Disregulasi RNA Elemen Boleh Alih dalam Spheroid Kanser Paru-paru 3D KRAS(G12C) Mutant
Oct 27, 2023
ABSTRAK
KRAS Mutant mengawal selia RNA unsur transposable (TE) dan ekspresi gen yang dirangsang interferon (ISG), tetapi masih tidak jelas sama ada mutasi pelbagai dalam KRAS menjejaskan RNA TE yang berbeza di seluruh genom. Kami menganalisis transkrip sferoid kanser paru-paru manusia 3D yang mempunyai mutasi KRAS (G12C) untuk menentukan landskap TE RNA yang dikawal oleh KRAS (G12C) mutan. Kami mendapati bahawa isyarat KRAS (G12C) diperlukan untuk ekspresi TE RNA yang diperolehi LINE dan LTR yang berbeza daripada RNA TE yang sebelum ini ditunjukkan dikawal oleh KRAS (G12D) atau KRAS (G12V) mutan. Selain itu, perencatan KRAS (G12C) secara khusus mengimbangi TE RNA yang berasal dari SINE daripada subfamili Alu termuda AluY. Keputusan kami mendedahkan bahawa disregulasi TE RNA dalam sel-sel kanser paru-paru yang didorong oleh KRAS adalah bergantung kepada mutasi, sementara juga menonjolkan subset TE RNA yang berasal dari Alu muda yang secara selaras diaktifkan dengan gen imuniti semula jadi apabila perencatan KRAS (G12C).
Kebaikan cistanche tubulosa-Antitumor
PENGENALAN
RNA unsur transposable (TE) didisregulasi berulang kali dalam konteks kanser 1. Dalam sel-sel kanser paru-paru KRAS mutan, gen zink-jari KRAB (KZNF) dikurangkan secara meluas, yang membawa kepada pengawalseliaan menyimpang RNA TE yang diperoleh daripada LINE, SINE, dan Elemen LTR 2,3. Selain RNA TE, RNA bukan pengekodan panjang (lncRNA) juga dikawal selia dengan gen isyarat RAS 4, dan corak ekspresinya juga diubah dalam banyak kanser 5-8. Bagi TE RNA, regulasi mereka dalam kanser mendorong keadaan mimik virus, yang membawa kepada pengaktifan intrinsik gen imuniti semula jadi seperti gen yang dirangsang interferon (ISGs) 3,9,10. Khususnya, keluarga SINE Alu adalah sumber utama RNA TE 11 imunogenik, yang disebabkan oleh perubahan epigenetik yang disebabkan oleh perencat metiltransferase DNA (DNMTi) atau perencatan KZNF yang dimediasi KRAS mutan 3,9,10.
Untuk menyiasat bagaimana mutasi biasa dalam KRAS mempengaruhi landskap TE RNA dalam sel-sel kanser paru-paru, kami mencirikan transkriptom spheroid kanser paru-paru 3D yang mempunyai mutasi KRAS(G12C) dengan kehadiran atau ketiadaan perencat KRAS(G12C) mutan 12. Kami menunjukkan bahawa isyarat KRAS(G12C) diperlukan untuk ekspresi TE RNA terbitan LINE dan LTR, manakala perencatan KRAS(G12C) secara khusus mengimbangi kedua-dua TE RNA terbitan SINE dan subset gen berkaitan interferon (IFN). Penemuan kami mendedahkan interaksi kompleks antara isyarat KRAS mutan dan disregulasi TE dalam sel-sel kanser paru-paru, di mana satu set elemen AluY muda yang ditentukan dikawal dengan cara yang bergantung kepada mutasi.
