Bahagian 2|Glikogen Synthase Kinase 3b Hiperaktif dalam Sel Pengelupasan Kencing Meramalkan Perkembangan Penyakit Buah Pinggang Diabetik

Klik di sini untuk bahagian 1

Untuk maklumat lanjut sila hubungi:emily.li@wecistanche.com

PERBINCANGAN

Di Amerika Syarikat dan negara Barat yang lain, DKD kekal sebagai etiologi utama progresifpenyakit buah pinggang yang kronikdan membebankan beban berat ke atas sistem perbendaharaan dan penjagaan kesihatan yang belum ada rawatan muktamad.5 Telah lama diakui bahawa tidak semua pesakit diabetes akan meneruskan untuk membangunkan DN.5 Bergantung pada kohort yang dikaji, telah dianggarkan bahawa DN menghidap w30 peratus hingga 50 peratus pesakit diabetes. Langkah-langkah yang diguna pakai oleh amalan klinikal semasa untuk mengenal pasti pesakit diabetes yang berisiko mendapat DKD sebahagian besarnya terhad kepada pemeriksaan mata untuk retinopati dan urinalisis untuk albuminuria.5 Walau bagaimanapun, bukti epidemiologi yang bertumpu menunjukkan bahawa vaskulopati mikro ekstrarenal atau albuminuria secara ketara tidak serasi dengan perkembangan berikutnya. DKD.12,13,26,27 Oleh itu, terdapat keperluan mendesak untuk membangunkan biomarker baru untuk stratifikasi tepat pesakit diabetes yang berisiko DN. Kajian ini, buat kali pertama, melaporkan bahawa GSK3b terlalu tertekan dan hiperaktif dalam parenkimbuah pinggangsel dalam DN eksperimen dan klinikal, yang dikaitkan denganperkembangan penyakit buah pinggang. Lebih-lebih lagi, hiperaktif GSK3b dalam sel terkelupas kencing berkemungkinan dapat meramalkan perkembangan DN.

Cistanche tubulosa mencegah penyakit buah pinggang, klik di sini untuk mendapatkan sampel

GSK3b, kinase serine/treonine-protein yang sangat konservatif, sensitif redoks, terlibat secara berpusat dalam isyarat insulin serta beberapa laluan isyarat selular lain yang penting untuk proses patofisiologi yang berkaitan denganbuah pinggangkecederaan, pembaikan dan penjanaan semula. Dalam tisu sensitif insulin, seperti hati dan otot rangka, GSK3b aktif di bawah keadaan basal dan menyekat aktiviti glikogen sintase.19,28 Insulin dengan cepat menyahaktifkan GSK3b melalui fosforilasi perencatan pada serin 9, menghasilkan biosintesis glikogen. Bukti yang semakin meningkat menunjukkan bahawa disregulasi GSK3b dikaitkan dengan diabetes mellitus jenis 2.19,29–31 Sesungguhnya, terdapat data yang menunjukkan ekspresi berlebihan dan hiperaktif GSK3b dalam otot pesakit diabetes31–33 dan dalam tisu adipos tikus diabetes obes.34 Selain itu , ekspresi berlebihan transgenik GSK3b dalam otot rangka tikus menyebabkan toleransi glukosa terjejas, rintangan insulin dan hiperinsulinemia.29,35 Sebaliknya, tikus yang kekurangan GSK3b dalam otot rangka menunjukkan toleransi glukosa yang lebih baik.36 Secara konsisten, perencat GSK3, seperti litium, dapat meniru tindakan insulin dalam garisan sel dan tisu.37 Selain itu, dalam tikus diabetes yang obes, perencat GSK3 meningkatkan sensitiviti insulin dan homeostasis glukosa.38buah pinggangsecara tradisinya tidak dianggap sebagai organ sasaran tindakan insulin. Walau bagaimanapun, bukti yang kukuh baru-baru ini mencadangkan bahawa isyarat insulin masukbuah pinggangsel, khususnya dalam podosit, memainkan peranan penting dalam mengekalkan glomerular danbuah pingganghomeostasis.39–41 Isyarat insulin yang rosak dalam podosit, kerana kekurangan atau rintangan insulin, berkemungkinan merupakan pemula penting bagi kebanyakan lesi patologi yang diperhatikan dalam DN. Tambahan pula, kajian klinikal telah menunjukkan bahawa rintangan insulin berkorelasi dengan permulaan dan keterukan albuminuria walaupun pada pesakit normotensif yang tidak menghidap diabetes, menunjukkan bahawa rintangan insulin per se boleh menyebabkan albuminuria.42 Begitu juga, tikus dengan rintangan insulin khusus podocyte, dicapai dengan kalah mati bersyarat bagi reseptor insulin dalam podosit glomerular, mengembangkan albuminuria dan lesi glomerular yang menyusun semula DN, walaupun tiada hiperglisemia atau diabetes.41 Sebaliknya, dalam haiwan diabetes, pemeka insulin mampu memperlahankan perkembangan DN tanpa kawalan glisemik.43 Penemuan ini menunjukkan bahawa isyarat insulin mengawal fungsi podosit bebas daripada tahap glukosa darah. Walau bagaimanapun, sebagai transduser utama laluan isyarat insulin, peranan GSK3b dalam patogenesis dan perkembangan DN telah banyak dikaji.

