Peroksidasi Lipid Lisosomal Mengawal Kekebalan Tumor

Perencatan lisosom yang ditimbulkan oleh perencat palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1) seperti DC661 boleh menghasilkan kematian sel, tetapi mekanisme untuk ini tidak difahami sepenuhnya. Laluan kematian sel yang diprogramkan (autophagy, apoptosis, nekroptosis, ferroptosis, dan pyroptosis) tidak diperlukan untuk mencapai kesan sitotoksik DC661. Perencatan cathepsin, atau pengkelat besi atau kalsium, tidak menyelamatkan sitotoksisiti yang disebabkan oleh DC661-. Perencatan PPT1 menyebabkan peroksidasi lipid lisosom (LLP), yang membawa kepada permeabilisasi membran lisosom dan kematian sel yang boleh diterbalikkan oleh antioksidan N-acetylcysteine ​​(NAC) tetapi bukan oleh antioksidan peroksidasi lipid lain. Pengangkut sistein lisosom MFSD12 diperlukan untuk pengangkutan intralysosomal NAC dan penyelamatan LLP. Perencatan PPT1 menghasilkan imunogenisiti sel-intrinsik dengan ekspresi permukaan calreticulin yang hanya boleh diterbalikkan dengan NAC. Sel-sel yang dirawat DC{11}}memulakan sel T naif dan meningkatkan ketoksikan pengantaraan sel T. Tikus yang divaksinasi dengan sel yang dirawat DC661-menghasilkan imuniti adaptif dan penolakan tumor dalam tumor "imun panas" tetapi tidak dalam tumor "imun sejuk". Penemuan ini menunjukkan bahawa LLP memacu kematian sel lysosomal, bentuk imunogenik unik kematian sel, menunjukkan jalan kepada kombinasi rasional imunoterapi dan perencatan lisosom yang boleh diuji dalam ujian klinikal.

Kebaikan cistanche tubulosa-Antitumor

pengenalan

Dengan aktiviti yang menggalakkan dalam ujian klinikal yang melibatkan perencat lysosomal hydroxychloroquine (HCQ) (1), pengenalpastian palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1) sebagai sasaran molekul derivatif klorokuin (2), dan pelancaran perencat PPT1 novel ke dalam klinikal. percubaan (3, 4), terdapat keperluan untuk memahami mekanisme di mana perencat lisosom mendorong kematian sel dan kesan perencatan lisosom pada imuniti tumor. Mekanisme kanonik kematian sel lisosom yang diterangkan untuk HCQ melibatkan permeabilisasi membran lisosom (LMP), kebocoran cathepsins, dan pengaktifan apoptosis pengantara caspase (5, 6). Kami sebelum ini telah menunjukkan bahawa perencat lisosom DC661 menembusi sel dalam persekitaran mikro tumor berasid dan menyetempat ke lisosom dengan lebih cekap daripada HCQ (2, 7). DC661 menghasilkan kematian sel yang kuat merentasi banyak saluran sel kanser (2). DC661 mengikat dan menghalang PPT1, menyahasidkan lisosom, dan menghalang autophagy. DC661 juga mendorong LMP dan meningkatkan tahap caspase terbelah 3 (2, 7). Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, mekanisme baru kematian sel yang mempunyai akibat imunogenik telah ditakrifkan dan termasuk nekroptosis, ferroptosis, dan pyroptosis (8). Autophagy yang bergantung kepada lisosom telah ditunjukkan untuk merendahkan kelas MHC I (9), serta komponen immunoproteasome (10), menunjukkan bahawa perencatan autophagy dapat meningkatkan pemprosesan antigen. Walau bagaimanapun, kesan imunogenik perencatan lisosom dan kematian sel yang berikutnya belum dicirikan sepenuhnya. Untuk menangani jurang pengetahuan ini, kami menyiasat kesan DC661 pada mekanisme kematian sel kanonik untuk menentukan sama ada kematian sel lisosom adalah bentuk kematian selnya atau hanya pendahulu kepada salah satu mekanisme lain yang telah ditetapkan. Kami mendapati bahawa HCQ dan DC661 menyebabkan peningkatan yang ketara dalam hanya sebilangan kecil protein dalam proteom melanoma dan kebanyakannya adalah protein berkaitan autophagy dan apoptosis. Inhibitor kematian sel yang diprogramkan (apoptosis, nekroptosis, ferroptosis, dan pyroptosis) tidak mengurangkan kesan sitotoksik selepas kerosakan lisosom oleh DC661. Peroksidasi lipid lisosom (LLP) ialah pemacu utama kematian sel yang disebabkan oleh LMP yang dikaitkan dengan ekspresi calreticulin (CALR) pada permukaan sel. Bentuk kematian sel ini boleh diterbalikkan hanya dengan menggunakan antioksidan N-acetylcysteine ​​(NAC). Aktiviti NAC telah terjejas oleh perencatan pengimport sistein lisosom MFSD12. LLP menimbulkan fenotip imunogenik yang menggalakkan pembunuhan pengantaraan sel T. Penemuan ini menunjukkan bahawa kematian sel lisosom adalah bentuk kematian sel imunogenik yang berpotensi unik.

sistem imun yang meningkatkan tumbuhan cistanche

Keputusan

Perencatan lisosom mendorong perubahan ketara dalam proteom yang berkaitan dengan autophagy dan apoptosis. Untuk mewujudkan kesan sitotoksik perencat lisosom, kami menilai daya maju melanoma A375P, karsinoma kolon RKO dan saluran sel kanser pankreas MIA PaCa-2 yang dirawat dengan perencat H+-ATPase vakuolar bafilomycin-A1 (1 00 nM); Perencat PPT1 DC661 (3 μM) atau HCQ (10 μM atau 30 μM); palmitat mimetik heksadesil sulfonil fluorida (HDSF; 60 μM); perencat cathepsin pepstatin A (PepA; 10 ug/mL), E64 (PepA; 10 ug/mL), atau PepA+E64; dan pengganggu membran lisosom Leu-Leu metil ester hidrobromida (20 μM) selama 48 jam. Hanya bafilomycin-A1 dan DC661 menyebabkan penurunan ketara dalam daya maju sel merentasi garisan sel kanser (Rajah 1A dan Rajah Tambahan 1A; bahan tambahan tersedia dalam talian dengan artikel ini; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), dengan DC661 menghasilkan pengurangan yang lebih mendalam dalam daya maju sel daripada bafilomycin-A1. Berdasarkan data ini dan sifat derivatif klorokuin seperti ubat farmakologi, kami menumpukan kajian kami pada derivatif klorokuin sebagai alat untuk memahami kematian sel lisosom. Analisis proteom global yang tidak berat sebelah telah digunakan pada sel melanoma A375P yang dirawat dengan DC661 (3 μM) atau HCQ yang kurang kuat (10 μM atau 30 μM) selama 24 jam. Daripada 4,264 protein terkuantiti berkeyakinan tinggi, hanya 87 dan 55 protein meningkat dengan ketara dengan DC661 (3 μM) dan HCQ (30 μM), masing-masing; tambahan, 14 dan 15 protein telah menurun dengan ketara dengan DC661 (3 μM) dan HCQ (30 μM), masing-masing (perubahan lipatan mutlak lebih besar daripada 2; q <0.05) dengan DC661 (3 μM) atau HCQ (30 μM), masing-masing , jika dibandingkan dengan kawalan kenderaan. Dos HCQ yang lebih rendah (10 μM) tidak menunjukkan perubahan protein yang ketara berbanding dengan kawalan kenderaan. 50 protein teratas yang meningkat dengan ketara berikutan rawatan DC661 terutamanya dikaitkan dengan autophagy dan apoptosis, dan perubahan serupa diperhatikan untuk dos HCQ yang lebih tinggi (Rajah 1B). Atas sebab ini, kami memilih untuk menumpukan kajian lanjut pada DC661 yang lebih kuat. Contoh beberapa perubahan protein terbesar yang dikaitkan dengan autophagy dan apoptosis ialah protein pengikat cukai 1 (TAX1BP1; meningkat 15-kali ganda); BCL2-protein berinteraksi 3 (BNIP3; meningkat 6-kali ganda); jiran protein gen 1 BRCA1 (NBR1; meningkat 12-kali ganda); sequestosome-1 (SQSTM1/p62; meningkat 5-kali ganda); coactivator reseptor nuklear 4 (NCOA4; meningkat 3-kali ganda); dan LC3B (MAP1LC3B; meningkat 3-kali ganda). Apolipoprotein B-100 (APOB; meningkat 66-kali ganda) diperoleh daripada serum betis janin dan tidak dikaji lebih lanjut. Immunoblotting mengesahkan bahawa rawatan dengan DC661 atau kepekatan HCQ yang lebih tinggi menghasilkan peningkatan yang ketara dalam ekspresi reseptor kargo autophagy NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62, dan NCOA4 dalam cara yang bergantung kepada dos dan masa (Tambahan Rajah 1, B dan C). CRISPR/Cas9 KO PPT1 dalam sel A375P memfenokopi kesan DC661 pada protein ini jika dibandingkan dengan rakan WT mereka (Tambahan Rajah 1D). Walau bagaimanapun, ekspresi reseptor kargo autophagy dan peningkatan relatif yang disebabkan oleh rawatan DC661 adalah berubah-ubah merentasi kanser kolon, kanser pankreas, dan garisan sel melanoma lain di mana DC661 menunjukkan sitotoksisiti (Tambahan Rajah 1E). Ini mencadangkan bahawa reseptor kargo autophagy sendiri, walaupun meningkat pada tahap protein, tidak mungkin bertanggungjawab untuk kematian sel berikutan rawatan DC661. Untuk mengesahkan ini, kami memberi tumpuan kepada reseptor kargo autophagy TAX1BP1 dan BNIP3 kerana mereka telah mengetahui kesan proapoptotik dalam sel kanser (Rajah 1C). TAX1BP1 ialah penyesuai kargo autophagy (11) dan juga mengawal apoptosis yang disebabkan oleh perencat sintesis protein atau agen merosakkan DNA dalam sel kanser (12). Penghancuran TAX1BP1 oleh siRNA (Rajah 1D) tidak menjejaskan sitotoksisiti akibat DC{119}}dalam jangka pendek (Rajah 1E) dan ujian daya maju jangka panjang (Rajah 1F). Keputusan ini menunjukkan bahawa TAX1BP1 tidak memainkan peranan penting dalam{126}}sitotoksisiti pengantara DC. BNIP3 ialah protein proapoptotik yang merosakkan bioenergetik mitokondria dan mengawal mitophagy (13). Ketukan BNIP3 (Rajah 1G) yang berkesan tidak menjejaskan sitotoksisiti teraruh DC (Rajah 1, H dan I). Keputusan ini menunjukkan bahawa kesan sitotoksik DC661 adalah bebas daripada ekspresi BNIP3. Seterusnya, kami mengkaji kesan pengurangan sel gen autophagy kanonik yang diperlukan untuk pengeluaran autophagosome pada keberkesanan DC661 dengan menumbangkan unc-51 seperti autophagy mengaktifkan kinase 1 (ULK1) dan gen berkaitan autophagy 7 (ATG7). Ketukan berkesan ULK1 atau ATG7 (Tambahan Rajah 2, A dan B) menghalang fluks autofagik (Tambahan Rajah 2C) tetapi tidak menjejaskan DC{146}}sitotoksisiti teraruh (Rajah 1, J–M). Keputusan ini menunjukkan bahawa ketiadaan jentera autophagy teras penting tidak membatalkan kesan sitotoksik DC661. Perencatan lisosom oleh DC661 mendorong pelbagai laluan kematian sel yang diprogramkan. Sudut pandangan kanonik ialah kematian sel lisosom adalah disebabkan oleh apoptosis (5). Immunoblotting mendedahkan bahawa rawatan DC661 menghasilkan pengaktifan caspase-3, -7 dan -9 serta belahan PARP-1, mengesahkan bahawa DC661 mengaktifkan apoptosis (Rajah 2A). Inhibitor pan-caspase Z-VAD-FMK menghalang pengaktifan caspase oleh DC661 tetapi tidak menghalang pengumpulan LC3B dan p62, menunjukkan bahawa pengaktifan apoptosis dan sekatan autophagy boleh dipisahkan berikutan perencatan lisosom (Rajah 2B). Menyekat apoptosis dengan ZVAD-FMK tidak meningkatkan atau mengehadkan sitotoksisiti DC661, menunjukkan bahawa apoptosis boleh diketepikan untuk kematian sel lisosom (Rajah 2, C, dan D). Kesan sitotoksik DC661 adalah serupa dalam sel sum-sum tulang primer Bax/Bak double-KO yang tidak mampu menjalani apoptosis dan sel WT (Rajah 2E). Sekatan apoptosis tidak menjejaskan sitotoksisiti akibat DC{171}}dalam kanser kolon dan sel-sel kanser pankreas juga (Tambahan Rajah 2, D–F). Oleh kerana kami mendapati apoptosis tidak boleh diketepikan untuk kematian sel akibat DC{173}}, kami menyiasat sama ada DC661 mendorong nekroptosis, satu lagi bentuk kematian sel terprogram yang dikawal oleh kinase protein berinteraksi reseptor (RIPK) dan protein seperti domain kinase keturunan campuran ( MLKL). Tahap bentuk RIPK dan MLKL terfosforilasi dan diaktifkan telah meningkat berikutan rawatan DC661 daripada 0.1-1 μM (Rajah 2F). Pada 3 μM DC661 terdapat ketiadaan RIPK1 terfosforilasi tetapi MLKL terfosforilasi yang berterusan, menunjukkan bahawa, pada kepekatan yang lebih tinggi ini, bentuk kematian sel tambahan boleh terlibat. Prarawatan dengan perencat RIPK1 necrostatin-1 atau necrostatin-1s atau necrosulfonamide perencat MLKL menghalang fosforilasi RIPK1 selepas rawatan DC661 (1 μM) dalam sel melanoma (Rajah 2G) tetapi gagal menyelamatkan DC{{192 }}aruh sitotoksisiti dalam sel melanoma (Rajah 2H) atau kanser kolon atau sel kanser pankreas (Tambahan Rajah 2G). Penemuan ini mencadangkan bahawa nekroptosis diaktifkan tetapi boleh diketepikan untuk{195}}kematian sel pengantara DC.

