Bahagian2: Interaksi Asid Askorbik, 5-Asid Kafeoilkuinik, Dan Quercetin-3-Rtinoside dalam Kehadiran Dan Ketiadaan Besi Semasa Pemprosesan Terma Dan Pengaruh Terhadap Aktiviti Antioksidan

Untuk maklumat lanjut. hubungi:tina.xiang@wecistanche.com

Klik pautan untuk mengetahui butiran bahagian 1:
https://www.xjcistanche.com/news/part1-interactions-of-ascorbic-acid-5-caffeo-54916714.html

3. Perbincangan

3.1. Hubungan Struktur-Aktiviti Asid Askorbik,5-Asid Kafeoilkuinik dan Quercetin-3-Rutinoside

Penunjuk pertama AOA, diukur untuk bahan yang berbeza bergantung pada hubungan struktur-aktiviti, terhasil daripada bilangan kumpulan berfungsi. Membandingkan ketiga-tiga bahan yang dianalisis, asid askorbik mempunyai AOA yang paling rendah, diikuti oleh 5-asid caffeoylquinic, manakalaquercetin-3-rutinosidemencapai AOA tertinggi. Cseregi et al. [14] mendapati susunan yang sama apabila membandingkan AOA bagi ketiga-tiga sebatian ini. Kedudukan ini mungkin dijelaskan oleh jumlah kumpulan hidroksi: quercetin-3-rutinoside mempunyai sepuluh, 5-asid caffeoylquinic mempunyai lima, danasid askorbikmempunyai empat. Untukflavonoid, jumlah kumpulan hidroksi dan kesannya terhadap mekanisme AOA sebelum ini ditunjukkan oleh Burda dan Oleszek[15]. Kumpulan hidroksi amat berharga dalam struktur enediol, kerana ia boleh dengan mudah teroksida kepada diketon [8]. Dalam bahan yang dianalisis, struktur endiol juga penting untuk keupayaan membentuk kompleks dengan ion logam [16-18]. Struktur endiol berlaku dalam molekul asid quercetin-3-rutinoside dan 5-caffeoylquinic dalam cincin fenil, yang mungkin juga mempengaruhi AOA yang lebih kuat bagi sebatian ini. Kajian lanjut mendapati bahawa AOA mungkin juga dipengaruhi oleh struktur molekul lain. Asid fenolik mungkin dipengaruhi oleh kumpulan asid karboksilik, contohnya, asid hidroksifenil asetik (R-CH=CH-COOH) ialah kumpulan penarik elektron yang lebih lemah, berbanding asid hidroksisinamik (R-CH,-COOH) seperti sebagai asid kafeik dalam 5-asid caffeoylquinic [19]. Dalam flavonoid, aglikon mempunyai AOA yang lebih tinggi daripada glikosida yang sepadan [20,21], dalam kes quercetin-3-rutinoside, glikosida, AOA bagi aglikonquercetinakibatnya adalah lebih tinggi [14]. Terdapat banyak kumpulan berfungsi yang berbeza yang boleh mempengaruhi AOA dan, akibatnya, adalah penting untuk menggunakan ujian ujian yang berbeza dengan mekanisme yang berbeza, seperti pemindahan elektron tunggal (SET), pemindahan atom hidrogen (HAT), dan elektron kehilangan proton berjujukan. pemindahan (SPLET) untuk pengesanan. Setiap mekanisme dan juga reagen ujian yang digunakan boleh mengesan struktur sebatian bioaktif yang berbeza [22].

3.2.Pengaruh Pemprosesan Terma dan Interaksi Antioksidan Berbeza Struktur Terhadap Aktiviti Antioksidan Tanpa Ketiadaan Besi Mineral

