Tetrandrine Mengurangkan Kecederaan Podocyte Melalui Calpain yang bergantung kepada Kalsium-1 Sekatan Isyarat

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Yin Ding, Xuanli Tang, Yuhui Wang, Dongrong Yu, Caifeng Zhu dan Jin Yu*

Abstrak

latar belakang:Podosit telah menjadi sasaran penting untuk campur tangan dalam proteinurikbuah pinggangpenyakit. Banyak kajian telah melaporkan bahawa ekspresi berlebihan protein saluran kation berpotensi penerima sementara 6 (TRPC6) dalam kecederaan podocyte mengimbangi kemasukan Ca2 campur intrasel dan merangsang isyarat calpain protease bergantung kepada Ca2-1. Ubat tradisional Cina, tetrandrine, penyekat saluran Ca2 ditambah yang tidak selektif, telah lama digunakan untuk merawat penyakit kronik.buah pinggangpenyakit. Penyelidikan ini bertujuan untuk meneroka kemungkinan mekanisme yang mendasari sifat anti-proteinurik tetrandrin.

Kaedah:Kami menyiasat penglibatan tetrandrine dalam isyarat Ca2 ditambah calpain{1}} bergantungan dalam podosit tetikus dan tikus nefropati yang disebabkan oleh adriamycin. Cyclosporine A (CsA) dan U73122 digunakan sebagai kawalan positif. Daya maju sel, sitotoksisiti, kepekatan Ca2 tambah, aktiviti calpain dan tahap ekspresi mRNA dan protein bagi laluan isyarat calpain-1 telah diperiksa. Perubahan klinikal dan patologi diukur.

Keputusan:Tetrandrine mengurangkan kemasukan Ca2 dan intraselular dalam TRPC{1}}podosit yang terlalu mengekspresikan. Dalam kedua-dua kajian in vitro dan in vivo, pentadbiran tetrandrine merendahkan aktiviti calpain dan ekspresi calpain-1 dan memulihkan ekspresi Talin hiliran-1 dan nephrin. Berbanding dengan CsA, rawatan tetrandrine mempamerkan kesan perencatan yang unggul pada aktiviti calpain dan ekspresi calpain-1.

Kesimpulan:Tetrandrine mempunyai potensi terapeutik dalam kerosakan podosit dengan menyekat pengaktifan bergantung kepada Ca2 bagi laluan isyarat calpain-1. Tetrandrine mengurangkan proteinuria, meningkatkan fungsi buah pinggang, dan mengurangkan kerosakan patologi buah pinggang.

Kata kunci:Tetrandrine, Kecederaan Podocyte, Protein saluran kation berpotensi reseptor sementara 6, Calpain-1

Cistanche tubulosa mencegah penyakit buah pinggang, klik di sini untuk mendapatkan sampel

Latar belakang

Podosit adalah prasyarat untuk mengekalkan kebolehtelapan terpilih penghalang penapisan glomerular dan integriti struktur glomerular. Kecederaan podocyte biasanya dikaitkan dengan penyakit buah pinggang proteinurik, termasuk glomerulosklerosis segmental fokus (FSGS), nefropati membran, penyakit perubahan minimum dan diabetes.buah pinggangpenyakit [1–4]. Perlindungan dan pemulihan podosit daripada faktor yang mencederakan merupakan cabaran utama dalam kejayaan rawatan penyakit buah pinggang.

