)[17]. Quercetin boleh kelat besi, menghalang tindak balas Fenton dan menghalang penjanaan ROS [19]. Akibatnya, quercetin adalah terapeutik yang berpotensi untuk pelbagai penyakit neurodegeneratif dan kecederaan neuron [20]. Theanti-oksidapotensi quercetin menggalakkan kami menjalankan kajian ini untuk menyiasat potensi perlindungan quercetin terhadap perubahan oksidatif yang disebabkan oleh IONP pada tisu otak.

Klik untuk mengetahui lebih lanjut tentang produk

2. Keputusan

2.1. Saiz dan Caj IONP

Imej SEM bagi IONP, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1, mendedahkan bentuk sfera dengan saiz purata 16.34-22.88 nm sambil mempunyai nilai potensi zeta positif ditambah 22.8 mV (Rajah 2).

2.2. Tekanan Oksidatif Otak dan Status Anti-Oksidan

Tahap produk peroksidasi lipid malondialdehid (MDA) telah meningkat dengan ketara dalam kumpulan IONPs (p<0.05) while="" they="" significantly="" decreased="" in="" ionps="" +="" q100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" (figure="" 3a).mda="" levels="" in="" ionps+="" q25=""><0.01), ionps+=""><0.01) and=""><0.01) were="" significantly="" decreased="" compared="" with="">

Tahap GSH dalam homogenat otak telah menurun dengan ketara dalam IONPs(p<0.001), ionps+=""><0.001),ionps+o50><0.001) and="" ionps+="" o100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.in="" ionps+q100,="" the="" gshlevels="" were="" significantly="" increased="" than=""><0.001) and="" ionps+="" q25(p=""><0.01), as="" represented="" in="" figure="">

Tahap glutation (GSSG) teroksida telah meningkat dengan ketara dalam IONP (p<0.001), ionps+q25=""><0.001),><0.001) and=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="">

Berdasarkan data GSH dan GSSG, nilai nisbah GSH/GSSG telah menurun dengan ketara dalam IONPs(p<0.001), ionps+="" q25,ionps+="" q50="" and="" ionps+="" o100="" compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="" 3d).="" in="" ionps+="" q100,="" gsh/gssg="" ratio="" values="" were="" significantly="" increased="" in="" comparison="" with=""><0.01)and ionps+q25=""><>

2.3.Aktiviti Brain Creatine Phosphokinase(CPK) dan Acetylcholinesterase(AChE)

Aktiviti CPK meningkat dengan ketara dalam IONP (m.s<0.001), ionps="" +="" q25=""><0.001), ionps+="" q50=""><0.001) and="" ionps+="" q100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.="" in="" comparison="" with="" the="" ionp="" groups,="" cpk="" activities="" were="" significantly="" decreased="" in=""><0.01),><0.01) and="" ionps+q100=""><0.001)(figure>

Dalam Rajah 4B, aktiviti AChE telah meningkat dengan ketara dalam IONPs(p<0.001), ionps=""><0.001), ionps+="" q50=""><0.001) and="" ionps+=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.="" they="" significantly="" decreased="" in="" ionps+q25=""><0.01), ionps+q50=""><0.001)and ionps+q100(p=""><0.001) than="" ionps.in="" addition,="" ache="" activities="" were="" significantly="" decreased=""><0.001) in="" ionps+="" q100="" compared="" with="" ionps+="">

2.4. Hormon Epinefrin, Serotonin, dan Melatonin Otak

Tahap epinefrin dalam homogenat otak telah menurun dengan ketara dalam IONPs (p<0.001), ionps+="" q25=""><0.001) and=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group(figure="" 4c).in="" the="" ionps+="" q25=""><0.05),ionps+><0.001)and ionps+q100=""><0.001)groups, the="" epinephrine="" levels="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" ionps.="" furthermore,="" the="" levels="" were="" significantly="" increased="" in="" ionps+=""><0.05)compared with="" ionps="" +="">

Seperti yang dapat dilihat dalam Rajah 4D, paras serotonin telah menurun dengan ketara dalam IONP (m.s<><0.001),><0.01) and=""><0.05)compared with="" the="" control="" group.="" in="" ionps+="" q100,="" the="" levels="" significantly="" increased=""><0.05) than="" ionps="" +="">