Di dalambuah pinggang, GSK3b kebanyakannya dinyatakan dalam podosit dan, pada tahap yang lebih rendah, dalam sel mesangial dan endothelial dalam glomerulus20,21 dan secara meluas dinyatakan oleh sel tiub buah pinggang. Terdapat data daripada kumpulan kami dan kumpulan lain yang menunjukkan bahawa GSK3b mengantara kecederaan autonomi podocyte dengan menyepadukan berbilang laluan isyarat topatik podocy.17,20,44,45 Ketidakkonsistenan, sekatan genetik atau farmakologi GSK3b boleh melindungi daripada kecederaan podocyte dan melemahkan proteinuria dalam model haiwan pelbagai glomerulopati bukan diabetes.21 Selain itu, secara progresifkronikbuah pinggangpenyakit, GSK3b didapati sebagai modulator kecederaan tiub renal dan interstisial. Walau bagaimanapun, sama ada dan bagaimana GSK3b terlibat dalam DN tidak pasti dan sangat kontroversi, walaupun kajian ini menunjukkan bahawa pengaktifan GSK3b dipertingkatkan dalambuah pinggangdan dalam sel terkelupas kencing mungkin dikaitkan dengan perkembangan atau perkembangan DKD. Sebagai contoh, dalam tikus dengan diabetes yang disebabkan oleh streptozotocin, Lin et al.46 mendapati bahawa perencatan GSK3b oleh perencat kompetitif adenosin trifosfat (20 Z,30 E)-6- Bromo dalam indirubin-30 -oxime ( BIO) melemahkan proteinuria dan memperbaiki lesi glomerular DN jika tiada pembetulan hiperglikemia, menunjukkan bahawa GSK3b memainkan peranan yang memudaratkan dalam DN. Juga, dalam tikus dengan diabetes yang disebabkan oleh streptozotocin, Paeng et al.22 membuat penemuan yang sama dengan menggunakan BIO dan membuat kesimpulan bahawa aktiviti GSK3b yang dipertingkatkan dalam podosit di bawah keadaan diabetes dikaitkan dengan apoptosis podocyte dan kehilangan dalam DN. Ini adalah selaras dengan satu lagi kajian in vitro, di mana GSK3b didapati menjadi pengantara penyahbezaan podosit dan kecederaan selepas terdedah kepada medium glukosa tinggi.47 Sebaliknya, Mariappan et al.48 mendakwa bahawa pengaktifan GSK3b sebaliknya memperbaiki yang disebabkan oleh diabetes.buah pinggangkecederaan. Dalam kajian mereka, tikus diabetes yang disebabkan oleh streptozotocin telah dirawat dengan natrium nitroprusside, penderma nitrik oksida yang dapat mengaktifkan GSK3b. Mereka mendapati bahawa albuminuria, hipertrofi buah pinggang, dan pengumpulan matriks ekstraselular dalam glomeruli semuanya diperbaiki dengan ketiadaan peningkatan dalam hipertensi atau hiperglikemia. Walau bagaimanapun, penemuan ini sangat bertentangan dengan data daripada tikus knock-in sasaran gen dengan GSK3 yang aktif secara konstitutif yang membangunkan albuminuria spontan dan kecederaan podosit.49 Untuk menyelaraskan penemuan yang bercanggah, berhati-hati harus diambil untuk mentafsir data yang dihasilkan dengan menggunakan perencat atau pengaktif kimia. daripada GSK3b. Walaupun BIO telah berulang kali disahkan sebagai perencat molekul kecil GSK3b yang sangat selektif, natrium nitroprusside bukanlah pengaktif khusus GSK3b tetapi diketahui mempunyai kesan hemodinamik yang kuat,50 yang mungkin mengelirukan tindakan pengurangan albuminuria dan renoprotektifnya dalam tikus kencing manis. Diambil bersama, walaupun terdapat beberapa data yang bercanggah, bukti lazim cenderung menyokong bahawa GSK3b mungkin dikaitkan dengannyabuah pinggangkecederaandan proteinuria dalam DN. Beberapa batasan kajian ini perlu dinyatakan. Pertama, data praklinikal hanya terhad kepada model murine DB/DB. Untuk menentukan kebolehgeneralisasian peranan GSK3b dalamkecederaan buah pinggang kencing manis, adalah perlu untuk mengesahkan penemuan dalam model DN lain, termasuk model DN jenis 1. Kedua, pemerhatian klinikal di sini diperoleh daripada kohort retrospektif pesakit diabetes dengan saiz sampel yang terhad dan masa susulan yang agak singkat. Diakui, kajian berskala besar, prospektif, rawak, berbilang pusat diperlukan untuk mengesahkan pemerhatian kami dan untuk mengesahkan kuasa GSK3b dalam sel terkelupas kencing dalam meramalkan hasil DKD.

GSK3b, kinase serine/treonine-protein yang sangat konservatif, sensitif redoks, terlibat secara berpusat dalam isyarat insulin serta beberapa laluan isyarat selular lain yang penting untuk proses patofisiologi yang berkaitan denganbuah pinggangkecederaan, pembaikan dan penjanaan semula. Dalam tisu sensitif insulin, seperti hati dan otot rangka, GSK3b aktif di bawah keadaan basal dan menyekat aktiviti glikogen sintase.19,28 Insulin dengan cepat menyahaktifkan GSK3b melalui fosforilasi perencatan pada serin 9, menghasilkan biosintesis glikogen. Bukti yang semakin meningkat menunjukkan bahawa disregulasi GSK3b dikaitkan dengan diabetes mellitus jenis 2.19,29–31 Sesungguhnya, terdapat data yang menunjukkan ekspresi berlebihan dan hiperaktif GSK3b dalam otot pesakit diabetes31–33 dan dalam tisu adipos tikus diabetes obes.34 Selain itu , ekspresi berlebihan transgenik GSK3b dalam otot rangka tikus menyebabkan toleransi glukosa terjejas, rintangan insulin dan hiperinsulinemia.29,35 Sebaliknya, tikus yang kekurangan GSK3b dalam otot rangka menunjukkan toleransi glukosa yang lebih baik.36 Secara konsisten, perencat GSK3, seperti litium, dapat meniru insulin

