Quercetin Menyekat Pengeluaran Sitokin Radang dalam Sinoviosit seperti Fibroblast Arthritis Rheumatoid

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

Abstrak.Rheumatoid arthritis (RA) adalah penyakit autoimun kronik, progresif dan sistemik yang dicirikan terutamanya oleh sinovitis multijoint simetri. Quercetin mempunyai aktiviti anti-radang, anti-pengoksidaan, dan pengawalan imun, dan oleh itu menunjukkan nilai perubatan yang tinggi. Kajian ini bertujuan untuk melihat kesan quercetin pada sinoviosit seperti fibroblast (FLS) dalam RA. Sinoviosit seperti fibroblast artritis reumatoid (RAFLS) telah dirawat terlebih dahulu dengan 50 nmol/l kuersetin selama 2 jam dan kemudian dirangsang menggunakan TNF-a selama 24 jam untuk eksperimen seterusnya. RAFLS telah ditransfeksi dengan transkrip spesifik interfering pendek (si)-X-tidak aktif (XIST), microRNA (miR)-485mimic,miR-485inhibitor, atau si-PSMB8 atau gabungan.ELISA, PCR dan western blotting telah digunakan untuk menilai kesan quercetin pada RAFLS yang dirawat dengan TNF -a. Telah didedahkan bahawa quercetin menghalang pengeluaran sitokin radang dan ekspresi XIST dalam RAFLS yang disebabkan oleh TNF-a. Analisis bioinformatik menunjukkan bahawa XIST bertindak sebagai span untuk miR-485 dan jenis subunit proteasome-8 (PSMB8) ialah sasaran langsung miR-485. Selain itu, PSMB8 berfungsi sebagai penindas dalam pengeluaran sitokin radang RAFLS yang disebabkan oleh TNF-a. Secara keseluruhannya, quercetin diperhatikan untuk menghalang pengeluaran sitokin radang dan ekspresi XIST dalam RAFLS yang disebabkan oleh TNF-a. Selain itu, pendiaman XIST boleh menyekat tindak balas keradangan dengan memanjatkan miR-485 dalam sel yang dirawat dengan TNF-a. Secara keseluruhannya, quercetin boleh menyekat perkembangan RA in vitro.

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

pengenalan

Rheumatoid arthritis (RA) adalah penyakit radang biasa yang dicirikan oleh penyusupan sel radang yang membawa kepada degenerasi sinovium, rawan artikular, dan tulang (1). Kejadian dan perkembangan RA melibatkan pembebasan sejumlah besar keradangansitokindan mediator, yang menyebabkan kemusnahan tidak dapat dipulihkan rawan dan tulang dalam sendi (2). Dengan peningkatan populasi yang semakin tua dalam masyarakat manusia, kejadian RA telah menunjukkan trend yang meningkat di negara maju dari tahun 1995 hingga 2001 (3,4). Pada masa ini, rawatan RA bergantung kepada ubat anti-radang bukan steroid, glukokortikoid, methotrexate, dan kaedah simptomatik lain untuk mengawal penyakit. Ubat-ubatan ini boleh memperbaiki gejala RA, tetapi penggunaan jangka panjang mempunyai kesan sampingan toksik yang kuat, seperti menghalang fungsi imun badan (5). Oleh itu, mencari ubat yang selamat dan berkesan untuk rawatan RA adalah sangat penting.

Quercetin adalah bioflavonoid yang paling penting dalam diet manusia dan banyak ditemui dalam bunga, daun, dan buah tumbuhan (6,7). Quercetin mempunyai aktiviti anti-radang, anti-pengoksidaan, dan pengawalan imun (8,9), dan oleh itu menunjukkan nilai perubatan yang tinggi. Kajian klinikal telah menunjukkan bahawa quercetin mempunyai kesan yang baik untuk melegakan osteoartritis lutut, serta sendi reumatoid dan sakit badan selepas bersenam (10-12). Sinoviosit seperti fibroblast (FLS) ialah sel-sel efektor utama dan boleh melepaskan pelbagai sitokin radang, memburukkan lagi perkembangan RA (13,14). Selain itu, TNF-a boleh menggalakkan pengaktifan dan penyerapan tulang osteoklas, dan boleh mendorong ekspresi faktor keradangan lain, molekul lekatan, dan protease yang berkaitan dengan tulang dan rawan; dengan itu, menyebabkan penebalan lapisan lapisan sinovial dan memburukkan lagi tindak balas keradangan sendi (15). Oleh itu, kajian ini bertujuan untuk melihat kesan kuersetin pada FLS dalam RA dan meneroka kemungkinan mekanismequercetindalam rawatan RA.