AOA yang stabil dalam masa lanjutan 40 minit pemprosesan haba menunjukkan bahawa degradasi haba adalah kurang penting daripada yang dihipotesiskan pada mulanya. Tambahan pula, data HPLC menunjukkan bahawa 5-asid caffeoylquinic dan quercetin-3-rutinoside tulen adalah stabil, dengan degradasi maksimum 20 peratus , semasa pemprosesan terma. Kajian terdahulu membuktikan kestabilan5-asid kafeoilkuinik sehingga takat didih air biasa [23], manakala Dawidowicz dan Typek[24] menemui sembilan sebatian terbitan, selepas memanaskan 5-asid kafeoilkuinik selama 5 jam di bawah refluks. Untuk kepekatan asid askorbik, degradasi selepas 40 minit memasak didapati. Faktor yang mempengaruhi, mengakibatkan degradasi asid askorbik tanpa besi dalam larutan akueus, boleh menjadi nilai pH, pendedahan cahaya, pengoksidaan, suhu, dan kepekatan yang berbeza [25,26]. Dalam kajian ini, faktor suhu dan kepekatan berkemungkinan besar memainkan peranan utama, kerana proses oksidatif dikurangkan kepada minimum kerana ruang gas yang minimum dalam mikrotiub. Ada kemungkinan fasa gas yang tinggal masih cukup untuk degradasi di bawah keadaan aerobik. Keadaan yang berbeza menghasilkan produk yang berbeza [27,28], jadi dalam kajian ini, selepas 40 minit memasak, produk kedua-dua keadaan boleh ditemui. Yuan dan Chen [28] melaporkan bahawa furfural, 2-asid furoik, 3-hidroksi-2-pirron, dan bahan yang tidak diketahui adalah produk degradasi utama asid askorbik dalam larutan akueus bergantung pada nilai pH . Shinoda et al. [29,30] mendapati dalam jus oren produk degradasi furfural, 2-asid furoik, 5-hidroksimaltol, 3-hidroksi-2-pirron dan 5-(hidroksimetil )furfural. Hsu et al. [31] menganalisis asid askorbik dalam larutan etanol dan mengesan 2-asid furoik dan 3-hidroksi-2-piron. Bergantung pada keadaan aerobik atau anaerobik, terbitan asid askorbik yang dikesan (puncak 3 dan 4) mungkin furfural, 2-asid furoik atau 3-hidroksi-2-piron atau perantaraan. Asid askorbik berkurangan dalam hubungan tindak balas dos, dan kepekatan asid askorbik yang lebih tinggi menunjukkan nisbah degradasi yang lebih rendah semasa memasak. Asid askorbik nampaknya menstabilkan dirinya dalam kepekatan yang lebih tinggi, mungkin disebabkan oleh ikatan hidrogen dan tenaga van de Waals [32].

Dalam campuran binari dan ternari, terutamanya kesan tambahan pada AOA ditemui. Dalam campuran binari, jika bahan dengan AOA yang lebih tinggi meningkat dalam kepekatannya, AOA gabungan mereka juga meningkat. Kajian lain juga mendapati kesan tambahan antara ( tambah )-catechin (200 um) dengan asid askorbik (50-200 mg/L)[33], dan antara campuran binari monoterpena yang berbeza[34]. Hanya dalam ujian DPPH, kesan antagonis ditemui dalam 5-asid caffeoylquinic digabungkan dengan quercetin-3-rutinoside dan dalam campuran terner dengan dua kali ganda kepekatan rutinoside-3-kuersetin. Ini mungkin disebabkan oleh orientasi molekul dalam angkasa, terutamanya quercetin-3-rutinoside, sebagai molekul yang agak besar, dan kebolehcapaian sterik molekul radikal DPPH [35]. Dalam ujian TPC, gabungan asid askorbik dan 5-asid kafeoilkuinik menghasilkan kesan antagonis yang kuat dalam nisbah 1:2, manakala campuran terbalik dengan nisbah 2:1 menghasilkan kesan sinergi yang kuat, melebihi jumlah AOA masing-masing. Asid askorbik kepekatan berganda mungkin memberi, dalam keadaan ini, rangsangan tambahan kepada AOA, disebabkan penstabilan diri diikuti oleh penstabilan molekul lain, yang ditunjukkan oleh 5-asid kafeoilkuinik dalam eksperimen ini. Dalam jus delima-nektarin, antara fenol semula jadi dan asid askorbik, interaksi yang sama didapati, manakala dalam jus anggur meningkatkan kesan antagonis dengan meningkatkan kepekatan asid askorbik diperhatikan [36]. Keputusan ini mencadangkan bahawa campuran asid askorbik, 5-kafeoilkuinik dan kuersetin-3-rutinoside mencapai potensi AOA tertinggi apabila paling kuatantioksidantersedia dengan banyaknya.