Rajah 1. Perencatan autophagy lisosom mendorong perubahan ketara dalam apoptosis dan protein autophagy. (A)

Lisosom adalah salah satu tempat penyimpanan utama untuk besi. Metabolisme besi intraselular yang tidak terkawal ditambah dengan kapasiti reduktif yang berkurangan boleh mencetuskan kematian sel nonapoptosis yang dikenali sebagai ferroptosis. Ciri khas ferroptosis ialah regulasi prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2), pengatur pengangkutan kation homolog 1 (CHAC1), dan cysteinyl-tRNA synthetase (CARS) (14). Kesemua 3 penanda ferroptosis ini telah dikawal secara transkripsi oleh rawatan DC661 (Rajah 3A), menunjukkan bahawa perencatan lisosom mendorong ferroptosis. DC661 mendorong peralihan pendarfluor dalam sel A375P yang dirawat C11-BODIPY, menunjukkan peroksidasi lipid, ciri ferroptosis. Anjakan teraruh DC661-ini telah terbalik dengan ketara dengan kehadiran perencat ferroptosis ferrostatin-1 atau roxstatin bibir-1 yang diberikan pada kepekatan berkesan (Rajah 3B dan Rajah Tambahan 3A), seterusnya menunjukkan bahawa DC661 ferroptosis teraruh. Walau bagaimanapun, perencatan ferroptosis tidak menyelamatkan sitotoksisiti yang dikaitkan dengan DC661 (Rajah 3, C dan D). Rawatan bersama sel kanser dengan deferoxamine chelator besi (DFO) dan DC661 tidak menyelamatkan sitotoksisiti DC661 (Rajah 3E). Rawatan dengan ferrostatin-1, lip roxstatin-1 atau DFO tidak menyelamatkan DC661 perencatan daya maju jangka pendek atau pertumbuhan klonogenik jangka panjang dalam melanoma, kolon dan sel-sel kanser pankreas (Tambahan Rajah 3, B –E, dan Tambahan Rajah 4, A–D). Data ini menunjukkan bahawa ferroptosis diaktifkan tetapi boleh diketepikan untuk{31}}kematian sel pengantara DC. Piroptosis ialah satu bentuk kematian sel terprogram yang dikaitkan dengan tindak balas keradangan yang melibatkan pengaktifan caspases yang memproses gastrin (GSDM), membenarkan pembentukan liang pada membran plasma dan pembebasan seterusnya corak molekul yang berkaitan dengan kerosakan, seperti mobiliti tinggi. kotak kumpulan 1 (HMGB1). Rawatan DC661 dalam berbilang talian sel melanoma (A375P, A375, WM35 dan WM793) menghasilkan pengaktifan caspase pemula-8 dan -9 dan caspase algojo-7, tipikal untuk pyroptosis dan dihasilkan belahan GSDME penuh, sama dengan tahap inducer pyroptosis yang diketahui PLX4720 dan PD0325901 (Tambahan Rajah 5A). DC661 menghasilkan pelepasan ekstraselular HMGB1 yang lebih kuat daripada inducer pyroptosis, BRAF, dan MEK yang diketahui dalam 1% FBS (15), mencerminkan akibat fungsi pyroptosis diaktifkan. Seterusnya, kami menguji sama ada perencatan pyroptosis oleh GSDME KO akan memperbaiki kesan sitotoksik DC661. Rawatan DC661 menyebabkan pengumpulan LC3II dan SQSTM1/p62 dan pengaktifan caspase, tetapi pelepasan HMGB1 hampir dimansuhkan sepenuhnya dalam sel manusia GSDME-KO WM35, menunjukkan bahawa akibat berfungsi menghalang pyroptosis telah dicapai (Rajah 3F). Walau bagaimanapun, rawatan DC661 menghasilkan sitotoksisiti yang sama dalam YUMM1.7 WT, vektor kosong (EV), dan sel Gsdme KO1 dan KO2 dalam kedua-dua 10% dan 1% keadaan FBS (Rajah 3G dan Rajah Tambahan 5B). Satu hasil biasa dari pelbagai bentuk kematian sel ialah pembebasan LDH. DC661 menghasilkan peningkatan ketara dalam pelepasan LDH, dan ini tidak boleh diterbalikkan oleh apoptosis, nekroptosis, atau perencatan ferroptosis (Tambahan Rajah 5C). Keputusan ini menunjukkan bahawa DC661 mendorong berbilang mod kematian sel, termasuk apoptosis dan pyroptosis serta nekroptosis dan ferroptosis, tetapi tiada satu pun daripada mod kematian sel ini diperlukan untuk661-kematian sel akibat DC. Perencatan Cathepsin atau pengkelasi kalsium tidak menghalang kematian sel daripada permeabilisasi membran lisosom. Setelah menunjukkan bahawa pengaktifan caspase (yang diperlukan untuk apoptosis dan pyroptosis) boleh diketepikan untuk kematian sel akibat DC, kami membuat hipotesis bahawa pelepasan cathepsin daripada lisosom boleh menyebabkan kematian sel yang bergantung kepada caspase. Perencatan kimia (DC661) atau genetik (PPT1 siRNA [siPPT1]) PPT1 menghasilkan permeabilisasi membran lisosom (LMP), manakala HDSF, perencat tak boleh balik yang kurang kuat PPT1 yang habis dengan cepat dalam kultur sel, tidak dapat mendorong LMP, seperti yang diukur oleh galectin-3–puncta positif (Rajah 4A). LMP menghasilkan pembebasan cathepsin dan kandungan lisosom lain ke dalam sitoplasma dan dianggap sebagai ciri proksimal utama kematian sel berasaskan lisosom. LMP yang disebabkan oleh DC661 dikaitkan dengan peningkatan ketara dalam aktiviti cathepsin-L sitoplasma, yang disekat dengan ketara dengan perencat protease sistein E64 (Rajah 4B). Laporan sebelumnya telah mencadangkan bahawa pelepasan cathepsin daripada lisosom yang patah menggalakkan pengaktifan caspase, yang membawa kepada kematian sel apoptosis (16-18). Perencatan cathepsin yang lengkap tidak menghalang pembelahan caspase (Rajah 4C) dan tidak menyelamatkan sitotoksisiti akibat DC{92}}dalam ujian daya maju jangka pendek dan jangka panjang dalam melanoma (Rajah 4, D dan E), kanser kolon dan pankreas sel kanser (Tambahan Rajah 6, A–C). Keputusan ini menentang pandangan kanonik kematian sel lisosom seperti yang didorong oleh kematian sel pengantara cathepsin. Selain pelepasan cathepsin daripada lisosom yang bocor, pelepasan kalsium daripada lisosom telah terlibat dalam disfungsi selular apabila PPT1 terjejas (19). Rawatan DC661 menghasilkan pelepasan kalsium yang banyak, yang telah dimansuhkan oleh prarawatan kalsium kekal sel (Ca{101}}) chelator, BAPTA-AM. (Rajah 4F). Terutama sekali, BAPTA-AM tidak menghalang LMP teraruh DC (Rajah 4G) atau belahan caspase (Rajah Tambahan 6, D dan E) dan, yang paling penting, tidak menyelamatkan sitotoksisiti teraruh DC ({108}} Rajah 4H). Penemuan ini juga diperhatikan dalam kedua-dua garisan sel RKO dan MIA PaCa{110}}, yang mana tiada perbezaan ketara dalam nilai IC50 diperhatikan dengan BAPTA-AM dan DC661 (Tambahan Rajah 6F), yang mencadangkan bahawa kematian sel berkaitan LMP adalah tidak bergantung kepada kalsium atau cathepsin.