Bahan dan kaedah

Kultur sel. RAFLS sel primer diperolehi daripada The Cell Bank of the Type Culture Collection of The Chinese Academy of Sciences (cat. no.408-05a). Semua sel dikekalkan dalam DMEM (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) yang mengandungi 10 peratus FBS (HyClone; Cytiva) 100 U/ml penisilin dan 100 ug/ml streptomycin dalam inkubator pada 37 darjah . Selepas pengkulturan selama 24 jam, RAFLS telah diprarawat dengan 50 nmol/l quercetin (MilliporeSigma) selama 2 jam pada 37 darjah dan kemudian dirangsang menggunakan 50 ng/ml TNF-a selama 24 jam pada 37 darjah untuk eksperimen berikut.

Cistanche boleh meningkatkan imuniti

Pemindahan sel. RNA gangguan kecil (si) yang menyasarkan XIST (si-XIST; kepekatan akhir, 20 nM) dan kawalan negatifnya (NC) siRNA (kepekatan akhir, 20 nM), miR-485perencat(kepekatan akhir, 30nM) dan kawalan perencat hancur (miR-NC; kepekatan akhir, 30 nM) dan miR-485 meniru (kepekatan akhir,15 nM) dan kawalan mimik hancur (mimik miR-NC; kepekatan akhir,15 nM) diperolehi dari Shanghai GenePharma Co.,Ltd. Sebanyak lx10 darjah RAFLS disalutkan ke dalam plat enam telaga selama 12j, kemudian binaan itu dipindahkan ke dalam RAFLS dengan mencampurkan dengan reagen Lipofectamine*2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) pada 37 darjah selama 15 minit mengikut arahan pengilang . Sebanyak 24-72 jam selepas pemindahan, sel yang ditransfeksi telah dikumpulkan untuk percubaan seterusnya. Urutan molekul yang ditransfeksi adalah seperti berikut:si-XIST, 5'-GCAAAUGAAAGCUACCAAU-3'; si-NC, 5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3'; perencat miR-485, 5'-UCACGCGGAGCCGAACGAACAA-3'; anti-miR-NC, 5'-CAGUACUUUUUGUGUAGUACAAA-3';miR-485 mimik, 5'-GUCAUACACGGCUCUCCUCUCUCU-3'; miR-NC, 5'-UUC UCCGAACGUGUUCACGUTT-3!

Ujian imunosorben berkaitan enzim (ELISA). Kepekatan sitokin keradangan dalam RAFLS yang ditransfeksi dan tidak ditransfeksi (IL-1 , IL-6 dan IL-8) ditentukan menggunakan kit ELISA (cat. nos. KE00021, KE00139 dan KE00006; Proteintech Group, Inc.) mengikut protokol pengeluar. Pembaca plat mikro digunakan untuk membaca penyerapan pada 450 nm.

Analisis PCR transkripsi-kuantitatif(RT-q) terbalik. Jumlah RNA selular telah diekstrak daripada RAFLS yang ditransfeksi dan tidak ditransfeksi menggunakan reagen TRIzol" (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Sintesis cDNA dilakukan menggunakan Maxima Probe qPCR Master Mix (Fermentas; Thermo Fisher Scientific, Inc.) mengikut arahan pengilang. Analisis kuantitatif ekspresi XIST dan PSMB8 dilakukan menggunakan reagen SYBROPremix Ex Taqm (Takara Bio, Inc.) dan GAPDH digunakan sebagai kawalan endogen. Keadaan termocycling adalah seperti berikut: 94 darjah selama 3min; 40 kitaran 94 darjah untuk 30 saat, 55 darjah selama 30 saat dan 72 darjah selama 1 minit; dan 72 darjah selama 10 minit. Tahap ekspresi miR-485 dianalisis menggunakan kit SYBRO PrimeScript"M miRNA RT-PCR (Takara Biotechnology Co., Ltd. ) dan RNA nuklear kecil U6 digunakan sebagai rujukan dalaman. Keadaan termocycling adalah seperti berikut: Pendenaturan pada 95 darjah selama 10 saat; 40 kitaran 95 darjah selama 5 saat dan 60 darjah selama 20 saat; diikuti dengan analisis lengkung disosiasi pada 95 darjah selama 60 saat, 55 darjah selama 30 saat, dan 95 darjah selama 30 saat. Primer telah dibeli daripada Sangon Biotech Co., Ltd., dan urutan primer adalah seperti berikut: GAPDH Forward, 5-CTTGGTATCGTGGA AGGACTC-3' dan terbalik, 5'-GTAGAGCAGGGATGATGATG TTCT-3'; U6 ke hadapan, 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTA AAAT-3' dan undur, 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTC AT-3'; IncRNA XIST ke hadapan, 5'-AATGGAACGGCTGA GTTTTAC-3' dan ke belakang, 5'-TCATCCGCTTGCGTTCAT AG-3'; miR-485 ke hadapan, 5'-CAGAGCTGGCCGTGAT-3 dan ke belakang, 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGTCCCGAGGTA TTCGCACTGGATACGACGAATTC-3'; PSMB8 ke hadapan, 5'-GCTGCCTTCAACATAACATCA-3' dan ke belakang, 5'-CTG CCACCACCACCATTA-3! Ungkapan relatif telah dianalisis menggunakan 2-AACq(16).