Klik untuk mengetahui lebih lanjut tentang produk

3.3. Pengaruh Besi Mineral

The addition of iron to the samples had the most influence on changes in their AOA. Contrary to the hypothesis, based on the pro-oxidative activity of iron, the AOA increased, compared to the same substance or substance mixture without iron. Iron may act like a catalyst itself or forms metal chelates, which are effective catalysts. The changed stoichiometry of the chelates can form additional radical-scavenging metal centers [18], which explains the increased AOA. Further tests showed that reduced ferrous iron (50-100%,v/o)itself interacts with the TEAC(0.266-0.538 mol TE/mol iron), DPPH(0.210-0.495 mol TE/mol iron), and TPC(16.65-31.82g GAE/mol iron) assay reagents, while oxidized ferric iron does not (data not shown). In the presence of iron, 5-caffeoylquinic acid had the highest AOA, followed by quercetin-3-rutinoside and ascorbic acid in TEAC and DPPH assays. This may be due to the changed stoichiometry by metal chelation. The AOA ranking detected by the TPCassay stayed the same, as in the absence of iron: quercetin-3-rutinoside >5-caffeoylquinic acid>asid askorbik. Walau bagaimanapun, penambahan besi kepada campuran mempunyai pengaruh ke atas keputusan ujian TEAC dan DPPH, manakala ujian TPC tidak terjejas secara meluas. Atas sebab ini, adalah penting untuk menggunakan ujian ujian yang berbeza dengan mekanisme kerja yang berbeza apabila bekerja dengan sampel yang kaya dengan besi.

Hanya dalam ujian DPPH, AOA kuersetin tulen-3-rutinoside, dan digabungkan dengan asid askorbik, ekuimolar atau bukan ekuimolar dengan kepekatan rutinosida-3-kuersetin berganda dua kali ganda, mempunyai nilai yang lebih rendah dengan kehadiran besi. Boligon et al. [351 menjelaskan bahawa ujian DPPH mengesan antioksidan yang lebih kecil dengan lebih baik, disebabkan oleh kebolehcapaian sterik radikal ini. Mungkin, quercetin-3-rutinoside dengan dua bahagian pengikat boleh membina kompleks yang agak besar dengan besi, dan dengan itu tidak boleh diakses untuk ujian. Seperti yang disebutkan oleh Kejic et al. [8], ini mungkin dijelaskan oleh pembentukan kompleks supramolekul melalui penyelarasan ion logam. Dalam kombinasi dengan asid askorbik, yang mampu membina kompleks valens campuran dalam nisbah 1:2 [12], mungkin, kompleks campuran yang lebih besar ini tidak boleh berinteraksi dengan radikal DPPH. Bertentangan dengan keputusan dalam kajian ini, kajian lain [18,37,38] mendapati, dengan menggunakan ujian DPPH, kompleks quercetin{13}}rutinoside adalah antioksidan yang lebih berkesan daripada quercetin{14}}rutinoside tulen. Adalah diketahui bahawa kompleks chelate flavonoid dan ion logam boleh menafikan aktiviti radikal ion logam kompleks [39]. Satu-satunya perbezaan ialah dalam kajian ini ammonium besi (II) sulfat digunakan, bukannya besi (ⅡI) klorida atau sulfat, digunakan dalam kerja Symonowics dan Kolandek [39].

Kesan sinergistik antara asid askorbik dan 5-asid caffeoylquinic dengan kehadiran besi dalam nisbah 2:1, dan kesan antagonis dalam nisbah 1:2, didapati. Gabungan 5-asid caffeoylquinic dengan besi tidak disyorkan dalam vivo [6]. Walau bagaimanapun, kajian ini menunjukkan bahawa, secara in vitro, jumlah dua kali ganda asid askorbik berbanding 5-asid caffeoylquinic malah boleh mempunyai kesan sinergistik pada AOA. Siasatan lanjut mengenai nisbah boleh menunjukkan sama ada kesan positif juga boleh dicapai dalam vivo.