Kebaikan cistanche tubulosa-Antitumor
KEPUTUSAN
Perencatan KRAS(G12C) mengubah transkrip pengekodan dan bukan pengekodan
Untuk menentukan cara isyarat KRAS(G12C) onkogenik mengawal transkrip pengekodan dan bukan pengekodan, kami melakukan penjujukan RNA (RNA-seq) pada sferoid kanser paru-paru KRAS(G12C) mutan 3D. Untuk RNA-seq, kami menggunakan protokol penuh dengan pengecam molekul unik (UMI) 5' untuk membolehkan pengiraan RNA yang tepat sambil mengurangkan bias amplifikasi PCR 13 (Rajah 1A). Kami membandingkan transkrip sferoid kanser paru-paru H358 yang dirawat dengan perencat KRAS(G12C) ARS-1620 (ARS) untuk mengawal spheroid (dirawat DMSO) (Rajah S1A) dan melihat bahawa rawatan ARS telah mengurangkan tahap ERK terfosforilasi dengan ketara. (p-ERK) (Rajah S1B), menunjukkan bahawa rawatan ARS menghalang isyarat KRAS (G12C) hiliran. Penindasan isyarat KRAS (G12C) oleh rawatan ARS juga dibuktikan dengan pengurangan saiz spheroid dan daya maju sel (Rajah S1C dan S1D).
Di peringkat RNA, kami menilai kelimpahan relatif biotip berbeza dan superfamili TE dalam spheroid kanser paru-paru 3D yang dirawat ARS- atau DMSO, yang mendedahkan perubahan dinamik dalam komposisi RNA TE apabila perencatan KRAS (G12C) (Rajah 1B). Walaupun kami mengesan hanya 32% daripada gen pengekodan protein beranotasi GENCODE dan 15% daripada gen lncRNA, 92-96% superfamili TE (92% LTR, 95% SINE, 96% LINE) telah diwakili dalam teg UMI kami Data RNA-seq, mendedahkan disregulasi luas RNA TE dalam transkrip yang dipacu KRAS (G12C). Sehingga satu perempat daripada semua molekul RNA yang dikesan dalam spheroid kanser paru-paru yang dirawat ARS diperoleh daripada TE, menunjukkan bahawa RNA TE mewakili sebahagian besar daripada keluaran transkrip sel-sel kanser paru-paru KRAS(G12C) mutan.
manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun
Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity
【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Kami seterusnya menentukan gen yang dinyatakan secara ketara di antara spheroid kanser paru-paru 3D yang dirawat ARS dan DMSO untuk mengenal pasti proses biologi yang dikawal oleh isyarat KRAS (G12C) onkogenik. Spheroid kanser paru-paru dengan isyarat KRAS (G12C) yang utuh diperkaya dengan ketara untuk gen yang terlibat dalam pusat pemeriksaan G2M, sasaran E2F, sasaran MYC, dan gelendong mitosis (Rajah 1C). Walau bagaimanapun, selepas perencatan KRAS (G12C), spheroid kanser paru-paru menyatakan tahap gen yang lebih tinggi yang terlibat dalam fosforilasi pengoksidaan, pelengkap, dan tindak balas alfa dan gamma IFN (Rajah 1C), memberikan bukti sokongan lanjut untuk penglibatan isyarat KRAS dalam peraturan. gen berkaitan IFN 2,3.
Perencatan KRAS(G12C) secara koordinat mendorong ISG dan unsur AluY muda
Untuk menjelaskan lebih lanjut regulasi intrinsik ISG apabila perencatan KRAS (G12C), kami mengenal pasti gen dan TE mana yang dinyatakan secara signifikan secara berbeza dalam setiap set gen dan superfamili TE. Merentasi kedua-dua gen tindak balas gamma IFN alfa dan IFN, gen yang paling kuat disebabkan oleh perencatan KRAS(G12C) dalam spheroid kanser paru-paru ialah RTP4 (Rajah 2A), protein pengangkut reseptor yang mengawal isyarat TBK1 secara negatif 14. Selain itu, kompleks kelas I MHC gen beta-2-microglobulin (B2M), yang dinyahaktifkan berulang kali dalam kanser paru-paru 15, juga dikawal dengan ketara dalam kedua-dua set gen berkaitan IFN dalam spheroid kanser paru-paru yang dirawat ARS (Rajah 2A).