Western blotting. Jumlah protein telah diasingkan daripada RAFLS menggunakan penimbal lisis RIPA pra-sejuk (Institut Bioteknologi Beyotime) termasuk perencat protease. Jumlah protein dikira menggunakan kit ujian protein BCA (Pierce; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Sebanyak 30 sampel protein ug setiap lorong dipisahkan oleh 10 peratus SDS-PAGE dan seterusnya dipindahkan ke membran nitroselulosa (MilliporeSigma). Membran telah disekat dengan 5 peratus susu bukan lemak pada suhu bilik selama 1 jam. Selepas itu, membran diinkubasi semalaman pada 4 darjah dengan antibodi utama disasarkan terhadap PSMB8(1:1,000; cat. no. abl80606) dan GAPDH (1:1,000; cat.no. abl81602)(semua daripada Abcam). Membran telah diinkubasi dengan antibodi sekunder IgG anti-arnab berlabel lobak pedas (1:1,000;sc-2027; Santa Cruz Biotechnology, Inc.) pada suhu bilik selama 1 jam. Jalur protein divisualisasikan menggunakan kit pengesanan ECL (Pierce; Thermo Fisher Scientific, Inc.) dan dianalisis dengan perisian Quantity One v4.6.2 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). GAPDH digunakan sebagai kawalan pemuatan.

Ujian wartawan Luciferase. Serpihan XIST dan kawasan PSMB8 3'-tidak diterjemahkan yang mengandungi tapak pengikat jenis liar (WT) atau mutan (MUT)miR-485 diperoleh daripada Shanghai GenePharma Co., Ltd. Mereka telah diklon ke kelip-kelip vektor wartawan gen luciferase pmiRGLO(Promega Corporation). Plasmid telah disintesis oleh Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. Kemudian 48 jam selepas pemindahan menggunakan reagen LipofectamineD 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) pada 37 darjah dengan 5 peratus CO, ujian luciferase dilakukan menggunakan kit sistem ujian wartawan dwi-luciferase (Promega Corporation ) mengikut arahan pengilang. Aktiviti luciferase dianalisis menggunakan pembaca multimode tiub tunggal Modulus (Promega Corporation) berbanding dengan aktiviti Renilla luciferase. Urutan berikut telah digunakan: XIST-WT Hadapan, 5'-CGCCAGCTTCGACAATTCGAC-3 dan songsang, 5'-ACT TGAAGCGGCCATACGTTGACAA-3';XIST-MUT hadapan, 5'-TCAAAACCCAACTAGAGGACGATTTGTGA{{20} ', dan sebaliknya, 5'-AACCCAGAAAACCGTACGGCAATCGT-3';

PSMB8-WT ke hadapan, 5'-CCGCTAAGTCCGAGTAGTCA-3' dan ke belakang, 5'-ATAAGAATGCGGCCGAATTCATGG GAA-3'; dan PSMB8-MUT ke hadapan, 5-TTAGGACACGCA TCGGATTACGCTATTAT-3', dan ke belakang, 5'-GACACCTGT TTACGGCTACCCGCAAATATGCCAA-3'.

Analisis bioinformatik. Tapak pengikat antara miR{{0}} dan XIST, serta miR-485 dan PSMB8, telah diramalkan oleh StarBase v2.0 (http://www.microrna.gr/lncBase) atau Perisian TargetScan v7.1 (http://www.targetscan.org/vert_71/), masing-masing.