Podosit adalah sel yang sangat khusus, dibezakan secara terminal yang terletak di luar membran bawah tanah glomerular dan dicirikan oleh proses kaki. Disfungsi peraturan isyarat kalsium dalam podosit membawa kepada kekacauan sitoskeletal aktin podosit, kerosakan proses kaki, gangguan diafragma celah, dan proteinuria. Protein saluran kation berpotensi penerima sementara 6 (TRPC6), protein berkaitan diafragma celah novel dalam podosit, telah dikenal pasti sebagai saluran ion pengalir Ca2 tambah yang tidak spesifik [5-8]. Ekspresi TRPC6 glomerular meningkat dalam banyak penyakit proteinurik keturunan dan diperolehi. Kajian terdahulu telah melaporkan bahawa mengekspresikan TRPC6 secara berlebihan dalam podosit mencetuskan peningkatan unggul Ca2 ditambah kemasukan intrasel, yang dipercayai bertanggungjawab untuk kecederaan sel podocyte. Peningkatan beban kalsium dalam podosit mengaktifkan laluan isyarat hiliran, termasuk calpain-1, Talin-1, nefrin dan calcineurin, untuk memodulasi aktiviti atau ekspresi gen sasaran [9–12]. Fangji Huangqi Tang ialah ubat tradisional Cina (TCM) klasik untuk rawatan sindrom nefrotik [13]. Ia terdiri daripada enam herba: Radix Stephania Tetrandra (akar Stephania tetrandra), Radix Astragali (akar Astragalus membranaceus), Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (akar Atractylodes macrocephaly), Radix Glycyrrhizae (akar Glycyrrhiza uralensis), Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (akar Zingiber Officinale) dan Fructus Ziziphi Jujubae (Fructus of Ziziphus jujuba) [1]. Tetrandrine, salah satu komponen aktif utama Radix Stephania Tetrandra, penyekat saluran Ca2 plus yang tidak selektif, telah diuji dalam ujian klinikal dan telah ditunjukkan untuk mengurangkan proteinuria dan meningkatkan fungsi buah pinggang [14, 15]. Kajian terdahulu menunjukkan kesan menyekat tetrandrine pada isyarat RhoA yang bergantung kepada Ca2 dalam podosit [16], tetapi mekanisme asas tidak dijelaskan. Di sini, model TRPC6-berekspresi berlebihan telah dibangunkan secara in vitro dan in vivo. Selepas pemberian tetrandrine, perubahan dalam isyarat TRPC6-yang bergantung kepada Ca2 tambah telah dinilai, termasuk sasaran hiliran, calpain-1, Talin-1, nefrin dan calcineurin. Cyclosporine A (CsA), perencat calcineurin, digunakan secara meluas dalam rawatan penyakit proteinuria) [17] dan U73122, perencat pembukaan saluran TRPC6 [18] digunakan sebagai kawalan positif.

Kaedah

Kultur sel dan pembinaan plasmid

Sel barisan sel podocyte tikus (MPC5) yang diabadikan secara bersyarat, yang diperoleh daripada Profesor Peter Mundel (Sekolah Perubatan Gunung Sinai, Amerika Syarikat), dikekalkan pada 33 darjah untuk percambahan, dan kemudian beralih kepada 37 darjah untuk pembezaan. Plasmid ekspresi TRPC6 telah dibina dengan mengklonkan panjang penuh jujukan DNA pengekodan gen TRPC6 ke dalam tapak EcoRI/BamHI bagi vektor pCDH-GFP-PURO dan dibungkus ke dalam lentivirus. Apabila dibezakan dan dibesarkan kepada kira-kira 80 peratus pertemuan, podosit telah disemai pada ketumpatan sel 4× 104 per cm2 dan diinkubasi dalam kombinasi dengan TRPC{11}}lentivirus yang mengekspresikan berlebihan. Talian sel stabil TRPC6, yang disahkan menggunakan protein TRPC6 dan ekspresi mRNA, telah digunakan untuk eksperimen selanjutnya. Tus, podosit MPC5 dibahagikan kepada tiga kumpulan, kumpulan kawalan normal (NC), kumpulan lentivirus kosong (Lv-NC) dan kumpulan TRPC6-terlebih menyatakan (OverTRP).

Rawatan ubat sel in vitro dan ujian sitotoksisiti

Daya maju sel telah diakses menggunakan kit Pengiraan Sel{{0}} (CCK-8) ujian, mengikut arahan pengilang. Sebanyak 5000 podosit MPC5 setiap telaga telah ditanam dalam tiga kali ganda dalam 96-plat perigi. Sel telah dirawat dengan satu siri CsA (0-2μmol / L; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Syarikat) dan tetrandrine (0-40μmol / L; Sigma Aldrich) pada 37 darjah selama 48 jam. CCK-8 kemudiannya ditambahkan ke dalam plat (10μL/telaga), yang kemudiannya diinkubasi dalam gelap selama 2 jam. Penyerapan pada 450nm diukur menggunakan pembaca plat mikro (Instrumen BioTek, Amerika Syarikat). Sitotoksisiti diuji dengan mengukur, pelepasan laktat dehidrogenase (LDH) menggunakan Kit Ujian LDH Sitotoksisiti-WST (Dojindo Laboratories, Jepun). Sebagai kawalan positif, sel telah dirawat dengan 10μmol/LU73122 (Cal biochem, USA) pada 37 darjah selama 10 minit.

Pengekstrakan RNA dan tindak balas rantai transkripase-polimerase terbalik kuantitatif (qRT‑PCR)

Jumlah RNA disediakan daripada sel berbudaya danbuah pinggangtisu menggunakan reagen RNAiso Plus (Takara, Jepun) dan ditranskripsikan terbalik ke dalam kit Campuran Induk PrimeScript™ RT cDNA (Takara) mengikut protokol pengeluar. qRT-PCR dilakukan menggunakan Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Jerman). Urutan primer gen sasaran dan rujukan disenaraikan dalam Jadual Tambahan S1. Data dikumpul menggunakan sistem PCR Masa Nyata ABI Prism 7900HT FAST. Kuantifikasi relatif ekspresi gen sasaran telah dinormalisasi menggunakan kaedah perbandingan 2-ΔΔCt. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) telah digunakan sebagai kawalan dalaman.