tindakan dalam garisan sel dan tisu.37 Selain itu, dalam tikus diabetes yang obes, perencat GSK3 meningkatkan sensitiviti insulin dan homeostasis glukosa.38 Buah pinggang secara tradisinya tidak dianggap sebagai organ sasaran tindakan insulin. Walau bagaimanapun, bukti yang kukuh baru-baru ini mencadangkan bahawa isyarat insulin dalam sel buah pinggang, khususnya dalam podosit, memainkan peranan penting dalam mengekalkan homeostasis glomerular dan buah pinggang.39–41 Isyarat insulin yang rosak dalam podosit, kerana kekurangan atau rintangan insulin, berkemungkinan merupakan pemula yang penting. untuk banyak lesi patologi yang diperhatikan dalam DN. Tambahan pula, kajian klinikal telah menunjukkan bahawa rintangan insulin berkorelasi dengan permulaan dan keterukan albuminuria walaupun pada pesakit normotensif yang tidak menghidap diabetes, menunjukkan bahawa rintangan insulin per se boleh menyebabkan albuminuria.42 Begitu juga, tikus dengan rintangan insulin khusus podocyte, dicapai dengan kalah mati bersyarat bagi reseptor insulin dalam podosit glomerular, mengembangkan albuminuria dan lesi glomerular yang menyusun semula DN, walaupun tiada hiperglisemia atau diabetes.41 Sebaliknya, dalam haiwan diabetes, pemeka insulin mampu memperlahankan perkembangan DN tanpa kawalan glisemik.43 Penemuan ini menunjukkan bahawa isyarat insulin mengawal fungsi podosit bebas daripada tahap glukosa darah. Walau bagaimanapun, sebagai transduser utama laluan isyarat insulin, peranan GSK3b dalam patogenesis dan perkembangan DN telah banyak dikaji.

Dalam buah pinggang, GSK3b kebanyakannya dinyatakan dalam podosit dan, pada tahap yang lebih rendah, dalam sel mesangial dan endothelial dalam glomerulus20,21 dan secara meluas dinyatakan oleh sel tiub buah pinggang. Terdapat data daripada kumpulan kami dan kumpulan lain yang menunjukkan bahawa GSK3b mengantara kecederaan autonomi podosit dengan menyepadukan berbilang laluan isyarat patik podosit.17,20,44,45 Ketidakkonsistenan, sekatan genetik atau farmakologi GSK3b boleh melindungi daripada kecederaan podosit dan melemahkan proteinuria dalam model haiwan pelbagai glomerulopati bukan diabetes.21 Selain itu, dalam kronik progresifbuah pinggangpenyakit, GSK3b didapati sebagai modulator kecederaan tiub renal dan interstisial. Walau bagaimanapun, sama ada dan bagaimana GSK3b terlibat dalam DN tidak pasti dan sangat kontroversi, walaupun kajian ini menunjukkan bahawa pengaktifan GSK3b yang dipertingkatkan dalam buah pinggang dan dalam sel terkelupas kencing mungkin dikaitkan dengan perkembangan atau perkembangan DKD. Sebagai contoh, dalam tikus dengan diabetes yang disebabkan oleh streptozotocin, Lin et al.46 mendapati bahawa perencatan GSK3b oleh perencat kompetitif adenosin trifosfat (20 Z,30 E)-6- Bromo dalam indirubin-30 -oxime ( BIO) melemahkan proteinuria dan memperbaiki lesi glomerular DN jika tiada pembetulan hiperglikemia, menunjukkan bahawa GSK3b memainkan peranan yang memudaratkan dalam DN. Juga, dalam tikus dengan diabetes yang disebabkan oleh streptozotocin, Paeng et al.22 membuat penemuan yang sama dengan menggunakan BIO dan membuat kesimpulan bahawa aktiviti GSK3b yang dipertingkatkan dalam podosit di bawah keadaan diabetes dikaitkan dengan apoptosis podocyte dan kehilangan dalam DN. Ini adalah selaras dengan satu lagi kajian in vitro, di mana GSK3b didapati menjadi pengantara penyahbezaan podosit dan kecederaan selepas terdedah kepada medium glukosa tinggi.47 Sebaliknya, Mariappan et al.48 mendakwa bahawa pengaktifan GSK3b sebaliknya memperbaiki yang disebabkan oleh diabetes.buah pinggangkecederaan. Dalam kajian mereka, tikus diabetes yang disebabkan oleh streptozotocin telah dirawat dengan natrium nitroprusside, penderma nitrik oksida yang dapat mengaktifkan GSK3b. Mereka mendapati bahawa albuminuria, hipertrofi buah pinggang, dan pengumpulan matriks ekstraselular dalam glomeruli semuanya diperbaiki dengan ketiadaan peningkatan dalam hipertensi atau hiperglikemia. Walau bagaimanapun, penemuan ini sangat bertentangan dengan data daripada tikus knock-in sasaran gen dengan GSK3 yang aktif secara konstitutif yang membangunkan albuminuria spontan dan kecederaan podosit.49 Untuk menyelaraskan penemuan yang bercanggah, berhati-hati harus diambil untuk mentafsir data yang dihasilkan dengan menggunakan perencat atau pengaktif kimia. daripada GSK3b. Walaupun BIO telah berulang kali disahkan sebagai perencat molekul kecil GSK3b yang sangat selektif, natrium nitroprusside bukanlah pengaktif khusus GSK3b tetapi diketahui mempunyai kesan hemodinamik yang kuat,50 yang mungkin mengelirukan tindakan pengurangan albuminuria dan renoprotektifnya dalam tikus kencing manis. Diambil bersama, walaupun terdapat beberapa data yang bercanggah, bukti lazim cenderung menyokong bahawa GSK3b mungkin dikaitkan dengannyabuah pinggangkecederaandan proteinuria dalam DN. Beberapa batasan

kajian semasa perlu dinyatakan. Pertama, data praklinikal hanya terhad kepada model murine dB/dB. Untuk menentukan kebolehgeneralisasian peranan GSK3b dalamkecederaan buah pinggang kencing manis, adalah perlu untuk mengesahkan penemuan dalam model DN lain, termasuk model DN jenis 1. Kedua, pemerhatian klinikal di sini diperoleh daripada kohort retrospektif pesakit diabetes dengan saiz sampel yang terhad dan masa susulan yang agak singkat. Diakui, kajian berskala besar, prospektif, rawak, berbilang pusat diperlukan untuk mengesahkan pemerhatian kami dan untuk mengesahkan kuasa GSK3b dalam sel terkelupas kencing dalam meramalkan hasil DKD.