Analisis statistik. Semua data yang diukur dinyatakan sebagai min± sisihan piawai. Perbezaan dikira dengan ujian t Pelajar berpasangan untuk perbandingan antara dua kumpulan atau ANOVA sehala diikuti oleh ujian post hoc Dunnett atau Tukey untuk pelbagai perbandingan. Semua analisis statistik telah dilakukan menggunakan GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc.) dan SPSS 14.0 (SPSS, Inc.).P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="" difference.="" experiments="" were="" repeated="" three="">

Keputusan

Quercetin menghalang pengeluaran sitokin radang dan ekspresi XIST dalam RAFLS yang disebabkan oleh TNF-a. Di bawah rangsangan TNF-a, kepekatan sitokin radang (IL-1 , IL-6, dan IL-8) dan tahap ekspresi XIST dikawal dengan ketara dalam RAFLS berbanding dengan yang terdapat dalam NC(Rajah IA dan B). Walau bagaimanapun, rawatan dengan kuersetin boleh menyekat promosi TNF-a dengan ketara dalam pengeluaran sitokin radang, dan tahap ekspresi XIST telah menurun dengan ketara dalam FLS (Rajah IA dan B). Keputusan ini menunjukkan bahawa quercetin boleh menyekat tindak balas keradangan dalam RAFLS yang disebabkan oleh TNF-a.

XIST bertindak sebagai span untuk miR{{0}}. Selepas itu, mekanisme molekul yang berpotensi telah diterokai dan kemungkinan sasaran XIST telah diramalkan menggunakan pangkalan data StarBase v2.0.

Analisis bioinformatik menunjukkan bahawa miR-485 mempunyai tapak pengikatan yang berpotensi dengan jujukan XIST (Gamb.2A). Transfeksi dengan mimik miR-485 telah ditunjukkan untuk mengawal selia ekspresi miR-485 dalam RAFLSs(Rajah 2B). Sementara itu, miR-485 meniru aktiviti luciferase yang ditindas dengan ketara dalam jenis liar XIST berbanding dengan aktiviti luciferase dalam NC(Rajah 2C). TNF-a boleh mengecilkan tahap ekspresi miR-485 dengan ketara dalam RAFLS, yang diselamatkan oleh quercetin (Rajah.2D). XIST kurang dinyatakan dengan ketara dalam RAFLS selepas pemindahan dengan si-XIST (Rajah 2E). Selain itu , penyenyapan XIST dengan ketara menggalakkan ungkapan miR-485, yang telah diterbalikkan oleh perencat miR-485 dalam RAFLSstreated dengan TNF-a(Rajah2F). Keputusan ini menunjukkan bahawa XIST berinteraksi dengan miR-485.

PSMB8 ialah sasaran langsung -485. Menurut analisis TargetScan, tapak pengikat putatif yang sangat konservatif dengan miR-485 telah dikenal pasti di rantau PSMB8 3'-tidak diterjemahkan (Rajah 3A). MiR-485 meniru dengan ketara menindas pendarfluor dalam jenis liar PSMB8 berbanding dengan yang dalam NC (Rajah 3B). TNF-a boleh mengimbangi tahap ekspresi PSMB8in RAFLS dengan ketara, yang diterbalikkan oleh quercetin (Rajah 3C). Perencat miR{13}} boleh menurunkan dengan ketara tahap ekspresi miR-485 dalam RAFLS (Rajah 3D). Selain itu, ekspresi PSMB8 telah berkurangan dengan ketara dalam RAFLS selepas pemindahan dengan si-PSMB8 ( Rajah 3E).miR-485 boleh meningkatkan ekspresi PSMB8 dengan ketara pada tahap mRNA dan protein, yang telah dimansuhkan oleh si-PSMB8 dalam RAFLS yang dirawat dengan TNF-a (Rajah 3F). Keputusan ini menunjukkan bahawa miR-485 menyasarkan PSMB8 secara langsung.

PSMB8 berfungsi sebagai penindas dalam pengeluaran sitokin radang dalam RAFLS yang disebabkan oleh TNF-a. Selepas pemindahan dengan si-PSMB8, kepekatan sitokin radang (IL-1 , IL-6 dan IL-8) telah berkurangan dengan ketara dalam RAFLS yang ditransfeksi yang dirawat dengan TNF-a berbanding dengan yang tidak ditransfeksi. sel yang dirawat dengan TNF-a (Rajah 4A). Tambahan pula, quercetin menindas tindak balas keradangan dalam RAFLS di bawah rangsangan TNF-a, yang

telah diselamatkan melalui pemindahan dengan si-PSMB8 (Rajah 4B). Keputusan ini menunjukkan bahawa PSMB8 boleh menyekat tindak balas keradangan dalam RAFLS yang disebabkan oleh TNF-a.