Rajah 2. DC661-apoptosis dan nekroptosis teraruh. (A)

Rajah 3. ferroptosis dan pyroptosis teraruh DC661-. (A)

LLP memacu LMP. Setelah menetapkan bahawa perencat laluan kematian sel utama (apoptosis, nekroptosis, ferroptosis, dan pyroptosis), cathepsin (PepA dan E64), dan chelator ion (BAPTA-AM [Ca2+] dan DFO [Fe{{3} }]) tidak menghalang kematian sel oleh DC661 dan mencari bukti peroksidasi lipid oleh C-11-BODIPY, kami melakukan analisis lipidome global pada 2 dan 4 jam selepas rawatan DC661. DC661 mendorong awal dan mengekalkan 3- hingga 10-peningkatan kali ganda dalam setiap kelas lysophospholipid (Rajah 5A). Sebaliknya, perubahan yang minimum atau tiada kelihatan dalam kelas fosfolipid, termasuk fosfatidilkolin, fosfatidillethanolamine, fosfatidilserin, fosfatidilinositol, fosfatidilgliserol, dan asid fosfatidik (Tambahan Rajah 7A). Spesies lysophospholipid boleh dihasilkan oleh ROS, yang mengoksidakan rantai asid lemak tepu yang kemudiannya dipecahkan oleh fosfolipase (20). Untuk menentukan sama ada antioksidan boleh menghalang kerosakan lipid pengantaraan ROS, kami menyiasat sitotoksisiti tercetus DC{16}}dengan kehadiran pan-ROS scavenger N-acetylcysteine ​​(NAC) (21, 22) dan perencat peroksidasi lipid diduga Trolox (23). ) dan vitamin C (asid askorbik) (24, 25). Tidak seperti mana-mana ejen lain yang diuji setakat ini, rawatan bersama dengan NAC menyelamatkan sitotoksisiti DC661-yang merentasi pelbagai garisan sel (Rajah 5B dan Rajah Tambahan 7B). Ujian CFU jangka panjang menunjukkan bahawa NAC, tidak seperti semua perencat kematian sel, pengkelat ion dan perencat cathepsin yang diuji di sini, menghalang kesan sitotoksik DC661 dalam sel A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10 dan MC38 ( Rajah 5C dan Rajah Tambahan 7C). Menariknya, Trolox dan vitamin C tidak menyelamatkan sitotoksisiti DC661 dalam melanoma manusia, kanser kolorektal, sel kanser pankreas dan melanoma murine dan sel kanser kolorektal (Rajah 5D dan Rajah Tambahan 7, D–H). Perbezaan ini mendorong kami untuk menguji sama ada NAC, Trolox dan vitamin C menjejaskan LMP. Keputusan kami menunjukkan bahawa NAC ialah satu-satunya antioksidan yang mengurangkan LMP661-DC (Rajah 5E) dengan ketara. Kami membuat hipotesis bahawa LLP memacu pengeluaran LMP oleh DC661, yang mungkin dikembalikan oleh NAC tetapi bukan oleh Trolox dan vitamin C. Untuk mengkaji proses LLP kami menggunakan probe pendarfluor FOAM-LPO (26), yang secara khusus menyetempat pada lisosom dan menghasilkan anjakan spektrum daripada 586 kepada 512 nm (merah ke hijau) apabila terdedah kepada lipid peroksida. Kami mendapati bahawa DC661 mendorong LLP berbanding dengan kawalan (Rajah 5F). NAC mengurangkan peroksidaan lipid dalam lisosom sel melanoma yang dirawat661-DC, manakala Trolox dan vitamin C gagal mengurangkan LLP (Rajah 5F). NAC, Trolox, dan vitamin C sendiri tidak mempunyai kesan yang ketara terhadap peroksidasi lipid. Penghancuran PPT1 (Tambahan Rajah 8A), atau rawatan dengan kepekatan tinggi HCQ (Tambahan Rajah 8B) juga mendorong LMP yang boleh diterbalikkan oleh NAC, manakala perencatan kimia ULK1 tidak mendorong LMP (Tambahan Rajah 8C). Yang penting kejatuhan siPPT1 juga termasuk LLP yang boleh diterbalikkan dengan NAC (Tambahan Rajah 8D) Keputusan ini menunjukkan bahawa perencatan PPT1 mendorong LLP yang boleh diselamatkan oleh NAC dan berkemungkinan punca LMP{58}} perencatan PPT. Selanjutnya, penemuan ini mencadangkan bahawa LLP adalah penting untuk kematian sel lisosom.

Tumbuhan cistanche herba Cina-Antitumor

Import sistein ke dalam lisosom oleh MFSD12 melemahkan kematian sel lisosom. Daripada 3 perencat peroksidasi lipid, hanya NAC yang menghalang LLP. Laporan baru-baru ini menunjukkan bahawa domain superfamili fasilitator utama yang mengandungi 12 (MFSD12) adalah komponen penting pengimport sistein untuk lisosom dan melanosom (27). Kami memberi alasan bahawa NAC, atau sistein metabolitnya, diangkut ke dalam lisosom melalui MFSD12, di mana sistein teroksida kepada disulfida, sistein. Untuk menguji hipotesis ini, kami membandingkan keupayaan NAC untuk menyelamatkan sitotoksisiti DC661 dalam sel siNT dan siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP. Keputusan kami menunjukkan bahawa NAC menyelamatkan DC{11}}mendorong LMP dalam sel siNT tetapi tidak menyelamatkan LMP dalam sel siMFSD12 (Rajah 6A). NAC mengurangkan LLP sel siNT-A375P yang dirawat661-DC tetapi bukan sel siMFSD12. sel siMFSD12 yang dirawat dengan DMSO atau NAC telah meningkatkan LLP basal (Rajah 6B) berbanding dengan sel siNT. Walaupun NAC menyelamatkan sitotoksisiti DC661 dalam sel siNT, keupayaan NAC untuk menyelamatkan sitotoksisiti DC661 telah dimansuhkan sepenuhnya dalam sel siMSFD12 (Rajah 6C). Ini menunjukkan bahawa MFSD12 knockdown menghalang kesan sitoprotektif NAC terhadap DC661. NAC dinyahasetilasi oleh asilase dalam sitosol (28). Untuk menentukan sama ada rawatan NAC menghasilkan pengumpulan sistein atau sistin dalam lisosom, kami menggunakan teknik imunopresipitasi lisosom (Lyso-IP) (29) untuk membersihkan lisosom daripada sel A375P yang dirawat DMSO dan NAC (Rajah 6D dan Rajah Tambahan 9A) dan melakukan metabolomik yang disasarkan untuk mengukur NAC dan metabolit yang berkaitan. Seperti yang dijangkakan, NAC dikesan dalam lisat seluruh sel yang dirawat NAC dan pecahan tidak terikat yang berkaitan. Tahap L-sistein telah meningkat dengan ketara dalam lisosom yang dirawat NAC. L-cystine hanya dapat dikesan dalam lisosom yang dirawat NAC. Secara mengejutkan, kami tidak mendapati peningkatan ketara dalam glutation (dikurangkan) dalam kumpulan yang dirawat NAC (Rajah 6E); ini mengejutkan kerana lazimnya dipercayai bahawa rawatan NAC mendorong peningkatan pengeluaran glutation, membetulkan keseimbangan redoks. Keputusan ini menunjukkan bahawa sistein yang diimport ke dalam lisosom melalui pengimport MFSD12 adalah penting untuk menyelamatkan LLP, LMP, dan kematian sel lisosom. LLP adalah imunogenik. Beberapa bentuk kematian sel terkawal yang disebabkan oleh DC661 (pyroptosis, nekroptosis, ferroptosis) telah dikenal pasti sebagai imunogenik. Sebelum ini, kematian sel imunogenik telah diterangkan untuk ubat kemoterapi berdasarkan ciri ciri, termasuk paparan corak molekul yang berkaitan dengan kerosakan, termasuk ekspresi permukaan sel CALR dan pembebasan protein HMGB1 dan adenosin trifosfat (ATP) (30). CALR bertindak sebagai isyarat "makan-saya" apabila terdedah kepada permukaan sel semasa tekanan sel. Pelepasan ekstraselular HMGB1 dan ATP bertindak sebagai isyarat "cari-saya" yang diiktiraf oleh sel fagosit. Kami membandingkan dua model: sel B16F10, yang dalam model tumor syngeneik hampir tidak mempunyai limfosit penyusupan tumor sepenuhnya, dan sel MC38, yang dalam model tumor syngeneik mempunyai limfosit yang menyusup tumor. Pertama, kami menunjukkan bahawa rawatan DC661 atau siPpt1 dengan ketara mendorong ekspresi CALR permukaan yang boleh dimansuhkan sepenuhnya dengan rawatan NAC dalam sel MC38 (Rajah 7, A, dan B). Penemuan yang sama diperhatikan dalam sel B16F10 (Rajah 7C). Inhibitor laluan kematian sel utama (apoptosis, nekroptosis, ferroptosis, dan pyroptosis) gagal menghalang ekspresi permukaan CALR (Rajah 7D). Untuk menentukan sama ada kematian sel imunogenik yang disebabkan oleh DC661 disebabkan oleh penyelarasan kelas I MHC, sel B16F10 dan MC38 telah dirawat dengan DC661 (3 μM) atau DMSO selama 24 jam. Kami mendapati bahawa rawatan DC661 tidak meningkatkan ekspresi kelas MHC I dan regulasi imunoproteasome (Rajah 7E dan Rajah Tambahan 9, B dan C).