Ringkasnya, kajian kami menunjukkan bahawa ekspresi renal dan aktiviti GSK3b dikuatkan dalam DN eksperimen dan klinikal. Aktiviti GSK3b dalam sel terkelupas kencing boleh berfungsi sebagai biomarker novel untuk meramalkan perkembangan DN. Data kami mungkin membuka jalan untuk pemeriksaan besar-besaran dan mendalam tentang nilai yang GSK3b dalam sel terkelupas kencing boleh berfungsi sebagai biomarker prognostik DN.

KAEDAH

Kajian haiwan

Kajian haiwan telah diluluskan oleh Jawatankuasa dan Penjagaan Haiwan Institusi, dan ia mematuhi peraturan Jabatan Pertanian AS dan Panduan Institut Kesihatan Nasional untuk Penjagaan manusia dan Penggunaan Haiwan Makmal. Tikus DB/DB jantan dan rakan serakan db/m kawalan berumur 6 minggu telah dibeli dari Pusat Penyelidikan Haiwan Model Universiti Nanjing (Nanjing, China) dan ditempatkan di Pusat Kemudahan Haiwan Universiti Zhengzhou. Semua tikus diberi makan secara ad libitum, dan 8 hingga 10 tikus dibunuh pada umur yang dinyatakan. Spesimen air kencing dan darah diambil pada titik masa yang dinyatakan. Selepas membunuh, buah pinggang dituai untuk pemeriksaan lanjut. Tahap albumin kencing diukur menggunakan kit kuantiti ujian imunosorben berkaitan enzim albumin tetikus (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Tahap kreatinin air kencing ditentukan menggunakan kit ujian kreatinin (BioAssay Systems, Hayward, CA).

Kultur sel

Podosit tikus yang diabadikan secara bersyarat antara petikan 21 dan 25 telah dikultur dalam medium Roswell Park Memorial Institute 1640 ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin di bawah keadaan permisif seperti yang diterangkan sebelum ini.22 Subkultur podosit tertakluk kepada keadaan tidak membenarkan untuk mendorong pembezaan selama 14 hari dan telah kemudian terdedah kepada medium lingkungan/kultur biasa yang mengandungi 5 mM glukosa, lingkungan diabetes yang terdiri daripada glukosa (25 mM), dan faktor pertumbuhan mengubah b1 (2 ng/ml), atau medium kawalan osmolaliti tinggi yang mengandungi 20 mM manitol selama 48 Jam. Sel epitelium tiub proksimal Murine dan sel mesangial glomerular tikus dikekalkan dalam medium Eagle/F12 yang diubah suai Dulbecco ditambah dengan 5 peratus serum lembu janin. Sel-sel disalut pada pertemuan w70 peratus dalam medium yang mengandungi 5 peratus serum lembu janin selama 24 jam dan kemudian menjalani kebuluran serum selama 24 jam lagi diikuti dengan pendedahan kepada medium lingkungan/kultur biasa yang mengandungi 5 mM glukosa, lingkungan diabetes yang terdiri daripada tinggi. glukosa (25 mM) dan mengubah faktor pertumbuhan b1 (2 ng/ml), atau medium kawalan osmolaliti tinggi yang mengandungi 5 mM glukosa dan 20 mM manitol selama 48 jam. Daya tahan sel dinilai oleh pengecualian biru Trypan. Pada titik masa yang dinyatakan, sel telah ditetapkan atau lisat sel dikumpulkan untuk siasatan lanjut.

Pemindahan sementara bagi vektor

Vektor yang mengekodkan vektor kosong atau mutan hemagglutinin (HA)– yang ditanda secara konstitutif aktif (S9A) (S9A-GSK3b-HA/pcDNA3) GSK3b telah disediakan oleh Dr. Gail VW Johnson (Birmingham, AL) dan telah ditransfeksi kepada podosit kultur, sel mesangial, dan sel epitelium tiub dengan menggunakan Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) seperti yang diterangkan sebelum ini.44 Kecekapan transfeksi telah disahkan oleh pewarnaan imunofluoresensi atau immunoblotting untuk HA pada 12 jam. Sel-sel kemudiannya dikumpulkan dan disediakan untuk analisis blot Barat atau ujian lain.

RNAi

Sekumpulan 3 ekor tikus GSK3b-spesifik dupleks RNA kecil yang mengganggu—50-CUUGUCCUGUAGAACUUUCtt-30, 50-AUGAUCCAUUUCCAAUCACtt-30 dan 50-AUACCGCAGUCGGACUAUGtt-30 — telah direka bentuk dan disintesis mengikut urutan pengekodan lengkap gen GSK3b murine (kesertaan GenBank no.BC060743.1). Selain itu, jujukan RNA kecil yang mengganggu (50-GCGAGUAGCGCUAGGAAGUtt-30) tanpa persamaan jujukan dengan mana-mana jujukan gen yang diketahui daripada tikus, tikus atau manusia telah digunakan sebagai kawalan untuk RNAi. Kecekapan lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA)-pengantara gen-pembungkaman dinilai oleh analisis imunoblot untuk GSK3b. Penindasan yang memuaskan terhadap ekspresi protein GSK3b diperhatikan dalam podosit berbudaya, sel mesangial, dan sel epitelium tiub 24 jam selepas RNAi. Sel-sel kemudiannya tertakluk kepada medium persekitaran/budaya biasa, persekitaran diabetes, atau medium kawalan osmolaliti tinggi selama 48 jam seperti yang dinyatakan di atas sebelum sel diproses untuk ujian lanjut.