Perbincangan

Sebagai produk aktif semula jadi daripada tumbuhan, quercetin ialah metabolit sekunder yang diasingkan dan diekstrak daripada tumbuhan Fagaceae oleh kimia perubatan semula jadi (17). Pada tahun-tahun sebelumnya, quercetin telah disahkan untuk menghalang tindak balas keradangan dalam beberapa penyakit, termasuk tumor malignan ( 18), diabetes Mellitus (19), dan aterosklerosis (20). Kajian ini menilai peranan quercetin terhadap perkembangan RA. Adalah dihipotesiskan bahawa sebaik sahaja fibroblas diaktifkan dalam patogenesis RA, satu siri faktor keradangan dan enzim pengurai matriks ekstraselular akan dihasilkan untuk mengantara tindak balas keradangan, menyebabkan kemusnahan progresif tulang dan rawan, dan mempengaruhi kualiti

kehidupan yang teruk (21,22). Kajian ini mendapati bahawa quercetin menindas pengeluaran sitokin radang FLS yang disebabkan oleh TNF-a.

As a class of non-coding transcripts, IncRNAs are >200 nukleotida panjangnya dan mengawal ekspresi gen pada tahap epigenetik, transkripsi dan pasca-transkripsi (23,24).lncRNA XIST pada asalnya dikenal pasti dalam pengawalan ketidakaktifan X dalam sel somatik mamalia betina (25). Penyelidikan terdahulu menunjukkan bahawa ekspresi deregulasi XIST terlibat dalam tindak balas keradangan beberapa penyakit termasuk neuralgia radang dan radang paru-paru akut (26,27). Selaras dengan penyelidikan terdahulu, kajian ini mendapati bahawa tahap ekspresi XIST telah dikawal dalam FLS yang disebabkan oleh TNF-a, yang telah dimansuhkan oleh quercetin. ncRNA boleh mengawal ekspresi gen dengan span miRNA (28). Analisis bioinformatik menunjukkan bahawa miR-485 mempunyai tapak pengikat yang berpotensi dengan jujukan XIST.cistanche deserticola maDi samping itu, tahap ekspresi miR-485 telah dikurangkan dalam FLS yang dirawat dengan TNF-a. Selain itu, pendiaman XIST secara berkesan mempromosikan ekspresi miR-485 dalam sel selepas pemindahan.

miRNA boleh menyasarkan kawasan 3'-tidak diterjemahkan mRNA untuk mengawal ekspresi gen (29).kesan cistancheKajian ini mendedahkan bahawa PSMB8 ialah sasaran langsung miR-485.PSMB8 boleh berfungsi sebagai subunit imunoproteasom untuk mendorong tindak balas keradangan seperti berikut. Yamagishi (30) melaporkan bahawa perencatan khusus PSMB8 boleh mengurangkan rembesan faktor keradangan, sekali gus melambatkan tindak balas keradangan diabetes mellitus. Koerner et al (31) mendedahkan bahawa penglibatan PSMB8 dalam tindak balas keradangan berkait rapat dengan perkembangan kanser kolorektal. Kajian ini mendedahkan bahawa TNF-a boleh mengimbangi tahap ekspresi PSMB8 dengan ketara dalam RAFLS. Tambahan pula, si-PSMB8 boleh menghalang kepekatan sitokin radang dalam RAFLS yang dirawat dengan TNF-a. Di samping itu, quercetin tidak dapat menyekat tindak balas keradangan dalam RAFLS yang dirawat dengan si-PSMB8 di bawah rangsangan TNF-a. Data ini mencadangkan bahawa PSMB8 berfungsi sebagai penindas dalam pengeluaran sitokin radang dalam RAFLS yang disebabkan oleh TNF-a.

Kajian ini mendapati bahawa penindasan pengeluaran sitokin radang oleh kuersetin dalam FLS yang disebabkan oleh TNF-a adalah menjanjikan secara in vitro. Walau bagaimanapun, kesan in vivo dan kesan farmakokinetik dan penembusan membran sinovial pada kuersetin masih belum disiasat. Oleh itu, kajian lanjut dirancang untuk cuba mengkaji kesan quercetin pada RA in vivo.

Kesimpulannya,cistanche deserticolakajian ini memerhatikan pengeluaran sitokin radang dan ekspresi XIST yang dihalang kuersetin dalam RAFLS yang disebabkan oleh TNF-a. Selain itu, pendiaman XIST boleh menyekat tindak balas keradangan dengan memanjatkan miR-485 dalam sel yang dirawat dengan TNF-a. Secara keseluruhannya, quercetin boleh menyekat perkembangan RA in vitro.

Artikel ini dipetik daripada Diterima 17 Jun 2020; Diterima 11 Jun 2021DOI: 10.3892/etm.2021.10695