Rajah 4. Perencatan Cathepsin atau pengkelat kalsium tidak menghalang661-kematian sel akibat DC. (A)

Untuk memahami kesan perencatan autophagy pada penyebuan sel T, kami melakukan penyebuan in vitro dan eksperimen kokultur menggunakan splenosit C57BL6 / J seperti yang diterangkan sebelum ini (31). Untuk penyebuan, kami mendedahkan splenosit kepada DC661- atau sel B16F10 atau MC38 yang dirawat DMSO. Seterusnya, splenosit prima ini dibiakkan dengan sel B16F10 atau MC38 hidup, dan sitotoksisiti diukur (Rajah 8A). Splenocytes yang disiapkan dengan sel B16F10 yang dirawat DC{12}}menghasilkan peningkatan yang ketara dalam IFN- berbanding dengan splenosit yang terdedah kepada sel B16F10 yang dirawat DMSO. Pembunuhan pengantara sel T prima bagi sel B16F10 yang membiak telah meningkat dengan ketara dalam661-splenosit prima DC jika dibandingkan dengan splenosit prima DMSO (Rajah 8, B dan C). Sel MC38 yang dirawat dengan DC661 menghasilkan lebih banyak sitotoksisiti sel T IFN dan prima jika dibandingkan dengan sel B16F10 (Rajah 8, D, dan E). Rawatan bersama NAC dengan DC661 dapat membatalkan sepenuhnya pelepasan IFN daripada splenosit dan sitotoksisiti sel T prima yang tumpul (Rajah 8, F, dan G). Penghancuran calreticulin oleh siCalr dalam sel MC38 (Tambahan Rajah 9D) membatalkan keberkesanan penyebuan rawatan DC661 dan mengurangkan sitotoksisiti sel T prima dengan ketara (Rajah 8, H, dan I). Diambil bersama, data ini menyokong peranan mekanistik penyelarasan CALR yang berkaitan dengan LLP dalam menggalakkan imuniti sel T sel antitumor. Seterusnya, kami mengembangkan penemuan in vitro ini kepada kajian vaksinasi antitumor in vivo dalam model tikus immunocompetent dan immunodeficient. Untuk ujian ini, sel B16F10 atau MC38 yang telah dicairkan beku secara in vitro atau DC661-disuntik sc pada sayap kiri untuk melindungi tikus C57BL/6 atau NOD/SCID yang imunokompeten terhadap cabaran semula dengan sel tumor hidup yang sama disuntik. 7 hari kemudian ke sayap kanan (Rajah 9A). Sel B16F10 yang dirawat DC{48}}gagal menghalang penolakan tumor walaupun ujian in vitro, menunjukkan bahawa DC661 menyebabkan kematian sel imunogenik (Rajah 9B dan Rajah Tambahan 9E). Sebaliknya, inokulasi satu rusuk dengan sel MC38 yang dirawat661-DC menggalakkan penolakan sepenuhnya sel MC38 hidup yang ditanam pada rusuk bertentangan (Rajah 9C dan Rajah Tambahan 9F). Untuk menentukan sama ada imuniti adaptif adalah kritikal untuk kesan vaksin DC661 nampaknya dengan tumor MC38, kami mengulangi eksperimen dalam tikus NOD / SCID. Secara mengejutkan, kami mendapati bahawa sel MC38 yang dirawat DC{61}}tidak mendorong penolakan tumor recallenge dalam tikus NOD/SCID yang kurang imun (Rajah 9D dan Rajah Tambahan 9G), menunjukkan bahawa imuniti adaptif diperlukan untuk kesan vaksin yang diperhatikan. Untuk menguji keteguhan penemuan ini, kami memilih satu lagi barisan sel kanser tikus imunogenik yang terkenal, CT26, dan melakukan eksperimen vaksinasi seperti di atas. Seperti yang dijangkakan, implantasi sel CT26 DC661-dirawat dalam satu rusuk tetikus menghasilkan kesan seperti vaksin dan menghalang pembiakan sel CT26 hidup yang ditanam pada rusuk yang lain (Rajah 9E dan Rajah Tambahan 9H). Penemuan kami mencadangkan bahawa DC661-induced LLP adalah kritikal untuk kematian sel imunogenik pengantara LMP, yang diterbalikkan oleh import sistein ke dalam lisosom oleh pengangkut lisosom MFSD12 (Rajah 9F).

Perbincangan

Perencatan lisosom nampaknya merupakan pendekatan terapeutik yang menjanjikan dalam kajian praklinikal, dan ujian klinikal HCQ telah menghasilkan keputusan yang menggalakkan tetapi bercampur-campur (1, 32). PPT1 ialah sasaran molekul HCQ, dan perencat PPT1 yang lebih kuat, seperti DC661 (2) dan GNS561 (3), mendorong kematian sel pengantara LMP secara in vitro. Mekanisme tepat kematian sel lisosom dan peranannya dalam imunogenisiti tumor belum dijelaskan sepenuhnya. Imuniti antitumor dipertingkatkan apabila perencatan autophagy digabungkan dengan imunoterapi (9, 10, 31). Mekanisme yang dicadangkan untuk imunogenisiti sel-intrinsik berikutan perencatan autophagy termasuk kelas MHC I dan regulasi imunoproteasome, yang kedua-duanya menyokong pemprosesan dan pembentangan antigen yang lebih baik. Selain itu, kehilangan protein autophagy atau perencatan autophagy oleh tindak balas sel T CD{13}} klorokuin ditambah dengan meningkatkan paras permukaan MHC kelas I dalam sel dendritik (33). Kami sebelum ini menunjukkan bahawa perencatan PPT1 sistemik boleh repolarize makrofaj dari fenotip M2 hingga M1. Inhibitor PPT1 boleh meningkatkan tahap STING, yang membawa kepada pembebasan IFN dan penambahan pembunuhan yang dimediasi sel T dalam model melanoma (31). Di sini, kami menunjukkan bahawa LLP sendiri menghasilkan bentuk imunogenik sel tumor-intrinsik kematian sel. Kami mendapati bahawa perencatan lisosom menyebabkan sedikit perubahan protein dalam sel-sel kanser, dan protein yang paling ketara tinggi termasuk reseptor kargo autophagy dan pengawal selia apoptosis. Pendekatan kami yang menyasarkan beberapa gen ini merentasi fungsi menunjukkan bahawa protein yang disebabkan oleh dadah tidak mungkin menjadi pengawal selia utama kematian sel. Perencatan genetik ULK1 atau ATG7 juga tidak menyelamatkan sitotoksisiti DC661. Kami menunjukkan bahawa perencatan lisosom mengaktifkan pelbagai bentuk kematian sel yang diprogramkan, termasuk apoptosis, nekroptosis, ferroptosis, dan pyroptosis, tetapi setiap satu daripada ini boleh diketepikan untuk sitotoksisiti yang disebabkan oleh dadah. Nota, mekanisme kematian sel yang diprogramkan boleh bertindih dan penargetan bersama mekanisme kematian berbilang sel boleh memberikan sitoproteksi terhadap kematian sel berikutan permeabilisasi membran lisosom. Kerja kami telah menolak mekanisme yang bergantung kepada cathepsin dan kalsium untuk kematian sel lisosom dan menekankan kepentingan LLP sebagai penentu kritikal kematian sel. Kami menemui bukti LLP yang boleh diterbalikkan oleh antioksidan yang diangkut ke dalam lisosom, NAC dan penting untuk permeabilisasi membran lisosom dan sitotoksisiti. NAC ialah satu-satunya ejen yang dapat mengurangkan atau membalikkan kematian sel akibat DC661-dan kapasiti ini bergantung pada kehadiran pengangkut sistein lisosom MFSD12. Kekurangan penembusan lisosom berkemungkinan menyebabkan perencat peroksidasi lipid yang lain, Trolox dan vitamin C, tidak dapat menghalang sitotoksisiti DC661. NAC ditukar kepada sistein, yang diimport ke dalam lisosom dan teroksida kepada bentuk disulfida, sistin. Cystine dieksport ke sitosol oleh pengangkut lisosom lain, cystinosis, di mana ia dikurangkan kepada sistein yang menggerakkan semula sumber nutrien dalaman, mengaktifkan semula sasaran kompleks rapamycin 1, dan menggalakkan autophagy (34). Kitaran pengurangan pengoksidaan sistein kepada sistin (lisosom) dan kembali kepada sistein (sitosol) boleh menjadi mekanisme penyelamat yang mungkin NAC terhadap sitotoksisiti DC661 atau kecederaan lisosom yang lebih umum merentas konteks penyakit lain di mana NAC telah terbukti berguna secara terapeutik (35) . NAC bukan sahaja membalikkan DC661-LLP dan LMP tetapi juga ekspresi permukaan penanda kematian sel imunogenik calreticulin. Ekspresi permukaan sel protein CALR diperlukan untuk sitotoksisiti pengantaraan sel T yang dipertingkatkan yang disebabkan oleh{36}}splenosit prima DC, menunjukkan bahawa perencatan lisosom menghasilkan bentuk imunogenisiti intrinsik sel tertentu.