Western blotting

jumlah sampel protein telah diekstrak daripada sel kultur danbuah pinggangtisu. Kepekatan protein ditentukan menggunakan kit ujian protein BCA (Thermo Fisher Scientific). Sampel diasingkan pada gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida 10 peratus dan dipindahkan ke membran polivinilidena difluorida. Membran kemudiannya disekat semalaman pada 4 darjah dengan antibodi primer, iaitu anti-TRPC6 (Santa Cruz, Amerika Syarikat), anti-kal sakit-1 (Abcam, UK), anti-Talin-1 (Abcam) , anti-nephrin (Santa Cruz), dan anti-calcineurin (Abcam). Selepas mencuci, membran diinkubasi dengan IgG antiarnab kambing (H plus L; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Amerika Syarikat). Membran juga diproses untuk mengesan GAPDH (Abcam) untuk pemuatan yang sama. Band yang diiktiraf oleh antibodi utama telah divisualisasikan, dan ketumpatan optik jalur protein dianalisis menggunakan perisian TanonImage (Tanon, China).

Penentuan sitosolik Ca2 plus dalam podosit podosit MPC5 berbudaya telah disemai dan dirawat dengan tetrandrine, CsA, dan U73122 untuk 48j, 48j, dan 10min, masing-masing. Podosit kemudian diinkubasi dengan RPMI-1640 ditambah dengan 10μM Fluo-3AM (Dojindo Laboratories) selama 30 minit dalam gelap. Selepas itu, mereka segera dibasuh dengan garam penimbal fosfat, di mana ia dikekalkan dan teruja pada 488nm. Kepekatan relatif ion Ca2 plus sitosolik dinilai dengan mengukur keamatan pendarfluor menggunakan sistem pengimejan confocal laser Zeiss (Zeiss, USA).

Pengukuran aktiviti calpain

Aktiviti Calpain ditentukan menggunakan Kit Ujian Aktiviti Calpain daripada Abcam Inc., mengikut protokol pengeluar. Supernatan (150 uL) podosit ataubuah pinggangtisu diambil dalam larutan penimbal yang sesuai (145mmol/L Nacl, 100mmol/L Tris-HCL, pH7.3) dan 0.15mLN-Succinyl-Leu-Tyr-AMC (500 umol/L). Selepas pengeraman 1-j pada 37 darjah dalam gelap, sampel dibaca menggunakan fluorometer yang dilengkapi dengan penapis pengujaan 360nm dan penapis pelepasan 440nm.

Model tikus Adriamycin-induced nephropathy (ADRN) Berdasarkan anggaran Fermi saiz sampel [19] dan perbezaan proteinuria antara kumpulan kawalan dan model dalam eksperimen awal kami, jumlah bilangan tikus yang diperlukan dalam kajian kami telah ditentukan. Sebanyak 56 ekor tikus Sprague–Dawley jantan yang sihat, seberat kira-kira 200g dan berumur kira-kira 8 minggu (Zhejiang Institute of TCM), dibahagikan secara rawak kepada tujuh kumpulan (n =8 tikus/kumpulan), iaitu kumpulan ADR, ADR plus kumpulan dos rendah tetrandrine (4mg/kg/d), kumpulan dos pertengahan ADR campur tetrandrine (8mg/kg/d), kumpulan dos tinggi ADR ditambah tetrandrine (16mg/kg/d), kumpulan terawat ADR ditambah CsA (30mg /kg/d), ADR ditambah dos pertengahan tetrandrine (8mg/ kg/d) dalam kombinasi dengan kumpulan CsA (30mg/kg/d) dan kumpulan NC. Tikus dalam kumpulan model dan kumpulan rawatan dadah telah dibius dengan suntikan intraperitoneal ketamin hidroklorida (50mg/kg), dan dua dos ADR (4mg/kg) telah disuntik ke dalam urat ekor untuk membangunkan model tikus FSGS. Selepas 12 minggu, sampel air kencing tikus dikumpul selama 24 jam menggunakan sangkar metabolik, diikuti dengan pengumpulan darah dan penuaianbuah pinggang. Keberkesanan klinikal telah diperhatikan dan perubahan dalam 24-h protein air kencing, albumin plasma, kreatinin serum (Scr) dan paras nitrogen urin darah (BUN) diukur menggunakan kit diagnostik yang tersedia secara komersial dengan penganalisis kimia automatik (HITACHI 7180). ).

Semua prosedur eksperimen yang melibatkan penggunaan haiwan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Eksperimen Haiwan di Zhejiang Institute of TCM (Tianmushan Road No.132) dan telah dilaksanakan dengan ketat mengikut prinsip yang digariskan dalam Panduan NIH untuk Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal. .