Menurut data HPLC, menambahkan besi pada sampel akan memberi kesan minimum pada aktiviti pemangkinnya, kerana hanya kepekatan asid askorbik dalam 0 sampel min yang dimasak berkurangan. Dalam sampel asid askorbik yang telah dimasak, bertentangan dengan sampel tanpa besi, kepekatan asid askorbik yang lebih tinggi membawa kepada nisbah degradasi yang lebih tinggi.5-Asid Caffeovlquinic dan kuersetin-3-rutinoside memerlukan faktor tambahan suhu dan masa, serta interaksi dalam campuran, untuk aktiviti pemangkin besi berfungsi. Quercetin-3-rutinoside, dengan kehadiran besi, hanya berkurangan dalam campuran binari dengan asid askorbik selepas pemprosesan haba. Ini mungkin disebabkan oleh fakta bahawa flavonoid bertindak sebagai antioksidan utama dan kemudian radikal sebatian yang terhasil bertindak balas dengan asid askorbik, menjana semula sebatian asal [18]. 5-Asid kafeoilkuinik nampaknya istimewa, kerana ia melindungi quercetin-3-rutinoside, manakala asid askorbik tidak dapat melindungi quercetin-3-rutinoside. Oleh itu, 5-asid kafeoilkuinik mungkin merupakan molekul utama untuk menstabilkan sistem dalam kombinasi dengan pemprosesan besi dan haba. Hipotesis 5-asid caffeoylquinic ini sebagai molekul penstabil telah disahkan selanjutnya dalam campuran ternary. Di sini, quercetin-3-rutinoside sentiasa distabilkan oleh 5-asid caffeoylquinic, supaya walaupun dengan kehadiran asid askorbik tiada pengurangan dalam kepekatan rutinoside-3-kuersetin diperhatikan. Dalam kajian lain, 5-asid caffeoylquinic menunjukkan sifat perlindungan terhadap degradasi antosianin melalui mekanisme co-pigmentasi [40]. Produk degradasi baru, dengan AOA yang mungkin lebih tinggi, muncul daripada ketiga-tiga bahan dengan kehadiran besi. Asid kafeik (puncak 6) telah dikenal pasti sebagai 5-produk pecahan asid kafeoilkuinik (data tidak ditunjukkan). Ini membawa kepada andaian bahawa bahan lain mungkin asid kuinik atau salah satu daripada sembilan kemungkinan terbitan yang diterangkan oleh Dawidowicz dan Typek [24]: asid kuinik;(1S,3R,4R,5R)-5-[{{24 }}(3,4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoyl]-1,4,5-trihydroxy-cyclohexane carboxylic acid;(1S3R,4R,5R)-5- [3-(3,4-dihydroxyphenyl)-3-hydroxypropanoyl]-1,4,5 trihydroxycyclohex-anecarboxylic acid; trans 3-asid O-kafeoilkuinik; trans 5-asid O-kafeoilkuinik; trans 4-asid O-kafeoilkuinik; asid kafeik; cis-5-asid O-caffeoylquinic;4,5-asid dicaffeoylquinic. Untuk quercetin-3-rutinoside, produk degradasi muncul dalam kromatogram, yang tidak dapat dikenal pasti.

3.4. Keupayaan untuk Membentuk Chelates dengan Ferric (Fe3 plus ) dan Ferrous Iron (Fe2 plus )

Dalam semua sampel yang mengandungi asid askorbik, besi ferik telah dikurangkan kepada besi ferus. Dalam proses ini,asid askorbikmengambil elektron daripada besi ferik dan mengurangkannya kepada besi ferus, dan menjadi radikal itu sendiri. Radikal yang tidak stabil bertukar dengan cepat kepada asid dehidroaskorbik dan produk degradasi selanjutnya [12]. Disebabkan kehilangan hidroksi peroksida, tindak balas kembali kepada besi ferik melalui kitaran Fenton tidak mungkin. Dalam 0 campuran binari masak min, lebih daripada 20 peratus besi terikat dengan kehadiran asid askorbik. Adalah diketahui bahawa asid askorbik membentuk kompleks dengan spesies besi dan ion logam lain melalui pengkelasi melalui nukleus 3-O dan 2-O berikutan anjakan hidrogen daripada 3-OH dan 2- Kumpulan OH [16,17,41. Ia juga boleh membentuk kompleks askorbat besi valens bercampur [42]. Walau bagaimanapun, asid askorbik adalah agen pengkelat yang lemah dan, selepas memasak, hanya kesan besi terikat dikesan dalam sampel tulen dan campuran apabila asid askorbik hadir. Tambahan pula, disebabkan oleh proses memasak, asid askorbik terurai kepada produk degradasi, yang kelihatan tidak dapat kelat dengan besi.

5-Asid kafeoilkuinik ialah reduktor yang agak lemah. Besi ferik telah dikurangkan oleh 5-asid kafeoilkuinik dan dengan memasak berpanjangan, pengurangan meningkat.5-Asid kafeoilkuinik mengelat dengan besi ferik dalam pemindahan cas ligan kepada logam [17].5-Asid kafeoilkuinik membawa satu bahagian pengikat yang mungkin pada struktur 3,4 endiol asid kafeik. Ini boleh menjadi penunjuk mengapa asid kafeik ialah bahagian bioaktif 5-asid caffeoylquinic, manakala asid kuinik hampir tidak mempunyai AOA [43]. Endiol menghalang pembentukan OH kerana pembentukan kompleks besi[41]dalam nisbah satu kepada satu [44,45]. Lamy et al.[46]menyimpulkan bahawa 5-asid kafeoilkuinik membentuk kompleks monomerik, manakala Kiss et al. [47] menemui spesies oligomerik. Bertentangan dengan kajian terdahulu [17,48], hanya kesan besi terikat ditemui dengan kehadiran 5-pemprosesan sebelum dan selepas terma asid caffeoylquinic. Ini boleh dijelaskan oleh keadaan pH neutral dalam kajian ini, manakala kajian lain bekerja dalam medium berasid, berdasarkan nilai pH daripada 1-2.5dalam perut manusia [48]. Mendakan hitam ditemui dalam sampel yang disimpan selepas beberapa jam, yang merupakan penunjuk 5-kompleks besi asid-ferrik kafeoilikkuinik. Sampel campuran baru-baru ini digunakan untuk analisis, jadi pembentukan kompleks ini pada pH neutral memerlukan tempoh masa yang lebih lama. Kompleks besi dengan asid kafeik menunjukkan sedikit aktiviti penghapusan [49]. Tambahan pula, tiada bukti spektrofotometri untuk tindak balas antara asid kuinik dan besi ferik [48]. Bertentangan dengan 5-asid caffeoylquinic, dalam sampel rutinoside-3-kuersetin, besi terikat ditemui, walaupun selepas pemprosesan terma.