Walaupun kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa perencatan lisosom boleh meningkatkan aktiviti antitumor perencatan pusat pemeriksaan imun dalam tumor sayap yang ditubuhkan (9, 31), kajian kami adalah yang pertama untuk pengetahuan kami untuk menunjukkan kesan seperti vaksin untuk tumor MC38 tetapi bukan tumor B16 dalam sel tumor dirawat terlebih dahulu dengan DC661 sebelum implantasi. Ini menunjukkan bahawa kematian sel lisosom boleh mendorong imunogenisiti sel-intrinsik, tetapi perubahan ini dengan sendirinya tidak mungkin cukup untuk membalikkan persekitaran mikro tumor "imun sejuk" kepada persekitaran mikro tumor "panas imun". Kajian terdahulu kami dalam model persekitaran mikro tumor "imun sejuk" B16 dan BRafCA PtenloxP Tyr: model tetikus kejuruteraan genetik CreERT2 (31) menunjukkan bahawa perencatan lisosom sistemik menghasilkan kesan pada makrofaj yang berkaitan dengan tumor dan sel penindas yang berasal dari sel myeloid yang mencukupi untuk meningkatkan keberkesanan imunoterapi. Ia mungkin berlaku bahawa imunogenisiti sel-intrinsik juga memainkan peranan dalam tumor selsema imun ini yang menjadi lebih responsif kepada ICD berikutan perencatan lisosom. Kesan seperti vaksin perencatan lisosom yang diperhatikan dalam persekitaran makmal terkawal mungkin atau mungkin tidak diterjemahkan ke dalam klinik, tetapi ia boleh menjelaskan mengapa sesetengah pesakit yang dirawat dengan dabrafenib, trametinib, dan HCQ dalam melanoma mutan BRAF yang dirawat sebelum ini mempunyai penyakit yang mendalam dan tahan lama. tindak balas rejimen ini (32). Kajian lanjut diperlukan untuk memahami bagaimana perencatan PPT1 menghasilkan ROS lisosom dan peroksidasi lipid. PPT{15}}peraturan bergantung pada V-ATPase dan pengasidan lisosom bukanlah penjelasan yang mencukupi kerana bafilomycin menghalang pengasidan lisosom tetapi tidak menghasilkan LMP (data tidak ditunjukkan). Implikasi penemuan ini menunjukkan bahawa perencat lisosom yang meningkatkan imunogenisiti intrinsik sel tumor boleh digabungkan secara rasional dengan terapi yang meningkatkan pengaktifan sel T, atau penyusupan ke dalam persekitaran mikro tumor, yang berpotensi menghasilkan kesan sinergi.

Rajah 5. N-asetil sistein menghalang DC661-kematian sel teraruh. (A)

Kaedah

Kultur sel. A375P Manusia (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), talian sel A549 (CRM-CCL-185) dan tetikus B16F10 (CRL-6475) telah dibeli daripada ATCC. Talian A375 Manusia (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 dan tetikus YUMM1.7 (WT, Gsdme EV dan Gsdme KO1 dan KO2) diperoleh secara dalaman. Tetikus MC38 dan sel CT26 disediakan oleh Andy Minn, University of Pennsylvania. FL5.12 dan IL-3–bergantung kepada Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) sel sum-sum tulang primer diperolehi daripada Kathryn E. Wellen, Universiti Pennsylvania. Barisan sel manusia Panc-1 (CRL-1469, ATCC) telah disediakan oleh Ben Z. Stanger, University of Pennsylvania. Talian sel YUMMER 1.7 tetikus diperoleh daripada Xiaowei (George) Xu, Universiti Pennsylvania. Semua talian sel telah diuji untuk Mycoplasma dua kali setahun oleh kemudahan Teras Universiti Pennsylvania dan disahkan menggunakan cap jari ulangan tandem pendek oleh teras Wistar Institute Genomics. Barisan sel A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 dan Bax/ Bak DKO telah dikultur dalam RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); Talian sel A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10 dan MC38 telah dikultur dalam DMEM (Invitrogen, 11995); dan sel YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV dan Gsdme KO1 dan KO2) (15) telah dikultur dalam DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). Media kultur telah ditambah dengan 10% serum lembu janin (12306C, MilliporeSigma) dan 1x larutan antimikotik antibiotik (Gibco, 15140-122). Talian sel FL5.12 dan Bax/Bak DKO dikekalkan dalam media RPMI lengkap ditambah dengan 50 μM -mercaptoethanol (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES (H3537, MilliporeSigma), dan 0.35 ng/mL dan 3.5 ng /mL IL-3, masing-masing. Talian sel YUMMER1.7 dan YUMM1.7 (WT, Gsdme EV, dan Gsdme KO) dikekalkan dalam media lengkap ditambah dengan 1× MEM NEAA (Gibco, 11140-050). Sel WM35 dan WM793 telah dibiakkan dalam media MCDB 153 (MilliporeSigma, M7403), mengandungi 10% FBS dalam medium 1× Leibovitz L-15 (Corning, 10-045-CV), 7.5% w/v natrium bikarbonat ( Corning, 25-035-CI), 1x larutan antimikotik antibiotik (Gibco, 15140-122), dan 5 ug/mL insulin (MilliporeSigma, I0516). Sel telah ditanam pada 37 darjah dengan kehadiran 5% CO2. Bahan kimia dan reagen. Bahan kimia yang dibeli termasuk HCQ Sulfate (Spectrum Chemicals, 747-36-4) dan DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo{100}}, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) telah digunakan untuk mengotorkan sel untuk kalsium mengikut arahan pengilang. Senarai antibodi dan perencat disediakan dalam Jadual Tambahan 1 dan Jadual Tambahan 2.

Rajah 6. NAC membalikkan LLP dalam12-cara bergantung kepada MFSD. (A–C)

Pengekstrakan protein dan pencernaan untuk analisis spektrometri jisim kromatografi cecair-tandem untuk proteomik. {{0}}.7 × 106 sel melanoma A375P telah dibiakkan dalam hidangan kultur 60 mm. Sel telah dirawat dengan DMSO (kawalan), DC661 (3 μM), HCQ (10 μM) atau HCQ (3{{70}} μM) selama 24 jam pada kira-kira 5{{ 112}}% pertemuan. Pelet sel beku telah dilisiskan dengan 5{142}} mM Tris pH 7.4, 1% SDS, 15{152}} mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.15 mM PMSF, 1 ug/mL pepstatin, dan 1 ug/mL leupeptin. Lisat terjernih (1{185}} ug setiap satu) dielektroforesis 0.5 cm ke dalam gel bis-tris diikuti dengan membetulkan dan mewarnakan dengan Coomassie koloid. Setiap lorong gel 0.5 cm telah dipotong, dikekalkan, dikurangkan dengan tris (2-carboxyethyl) fosfin, dialkilasi dengan iodoacetamide dan dicerna dengan trypsin seperti yang diterangkan sebelum ini (36). Pencernaan (1 ug) dianalisis dengan spektrometri jisim kromatografi-tandem cecair (LC-MS/MS) pada spektrometer jisim Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) selaras dengan nanoAQUITY UPLC (Waters). Pemisahan analitik dilakukan pada lajur 1.7 μm × 250 mm Peptide BEH C18 (Waters, 186003546) menggunakan 245-kecerunan minit dengan 0.1% asid formik dalam air (fasa mudah alih A) dan asetonitril (fasa mudah alih B) seperti berikut : 5%–30% B selama 225 minit, 30%–80% B selama 5 minit, 15-penahanan minit pada 80% B dan kembali kepada keadaan asal. Spektrum MS penuh diperoleh pada resolusi 70,000, dengan julat imbasan 400–2,000 m/z, sasaran kawalan perolehan automatik sebanyak 3 × 106 ion dan masa suntikan maksimum sebanyak 50 milisaat. Spektrum MS2 yang bergantung kepada data telah diperoleh untuk 20 ion paling banyak teratas pada resolusi 17,500, dengan lebar pengasingan 1.5 m/z, sasaran kawalan keuntungan automatik sebanyak 5 × 104 ion, dan masa suntikan maksimum 50 milisaat. Padanan peptida ditetapkan kepada pilihan, dan ion yang tidak ditetapkan dan bercas tunggal telah ditolak (37). Data MS mentah dianalisis menggunakan MaxQuant 1.6.5.0 (https:// maxquant.net/perseus/) dengan pangkalan data jujukan manusia Uniprot (diakses pada 10 Oktober 2019) dan pangkalan data pencemar biasa, termasuk trypsin, keratin, protein lembu, dan mycoplasma (38). Kekhususan peptida tryptic dengan maksimum 2 belahan terlepas, pengubahsuaian tetap pada sistein (carbamidomethylation), dan pengoksidaan metionin berubah atau asetilasi N-terminal telah digunakan dalam carian (39). Potongan 1% FDR digunakan untuk peptida dan protein. Perlawanan antara larian telah didayakan; protein dikira menggunakan kuantiti tanpa label (40). Analisis statistik dilakukan menggunakan Perseus 1.6.2.3 (https:// maxquant.net/perseus/) (41, 42). Protein perlu dikenal pasti oleh sekurang-kurangnya 3 peptida unik dan mempunyai 3 nilai sah (kuantisasi bukan sifar) dalam kumpulan sampel, dan bahan cemar dan protein terbalik telah ditapis daripada set data. Nilai yang hilang telah dikira daripada taburan normal. Perbandingan berpasangan antara keadaan dilakukan pada tahap protein menggunakan 2-ujian-t Pelajar berekor dengan FDR berasaskan pilih atur dengan s0=0.1 dan 250 rawak. Perubahan ketara ditakrifkan sebagai FDR kurang daripada 5% dan perubahan lipatan mutlak lebih besar daripada 1.5 atau 2.0, seperti yang dinyatakan. Lyso-IP. Sel A375P telah dijangkiti dengan pLJC5-Tmem192-3xHA lentivirus dan dipilih menggunakan 1 mg/mL puromycin (MilliporeSigma, P4512). Kira-kira 3 × 106 sel A375P bertanda HA telah dirawat dengan sama ada 10 mM NAC atau kawalan kenderaan air selama 24 jam dalam keadaan kultur yang diterangkan sebelum ini. Selepas rawatan, sel telah dibasuh dalam PBS, dituai dalam 0.5 mL KPBS sejuk, dan dihomogenkan perlahan-lahan menggunakan 20 pukulan dalam homogenizer 2 mL Dounce. Kira-kira 2.5% daripada homogenat dikhaskan untuk analisis lisat sel keseluruhan, dan selebihnya disentrifugasi pada 3,000g selama 2 minit pada 4 darjah untuk membuang serpihan membran sel. Supernatan homogen kemudiannya dipindahkan ke tiub 1.5 mL yang bersih dan diinkubasi dengan manik anti-HA 50 μL (Pierce, 88836) atau manik anti-DDK/Flag (OriGene, TA150042) selama 15 minit pada 4 darjah . Sampel kemudiannya dimendakkan dengan meletakkan tiub pada DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) dan digoyang perlahan-lahan selama 2 minit pada suhu bilik. Supernatan itu dikhaskan untuk analisis pecahan tidak terikat. IP dibasuh 3 kali dengan KPBS yang mengandungi 8 mM CaCl2. Lyso-IP telah diekstrak dalam 80% MeOH untuk analisis metabolomik. Pengekstrakan dan analisis lipid menggunakan LC-MS/MS untuk lipidome global. Sel Melanoma A375P telah disemai dalam hidangan 60 mm pada 0.7 × 106 sel setiap hidangan. Apabila sel berada pada kira-kira 50% pertemuan, mereka dirawat dengan DMSO (kawalan), DC661 (3 μM), atau HCQ (30 μM) selama 24 jam. Sel telah dibasuh 2 kali dengan HBSS, dikikis ke dalam metanol sejuk ais, dan dipindahkan ke tiub kaca untuk pengekstrakan lipid dengan kloroform/metanol/0.88% NaCl (2:1:1) yang mengandungi standard lipid dalaman EquiSPLASH (Avanti Polar Lipid). Sampel telah divorteks dan kemudian mandi air disonikasi selama 5 minit di atas ais. Selepas sentrifugasi pada 500g selama 15 minit pada 40 darjah, fasa bawah dipindahkan ke tiub kaca lain. Fasa atas diekstrak semula menggunakan fasa bawah sintetik. Selepas sonication dan sentrifugasi, fasa bawah digabungkan dengan pengumpulan fasa bawah pertama. Sampel telah dikeringkan di bawah nitrogen, digantung semula dalam 10% kloroform/90% metanol, dan dipindahkan ke botol kaca LTQ. Sampel lipid dianalisis pada spektrometer jisim Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X dan sistem Vanquish Horizon UHPLC. Pemisahan analitik menggunakan lajur Accucore C30 (2.1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific) dengan 50:50 asetonitril/air dan 88:10:2 isopropanol/asetonitril/air, setiap satu mengandungi 5 mM ammonium format dan 0.1% asid formik. Data LC-MS/MS diperoleh secara berasingan dalam kekutuban positif dan negatif dengan parameter instrumen berikut: Imbasan MS1 ​​120,{179}} resolusi; MS2 yang bergantung kepada data pada 20 teratas ion paling banyak pada resolusi 15,000; 0.4 m/z lebar pengasingan; dan tenaga perlanggaran ternormal berperingkat 20:30:40 (43).