Pewarnaan histologi, mikroskop elektron, dan analisis

Tikusbuah pinggangtelah ditetapkan dalam paraformaldehid, dehidrasi menggunakan siri etanol berperingkat, dan tertanam dalam parafin. Bahagian (tebal 5-μm) telah diwarnakan dengan hematoxylin dan eosin (H&E) dan trichrome Masson dan diperiksa di bawah mikroskop optik. Buah pinggang telah disapu dan dibetulkan dengan glutaraldehid dan kemudian dipotong menjadi 1-blok tisu mm3 untuk dibenamkan epoksi. Mikroskopi elektron dilakukan menggunakan prosedur standard. Lima ultra-mikrograf diperolehi secara rawak daripada setiap spesimen. Kadar gabungan proses kaki podocyte (PFR) dikira menggunakan formula berikut: PFR ( peratus )=∑LFP / ∑LBM×100 peratus , dengan ∑LFP ialah jumlah panjang proses kaki bercantum dan ∑LBM ialah jumlah panjang membran bawah tanah kapilari periferi (BM).

Analisis statistik

Data dinyatakan sebagai min±ralat standard pengukuran dan dianalisis menggunakan SPSS 20.0 (IBM Statistics SPSS, US) dan GraphPad Prism 6 untuk Windows (GraphPad Software Inc., USA). Taburan normal dinilai oleh plot qq dan ujian SW. Data menunjukkan taburan normal. Apabila dua kumpulan data dibandingkan, ujian-t sampel bebas digunakan. Perbezaan antara tiga atau lebih kumpulan bebas dibandingkan menggunakan analisis varians sehala diikuti dengan ujian post hoc Tukey. Kepentingan statistik ditetapkan pada p<>

Keputusan

Pemilihan kepekatan optimum dan sitotoksisiti tetrandrin, CsA, dan U73122

Ujian CCK{{0}} digunakan untuk mengesan daya maju sel. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1a dan b, kepekatan maksimum 10μmol/L tetrandrin dan 0.1μmol/L CsA tidak menjejaskan daya maju podosit MPC5. Ujian pelepasan LDH seterusnya mengesahkan bahawa 10μmol/L tetrandrine dan 0.1μmol/L CsA selama 48j tidak menunjukkan ketoksikan, manakala 10μmol/LU73122 selama 10min menunjukkan ketoksikan yang dijangkakan (Rajah 1c). Oleh itu, eksperimen sel seterusnya menggunakan tetrandrine dan CsA pada 10μmol/L dan 0.1μmol/L, masing-masing.

Tetrandrine menurunkan Ca2 intraselular ditambah kemasukan dalam sel MPC5 berbudaya yang mengekspresikan TRPC6 secara berlebihan

Menggunakan pemindahan plasmid, model sel overexpression TRPC6 dalam podosit MPC5 berjaya ditubuhkan. qRT-PCR dan analisis western blot menunjukkan bahawa tahap ekspresi TRPC6 dalam kumpulan Over-TRP meningkat dengan ketara berbanding dengan kumpulan NC dan Lv-NC (p<0.05; fig.="" 2a="" and="" b).="" and="" full-length="" gel="" and="" blot="" of="" trpc6="" were="" included="" in="" supplementary="" fig.="">

Pengimejan pendarfluor (Rajah 2c) dan analisis separa kuantitatif (Rajah 2d) menunjukkan bahawa ekspresi berlebihan TRPC6 meningkatkan kemasukan Ca2 intraselular ditambah, sedangkan tiada perbezaan yang jelas antara kumpulan NC dan Lv-NC. Sepuluh sel kumpulan OverTRP kemudiannya dirawat dengan ubat eksperimen. Kumpulan prarawatan ubat (tetrandrine, CsA, dan U73122) mempunyai kesan perencatan pada kemasukan Ca2 campur intraselular (P<0.05), while="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" among="" the="" three="" groups="" of="">

Kesan tetrandrine pada aktiviti dan ekspresi calpain‑1, calcineurin, Talin‑1, dan nefrin dalam sel MPC5