Quercetin-3-rutinoside mengurangkan besi ferik kepada besi ferus dengan peningkatan minimum dengan masa memasak yang berpanjangan. Aktiviti pengurangan sederhana kuersetin-3-rutinoside ini sebelum ini diterangkan oleh Mira et al. [50]. Aktiviti penurunan ferik kuersetin-3-rutinoside telah dikesan dalam 3-rutinoside, 5,7,3',4'-OH [50]. Interaksi sederhana dengan besi ferik boleh dijelaskan oleh bilangan kumpulan -OH yang lebih rendah, yang mengakibatkan ketumpatan cas negatif yang lebih rendah pada bahagian chelation [50]. Flavonoid boleh kelat dengan ion logam pada tiga bahagian koordinasi yang berpotensi:(i)antara 5-hidroksi dan 4-kumpulan karbonil, (ii) antara 3-hidroksi dan 4-kumpulan karbonil, dan (ii) antara 3', kumpulan A'-hidroksi dalam Bring [39]. Quercetin-3-rutinoside menggunakan sisi pengikat (i) dan (i)[9], dan pada 3-kumpulan hidroksi, rutinoside dilampirkan. Data spektrum malah menunjukkan bahawa ion logam hanya terikat pada kumpulan 3', A'-hidroksi [18]. Chelates lebih berkesan dengan besi dalam bentuk bivalennya [50]. Dalam campuran binari, quercetin-3-rutinoside tidak dapat membentuk kompleks apabila asid askorbik hadir, sebaliknya dalam campuran terner. Jika 5-asid kafeoilkuinik hadir, sejumlah kecil besi terikat ditemui. Ini menunjukkan bahawa 5-caffeoylquinic melindungi quercetin-3-molekul rutinoside dengan kehadiran asid askorbik, jadi quercetin-3-rutinoside boleh membentuk kompleks dengan besi.

4. Bahan dan Kaedah

4.1.Bahan kimia

ABTS(2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)(≥98%)was obtained from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), DPPH*(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical (95%) and Trolox(97%)were obtained from Thermo Fisher (Kandel, Germany). Folin-Ciocalteu phenol reagent was purchased from Merck(Darmstadt, Germany). HPLC grade methanol, acetonitrile(HPLC grade), glacial acetic acid (100%, p.a.), sodium acetate trihydrate (≥99.5% p.a.), potassium thiocyanate (≥98.5%, p.a., ACS),2,2'-dipyridyl (≥95%), hydrochloric acid (≥25%, p.a., ISO), gallic acid monohydrate (≥99%), potassium persulfate (≥99%), rutin trihydrate (working standard), chlorogenic acid (working standard), L-(+)-ascorbic acid (working standard), sodium carbonate(>99 peratus ), ferik ammonium sulfat dodecahydrate, dan ferus ammonium sulfat hexahydrate telah dibeli daripada Carl Roth (Karlsruhe, Jerman).

4.2.Sampel

Larutan akueus dan campuran piawaian tulen asid askorbik, {{0}}asid caffeoylquinic dan quercetin-3-rutinoside telah disediakan sebagai larutan tulen dan campuran dalam nisbah yang berbeza. Semua campuran binari yang mungkin dibuat dalam nisbah ekuimolar, dan nisbah bukan ekuimolar dengan satu kompaun digandakan. Campuran ternary juga disediakan dalam nisbah ekuimolar, dan juga dalam nisbah bukan ekuimolar dengan satu atau dua sebatian digandakan, masing-masing. Kepekatan akhir antioksidan ialah 0.3 mM untuk setiap larutan ujian. Selain itu, semua eksperimen diulang selepas penambahan 0.3 mM besi({{10}}.15 mM ferus ferum dan 0.15 mM ferum ferum) dalam jumlah setiap campuran. Jumlah antioksidan dan zat besi yang dipilih tidak berdasarkan tahap fisiologi atau makanan, ia berdasarkan jisim molar untuk mengkaji kesan interaksi molekul. Akibatnya, nisbah equimolar antara jumlah antioksidan dan besi telah ditubuhkan. Semua campuran dimasak selama 0, 10, 20, dan 40 minit dalam air mendidih, dan selepas itu disejukkan di atas ais untuk menghentikan proses pemanasan. Ini dilakukan untuk tiga replika bebas.