Rajah 7. N-asetil sistein menghalang ekspresi permukaan calreticulin yang disebabkan DC661-. (A–D)

Lipid telah dikenal pasti dan dikuantisasi menggunakan LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). Spesies lipid yang dikenal pasti telah ditapis oleh penambahan yang dijangkakan dan gred pengenalan berdasarkan kelas. Kawasan puncak telah dinormalisasi kepada piawaian EquiSPLASH untuk kelas yang disokong dan selanjutnya dinormalisasi berdasarkan jumlah kawasan untuk setiap sampel untuk dibetulkan untuk variasi dalam nombor sel. Analisis statistik dilakukan pada data yang diubah log menggunakan Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Pengekstrakan dan analisis metabolit menggunakan LC-MS/MS untuk metabalone. Metabolit polar telah diekstrak daripada keseluruhan sel, pecahan tidak terikat Lyso-IP dan sampel terikat Lyso-IP menggunakan 80% metanol dan disimpan pada –8{{30}} darjah sebelum kromatografi cecair –analisis spektrometri jisim (LC-MS). Ekstrak dianalisis oleh LC-MS menggunakan spektrometer jisim Thermo Scientific Q-Exactive HF-X dengan probe HESI II selaras dengan sistem UHPLC Thermo Vanquish Horizon. Pemisahan LC dilakukan menggunakan lajur ZIC-HILIC (2.1 mm × 150 mm, saiz zarah 5 μm, EMD Millipore) dengan lajur pengawal ZIC-HILIC (2.1 mm × 20 mm, EMD Millipore) dipegang pada 45 darjah dengan kadar aliran sebanyak 0.2 mL/min. Kromatografi dilakukan dalam keadaan berasid untuk mengurangkan kereaktifan kumpulan tiol. Fasa mudah alih A ialah air dan B ialah asetonitril, kedua-duanya mengandungi 0.1% asid formik. Kecerunan LC ialah 85% B selama 2 minit, 85% B hingga 20% B selama 15 minit, 20% B hingga 85% B selama 0.1 minit, dan 85% B selama 8.9 minit. Autosampler dipegang pada 4 darjah, dan 4 μL setiap sampel disuntik setiap analisis. Parameter MS berikut telah digunakan: kadar aliran gas sarung, 40 AU; kadar aliran gas tambahan, 10 AU; kadar aliran gas sapu, 2 AU; suhu pemanas gas tambahan, 350 darjah; voltan semburan, 3.75 kV untuk mod positif dan 3.5 kV untuk mod negatif; suhu kapilari, 375 darjah ; dan tahap RF corong, 40%. Semua sampel dianalisis oleh MS penuh dengan pensuisan polariti. Imbasan MS penuh diperoleh daripada 65 hingga 975 m/z pada resolusi 120,000 dengan sasaran kawalan keuntungan automatik sebanyak 1 × 106 ion dan masa suntikan maksimum 100 milisaat. Data mentah dianalisis menggunakan TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Metabolit yang disasarkan telah dikenal pasti dengan jisim yang tepat dan masa pengekalan dalam polariti pilihan mereka berdasarkan piawaian analisis. Pengesanan puncak menggunakan algoritma ICIS dengan pelicinan 1. Kuantifikasi relatif dilakukan menggunakan kawasan puncak bersepadu, dan nilai ini telah diperbetulkan kepada jumlah keseluruhan setiap sampel (ditakrifkan sebagai jumlah kawasan puncak). Pengeditan PPT1-CRISPR/Cas9. A375P PPT1-bukan sasaran dan sel KO telah disediakan seperti yang diterangkan sebelum ini (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) ialah hadiah daripada Feng Zhang (Addgene plasmid, 48139). Guide RNA oligos (IDT) telah disepuhlindap, difosforilasi, dan kemudian diikat ke dalam plasmid pX459 yang dicerna dan dinyahfosforilasi BbsI mengikut protokol makmal Zhang, tersedia melalui Addgene. Plasmid berikat telah diubah menjadi sel Stbl3 (Invitrogen). Penjujukan persediaan plasmid mengesahkan kehadiran jujukan RNA panduan yang dikehendaki. Sel A375P telah ditransfeksi menggunakan Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015), diikuti dengan pemilihan puromycin. Uji juruukur mengesahkan penyuntingan gen PPT1 oleh CRISPR/Cas9, dan ketukan PPT1 telah disahkan oleh Western blotting dengan antibodi PPT1 (Origene). Urutan untuk oligo RNA panduan adalah seperti berikut: panduan bukan sasaran RNA ke hadapan (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), panduan bukan sasaran RNA terbalik (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), panduan PPT1 manusia RNA 1 ke hadapan (CACCGTTTTGACTCCTCGATGCCC), panduan PPT1 manusia RNA 1 terbalik (AAAAGGGTCCATAAA panduan manusia (AAAAGGGTCCATAAA) hadapan (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC), dan panduan PPT1 manusia RNA 3 terbalik (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Klon yang ditanam daripada sel tunggal yang digunakan dalam kertas ini termasuk yang berikut: klon C8 ialah panduan manusia 1 dan klon B5 ialah panduan manusia 3. Immunoblotting. Satu juta sel disalut dalam hidangan 10 cm, dan rawatan diberikan pada hari berikutnya; sel dikumpulkan dengan mengikis. Lysates seluruh sel telah disediakan menggunakan penimbal lisis SDS. Kepekatan protein diukur menggunakan Kit Ujian Protein Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, 23225). Protein 30-50 ug digunakan untuk SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran PVDF (Bio-Rad, 1620177). Membran telah disekat menggunakan 5% BSA atau 5% susu skim, mengikut keadaan yang dioptimumkan, dan diinkubasi dengan antibodi primer semalaman pada 4 darjah . Membran PVDF telah dibasuh dengan 1× TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu bilik dengan antibodi sekunder konjugasi HRP khusus spesies. Membran kemudiannya dibasuh dan dibangunkan menggunakan substrat Pierce ECL Western Blotting (Thermo Fisher Scientific, 32106) dan filem autoradiografi (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Untuk kajian pyroptosis, lisat protein dipisahkan oleh SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran PVDF. Selepas menyekat dalam 5% BSA, membran PVDF diinkubasi dengan antibodi primer yang ditunjukkan semalaman pada 4 darjah, dibasuh dalam PBS / Tween, dan diinkubasi dengan antibodi sekunder yang digabungkan dengan peroksidase. Imunoreaktiviti dikesan menggunakan antibodi sekunder konjugasi HRP (CalBioTech), substrat chemiluminescence (Thermo Fisher Scientific), dan sistem pengimejan ChemicDoc MP (Bio-Rad). Untuk eksperimen yang melibatkan supernatan, sel telah dikultur dalam medium bebas FBS untuk mengelakkan herotan SDS-PAGE. Supernatan sel dituai dan disentrifugasi selama 10 minit pada 500g pada 4 darjah untuk membuang serpihan sel. Supernatan yang terhasil dipekatkan 10× menggunakan Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) secara sentrifugasi selama 30 minit pada 4,500g pada 4 darjah . Konsentrat dicampur dengan penimbal sampel dan dianalisis melalui Western blotting seperti yang diterangkan di atas. Pewarnaan gel protein dilakukan menggunakan pewarnaan merah Ponceau. Ujian aktiviti LMP dan cathepsin L. Plasmid pEGFP-hGal3 manusia ialah hadiah daripada Tamotsu Yoshimori (Addgene plasmid, 73080) dan digunakan untuk mencipta baris A375P-Galectin-3. Tulang belakang vektor plasmid kawalan pEGFP-C1 telah dibeli (novo prolabs, V012024). Plasmid telah dipindahkan (1 ug/mL) ke dalam sel A375P menggunakan Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) mengikut protokol pengilang; sel yang ditransfeksi telah dipilih secara stabil menggunakan G418 (Gibco, 10131035). Untuk LMP, sejumlah 25 A375P-galectin{152}} sel puncta–positif dalam berbilang medan imej telah dikira. Peratusan sel puncta-positif dikira dalam setiap medan secara berasingan, dan peratusan purata dikira untuk setiap kumpulan. Kit ujian Magic Red Cathepsin L (Abcam, ab270774) telah digunakan mengikut protokol pengeluar. Sel-sel telah diimej di bawah mikroskop terbalik Zeiss Axio Observer 7. Keamatan bersepadu mentah Magic Red dikira menggunakan perisian Fiji - ImageJ (NIH). MTT (3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 diphenyl tetrazolium bromide) ujian daya maju sel. 2,000 sel disadur dalam tiga kali ganda dalam setiap telaga 96-plat perigi dan 3-ujian MTT hari dilakukan menggunakan Kit daya maju Sel (Roche, 11465007001) mengikut protokol pengeluar. Prarawatan perencat diberikan selama 1 jam, diikuti dengan rawatan bersama sel dengan perencat dengan atau tanpa DC661. Kaedah regresi tak linear (padanan lengkung) digunakan untuk mengira IC50.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity

【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Ujian pembentukan koloni. 2,000 sel setiap telaga telah disemai ke dalam plat telaga 6-dan dirawat pada hari berikutnya; sel disimpan di bawah rawatan selama 8 hari. Koloni yang terbentuk dalam setiap telaga dicuci dengan PBS, difiksasi dengan metanol sejuk pada –20 darjah selama 20 minit, dan diwarnakan dengan larutan akueus 0.5% kristal ungu (V5265; MilliporeSigma).

Ujian pengecualian pewarna biru trypan. Campuran tindak balas untuk ujian biru Trypan telah disediakan dengan mencampurkan 1 bahagian 0.4% Trypan blue (25- 900-CI, Corning) dan 1 bahagian sampel sel yang dicairkan. Campuran diinkubasi selama 1 minit dan sel dikira pada Penglihatan Cellometer (Nexcelom, Vision-310-0208).

Rajah 8. Ungkapan permukaan calreticulin teraruh DC661-prima sel T terhadap sel tumor. (A)

Rajah 9. Inokulasi sel yang dirawat661-DC menghasilkan penolakan tumor dalam konteks tertentu. (A)

FOAM-LPO. LLP dikaji menggunakan probe pendarfluor, FOAMLPO. FOAM-LPO telah disintesis seperti yang diterangkan sebelum ini (26). Sel telah dibiakkan pada 8 Well μSlide (ibid, 80807) dan dirawat dengan perencat dan dengan atau tanpa DC661. Sel telah diinkubasi dengan media yang mengandungi FOAM-LPO (1 M) dalam suasana 5% CO2 dan 95% udara selama 5 minit pada 37 darjah. Sel-sel telah dibasuh dua kali dengan media, dan kemudian sel-sel diperhatikan di bawah mikroskop (mikroskop terbalik Zeiss Axio Observer 7) untuk mengesan peralihan pendarfluor dari 586 hingga 512 nm sebagai tindak balas kepada LLP. qRT-PCR dan primer. Sel A375P (3 × 105 ) dibiakkan dalam hidangan 60 mm dan dirawat dengan DMSO atau DC661 (3 μM) selama 24 jam. Jumlah RNA telah diasingkan dengan kit pengasingan RNA (QIAGEN, 74134) mengikut protokol pengeluar. cDNA telah disintesis menggunakan kit iScript Reverse Transcriptase dengan 500 ng RNA yang telah disucikan mengikut protokol pengeluar (Thermo Scientific, K1642). Reaksi qPCR telah disediakan menggunakan SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) yang mengandungi 1 μL cDNA. Semua pengukuran dilakukan dalam tiga kali ganda, dan BACTIN digunakan sebagai standard dalaman untuk pengiraan ΔCT. Analisis ekspresi gen dilakukan menggunakan primer berikut: PTGS2/COX-2 ke hadapan (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 songsang (GCAAACCGTAGATGCTCCAGGGA), CARS forward (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS reverse (GACCAGTGATGTCAACAGGA ke hadapan), (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 terbalik (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN ke hadapan (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) dan BACTIN terbalik (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).

pemindahan siRNA. Kajian knockdown genetik untuk ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 dan MFSD12 manusia telah dilakukan dalam talian sel A375P. Kajian perencatan genetik untuk tetikus Ppt1 dan Calreticulin telah dilakukan dalam sel MC38. SiRNA bukan sasaran (sc{{10}}), ULK1 manusia (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), tetikus Ppt1/Cln1 (sc-142398) dan Calreticulin /Calregulin (sc-29895) siRNA telah dibeli daripada Santa Cruz Biotechnology. SiRNA ini terdiri daripada kumpulan 3-5 siRNA khusus sasaran. Sitometri aliran. Aruhan ferroptosis diukur menggunakan C{33}} BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). Sel A375P telah disemai dalam 6-plat perigi dan dirawat dengan DMSO, ferrostatin{{40}} (10 μM), roxstatin bibir-1 (2 μM), elastin (5 μM ), DC661 (3 μM), atau gabungan selama 24 jam. Sel dituai dengan mengempar pada 300g selama 5 minit. Sel telah digantung semula dalam 500 μL 1X HBSS (Corning, 21-023-CV) yang mengandungi 1 μM C11-BODIPY dan diinkubasi pada 37 darjah selama 15 minit. Sel telah dipel dan digantung semula dalam 500 μL 1X HBSS, dan keamatan pendarfluor diukur pada cytometer BD LSRII menggunakan 530/30 Blue (Kemudahan Teras Aliran Universiti Pennsylvania). Kuantiti ekspresi permukaan sel calreticulin untuk kematian sel imunogenik dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini (45) oleh sitometri aliran. Sel B16F10 atau MC38 telah dibiakkan dan dirawat dengan NAC (10 mM) atau DC661 (3 μM) selama 24 jam. Sel MC38 telah dirawat dengan siPpt1 atau siNT selama 48 jam dengan kehadiran atau ketiadaan 10 mM NAC selama 24 jam. Sel telah diwarnai dengan antibodi CALR (Teknologi Isyarat Sel, 12238), antibodi kedua anti-arnab kambing Alexa Fluor 647 (Invitrogen), dan propidium iodide (PI) (Biolegend, 421301). Sampel berwarna diperoleh pada cytometer aliran BD LSRII menggunakan 710/50 Biru dan 670/30 Merah untuk menangkap pendarfluor PI dan CALR, masing-masing (kemudahan Teras Aliran Universiti Pennsylvania), dan analisis dihadkan kepada sel CALR-positif dan PI-negatif untuk mengelakkan kejadian positif palsu. Penyebuan sel T dan peratusan sitotoksisiti. Sel tumor B16 atau MC38 (5 × 104) telah dibiakkan dan dirawat dengan NAC (10 mM) atau DC661 (1 μM atau 3 μM), masing-masing selama, 24 jam. Untuk perencatan genetik Calr, sel MC38 dirawat dengan Calr siRNA atau nontarget siRNA (siNT) selama 48 jam, diikuti dengan rawatan sama ada DMSO atau 3 μM DC661 selama 24 jam. Splenosit kemudiannya dikultur dengan DC661 dengan atau tanpa sel B16 atau MC38 dengan kehadiran IL{102}} (5 IU/mL) dan dikultur bersama selama 72 jam. Penyebuan telah disahkan oleh IFN- ELISA (Biolegend, 430815) supernatan. Splenocytes prima kemudiannya dikultur dengan sel B16 atau MC38 yang baru dikultur dengan nisbah sasaran-ke-efektor (B16 atau MC38 kepada splenosit) masing-masing 1:20 dan 1:50 untuk sel B16 dan MC38. Pelepasan LDH yang berkaitan dengan kematian sel B16 atau MC38 dan kemudian peratusan sitotoksisiti diukur mengikut protokol pengilang (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Ujian vaksinasi antitumor dan kajian kemoterapi dengan model kanser yang mantap. Tikus betina WT C57BL/6, NOD/SCID dan BALB/c betina berusia enam hingga lapan minggu telah diperoleh daripada Makmal The Jackson. Untuk eksperimen vaksinasi antitumor, sel WT B16F10, MC38, dan CT26 dirawat dengan DC661 (3 μM) selama 36 jam dalam kelalang 175 cm2. Kemudian, supernatan dan sel tertanggal dikumpulkan dalam tiub falcon 50 mL. Sel-sel telah disentrifugasi dan dibasuh dengan PBS sejuk ais. Untuk vaksinasi, 150 μL penggantungan selular disuntik sc di rusuk kiri tikus C57BL/6 immunocompetent, tikus NOD/SCID immunodeficient (1.8 × 104 B16F10 sel, 1.5 × 106 MC38 sel setiap tetikus), atau tikus BALB/c syngeneik × 106 sel CT26 setiap tetikus). Sel-sel beku-cair yang digantung semula dalam PBS telah disuntik sebagai kawalan negatif. Seminggu kemudian, sel kanser hidup dari jenis yang sama (3 × 104 sel B16F10, 2 × 105 sel MC38 atau 5 × 105 sel CT26 setiap tetikus) dengan jumlah Matrigel yang sama (Corning, 354248) telah disuntik di sayap kanan daripada tikus yang divaksin. Tumor diukur menggunakan kaliper elektronik, dan isipadu dikira sebagai L × W2 × 0.5. Pertumbuhan tumor sentiasa dipantau untuk hari-hari berikutnya, dan ketiadaan tumor dianggap sebagai petunjuk pemvaksinan antitumor yang cekap. DC{170}}Kajian vaksinasi MC38 diulang dalam tikus NOD/SCID. Perangkaan. Kepentingan statistik ditentukan dengan menggunakan ujian t berekor 2-tidak berpasangan Pelajar apabila membandingkan 2 kumpulan. 1-cara ujian ANOVA digunakan apabila lebih daripada 2 kumpulan dibandingkan. Hipotesis nol ditolak dengan ketara jika nilai P kurang daripada 0.05. Data ditunjukkan sebagai min ± SEM. Kelulusan belajar. Semua eksperimen haiwan dilakukan mengikut protokol yang diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Universiti Pennsylvania.