Telah ditunjukkan bahawa Ca2 plus intraselular mengaktifkan calpain, protease sistein yang bergantung kepada Ca2, dan calcineurin, fosfatase protein yang bergantung kepada Ca2/calmodulin. Selaras dengan pemerhatian sebelumnya, tahap aktiviti dan ekspresi calpain dan calcineurin dalam kumpulan Over TRP semuanya lebih tinggi daripada kumpulan NC dan Lv-NC (p<0.05; fig.="" 3a-e,="" h="" and="" i).="" drop="" intervention="" in="" cultured="" trpc6-overexpressing="" podocytes="" established="" that="" tetrandrine="" inhibited="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" expression.="" te="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" mrna="" levels="" were="" significantly="" reduced="" in="" the="" tetrandrine-exposed="" group="" than="" in="" the="" csa="" intervention="" group=""><0.05; fig.="" 3a="" and="" d).="" western="" blotting="" results="" demonstrated="" a="" considerable="" decrease="" in="" calpain-1="" protein="" levels="" because="" of="" tetrandrine=""><0.05; fig.="" 3c="" and="" h).="" in="" addition,="" calcineurin="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05; fig.="" 3b)="" after="" tetrandrine="" exposure,="" but="" the="" mrna="" and="" protein="" expression="" levels="" of="" calcineurin="" remain="" unchanged="" (fig.="" 3e="" and="" i).="" treatment="" with="" csa="" did="" not="" block="" calpain="" activation="" (fig.="" 3a),="" and="" the="" effect="" was="" not="" as="" robust="" as="" that="" of="" tetrandrine="" in="" calpain-1="" mrna="" expression=""><0.05; fig.="" 3d).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 3b,="" e="" and="">

The podocyte cytoskeleton-associated anchoring protein Talin-1 and the slit diaphragm protein nephrin are two specific targets of calpain-1. When treated with tetrandrine, there was an increasing trend in mRNA and protein expression of Talin-1 (p >0.05) dan nephrin (hlm<0.05), compared="" with="" that="" in="" the="" overtrp="" group,="" but="" this="" finding="" was="" not="" statistically="" significant="" among="" the="" three="" treatment="" groups="" (p="">0.05; Rajah 3f, g, j, dan k).

Gel dan tompok penuh telah dimasukkan ke dalam Rajah Tambahan S1.

Percubaan in vivo menggunakan model tikus ADRN Untuk mencirikan tindak balas terhadap perencatan pengantara tetrandrin bagi isyarat TRPC6/calpain-1 dalam vivo, model ADRN telah dibangunkan dalam tikus. Profil ekspresi mRNA dan protein TRPC6 meningkat dengan ketara dalam kumpulan ADRN berbanding dengan tikus yang diberi makan biasa (kumpulan NC; p<0.05; fig.="" 4a="" and="" b).="" consistent="" with="" the="" above="" studies="" in="" cell-based="" models,="" the="" activity="" and="" expression="" levels="" of="" calpain="" and="" calcineurin="" increased="" remarkably="" in="" the="" adrn="" group=""><0.05; fig.="" 4c-g,="" j,="" and="" k)="" than="" in="" the="" nc="">

Rawatan dengan CsA tidak menyekat pengaktifan calpain yang disebabkan oleh ekspresi berlebihan TRPC6 (Rajah 4c), dan kesannya tidak seteguh tetrandrine pada ekspresi protein sakit kal-1 (p<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="" k).="" the="" tetrandrine="" group="" was="" down="" compared="" to="" the="" adr="" group="" (fig.="">

Rawatan dengan CsA tidak menyekat pengaktifan calpain yang disebabkan oleh ekspresi berlebihan TRPC6 (Rajah 4c), dan kesannya tidak seteguh tetrandrine pada ekspresi protein calpain-1 (p<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="">

Tambahan pula, ungkapan Talin-1 dan nefrin telah dinilai (Rajah 4h, i, l, dan m). Kedua-dua tahap Talin-1 dan nephrin telah dikurangkan dalam tikus ADRN berbanding dengan kumpulan NC (p<0.05). upon="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" mrna="" levels="" and="" protein="" expression="" of="" talin-1="" and="" nephrin="" were="" visibly="" increased.="" the="" high-dose="" group="" of="" tetrandrine="" recovered="" the="" expression="" of="" the="" two="" structural="" components,="" similar="" to="" the="" adr+csa="" group="" (p="">0.05).

Gel dan bintik penuh telah dimasukkan dalam Rajah Tambahan S2.

Tetrandrine menyekat perkembangan ADRN dan menyelamatkan histopatologi Te kesan tetrandrine padabuah pinggangfungsi dalam tikus Sprague-Dawley yang dirawat dengan ADRN kemudiannya dinilai (Rajah 5a-d). Tiada perbezaan ketara awal dalam 24-h proteinuria, Scr dan tahap BUN dalam kalangan kumpulan. Dua belas minggu kemudian, tahap 24h-proteinuria, Scr, dan BUN dalam kumpulan ADRN meningkat secara statistik, manakala albumin plasma berkurangan dengan ketara, berbanding dengan kumpulan NC (P<0.05). after="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" levels="" of="" proteinuria,="" scr,="" and="" bun="" were="" markedly="" decreased,="" whereas="" the="" level="" of="" albumin="" was="" significantly="" improved="" compared="" to="" those="" in="" the="" adr="" group=""><0.05). among="" the="" three="" dose-response="" subgroups="" of="" tetrandrine,="" a="" significant="" difference="" was="" observed:="" the="" middle="" dose="" demonstrated="" considerably="" better="" efficacy="" than="" the="" other="" two="" doses=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" levels="" of="" serum="" alanine="" aminotransferase,="" before="" and="" after="" treatment="" among="" groups="" (p="">0.05; data tidak ditunjukkan).