Tahap melatonin dalam homogenat otak telah menurun dengan ketara dalam IONPs(p<0.001), ionps+=""><0.001) and="" ionps+="" q50=""><0.01) compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="" 4e).in="" comparison="" with="" ionps,="" the="" levels="" in="" the=""><0.01) and="" ionps="" +=""><0.001)groups were="" significantly="" increased.="" it="" significantly="" increased=""><0.001)in ionps="" +="" q100="" compared="" with="" ionps="" +="">

2.5. Otak PGC-1a dan Ungkapan mRNA mtTFA

Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha(PGC-1a) perubahan lipatan ekspresi mRNA telah berkurangan dengan ketara dalam IONP(p<0.001) and="" ionps+q25=""><0.05) and="" significantly="" increased="" in="" ionps+="" q100=""><0.001)compared with="" the="" control="" group="" (figure="" 5a).in="" comparison="" with="" ionps,="" the="" pgc-1a="" expression="" levels="" were="" significantly="" increased="" in="" ionps+="" q50=""><0.05) and="" ionps+q100=""><0.001).in addition,="" pgc-1a="" expression="" levels="" in="" ionps+="" o100="" were="" significantly="" increased="" (p=""><0.001)compared with="" the="" ionps="" +="" q25="" and="" ionps="" +="" q50="">

Dalam IONP(hlm<0.001), ionps+="" q25="" (p=""><0.001)and ionps+=""><0.05), the="" mrna="" expression="" levels="" of="" mitochondrial="" transcription="" factor="" a="" (mttfa)="" were="" significantly="" decreased="" than="" in="" the="" control="" group="" while="" they="" significantly="" increased="" in="" ionps+q50=""><0.01) and="" ionps+=""><0.05)compared with="" ionps+="" q25.mttfa="" expression="" levels="" were="" significantly="" increased=""><0.05) in="" ionps+o100="" in="" comparison="" with="" ionps+q50="" (figure="">

2.6.Penilaian Pewarnaan Hematoksilin (H) dan Eosin(E) Bahagian Otak

Penilaian histologi tisu otak mendedahkan bahawa kumpulan kawalan menunjukkan struktur histologi normal lapisan cerebellum (Rajah 6A). Dalam kumpulan IONP, cerebellum menunjukkan pengurangan teruk lapisan sel Purkinje (Rajah 6B) manakala penipisan sel Purkinje ini. lapisan disebabkan oleh IONP telah dikurangkan dalam kumpulan IONP tambah Q25 (Rajah 6C), IONP tambah Q50 (Rajah 6D), dan IONP tambah Q100 (Rajah 6E) dalam cara yang bergantung kepada dos.

Tikus dalam kumpulan kawalan menunjukkan struktur histologi normal meninges dan korteks serebrum (Skim 1A) manakala meninges tikus yang dirawat dengan IONP menunjukkan kesesakan saluran darah submeningeal (Skim 1B). Dalam kumpulan IONP, serebrum otak tikus menunjukkan satellitosis, neuronophagia (Skim 1C), gliosis (Skim 1D), dan spongiosis (Skim 1E) selain kesesakan plexus koroid (Skim 1F).

Seperti yang dapat dilihat dalam Skim iF, otak tikus dalam kumpulan IONPs ditambah Q25 menunjukkan spongiosis (anak panah pendek) dan kesesakan saluran darah submeningeal. Selain itu, serebrum tikus dalam kumpulan IONPs ditambah Q50 menunjukkan spongiosis ringan dan kesesakan saluran darah (Skim 1H). Otak tikus dalam kumpulan IONPs ditambah Q100 menunjukkan struktur histologi yang agak normal bagi meninges dan korteks serebrum (Skim 1I).

2.7. Penilaian Pewarnaan Biru Prusia bagi Bahagian Otak

Bahagian otak kumpulan kawalan menunjukkan pewarnaan biru Prusia negatif (Rajah 7A). Dalam kumpulan IONPs, bintik-bintik pewarnaan biru Prusia telah diiktiraf di bahagian otak (Rajah 7B). Sebaliknya, keamatan bintik-bintik pewarnaan biru Prusia pada bahagian-bahagian kumpulan IONP telah dilemahkan oleh kuersetin dalam kumpulan IONPs ditambah Q25(Rajah7C), IONPs ditambah Q50(Rajah 7D) dan IONPs ditambah Q100 (Rajah 7E) dalam kumpulan cara bergantung kepada dos.