4.3.Ukuran Fotometrik

Antioksidan(tulen atau bercampur) tanpa ketiadaan dan kehadiran besi diukur untuk jumlah aktiviti pengurangan dan aktiviti antioksidannya dalam tiga replika teknikal bebas menggunakan kaedah pemprosesan tinggi dalam 96-plat telaga (SynergyTM HTX Multi-Mode Microplate Reader, Instrumen BioTek, Winooski, VT, Amerika Syarikat). Ujian ujian yang berbeza digunakan, kerana mekanisme tindak balas yang berbeza: pemindahan elektron tunggal (SET) dan pemindahan atom hidrogen (HAT). Walaupun ujian TEAC dan TPC adalah berdasarkan SET [17,18], untuk ujian ujian DPPH, literatur tidak begitu jelas jika ia berdasarkan SET, HAT, atau gabungan kedua-dua mekanisme ini [{{6} }]. Kajian terbaru oleh Foti[51] mendapati bahawa fenol boleh bertindak balas dengan DPPH melalui pemindahan elektron kehilangan proton berurutan (SPLET), gabungan kedua-dua mekanisme. Faktor, seperti kekutuban sederhana dan potensi pengionan, mempengaruhi mekanisme utama.

4.3.1. Jumlah Kandungan Fenolik (TPC)

Jumlah kandungan fenol(TPC) ditentukan menggunakan kaedah Folin-Ciocalteu dalam 96-plat perigi, yang sebelum ini diterangkan oleh Bobo-Garcia et al.[52] dengan beberapa pengubahsuaian.

Briefly, 10 μL Folin-Ciocalteu reagents were mixed with a 50 μL sample, and afterward 100 μL Na, CO3 was added. The 96-well plate was incubated at 37 °C（±0.2°C） and with constant orbital shaking at a moderate speed (237 CPM, 4 mm) for 14 min. After a 1 min resting period, the absorbance was measured at 736 nm. Results were expressed as gallic acid equivalents (mg GAE/ mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 5.97 to 59.7 ug gallic acid/mL(R~>0.99). Nama biasa ujian ini mengelirukan kerana reagen Folin-Ciocalteu juga bertindak balas terhadap bukan fenolik, seperti vitamin dan mineral [22]. Ia menerangkan dengan lebih baik "aktiviti pengurangan jumlah" sebatian bioaktif.

4.3.2. Kapasiti Antioksidan Setara Trolox (TEAC)

Aktiviti antioksidan ditentukan menggunakan ujian TEAC dalam 96-plat perigi dengan beberapa pengubahsuaian. Larutan stok dengan 9.6 mg ABTS dan 1.66 mg kalium persulfat diisi dengan H2O hingga 25 mL telah disediakan dan diinkubasi dalam gelap pada suhu bilik selama 12-16 h. Daripada larutan stok ini, penyelesaian kerja TEAC, yang mengandungi larutan stok 5mL yang diisi sehingga 25 mL dengan 100 peratus MeOH, telah disediakan.

Briefly, 10 μL of the sample was mixed with 150 μL of the TEAC working solution. After a 5 min incubation, the plate was shaken orbitally at a moderate speed for 1 min, followed by a 1 min resting period. The absorbance was measured at a wavelength of 734 nm. The TEAC was expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R->0.98).

4.3.3. DPPH*Penyelidikan Radikal

Theantioksidanactivity was determined using the modified DPPHmethod for 96-well plates. A DPPHworking solution with 7.88 mg DPPH filled up to 100 mL was prepared. Briefly, 20 μL of the sample was mixed with 180 ul of the DPPH working solution and incubated in the dark for 28 min at room temperature. After 1 min orbital shaking at a moderate speed and a 1 min resting time, the absorbance was measured at a wavelength of 515 nm. Results were expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R2>0.98).

4.4. Sinergisme dan Antagonisme

Untuk analisis kesan sinergistik dan antagonis aktiviti antioksidan, perbandingan keputusan yang diperoleh secara eksperimen dengan nilai teori yang dikira dengan jumlah kesan komponen individu pada kepekatan yang sepadan telah dibuat [53]. Sinergisme menerangkan interaksi dua atau lebih bahan supaya tindakan gabungan lebih besar daripada jumlah setiap bertindak secara berasingan. Bertentangan dengan ini, antagonisme adalah fenomena di mana interaksi dua atau lebih bahan dalam kombinasi mempunyai kesan keseluruhan yang kurang daripada jumlah kesan individu mereka.