Kajian klinikal

Bahagian klinikal kajian ini mematuhi garis panduan etika Deklarasi Helsinki 1975 dan telah diluluskan oleh Lembaga Kajian Institusi Hospital Gabungan Pertama ZhengzhouUniversity. Peserta penyelidikan manusia tidak diambil secara khusus untuk kajian ini. Semua data klinikal dikumpul melalui semakan carta retrospektif dan dengan pemeriksaan bahagian tisu yang diarkibkan atau spesimen air kencing yang disimpan. Sampel biopsi buah pinggang yang berlebihan atau dibuang, serta sampel air kencing yang dipecahkan, telah disimpan secara rutin di Institut Nefrologi Hospital Gabungan Pertama Universiti Zhengzhou. Tisu biopsi buah pinggang tertanam parafin yang tidak dikenal pasti yang diarkibkan daripada pesakit pada pelbagai peringkat DN telah dipilih secara rawak untuk pemeriksaan. Spesimen buah pinggang tambahan tanpa lesi histomorfologi diperoleh daripada buah pinggang yang dibuang untuk pemindahan kerana anomali vaskular atau daripada tisu biopsi praimplantasi dan berfungsi sebagai kawalan biasa. Untuk kajian kohort retrospektif, sejumlah 127 pesakit dengan diabetes mellitus jenis 2, yang telah disusuli sejak 2010 dengan sampel air kencing yang dipecahkan, telah disaring secara retrospektif untuk dimasukkan dalam kajian ini. Pesakit yang dikaji berumur antara 29 dan 80 tahun dan didiagnosis dengan diabetes jenis 2 mengikut kriteria Persatuan Diabetes Amerika. Kriteria pengecualian termasuk kehilangan susulan, maklumat yang tidak mencukupi,buah pinggangdisfungsi, or overt proteinuria at baseline, or other superimposed kidney diseases such as acute kidney injury or glomerulopathies. Finally, 60 patients have enrolled in this study for further assessment. All patients had been followed up for >5 tahun. Semasa susulan rutin, data demografi, serta parameter klinikal, didokumenkan, termasuk jantina, umur, komorbiditi, ubat-ubatan, tempoh diabetes, tekanan darah, paras glisemik, paras kreatinin serum, data urinalisis, UAE dan eGFR. Hasil klinikal selepas 5 tahun susulan adalah kehadiran atau ketiadaan perkembangan kerosakan buah pinggang, yang ditakrifkan sebagai sama ada $25 peratus pengurangan dalam eGFR atau perkembangan albuminuria seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan keterukan albuminuria sepanjang pelbagai peringkat klinikal DN, iaitu, normoalbuminuria, mikroalbuminuria, makroalbuminuria, atau proteinuria yang terang-terangan. Semua pesakit memberikan persetujuan bertulis secara bertulis.

Penilaian morfologi buah pinggang dan analisis imunohistokimia

Blok tisu buah pinggang tikus tetikus tertanam formalin yang dibenamkan parafin telah dipotong kepada bahagian 3-mm. Untuk histologi umum, bahagian telah diproses untuk pewarnaan asid-Schiff berkala. Pewarnaan imunohistokimia untuk GSK3b dan p-GSK3b dilakukan menggunakan kit ABC VECTASTAIN (Vector Laboratories, Burlingame, CA) seperti yang diterangkan sebelum ini.20 Sebagai kawalan negatif, antibodi primer digantikan oleh serum bukan imun daripada spesies yang sama; tiada pewarnaan berlaku. Ciri morfologi semua bahagian dinilai oleh pemerhati tunggal secara buta dengan bantuan ahli patologi buah pinggang.

Pewarnaan imunofluoresen

Sel yang dikultur atau bahagian cryostat beku telah diperbaiki dan diwarnai dengan antibodi primer dan diikuti dengan menggunakan antibodi sekunder konjugasi Alexa Fluor (Invitrogen). Sebagai kawalan negatif, antibodi primer digantikan oleh IgG praimun daripada spesies yang sama; tiada pewarnaan berlaku. Akhir sekali, bahagian telah diwarnakan balas dengan 40,6-diamidino-2-phenylindole atau propidium iodide dan dipasang dengan medium pelekap VECTASHIELD (Vector Laboratories). Untuk mikroskop pendarfluor FL, semua bahagian dianalisis pada masa yang sama untuk mengecualikan artifak akibat pereputan fluorochrome yang berubah-ubah. Bahagian telah diperiksa menggunakan mikroskop pendarfluor Olympus FL yang dilengkapi dengan kamera digital Spot II (Olympus, Tokyo, Jepun). Untuk pewarnaan dwi-warna, imej diperoleh secara berurutan untuk mengelakkan gangguan pewarna. Perisian ImageJ (Institut Kesihatan Kebangsaan, Bethesda, MD) telah digunakan untuk pemprosesan pasca imej, contohnya, penskalaan, penggabungan dan analisis kolokalisasi.