2.8. Tahap Protein Caspase 3 dan Bcl2 dalam Bahagian Otak

Kumpulan kawalan menunjukkan ekspresi negatif tahap protein caspase 3 (Rajah 8A) manakala ia sangat dinyatakan dalam IONP (Rajah 8B).Dirawat dengan quercetinkumpulan (Rajah 8C-E) menunjukkan ekspresi caspase 3 yang rendah berbanding dengan IONP. Sebaliknya, Bcl2 dinyatakan dengan ketara dalam IONP ditambah Q25 (Rajah 9C), IONP ditambah Q50 (Rajah 9D) dan IONP ditambah Q100 (Rajah 9E) berbanding dengan IONP (Rajah 9B) dan kumpulan kawalan (Rajah 9A).

3. Perbincangan

Pendedahan kepada IONP membawa kepada besi dan pemendapannya dalam tisu lembut, terutamanya di otak [21]. Dalam kajian ini, kami mengiktiraf pemendapan besi di dalam otak yang dibuktikan oleh pewarnaan biru Prusia dan perubahan morfologi yang dipantau oleh penilaian pewarnaan H dan E. Dhakshinamoorthy et al. [22] menunjukkan bahawa kandungan besi meningkat dengan ketara dalam tisu otak kumpulan yang dirawat IONP berbanding dengan kawalan. Ini dinilai oleh pewarnaan biru Prusia di kawasan otak dan dibuktikan oleh bintik biru di korteks hadapan, hippocampus, dan cerebellum. El-Sayed et al. [23] juga menyatakan peningkatan ketara dalam paras besi dalam tisu otak disebabkan oleh pentadbiran IONP dalam tikus.

IONP boleh mempunyai lebih banyak keupayaan untuk menembusi BBB dan menyebabkan kecederaan sel otak daripada sel organ lain [24,25]. Penjelasan lain mungkin ialah peningkatan tahap zat besi

di dalam otak kerana pengikatan besi kepada transferrin mencetuskan regulasi reseptor besi di otak dan, akibatnya, mengangkut besi merentasi BBB [26].

Feion Bebas bertindak balas dengan H2O2 untuk menghasilkan ROS dalam proses tindak balas Fenton [27]. ROS yang tinggi meningkatkan kebolehtelapan membran mitokondria luar, peroksidasi lipid, kerosakan protein, dan rantai DNA putus [28]. Thetekanan oksidatifdaripada ROS membawa kepada peningkatan tahap otak produk peroksidasi lipid, MDA, seperti yang dinyatakan dalam kajian semasa dalam tikus yang dirawat IONP. Begitu juga, Dhakshinamoorthy et al, [22] melaporkan peningkatan ketara dalam tahap MDA dalam tisu otak tikus yang dirawat IONP. Reddy et al.[26] juga menyatakan bahawa tahap MDA telah meningkat dengan ketara dalam tisu otak dalam dos yang tinggi tetapi peningkatan yang tidak ketara dalam dos yang rendah dalam tikus yang dirawat IONP. Gaharwar dan Paulraj [5] mendedahkan bahawa paras MDA telah meningkat dengan ketara dalam tikus yang dirawat IONP. Begitu juga, IONP menyebabkan kecederaan oksidatif kardiomiosit yang dipantau oleh pengeluaran MDA yang tinggi dan kepekatan GSH yang berkurangan [29].

Pengarang dalam beberapa kajian telah menyiasat kesan perlindungan produk semulajadi atau ekstraknya terhadap kesan sampingan yang dikaitkan dengan IONP termasuk ekstrak Echinacea purpurea [30] dan Antlriscus sulvestris [31]. Dalam kajian semasa, kami menyiasat peranan perlindungan quercetin terhadap ketoksikan IONP dalam otak tikus. Suplemen Quercetin kepada tikus yang dirawat IONP mengurangkan tahap MDA dalam tisu otak dan keputusan kami adalah selaras dengan yang diperoleh oleh Dong et al. [32] yang menyatakan bahawa quercetin menurunkan peroksidasi lipid dengan menurunkan tahap MDA dalam tisu otak pada tikus. Ini mungkin dijelaskan oleh keupayaan quercetin untuk mengurangkan ROS, oleh itu, menghalang peroksidasi lipid dan menghalang pembentukan MDA [33]. Ini dikaitkan dengan kumpulan katekol (cincin B) dan kumpulan OH pada kedudukan 3 cincin A dan C, yang mempunyai penghapusan radikal bebas yang optimum [17].