4.5.Penentuan Besi Ionik

The colorimetric determination of ferrous and ferric iron was modified according to Niedzielski et al. 【54】 for 96-well plates. Briefly, for ferrous iron detection, 20 μL acetate buffer(90 g sodium acetate trihydrate and 48 g acetic acid glacial filled up to 200 mL)and 20 μL 2,2'dipyridyl （0.5%, m/m） and, for ferric iron detection, 20 μL hydrochloric acid （2 M） and 20 μL potassium thiocyanate （5%, m/m）were pipetted into a 200 μL sample in the 96-well plate, incubated there for 10 min at room temperature, and the absorbance was measured for ferrous iron at520nm and for ferric iron at 470nm. Results were expressed in mM ionic iron/mM total iron, using a standard curve ranging for ferrous iron from 0.024-0.214mM(R'>0.99) and for ferric iron from0.005-0.178 mM(R->0.99). Perbezaan antara jumlah besi dan besi ionik, hasil tambah besi ferus dan ferik, ialah besi terikat.

4.6.HPLC-DAD

Untuk mengukur asid askorbik antioksidan, 5-asid caffeoylquinic, dan quercetin-3-rutinoside dan produk degradasinya dalam ekstrak yang sama yang digunakan untuk fotometrik

measurements, a Shimadzu Prominence 20 high-performance liquid chromatography (HPLC) system equipped with a refrigerated SIL-20AC HT autosampler, CTO-10AS VP column oven, DGU-20A5 degasser, LC-20 AT liquid chromatograph quaternary pump, and an SPD-M20A diode array detector (DAD) was used. As a column for separation, a Supelco Ascentis⑧Express an F5 column (150× 3.0 mm, 5 um)equipped with a Supelco Guard column （5×3.0 mm, 5 μm） and a 0.2 micron SST Frit for UltraLite was used. The column temperature was set to 30°C. UV detection was at 245 nm for ascorbic acid, 320 nm for 5-caffeoylquinic, and 360 nm for quercetin-3-rutinoside. The mobile phase consisted of Eluent A (1% acetic acid (v/o), pH 2.5) and Eluent B(100% ACN). The separation was achieved using the following gradient program: 0-2.5 min.5% B:2.5-15 min.5-20%B:15-20 min,20%B;20-22.5 min, 20-5%B;22.5-30 min,5%B.The flow rate was 0.3 mL/min, and the sample injection volume was 30 μL. Standard calibration curves for the three substances 5-caffeoylquinic （0.5-0.15 μM; R2>0.99）, ascorbic acid （0.35-0.025 uM; R2>0.99）, and quercetin-3-rutinoside（0.35-0.025 μM; R2>0.99） telah disediakan. Sebatian terbitan telah dikenal pasti secara tentatif dengan menganalisis piawaian tulen dengan kehadiran dan ketiadaan pemprosesan pra dan pasca terma besi. Oleh itu, puncak baharu mesti diperoleh daripada piawai sisipan. Tambahan pula, campuran terpilih diukur melalui HPLC-MS untuk mengesahkan struktur yang dicadangkan.

4.7. Analisis statistik

Microsoft Excel 2016(Microsoft, Redmond, USA) dan R Statistics (versi 3.6.3, Hold-ing the Windsock, 2020) telah digunakan untuk ujian biostatistik dan mempersembahkan serta melukis keputusan data. Statistik inferensi untuk menilai dan menghubungkan rawatan telah dijalankan dengan menggunakan analisis varians tiga hala (ANOVA), ujian HSD Tukey post hoc, dan korelasi Pearson. Pakej R yang digunakan ialah ggplot2 [55], bermakna [56], dan multcomp [57].

5. Kesimpulan

Berdasarkan penemuan yang diterangkan di atas, AOA bagi asid askorbik, 5-asid caffeoylquinic dan quercetin-3-rutinoside telah dipengaruhi oleh struktur molekul, kepekatan, nisbah dan interaksi dengan antioksidan dan besi lain. Interaksi nampaknya memainkan peranan terutamanya dalam AOA apabila menggabungkan asid askorbik dan 5-asid caffeoylquinic. Di sini, kesan sinergistik dan antagonis dikesan. Suhu mempunyai pengaruh yang minimum pada AOA, manakala pada masa yang sama suhu mempengaruhi kestabilan semua antioksidan dalam campuran tertentu, terutamanya dengan kehadiran besi. Hanya kepekatan asid askorbik berkurangan jika tiada besi dengan masa memasak yang berpanjangan dan 5-kepekatan asid caffeoylquinic berkurangan hanya dengan kehadiran besi, manakala kepekatan quercetin-3-rutinoside berkurangan hanya dalam kombinasi dengan asid askorbik dalam kehadiran besi. Dalam kombinasi dengan besi, 5-asid caffeoylquinic dapat melindungi molekul lain daripada berkurangan kepekatannya melalui pemprosesan terma.