Morfometri berkomputer

Imej pewarnaan imunohistokimia telah ditangkap dan didigitalkan menggunakan sistem analisis imej berkomputer yang terdiri daripada kamera digital peranti berganding cas resolusi tinggi yang dilampirkan pada mikroskop (Olympus BX41, Olympus) dan pada komputer. Imej telah dipaparkan pada resolusi piksel 1024 768 piksel (peleraian ruang, 0.24 mm/piksel). Untuk imej pewarnaan imunohistokimia tisu buah pinggang manusia, perisian ImageJ digunakan untuk pembahagian imej, penetapan ambang, dan pengukuran intensiti isyarat. Pembetulan manual dilakukan mengikut keperluan. Secara keseluruhan, 10 glomeruli atau 10 medan tubulointerstitial rawak telah diambil sampel untuk analisis morfometrik, dan data akhir dinyatakan sebagai nilai ketumpatan piksel bersepadu berbanding kumpulan kawalan.

Analisis imunoblot Barat

Sel-sel yang dikultur telah dilisiskan;buah pinggangtisuatau glomeruli buah pinggang terpencil telah dihomogenkan dalam penimbal ujian radioimunopresipitasi ditambah dengan perencat protease, dan sampel telah diproses untuk analisis imunoblot. Untuk analisis imunoblot bilangan terhad sel terkelupas dalam air kencing, protokol Western blot telah diubah suai seperti yang diterangkan sebelum ini dengan menggunakan NuPAGE Bis-Tris Gels (Invitrogen) berprestasi tinggi dan membran pemindahan berkualiti tinggi. mengesan protein yang dinyatakan sederhana dalam sekurang-kurangnya 1000 sel. Antibodi terhadap GSK3b, fibronektin, kolagen IV, aktin dan gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenase (GAPDH) telah dibeli daripada Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); yang menentang synaptopodin dibeli daripada PROGEN Biotechnik GmbH (Heidelberg, Jerman); dan yang menentang ZO-1 dan p-GSK3b telah diperoleh daripada Teknologi Isyarat Sel (Danvers, MA).

Analisis statistik

All in vitro studies were repeated 3 to 6 times. For immunoblot analysis, bands were scanned and the integrated pixel density was determined using a densitometer and the ImageJ analysis program, version 1.48 (National Institutes of Health). Data were expressed as mean -SD or median (interquartile range). All included patients had baseline data. Patients with missing data or lost to follow-up were excluded from this study. Continuous variables were analyzed as appropriate by using the t-test, Mann-Whitney U test, or 1-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Student-NewmanKeuls test if there were 3 comparisons or by the Scheffé test if there were >3 perbandingan. Data kategori dibandingkan antara kumpulan menggunakan ujian khi kuasa dua. Analisis regresi linear digunakan untuk mengkaji kemungkinan hubungan antara 2 parameter. Analisis regresi bahaya berkadar Univariat Cox telah dilakukan untuk menilai perkaitan antara pembolehubah yang berkaitan dan risiko perkembangan kerosakan buah pinggang, diikuti dengan analisis multivariate berkenaan dengan kemungkinan pengacau. Analisis keluk ROC telah dilakukan dan kawasan di bawah keluk ROC diukur untuk menganalisis kuasa pembolehubah tertentu dalam meramalkan perkembangan kerosakan buah pinggang dalam pesakit diabetes. Pembolehubah tidak teragih secara normal, seperti UAE, telah diubah oleh logaritma untuk mencapai kenormalan bagi analisis regresi bahaya perkadaran Cox analisis keluk ROC. Semua analisis statistik dilakukan menggunakan PSS versi 22 (IBM Corporation, Armonk, NY). nilai P<0.05 in2-tailed="" tests="" were="" considered="" statistically="" significant="" in="" all="">

PENDEDAHAN

Semua pengarang mengisytiharkan tiada kepentingan bersaing.

PENGHARGAAN

Sebahagian daripada kajian ini dibentangkan sebagai pembentangan lisan di KidneyWeek 2016: American Society of Nephrology Annual Meeting, 15–20 November 2016, Chicago, IL. RG disokong sebahagiannya oleh yayasan untuk Kesihatan. XL disokong oleh persekutuan penyelidikan untuk menerima latihan luar sekolah. ZL disokong oleh geran Yayasan Sains Semulajadi Kebangsaan China U1604284, 81770672, dan81873612. Pembiaya tidak mempunyai peranan dalam reka bentuk dan pengendalian kajian, pengumpulan, dan tafsiran data, atau penyediaan dan kelulusan manuskrip ini.

SUMBANGAN PENULIS

RG mencipta idea konsep. XL, ZL, dan RG menyumbang kepada reka bentuk kajian. XL, PW, BC, YG, AYG, dan BF menjalankan eksperimen kultur sel. XL dan ZL melakukan eksperimen haiwan dan mengumpul data daripada pesakit diabetes. XL, LJW, DKM, LDD, ZL, dan menyumbang kepada perbincangan dan tafsiran keputusan. memimpin dalam penulisan manuskrip. XL, BC, dan BF menyumbang kepada penyuntingan manuskrip. Semua pengarang bersetuju bahawa keseluruhan konsep dan pemilikan karya ini adalah milik RG. Semua pengarang meluluskan manuskrip akhir.

BAHAN TAMBAHAN

Kaedah Tambahan.