GSH adalah bahagian penting dalam pertahanan antioksidan selular yang bertindak balas secara langsung dengan ROS dan spesies reaktif lain [34]. Dalam kajian ini, tahap GSH otak telah menurun dengan ketara dalam tikus yang dirawat IONP tetapi tahap GSSG meningkat dengan ketara. Reddy et al.[26]menyatakan pengurangan tahap GSH dalam tisu otak tikus yang dirawat IONP dan mencadangkan bahawa ia mungkin disebabkan oleh peningkatan penggunaan GSH dalam tindak balas konjugasi sebagai sebahagian daripada mekanisme detoksifikasi, oleh itu pengurangan GSH berkurangan dan GSSG teroksida. meningkat. Pentadbiran bersama tikus yang dirawat IONP dengan quercetin memulihkannya dengan meningkatkan GSH dan menurunkan tahap GSSG dalam tisu otak. Keputusan ini adalah selaras dengan Singh et al. [35] yang melaporkan peningkatan paras GSH dalam tisu otak yang menunjukkan potensi antioksidan quercetin. Dong et al. [32] juga mendedahkan bahawa quercetin mengubah ekspresi gen faktor nuklear erythroid 2-faktor 2(Nrf2). Nrf2 seterusnya merangsang pengeluaran enzim anti-oksidan dalam tisu otak.

Dalam kajian ini, CPK telah meningkat dengan ketara dalam tisu otak tikus yang dirawat IONP. Dalam penimbalan tenaga selular dan penghantaran tenaga, CPK/phosphocreatine memainkan peranan utama, terutamanya dalam sel yang mempunyai keperluan tenaga yang tinggi dan turun naik seperti neuron [36]. Oleh itu, pengaktifan sistem CPK/phosphocreatine dan perubahan ekspresi CPK mungkin merupakan penunjuk awal bagi tekanan oksidatif dan bioenergetik dalam sel [37] sebagai pampasan untuk mengurangkan pengeluaran tenaga akibat tekanan oksidatif. Pentadbiran bersama tikus yang dirawat IONP dengan kuersetin menurunkan CPK dalam tisu otak, Lemmens et al. [38]menunjukkan penurunan aktiviti CPK disebabkan oleh suplemen kuersetin.

Aktiviti AChE dalam tisu saraf bertanggungjawab untuk hidrolisis asetilkolin (Ach) kepada kolin pada sinaps dan persimpangan neuromuskular [39]. Dalam kajian ini, AChE telah meningkat dengan ketara dalam tikus yang dirawat IONP dan keputusan ini adalah selaras dengan Dhakshinamoorthy et al. [22] yang mengiktiraf peningkatan ketara dalam aktiviti AChE dalam tisu otak tikus yang dirawat IONP di mana pengumpulan besi oleh IONP mengubah sistem kolinergik.

Neurotransmitter ialah bahan kimia endogen yang membolehkan neuron berkomunikasi ke seluruh badan; ia membolehkan otak melaksanakan fungsi yang berbeza dalam penghantaran sinaptik kimia [40]. Dalam kajian semasa, kepekatan epinefrin, serotonin, dan melatonin dalam tisu otak telah menurun dengan ketara dalam tikus yang dirawat IONP.

Yousef et al. [41] melaporkan bahawa tahap serotonin dan dopamin telah menurun dengan ketara dalam tisu otak dalam tikus yang dirawat IONP. Sebaliknya, quercetin meningkatkan kepekatan epinefrin, serotonin, dan melatonin dalam tisu otak berbanding dengan IONP. Singh et al. [35l menyatakan bahawa quercetin meningkatkan serotonin, norepinephrine, dan dopamin.