Tumbuhan cistanche herba Cina-Antitumor

Rujukan

1. Zeh HJ, et al. Kajian praoperasi fasa II rawak perencatan autophagy dengan hydroxychloroquine dan gemcitabine / Nab-paclitaxel dos tinggi dalam pesakit kanser pankreas. Clin Cancer Res. 2020;26(13):3126–3134.

2. Rebecca VW, et al. PPT1 menggalakkan pertumbuhan tumor dan merupakan sasaran molekul derivatif klorokuin dalam kanser. Discov Kanser. 2019;9(2):220–229.

3. Brun S, et al. GNS561, perencat autophagy baru yang aktif terhadap sel stem kanser dalam karsinoma hepatoselular dan metastasis hepatik daripada kanser kolorektal. J Kanser. 2021;12(18):5432–5438.

4. Brun S, et al. GNS561, perencat PPT1 peringkat klinikal, adalah cekap terhadap karsinoma hepatoselular melalui modulasi fungsi lisosom. Autophagy. 2022;18(3):678–694.

5. Oberle C, et al. Permeabilisasi membran lisosom dan pelepasan cathepsin adalah peristiwa apoptosis yang bergantung kepada Bax/Bak, menguatkan dalam fibroblas dan monosit. Kematian Sel Berbeza. 2010;17(7):1167–1178.

6. Boya P, Kroemer G. Permeabilisasi membran lisosom dalam kematian sel. Onkogen. 2008;27(50):6434–6451.

7. Rebecca VW, et al. Pendekatan bersatu untuk menyasarkan peranan isyarat degradasi dan pertumbuhan lisosom. Discov Kanser. 2017;7(11):1266–1283.

8. Tang R, et al. Ferroptosis, nekroptosis, dan pyroptosis dalam imuniti antikanser. J Hematol Oncol. 2020;13(1):110.

9. Yamamoto K, et al. Autophagy menggalakkan pengelakan imun kanser pankreas dengan merendahkan MHCI. alam semula jadi. 2020;581(7806):100–105.

10. Deng J, et al. Perencatan ULK1 mengatasi persembahan antigen yang terjejas dan memulihkan imuniti antitumor dalam kanser paru-paru mutan LKB1. Kanser Nat. 2021;2(5):503–514.

11. Lazarou M, et al. ubiquitin kinase PINK1 merekrut reseptor autophagy untuk mendorong mitophagy. alam semula jadi. 2015;524(7565):309–314.

12. Choi YB, et al. TAX1BP1 menghalang apoptosis yang disebabkan oleh virus dengan memudahkan kemerosotan pengantara gatal-gatal penyesuai mitokondria MAVS. Biol Sel Mol. 2017;37(1):e00422-16.

13. Rikka S, et al. Bnip3 merosakkan bioenergetik mitokondria dan merangsang pusing ganti mitokondria. Kematian Sel Berbeza. 2011;18(4):721–731.

14. Leu JI, et al. Asas mekanistik untuk ferroptosis terjejas dalam sel yang menyatakan varian S47 berpusat Afrika p53. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.

15. Erkes DA, et al. Perencat BRAF dan MEK mutan mengawal persekitaran mikro imun tumor melalui pyroptosis. Discov Kanser. 2020;10(2):254–269.

16. Serrano-Puebla A, Boya P. Permeabilisasi membran lisosom dalam kematian sel: bukti dan implikasi baru untuk kesihatan dan penyakit. Ann NY Acad Sci. 2016;1371(1):30–44.

17. Thirusangu P, et al. Autophagy yang disebabkan oleh Quinacrine dalam kanser ovari mencetuskan permeabilisasi membran lisosom/mitokondria yang dimediasi cathepsin-L dan kematian sel. Kanser (Basel). 2021;13(9):2004.

18. Michaellet MC, et al. Apoptosis yang bergantung kepada Cathepsin yang dicetuskan oleh pengaktifan supraoptimal limfosit T: kemungkinan mekanisme toleransi dos yang tinggi. J Immunol. 2004;172(9):5405–5414.

19. Mondal A, et al. Kekurangan Ppt1-mendisregulasi homeostasis Ca++ lisosom yang menyumbang kepada patogenesis dalam model tetikus penyakit CLN1. J Mewarisi Dis. 2022;45(3):635–656. 20. Engel KM, et al. Fosfolipase dan spesies oksigen reaktif memperoleh biomarker lipid dalam manusia dan haiwan yang sihat dan berpenyakit - tumpuan pada lisophosphatidylcholine. Fisiol Depan. 2021;12:732319.

21. Fu R, et al. Keberkesanan N-acetylcysteine ​​​​dalam penindasan fenotip model tetikus penyakit Niemann-Pick, jenis C1. Hum Mol Genet. 2013;22(17):3508–3523.

22. Boz Z, et al. N-acetylcysteine ​​menghalang tekanan oksidatif yang disebabkan oleh olanzapine dalam mHypoA-59 neuron hipotalamus. Sci Rep. 2020;10(1):19185.

23. Khare S, et al. ASS1 dan ASL menyekat pertumbuhan dalam karsinoma sel renal sel yang jelas melalui metabolisme nitrogen yang diubah. Metab Kanser. 2021;9(1):40.

24. Gęgotek A, et al. Perbandingan kesan perlindungan asid askorbik pada interaksi sistem redoks dan endokannabinoid secara in vitro kultur fibroblas kulit manusia yang terdedah kepada sinaran UV dan hidrogen peroksida. Arch Dermatol Res. 2017;309(4):285–303.

25. De Raedt T, et al. Mengeksploitasi kelemahan sel kanser untuk membangunkan terapi gabungan untuk tumor yang didorong oleh ras. Sel Kanser. 2011;20(3):400–413.

26. Zhang X, et al. Memantau peroksidasi lipid dalam sel buih dengan probe boleh disasarkan lisosom dan ratiometrik. Kimia Dubur. 2015;87(16):8292–8300.

27. Wei CY, et al. Analisis berasaskan bioinformatik mendedahkan peningkatan MFSD12 sebagai penggalak utama percambahan sel dan sasaran terapeutik yang berpotensi dalam melanoma. Onkogen. 2019;38(11):1876–1891.

28. Aldini G, et al. N-Acetylcysteine ​​sebagai agen pemecah antioksidan dan disulfida: sebab mengapa. Percuma Radic Res. 2018;52(7):751–762. 29. Abu-Remaileh M, et al. Metabolomik lisosom mendedahkan peraturan V-ATPase- dan mTOR yang bergantung kepada pengeluaran asid amino daripada lisosom. Sains. 2017;358(6364):807–813.

30. Zhou J, et al. Kematian sel imunogenik dalam terapi kanser: Pendorong masa kini dan muncul. J Sel Mol Med. 2019;23(8):4854–4865. 31. Sharma G, et al. Perencatan PPT1 meningkatkan aktiviti antitumor antibodi anti-PD-1 dalam melanoma. JCI Insight. 2020;5(17):e133225.

32. Mehnert JM, et al. BAMM (BRAF autophagy dan perencatan MEK dalam melanoma): percubaan fasa I/II dabrafenib, trametinib dan hydroxychloroquine dalam BRAFV600-melanoma mutan lanjutan. Clin Cancer Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. Loi M, et al. Protein Macroautophagy mengawal tahap MHC kelas I pada sel dendritik dan membentuk tindak balas sel T CD8(+) anti-virus. Rep Sel. 2016;15(5):1076–1087.

34. Jouandin P, et al. Mobilisasi sistein lisosom membentuk tindak balas TORC1 dan pertumbuhan tisu kepada puasa. Sains. 2022;375(6582):eabc4203.

35. Schwalfenberg GK. N-acetylcysteine: kajian semula kegunaan klinikal (ubat lama dengan helah baru). J Nutr Metab. 2021;2021:9949453.

36. Beer LA, et al. Penemuan sistematik biomarker serum kehamilan ektopik menggunakan 3-profil protein D ditambah dengan kuantiti tanpa label. J Proteome Res. 2011;10(3):1126–1138. 37. Goldman AR, et al. Kesan utama pada proteom karsinoma sel jernih ovari yang bermutasi ARID1A ialah penurunan regulasi laluan mevalonat pada tahap pasca transkripsi. Proteomik Sel Mol. 2016;15(11):3348–3360.

38. Cox J, Mann M. MaxQuant membolehkan kadar pengenalpastian peptida yang tinggi, ketepatan jisim julat ppb individu, dan kuantifikasi protein seluruh proteom. Nat Biotechnol. 2008;26(12):1367–1372.

39. Cox J, et al. Andromeda: enjin carian peptida yang disepadukan ke dalam persekitaran MaxQuant. J Proteome Res. 2011;10(4):1794–1805.

40. Cox J, et al. Kuantifikasi bebas label proteom yang tepat dengan normalisasi tertunda dan pengekstrakan nisbah peptida maksimum, yang dipanggil MaxLFQ. Proteomik Sel Mol. 2014;13(9):2513–2526.

41. Tyanova S, et al. Platform pengiraan Perseus untuk analisis komprehensif data (prote)omics. Kaedah Nat. 2016;13(9):731–740.

42. Tyanova S, Cox J. Perseus: platform bioinformatik untuk analisis integratif data proteomik dalam penyelidikan kanser. Kaedah Mol Biol. 2018;1711:133–148.

43. Alicea GM, et al. Perubahan dalam metabolisme lipid fibroblast yang berumur mendorong rintangan sel melanoma yang bergantung kepada usia kepada terapi yang disasarkan melalui pengangkut asid lemak FATP2. Discov Kanser. 2020;10(9):1282–1295.

44. Ran FA, et al. Kejuruteraan genom menggunakan sistem CRISPR-Cas9. Nat Protoc. 2013;8(11):2281–2308.

45. Liu P, et al. Kuantiti pendedahan calreticulin yang dikaitkan dengan kematian sel imunogenik. Kaedah Enzim. 2020;632:1–13.