Jadual S1. Ciri-ciri subjek kawalan dan pesakit dengan nefropati diabetik, berstrata mengikut kelas histologi nefropati diabetik. Jadual S2. Data asas demografi, klinikal dan makmal kohort retrospektif pesakit diabetes peringkat awal tanpa tanda DKD. Jadual S3. Data demografi, klinikal dan makmal pesakit diabetes jenis 2 peringkat awal, berstrata mengikut hasil buah pinggang mereka selepas 5 tahun susulan. Rajah S1. Aktiviti buah pinggang yang dipertingkatkan GSK3b meramalkan perkembangan dan keterukankencing manisbuah pinggangpenyakitdalam tikus db/db. Tikus db/db dan db/m jantan disusuli antara umur 4 dan 13 minggu. (A) Darah diambil daripada tikus yang tidak berpuasa pada usia 4 dan 7 minggu, dan tahap glukosa plasma telah diuji. *P < 0.001="" berbanding="" db/m="" tikus="" pada="" umur="" 7="" minggu.="" n="" ¼="" 15–18.="" (b)="" urin="" bintik="" diambil="" pada="" usia="" 4,="" 7,="" 10,="" dan="" 13="" minggu="" dan="" tertakluk="" kepada="" ujian="" albumin="" urin="" dan="" kreatinin="" air="" kencing="" untuk="" penentuan="" nisbah="" albumin-ke-kreatinin="" urin="" (uacrs).="" *="" p=""><0.001 berbanding="" db/m="" tikus="" pada="" umur="" 10="" minggu="" (n="" ¼="" 15–18);="" #p=""><0.001 berbanding="" db/m="" tikus="" pada="" usia="" 13="" minggu.="" n="" ¼="" 15–18.="" (="" c="" )="" semua="" tikus="" menerima="" biopsi="" buah="" pinggang="" terbuka="" pada="" usia="" 7="" minggu="" dan="" spesimen="" biopsi="" telah="" diproses="" untuk="" analisis="" imunoblot="" untuk="" p-gsk3b,="" gsk3b,="" dan="" gapdh.="" (d)="" imunoblot="" tertakluk="" kepada="" analisis="" densitometrik.="" kelimpahan="" relatif="" gsk3b="" dan="" p-gsk3b="" ditentukan="" sebagai="" nisbah="" densitometri="" molekul="" gapdh="" masing-masing="" sebagai="" perubahan="" lipatan="" berbanding="" dengan="" tikus="" kawalan="" db="" m.="" aktiviti="" relatif="" gsk3b="" dikira="" sebagai="" nisbah="" p="" gsk3b="" kepada="" gsk3b="" sebagai="" lipatan="" kawalan="" db/m="" tikus.="" (e)="" analisis="" regresi="" linear="" menunjukkan="" korelasi="" positif="" yang="" signifikan="" secara="" statistik="" antara="" aktiviti="" gsk3b="" buah="" pinggang="" pada="" usia="" 7="" minggu="" dalam="" tikus="" db="" db="" dan="" perkembangan="" dan="" keterukan="" albuminuria,="" ciri="">kencing manisbuah pinggangpenyakitpada usia 13 minggu. R ¼ 0.699; P ¼ 0.0{{20}}}1. (F) Analisis keluk ciri operasi penerima menunjukkan bahawa aktiviti GSK3b buah pinggang pada peringkat awal diabetes (umur 7 minggu) memberikan ketepatan dan kuasa yang sangat baik dalam meramalkan perkembangan albuminuria dan DKD pada usia 13 minggu dalam tikus db/db. Rajah S2. Rintangan insulin dan glukosa ambien yang tinggi secara sinergistik mengaktifkan GSK3b dalam sel buah pinggang. (A) Podosit murine yang dikultur, (B) sel mesangial glomerular urin (MMCs), dan (C) sel epitelium tubular renal (TECs) telah ditransfeksi dengan oligonukleotida siRNA (siCon) atau siRNA oligonucleotides (siIRb) yang khusus untuk isoform b reseptor insulin (IRB) untuk memodelkan keadaan rintangan insulin secara in vitro. Sel-sel kemudiannya didedahkan selama 48 jam kepada lingkungan normal (NG) yang mengandungi glukosa biasa atau lingkungan diabetes (HG) yang mengandungi glukosa tinggi. Lisat sel telah dikumpul dan tertakluk kepada analisis imunoblot untuk IRB, p-GSK3b, GSK3b, dan GAPDH diikuti oleh analisis densitometrik bagi blots. *P <0.01 berbanding="" ekspresi="" irb="" dalam="" sel="" yang="" dirawat="" sicon="" yang="" terdedah="" kepada="" lingkungan="" yang="" sama="" (n="" ¼="" 3),="" #p=""><0.05 berbanding="" ekspresi="" protein="" yang="" sama="" dalam="" kumpulan="" siirb="" þ="" ng="" atau="" sicon="" þ="" hg="" (n="" ¼="" 3),="" &="" p="">< 0.05="" berbanding="" ungkapan="" protein="" yang="" sama="" dalam="" kumpulan="" þ="" hg="" atau="" siirb="" þ="" ng="" kedua="" (n="" ¼="" 3).="" rajah="" s3.="" tahap="" ekspresi="" mrna="" gsk3b="" dalam="" spesimen="" buah="" pinggang="" manusia="" yang="" diperoleh="" daripada="" penderma="" hidup="" sihat="" dan="" pesakit="" dengan="" nefropati="" diabetik.="" data="" diperoleh="" daripada="" www.nephroseq.org="" berdasarkan="" dataset="" ju="" ckd="" glom51="" dan="" dinyatakan="" sebagai="" keamatan="" berpusat="" median="" log2.="" rajah="" s4.="" peningkatan="" aktiviti="" gsk3b="" dalam="" sel="" terkelupas="" kencing="" yang="" dikumpulkan="" daripada="" pesakit="" diabetes="" peringkat="" awal="" meramalkan="" perkembangan="" penyakit="" buah="" pinggang="" diabetes.="" (a,="" b)="" pengesanan="" gsk3b="" dan="" mengaktifkan="" gsk3b="" dalam="" sel="" terkelupas="" kencing="" yang="" dikumpulkan="" daripada="" pesakit="" diabetes="" peringkat="" awal="" (pts)="" dan="" kawalan="" sihat="" (ctrls).="" sel-sel="" terkelupas="" kencing="" dikumpulkan="" dan="" dilisiskan.="" lisat="" sel="" telah="" diproses="" untuk="" analisis="" imunoblot="" untuk="" gsk3b,="" p-gsk3b,="" dan="" gapdh.="" (c)="" immunoblots="" tertakluk="" kepada="" analisis="" densitometrik.="" kelimpahan="" relatif="" gsk3b="" dan="" p-gsk3b="" ditentukan="" sebagai="" nisbah="" densitometrik="" molekul="" gapdh="" masing-masing="" sebagai="" perubahan="" lipatan="" berbanding="" dengan="" kawalan="" (ctrls).="" aktiviti="" relatif="" gsk3b="" dikira="" sebagai="" nisbah="" p-gsk3b="" kepada="" gsk3b="" sebagai="" lipatan="" kawalan="" biasa="" (ctrls).="" (d)="" analisis="" lengkung="" ciri="" operasi="" penerima="" menunjukkan="" bahawa="" aktiviti="" gsk3b="" relatif="" (nisbah="" p-gsk3b/gsk3b)="" dalam="" sel="" terkelupas="" kencing="" yang="" dikumpulkan="" daripada="" pesakit="" diabetes="" peringkat="" awal="" memberikan="" ketepatan="" yang="" sangat="" baik="" dalam="" meramalkan="">penyakit buah pinggang kencing manisdalam 5 tahun, dengan luas di bawah lengkung (AUC) ialah 0.886.