Biogenesis mitokondria memainkan peranan utama dalam mengekalkan homeostasis mitokondria untuk memenuhi keperluan fisiologi selular sel saraf [42]. PGC-1a ialah faktor peraturan transkripsi bersama yang mendorong biogenesis mitokondria dan menggalakkan ekspresi mtTFA [43]. Dalam kajian ini, tahap ekspresi PGC-1a dan mtTFA telah menurun dengan ketara dalam tisu otak dalam tikus yang dirawat IONP. Keputusan kami adalah selaras dengan yang diperolehi oleh Yousef et al. [44]. Mereka menggambarkan bahawa biogenesis mitokondria yang diwakili oleh PGC-la dan mtTFA dengan ketara mengurangkan ekspresi mereka dalam tisu otak dalam tikus terdedah IONP yang menunjukkan penurunan biogenesis mitokondria dan replikasi dan transkripsi mtDNA yang boleh membawa kepada disfungsi mitokondria. Pentadbiran bersama tikus yang dirawat IONP dengan kuersetin memulihkan penurunan ini dengan meningkatkan kedua-dua ekspresi PGC-1a dan mtTFA dalam tisu otak dan keputusan kami adalah selaras dengan Sharma et al.[45] yang melaporkan bahawa quercetin meningkatkan ungkapan PGC-1a, NRF-1, NRF-2 dan mtTFA. Mereka mencadangkan bahawa disebabkan oleh penurunan ROS oleh PGC yang disebabkan oleh quercetin{{17 }}peningkatan, ini membawa kepada pengaktifan ekspresi rangsangan NRF-1 dan NRF{19}} mtTFA.

Quercetin melemahkan kesan apoptosis IONP melalui pengurangan ketara dalam caspase 3 dan peningkatan tahap ekspresi Bcl2 dalam bahagian imunohistokimia otak. Penemuan ini menyokonganti-oksidapotensi kuersetin. Begitu juga, rawatan quercetin melemahkan peningkatan caspase 3 dalam kecederaan otak iskemia pada tikus [46,47] dan Bcl2 dalam tikus yang dirawat lipopolysaccharide [48].

4. Bahan dan Kaedah

4.1.Reagen dan Bahan Kimia

Serbuk nanozarah besi (ⅡI) oksida diperoleh daripada Sigma-Aldrich (Louis, Mo, USA), yang telah dilarutkan dalam air ternyahion sebelum digunakan. Quercetin adalah bentuk serbuk juga diperoleh daripada Sigma-Aldrich, yang telah dibubarkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO) dan air suling pada nisbah 1:20, masing-masing sebelum digunakan. DMSO Lebih daripada atau sama dengan 99.6 peratus telah dibeli daripada Sigma-Aldrich. Bahan kimia lain dan air ternyahion telah dibeli dari Pusat Pengajian Siswazah dan Penyelidikan di Universiti Alexandria.

4.2. Pernyataan Etika

Kajian itu telah diluluskan sebagai tindak balas kepada garis panduan "Panduan NIH untuk Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal" oleh Jawatankuasa Etika Fakulti Perubatan Veterinar Universiti Alexandria, Mesir.

4.3. Pencirian IONP

Morfologi dan saiz zarah IONP diperiksa dengan mengimbas mikroskop elektron (SEM). Caj zarah juga ditentukan oleh potensi zeta menggunakan ZetaSizer Nano ZS (Instrumen Malvern, Malvern, UK).

4.4.Haiwan, Perumahan dan Reka Bentuk Eksperimen

Empat puluh ekor tikus albino jantan dewasa yang sihat dengan berat 150± 20 berat badan (BW) telah dibeli daripada Unit Pembiakan Haiwan, Institut Penyelidikan Perubatan Universiti Alexandria, Mesir. Haiwan itu disimpan dalam sangkar logam di bawah keadaan persekitaran terkawal dengan suhu optimum (23± 2), kelembapan (55±5) dan kitaran gelap/cahaya (12 jam), dan akses percuma kepada diet makanan asas (Jadual 1) dan air minuman. Semua haiwan ditempatkan selama dua minggu sebelum eksperimen untuk penyesuaian. Tikus-tikus tersebut telah diagihkan secara rawak kepada lima kumpulan (masing-masing lapan tikus); kawalan menerima diet asas biasa dan air ad libitum, kumpulan IONPs disuntik secara intraperitoneal dengan IONPs 50 mg/kg BW tiga kali seminggu[49], kumpulan IONPs ditambah Q25 mg ditadbir dengan dos yang sama

IONPs dan digavaged dengan 25 mg quercetin/kg BWdaily, kumpulan IONPs ditambah Q50 telah ditadbir dengan dos yang sama IONPs dan digavaged dengan 50 mg quercetin/kg BW setiap hari dan IONPs ditambah Q100group telah ditadbir dengan dos IONPs dan gavaged yang sama. dengan 100 mg quercetin/kg BW setiap hari [17]. Semua rawatan dikekalkan selama 30 hari.