Perubahan dalam histomorfologi ditunjukkan dalam Rajah 6. Dalam tikus ADRN, pewarnaan H&E dan Masson menunjukkan FSGS, fibrosis tubulointerstitial, dan penyusupan sel radang interstisial buah pinggang. Di samping itu, pengimejan mikroskop elektron glomeruli mendedahkan proses kaki podosit yang sangat terhapus, digemukkan, dan bercantum dengan 80-100 peratus podosit PFR. Tikus dalam subkumpulan tetrandrine (kumpulan dos pertengahan dan dos tinggi) menunjukkan lesi yang lebih sedikit daripada kumpulan ADR dengan pelbagai tahap, dan peningkatan dalam kumpulan dos tinggi mengatasi kumpulan dos pertengahan. Dalam kumpulan yang dirawat tetrandrine dos rendah, pertengahan dan tinggi, PFR podosit adalah 70 –80 peratus, 50 –60 peratus, dan 30 –40 peratus, masing-masing. Data ini menunjukkan bahawa tetrandrine dilindungi daripada kerosakan struktur glomeruli buah pinggang yang disebabkan oleh pentadbiran ADR. Tiada perbezaan ketara dalam perubahan patologi di bawah mikroskop cahaya di kalangan kumpulan (tetrandrin dos tinggi, CsA, dan tetrandrine dalam kombinasi dengan CsA). Di samping itu, PFR podocyte dalam kumpulan ADRN yang dirawat CsA adalah sama seperti dalam kumpulan yang dirawat tetrandrine dos tinggi.

Perbincangan

Podosit telah menjadi semakin penting sebagai sasaran untuk campur tangan dalam FSGS dan penyakit nefrotik yang berkaitan [20, 21]. Di sini, berdasarkan data in vitro dan in vivo, ia adalah

menunjukkan bahawa perlindungan podosit dan kesan antiproteinurik tetrandrine, penyekat saluran Ca2 tambah yang tidak selektif, telah dimediasi melalui perencatan kemasukan Ca2 campur intrasel dan calpain bergantung kepada Ca2-1 lata isyarat, termasuk Talin-1 , nefrin, dan kalsineurin. Tetrandrine lebih berkesan daripada menghalang perencatan calpain-1.

Menurut penemuan sebelumnya, podocyte TRPC6 adalah saluran yang menyumbang terutamanya kepada perubahan dalam kemasukan Ca2 ditambah di bawah keadaan normal dan patologi [7, 22]. Adalah diketahui secara meluas bahawa aktiviti calpain bergantung pada tahap kalsium dan dikaitkan denganbuah pinggangkecederaan, terutamanya kecederaan BM anti-glomerular buah pinggang [10, 23]. Antara 15 isoform calpain yang dikenal pasti, calpain-1 baru-baru ini telah ditunjukkan untuk menghubungkan aktiviti TRPC6 dengan kecederaan podosit [24]. Calpain-1 dilaporkan akan membelah protein penambat yang berkaitan dengan sitoskeleton podocyte Talin-1 dan protein diafragma celah, nefrin, yang mengganggu integriti podosit dan mendorong proteinuria yang teruk [8–12, 16]. Calcineurin ialah fosfatase bergantung kepada Ca2 ditambah yang sebelum ini telah ditunjukkan untuk memainkan peranan dalam podosit danbuah pinggangfungsi. Bukti terkumpul semakin menunjukkan bahawa calpain boleh membelah dan mengaktifkan calcineurin dengan cara proteolitik [25, 26]. Kajian ini mencipta model overexpression TRPC6 oleh jangkitan virus dalam podosit berbudaya dan suntikan adriamycin dalam tikus SD. Selaras dengan itu, kami menunjukkan bahawa TRPC6-mengantarai kemasukan Ca2 ditambah mengaktifkan aktiviti calpain dan ungkapan calpain-1 ahli keluarga calpain. Peningkatan calpain-1 kemudiannya membelah Talin hiliran-1 dan nefrin.