Dalam tumbuhan, gabungan asid askorbik, 5-asid caffeoylquinic dan quercetin-3-rutinoside bukan sahaja mungkin tetapi biasa. Oleh itu, keputusan ini memberi pengetahuan asas tentang proses yang berlaku semasa memasak sayur-sayuran. Matriks makanan adalah lebih kompleks dan mengandungi sebatian bioaktif yang tidak terkira banyaknya, termasuk enzim, mineral lain, atau asid, yang mengubah keadaan tindak balas atau merupakan bahan tindak balas itu sendiri. Interaksi kompleks tersebut jauh di luar skop kajian ini dan kepekatan dan interaksi yang bermanfaatantioksidandalam sayur masak perlu ditangani pada masa hadapan.

Rujukan

1. Mellor, DD; Naumovski, N. Kesan Koko dalam Diabetes: Potensi Pankreas dan Hati sebagai Organ Sasaran Utama, Lebih daripada Kesan Antioksidan? Int. J. Sains Makanan. Technol. 2016, 51, 829–841. [CrossRef]

2. Crozier, A.; Jaganath, IB; Clifford, MN Fenol, Polifenol dan Tannin: Gambaran Keseluruhan. Metabolit Menengah Dalam Tumbuhan: Kejadian, Struktur dan Peranan dalam Diet Manusia; Crozier, A., Clifford, MN, Ashihara, H., Eds.; Blackwell Publishing: Hoboken, NJ, USA, 2006; ms 1–24. ISBN 1-4051-2509-8.

3. Miller, D. Logam Peralihan sebagai Pemangkin Tindak balas "Pengoksidaan". Radic Percuma. biol. Med. 1990, 8, 95–108. [CrossRef]

4. Buchner, N.; Krumbein, A.; Rohn, S.; Kroh, LW Kesan Pemprosesan Terma pada Flavonol Rutin dan Quercetin. Komuniti Cepat. Spektrom Jisim. 2006, 20, 3229–3235. [CrossRef]

5. Layrisse, M.; García-Casal, MN; Solano, L.; Barón, MA; Arguello, F.; Llovera, D.; Ramírez, J.; Leets, I.; Tropper, E. Ketersediaan Bio Besi dalam Manusia daripada Sarapan Diperkaya dengan Iron Bis-Glycine Chelate, Phytates dan Polifenol. J. Nutr. 2000, 130, 2195–2199. [CrossRef] [PubMed]

6. Hurrell, RF; Reddy, M.; Cook, JD Perencatan Penyerapan Besi Bukan Haem dalam Manusia oleh Minuman Yang Mengandungi Polifenol. Br. J. Nutr. 1999, 81, 289–295. [CrossRef] [PubMed]

7. Kostyuk, VA; Potapovich, Kesan Antiradikal dan Kelat AI dalam Perlindungan Flavonoid terhadap Kecederaan Sel Berpunca Silika. Gerbang. Biokim. Biophys. 1998, 355, 43–48. [CrossRef] [PubMed]

8. Kejík, Z.; Kaplánek, R.; Masaˇrík, M.; Babula, P.; Matkowski, A.; Filipenský, P.; Veselá, K.; Gburek, J.; Sýkora, D.; Martásek, P.; et al. Kompleks Besi Flavonoid-Kapasiti Antioksidan dan Selain itu. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 646. [CrossRef]

9. Latos-Brozio, M.; Masek, A. Analisis Hubungan Struktur-Aktiviti Polifenol Monomer dan Polimer (Quercetin, Rutin dan Catechin) Diperolehi Melalui Pelbagai Kaedah Pempolimeran. Kimia. Penyelam biologi. 2019, 16, e1900426. [CrossRef] [PubMed]

10. Gullón, B.; Lú-Chau, TA; Moreira, MT; Lema, JM; Eibes, G. Rutin: Kajian Mengenai Pengekstrakan, Pengenalpastian dan Kaedah Pembersihan, Aktiviti Biologi dan Pendekatan untuk Meningkatkan Ketersediaan Bionya. Trends Food Sci. Technol. 2017, 67, 220–235. [CrossRef]