4.5. Pensampelan

Pada penghujung eksperimen, tikus dipuasakan selama 12 jam dan dibius menggunakan suntikan intraperitoneal ketamin/xylazine (100 mg/kg/10 mg/kg) kemudian dimatikan dan otak segera dibedah, dibilas dengan garam biasa sejuk 0.9 peratus dan dibahagikan kepada tiga bahagian; yang pertama digunakan untuk analisis biokimia. Bahagian kedua disimpan pada -80 darjah untuk pengekstrakan mRNA dan penilaian RT-PCR manakala bahagian terakhir dibilas dengan garam penimbal fosfat (PBS, pH 7.4) dan difiksasi dalam 4 peratus paraformaldehid yang dilarutkan dalam PBS selama 48 jam untuk penetapan sampel.

4.6. Analisis Biokimia

Bahagian setiap otak tikus dihomogenkan dalam garam penampan fosfat sejuk (PBS) dan disentrifugasi selama 10 minit pada 4 darjah pada 1435 × g. Malondialdehid (MDA), GSH, glutathione teroksida (GSSG) dan kreatin fosfokinase(CPK) ditentukan oleh kit komersial Biodiagnostic Co.(Giza, Mesir). Aktiviti enzim asetilkolinesterase (AChE) dalam homogenat otak ditentukan oleh kit ujian kolorimetrik (BioVision Co., Milpitas, CA, Amerika Syarikat). Tahap epinefrin, serotonin, dan melatonin dalam homogenat otak juga ditentukan menggunakan kit ELISA (BioVision Co., Milpitas, CA, USA).

4.7.mRNA Pengekstrakan dan RT-PCR

Jumlah RNA diekstrak daripada sampel menggunakan Kit Pengekstrakan RNA Jumlah RED yang mudah (iNtRON Biotechnology, Inc., Gyeonggi-do, Korea Selatan). cDNA untaian pertama dicapai menggunakan pakej cDNA (iNtRON Biotechnology, Inc.) Skrip HiSen. Primer khusus digunakan untuk menguatkan gen terpilih dengan gliseraldehid 3-fosfat dehidrogenase (GAPDH) sebagai gen pengemasan yang stabil (Jadual 2). Ekspresi mRNA dicapai menggunakan gen Strata masa nyata MX3005P PCR(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) dan campuran induk qPCR TM PreMIX SYBR Green TOP sebenar (cat. RT 500, Enzynomics, Daejeon, Korea Selatan) mengikut arahan pengilang. Kepekatan ekspresi gen relatif telah dinilai menggunakan kaedah 2-Act seperti yang diterangkan oleh Pfaffl [50].

4.8. Pemeriksaan Histopatologi

Menggunakan teknik penggabungan parafin tradisional, spesimen tetap telah didehidrasi dengan tahap etanol menaik, dibersihkan kepada tiga anjakan xilena, dan disiapkan dengan pembenaman parafin pada 65 darjah C. Bahagian 4 um tebal telah diwarnakan dengan Hematoxylin dan Eosin (H dan E) [51].

Bahagian otak telah terhidrat melalui satu siri kepekatan alkohol yang berkurangan dan diletakkan dalam larutan kalium ferrosianida 20 peratus dengan larutan HCl 20 peratus selama 30 minit. Slaid telah dibasuh, dehidrasi, dibersihkan dengan xilena, dan diperhatikan di bawah mikroskop untuk pewarnaan biru atau kandungan besi [52].

4.9.Pemeriksaan Imunohistokimia

Teknik imunohistokimia peroksidase lobak pedas (HRP) standard telah digunakan pada slaid bercas positif bahagian tisu parafin. Menurut garis panduan pengilang, arnab anti-tikus caspase 3 (Lab Vision, Fremont, CA, USA) dan Bcl2 (DAKO, Glostrup, Denmark) telah digunakan. Lima bahagian serebrum, cerebellum, saraf tunjang dan saraf sciatic setebal um telah didewax, dihidrasi semula dan dirawat terlebih dahulu dengan 3 peratus hidrogen peroksida (H2O2) untuk menyekat aktiviti peroksidase endogen. Pengambilan semula antigen dicapai dengan meletakkan slaid dalam ketuhar gelombang mikro selama 1{10}} min dalam penimbal natrium sitrat 10 mM (pH6.0). Slaid diinkubasi dengan antibodi primer dan kemudian dibilas dengan garam Tris-buffer dan antibodi sekunder. Slaid diinkubasi dengan larutan kromogen substrat 3,3/-diaminobenzidine (DAB) dan kemudian diwarnakan dengan hematoksilin Mayer. Imej 10 medan berbeza telah diimej pada pembesaran ×400.