Tetrandrine ialah alkaloid yang diekstrak daripada tumbuhan perubatan tradisional China dan merupakan penyekat saluran Ca2 tambah yang tidak selektif. Di sini, ditegaskan semula bahawa tetrandrine menghalang ekspresi berlebihan TRPC6 dan mengurangkan kemasukan Ca2 plus dalam kedua-dua sel dan tikus yang mengekspresikan TRPC6, seperti yang didokumenkan sebelum ini [16]. Lebih penting lagi, kajian ini memberi tumpuan kepada kesan campur tangan tetrandrine pada laluan isyarat hiliran yang bergantung kepada kalsium. Telah diperhatikan bahawa, tidak seperti CsA, tetrandrine mengurangkan aktiviti protease neutral (calpain) yang diaktifkan kalsium. Tambahan pula, tetrandrine mengurangkan ekspresi keluarga protease diaktifkan kalsium, calpain-1 dan memulihkan ekspresi Talin{10}} dan nefrin yang tidak dikawal. Berbanding dengan CsA, pentadbiran tetrandrine mempamerkan kesan yang lebih baik pada penyahaktifan calpain dan ekspresi calpain yang dikurangkan{11}}. Keputusan ini menunjukkan bahawa tetrandrine mempunyai potensi terapeutik dalam kerosakan podosit dengan menyekat{12}}pengaktifan TRPC yang bergantung kepada laluan isyarat calpain-1.

Phospholipase C (PLC) telah dikenal pasti sebagai rakan kongsi6-TRPC [27]. U73122 menghalang PLC supaya kurang diasilgliserol dihasilkan dan pembukaan saluran TRPC6 dikurangkan [18, 24]. Oleh itu, U73122 digunakan secara selari sebagai kawalan positif, dan ia menunjukkan kesan ketara dalam mengurangkan kemasukan Ca2 campur intrasel, menghalang aktiviti calpain dan ekspresi calpain-1 dalam podosit yang mengekspresikan TRPC6 secara berlebihan. Walau bagaimanapun, ujian sitotoksisiti in vitro menunjukkan ketoksikan podosit yang jelas.

Dalam kajian ini, selepas 12 minggu suntikan ADR, proteinuria yang serius, hipoalbuminemia dan tahap BUN dan Scr yang tinggi telah terbukti dalam tikus yang dirawat--ADR. Mikroskopi cahaya mendedahkan FSGS, fibrosis tubulointerstitial, dan penyusupan sel radang interstisial buah pinggang dalam tikus ADRN. Mikroskopi elektron menunjukkan penyingkiran proses kaki yang meluas. Data in vivo selanjutnya menunjukkan bahawa terapi tetrandrine boleh mengurangkan proteinuria, meningkatkan fungsi buah pinggang, dan melemahkan perkembangan glomerulosklerosis. Selepas rawatan tetrandrine, perubahan patologi di bawah mikroskop cahaya dan mikroskop elektron, 24-h proteinuria, plasma albumin, Scr, dan BUN dalam tikus ADRN telah bertambah baik dengan ketara berbanding dengan kumpulan NC.

Inhibitor calcineurin, CsA, telah lama digunakan untuk merawat proteinurikbuah pinggangpenyakit [28]. Calcineurin secara klinikal penting sebagai sasaran langsung ubat imunosupresif CsA [17, 29]. CSA mengurangkan ekspresi calcineurin dan mengurangkan faktor nuklear pengantara calcineurin bagi sel T yang diaktifkan [30-32]. Bukti terkini menyokong kesan penstabilan CsA pada sitoskeleton aktin podocyte, seperti synaptopodin dengan menyekat defosforilasi pengantara calcineurin daripada synaptopodin [17]. Ia juga telah ditunjukkan bahawa calpain boleh membelah dan mengaktifkan calcineurin dengan cara proteolitik [25, 26]. Data daripada kajian ini mengesahkan bahawa CsA menghalang aktiviti dan ekspresi kalsineurin lebih kuat daripada tetrandrine. Seperti yang dilaporkan sebelum ini, CsA nampaknya tidak menjejaskan aktiviti calpain secara langsung.

Batasan utama kajian adalah kegagalan untuk menunjukkan kesan bergantung kepada dos di kalangan subkumpulan tetrandrine (kumpulan dos rendah, dos pertengahan dan dos tinggi). Satu penjelasan yang mungkin ialah julat dos yang kami gunakan terlalu tinggi untuk tikus. Di samping itu, perbezaan individu dalam eksperimen haiwan mungkin jauh lebih besar daripada perbezaan dos. Saiz sampel yang agak kecil mungkin mengurangkan kuasa statistik. Oleh itu, kajian lanjut termasuk dos yang lebih kecil dan saiz sampel yang sesuai diperlukan untuk memastikan julat dos yang tepat dan kesan tetrandrine dalam tikus ARDN.

Ringkasnya, dalam pengawalan laluan isyarat kalsium, tetrandrine mempamerkan kesan perencatan yang jelas pada calpain-1, manakala CsA secara langsung mempengaruhi perencatan kalsineurin. Penemuan ini menunjukkan bahawa rawatan gabungan tetrandrine dan CsA boleh menjejaskan pelbagai sasaran rangkaian isyarat kalsium untuk meningkatkan hasil klinikal. Kajian pengesahan adalah perlu untuk mengesahkan pemerhatian ini serta untuk menjelaskan mekanisme kesan sinergi.