RUJUKAN

1. Umanath K, Lewis JB. Kemas kini mengenai Nefropati Diabetik: Kurikulum Teras 2018. Am J Kidney Dis. 2018;71:884–895.

2. Gregg EW, Li Y, Wang J, et al. Perubahan dalam komplikasi berkaitan diabetes di Amerika Syarikat, 1990-2010. N Engl J Med. 2014;370:1514–1523.

3. Haller H, Ito S, Izzo JL Jr, et al. Olmesartan untuk penangguhan atau pencegahan mikroalbuminuria dalam diabetes jenis 2. N Engl J Med. 2011;364:907–917.

4. Schena FP, Gesualdo L. Mekanisme patogenetik nefropati diabetik. J Am Soc Nephrol. 2005;16(bekalan 1):S30–S33.

5. Ritz E, Zeng XX, Rychlik I. Manifestasi klinikal dan sejarah semula jadi nefropati diabetik. Sumbang Nephrol. 2011;170:19–27.

6. Holman RR, Paul SK, Bethel MA, et al. 10-tahun susulan kawalan glukosa intensif dalam diabetes jenis 2. N Engl J Med. 2008;359:1577–1589.

7. Perkins BA, Ficociello LH, Ostrander BE, et al. Mikroalbuminuria dan risiko penurunan fungsi buah pinggang progresif awal dalam diabetes jenis 1. J Am Soc Nephrol. 2007;18:1353–1361.

8. Koye DN, Magliano DJ, Reid CM, et al. Risiko perkembangan CKD normoalbuminurik kepada penyakit buah pinggang peringkat akhir pada penghidap diabetes: Kajian CRIC (Chronic Renal Insufficiency Cohort). Am J Ginjal Dis. 2018;72:653–661.

9. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Keperluan untuk peramal awal risiko nefropati diabetik: adakah kadar perkumuhan albumin mencukupi? kencing manis. 2000;49:1399–1408.

10. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Kadar penapisan glomerular rendah dalam pesakit diabetes jenis 1 normoalbuminurik: penunjuk lesi glomerular yang lebih maju. kencing manis. 2003;52:1036–1040.

11. Krolewski AS. Penurunan buah pinggang progresif: paradigma baru nefropati diabetik dalam diabetes jenis 1. Penjagaan Diabetes. 2015;38:954–962.

12. Robles NR, Villa J, Gallego RH. Nefropati diabetik bukan proteinurik. J Clin Med. 2015;4:1761–1773.

13. Adler AI, Stevens RJ, Manley SE, et al. Perkembangan dan perkembangan nefropati dalam diabetes jenis 2: Kajian Prospektif Diabetes United Kingdom (UKPDS 64). Buah Pinggang Int. 2003;63:225–232.

14. Gluhovschi C, Gluhovschi G, Perica L, et al. Biomarker kencing dalam penilaian nefropati diabetes awal. J Diabetes Res. 2016;2016: 4626125.

15. Doi T, Moriya T, Fujita Y, et al. Urinari IgG4 dan Smad1 adalah biomarker khusus untuk perubahan struktur dan fungsi buah pinggang pada peringkat awal nefropati diabetik. kencing manis. 2018;67:986–993.

16. De S, Kuwahara S, Hosojima M, et al. Ekskresi megalin panjang penuh dalam urin yang dimediasi oleh eksositosis dikaitkan dengan patogenesis nefropati diabetik. kencing manis. 2017;66:1391–1404.

17. Xu W, Ge Y, Liu Z, et al. Glycogen synthase kinase 3b menentukan motilitas podocyte dan perolehan lekatan fokus dengan memodulasi aktiviti paxillin: implikasi untuk kesan perlindungan litium dos rendah dalam podocytopathy. Am J Pathol. 2014;184:2742–2756.

18. Ali A, Hoefiich KP, Woodgett JR. Glikogen sintase kinase-3: sifat, fungsi dan peraturan. Chem Rev. 2001;101:2527–2540.

19. Beurel E, Grieco SF, Jope RS. Glycogen synthase kinase-3 (GSK3): peraturan, tindakan dan penyakit. Pharmacol Ther. 2015;148:114–131.

20. Li C, Ge Y, Dworkin L, et al. Isoform b GSK3 mengantara kecederaan autonomi podocyte dalam glomerulopati proteinurik. J Pathol. 2016;239:23.