4.10. Analisis statistik

ANOVA sehala dengan ujian julat berbilang post hoc Tukey telah digunakan untuk analisis data menggunakan GraphPad Prism v.5https://www.graphpad.com/, diakses pada 10 Mac 2021(GraphPad, San Diego, CA, USA) . Semua pengisytiharan kepentingan bergantung pada p<0.05. 5.="">

Nanopartikel besi oksida (IONPs) disuntik secara intraperitoneal dengan dos 50 mg/kg BPengubahan oksidatif terdorong dalam otak manakala kuersetin dalam dos 25, 50, dan 100 mg/kg BKecederaan oksidatif otak berwalleviated yang disebabkan oleh IONP. Oleh itu, quercetin adalah suplemen makanan yang menjanjikan bersama dengan terapi IONP.

Rujukan

1. Mazdeh, M.; Rahiminejad, SAYA; Nili-Ahmadabadi, A.; Ranjbar, A. Gangguan Neurologi, dan Tekanan Toksik Oksidatif: Peranan Zarah Nano Logam. Jundishapur J. Nat. Pharm. Prod. 2016, 11, e27628. [CrossRef]

2. Fidler, MC; Walczyk, T.; Davidsson, L.; Zeder, C.; Sakaguchi, N.; Juneja, LR; Hurrell, RF Pirofosfat ferik terdispersi mikron dengan bioavailabiliti relatif tinggi pada manusia. Br. J. Nutr. 2004, 91, 107–112. [CrossRef]

3. Ramimoghadam, D.; Bagheri, S.; Hamid, SBA Kemajuan dalam sintesis elektrokimia nanopartikel besi oksida magnetik. J. Magn. Magn. Mater. 2014, 368, 207–229. [CrossRef]

4. Gaharwar, AS; Kumar, S.; Rajamani, P. Tindak balas hematopoietik dan imunologi yang disebabkan oleh nanopartikel besi oksida dalam tikus. RSC Adv. 2020, 10, 35753–35764. [CrossRef]

5. Gaharwar, AS; Paulraj, R. Zarah Nano Oksida Besi Terinduksi Kerosakan Oksidatif dalam Sel Darah Periferi Tikus. J. Biomed. Sci. En. 2015, 8, 274–286. [CrossRef]

6. Feng, Q.; Liu, Y.; Huang, J.; Chen, K.; Huang, J.; Xiao, K. Pengambilan, pengedaran, pelepasan, dan ketoksikan nanozarah oksida besi dengan saiz dan salutan yang berbeza. Sci. Rep. 2018, 8, 1–13. [CrossRef] [PubMed]

7. Gaharwar, AS; Meena, R.; Rajamani, P. Pengedaran bio, pembersihan dan perubahan morfologi nanozarah oksida besi yang diberikan secara intravena dalam tikus Wistar jantan. Int. J. Nanomed. 2019, 14, 9677–9692. [CrossRef] [PubMed]

8. Palmieri, B.; Sblendorio, V. Ujian tekanan oksidatif: Gambaran keseluruhan tentang kebolehpercayaan dan penggunaan, Bahagian II. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2007, 11, 383–399.

9. Naqvi, S.; Samim, M.; Abdin, MZ; Ahmad, FJ; Maitra, AN; Prashant, CK; Dinda, AK Ketoksikan bergantung kepada kepekatan nanozarah oksida besi yang dimediasi oleh peningkatan tekanan oksidatif. Int. J. Nanomed. 2010, 5, 983–989. [CrossRef]

10. David, AVA; Arulmoli, R.; Parasuraman, S. Tinjauan tentang kepentingan biologi kuersetin: Flavonoid bioaktif. Farmakog. Wahyu 2016, 10, 84–89.

11. Wu, W.; Li, R.; Li, X.; Dia, J.; Jiang, S.; Liu, S.; Yang, J. Quercetin sebagai Ejen Antiviral Menghalang Kemasukan Virus Influenza A (IAV). Virus 2015, 8, 6. [CrossRef]

12. Akdemir, FNE; Gülçin, ˙I.; Karagöz, B.; Soslu, R. Quercetin melindungi otot rangka tikus daripada kecederaan iskemia-reperfusi. J. Enzim. Inhib. Med. Kimia. 2016, 31, 162–166. [CrossRef] [PubMed]