Singkatan

FSGS: Sklerosis glomerular segmental fokus; MCD: Penyakit perubahan minimum; MN: Nefropati membran; DKD: Diabetesbuah pinggangpenyakit; TRPC6: Protein saluran kation berpotensi reseptor sementara 6; Ca2 tambah : Kalsium; TCM: Perubatan tradisional Cina klasik; Tet: Tetrandrine; CsA: Siklosporin A; Scr: kreatinin serum; BUN: Nitrogen air kencing darah; PFR: Memproses kadar gabungan; BM: Membran bawah tanah; ADRN: Nefropati yang disebabkan oleh Adriamycin; PLC: Phospholipase C.

Rujuknces

1. Garg P. Kajian semula biologi podocyte. Am J Nephrol. 2018;47(Bekalan 1):3–13.

2. Khalilpourfarshbaf M, Hajiaghaalipour F, Selvarajan KK, et al. Terapi berasaskan sel stem mesenchymal terhadap kerosakan podosit dalam nefropati diabetik. Tisu Eng Regen Med. 2017;14:201–10.

3. Nagata M. Podocyte kecederaan dan akibatnya. Buah Pinggang Int. 2016;89:1221–30.

4. Pavenstädt H, Kriz W, Kretzler M. Biologi sel podosit glomerular. Physiol Rev. 2003;83:253–307.

5. Riehle M, Büscher AK, Gohlke BO, et al. Mutasi kehilangan fungsi TRPC6 G757D dikaitkan dengan FSGS. J Am Soc Nephrol. 2016;27:2771–83.

6. Ilatovskaya DV, Blass G, Palygin O, et al. Laluan NOX4/TRPC6 dalam peraturan kalsium podosit dan kerosakan buah pinggang dalam penyakit buah pinggang diabetes. J Am Soc Nephrol. 2018;29:1917–27.

7. Reiser J, Polu KR, Möller CC, et al. TRPC6 ialah saluran berkaitan diafragma celah glomerular yang diperlukan untuk fungsi buah pinggang yang normal. Nat Genet. 2005;37:739–44.

8. Huang H, You Y, Lin X, et al. Perencatan laluan isyarat TRPC6 mengurangkan kecederaan podosit yang disebabkan oleh TGF- 1. Biokim Fisiol Sel. 2017;41:163–72.

9. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M, et al. Protease yang bergantung kepada kalsium Calpain-1 memautkan aktiviti TRPC6 kepada kecederaan podosit. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–109.

10. Peltier J, Bellocq A, Perez J, et al. Pengaktifan dan rembesan Calpain menggalakkan kecederaan glomerular dalam glomerulonephritis eksperimen: bukti daripada tikus calpastatin-transgenik. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–23.

11. Tian X, Kim JJ, Monkley SM, et al. Talin1 yang berkaitan dengan podocyte adalah penting untuk penyelenggaraan penghalang penapisan glomerular. J Clin Investig. 2014;124:1098–113.

12. Jiang L, Ding J, Tsai H, et al. Lebih mengekspresikan saluran kation potensi reseptor sementara 6 dalam podosit mendorong penyusunan semula sitoskeleton melalui peningkatan Ca2 plus intraselular dan pengaktifan RhoA. Exp Biol Med (Maywood). 2011;236:184–93.

13. Liu X, Zhou QG, Zhu XC, et al. Penyaringan untuk komponen aktif berpotensi Fangji Huangqi tang pada rawatan sindrom nefrotik dengan menggunakan metabolomik bersepadu berdasarkan "korelasi antara profil kimia dan metabolik". Pharmacol Depan. 2019;10:1261.

14. Liu KC, Lin YJ, Hsiao YT, et al. Tetrandrine mendorong apoptosis dalam karsinoma nasofaring manusia NPC-TW 039 sel oleh tekanan retikulum endoplasma dan laluan Ca2 plus / Calpain. Antikanser Res. 2017;37:6107–18.

15. Wang YJ, He LQ, Sun W, et al. Projek pengoptimuman perubatan tradisional Cina dalam merawat penyakit buah pinggang kronik peringkat 3: percubaan terkawal rawak dua buta berbilang pusat. J Ethnopharmacol. 2012;139:757–64.

16. Yu J, Zhu C, Yin J, et al. Tetrandrine menyekat potensi reseptor sementara protein Saluran Kation 6 lebihan ekspresi- disebabkan kerosakan podosit melalui sekatan isyarat RhoA/ROCK1. Dadah Des Devel Ther. 2020;14:361–70.