Memandangkan peranan langsung untuk isyarat KRAS onkogenik dalam peraturan TE RNA 3, kami menyiasat subfamili TE RNA yang bergantung kepada KRAS mutan (G12C). Dalam spheroid kanser paru-paru dengan isyarat KRAS (G12C) utuh, kami mendapati bahawa subfamili LINE L1M6B dan L1PA12 sangat dinyatakan dan bergantung kepada KRAS (G12C), seperti yang dibuktikan oleh downregulation mereka dalam spheroid kanser paru-paru yang dirawat dengan ARS (Rajah 2B). Selain itu, walaupun hanya satu subkeluarga DNA MER44D bergantung pada isyarat KRAS(G12C), lebih sedozen subfamili LTR dikawal oleh KRAS(G12C) mutan, termasuk MLT1A0-int, LTR51, MER50B , dan LTR1B0 (Rajah 2B). Sebaliknya, subfamili SINE semuanya dikawal dengan ketara apabila perencatan KRAS (G12C) dan secara selaras diinduksi dengan gen ISG tertentu (Rajah 2A) dalam spheroid kanser paru-paru. RNA SINE TE ini semuanya berasal daripada subfamili AluY (Rajah 2B), menunjukkan bahawa perencatan KRAS (G12C) mendisregulasi subset tertentu unsur AluY muda.
Perencatan KRAS(G12C) mengecilkan RNA bukan pengekodan yang panjang
Untuk menjelaskan lebih lanjut kesan perencatan KRAS (G12C) pada transkrip, kami memeriksa semua lncRNA yang dinyatakan secara signifikan dalam spheroid kanser paru-paru yang dirawat dengan kawalan ARS atau DMSO. Kami mendapati bahawa sebilangan besar lncRNA bergantung kepada isyarat KRAS (G12C) untuk ekspresi mereka, kerana kebanyakan lncRNA ini telah dikurangkan dengan ketara apabila perencatan KRAS (G12C) (Rajah 3A). Tiga daripada lncRNA yang dikurangkan ini, AC114546.3, NCMAP-DT, dan AC073575.2, tidak mempunyai fungsi yang diketahui tetapi bertindih dalam orientasi antisense kepada gen pengekodan ZNF770, RCAN3, dan ERP29, masing-masing. Sebagai kelas RNA bukan pengekodan, kami memerhatikan pengurangan lncRNA yang luas semasa rawatan ARS dalam spheroid kanser paru-paru (Rajah 3B), menunjukkan bahawa banyak lncRNA bergantung pada isyarat KRAS (G12C) untuk ekspresi mereka.
manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun
PERBINCANGAN
Di sini kami menunjukkan bahawa isyarat KRAS(G12C) onkogenik diperlukan untuk ekspresi superfamili TE tertentu, iaitu elemen LINE dan LTR, serta subset lncRNA, seterusnya menunjukkan cara isyarat RAS mengawal transkriptom bukan pengekodan 2-4. Kami juga menggunakan model sferoid kanser paru-paru 3D untuk eksperimen perencat KRAS(G12C) kami memandangkan model 3D telah ditunjukkan untuk merumuskan semula tindak balas ubat in vivo dengan lebih tepat jika dibandingkan dengan model kultur 2D 16. Tambahan pula, aplikasi penuh berasaskan UMI kami -teknik RNA-seq panjang 13 membolehkan kami menangkap komposisi dan dinamik RNA TE dengan lebih tepat dalam sferoid kanser paru-paru kami dengan mengalih keluar pendua PCR dalam data RNA-seq kami.
Penemuan kami adalah konsisten dengan kajian terdahulu tentang perencatan KRAS(G12C), di mana gen tindak balas alfa dan gamma IFN dikawal dalam sel-sel kanser paru-paru H358 yang dirawat ARS 17. Berdasarkan sifat imunogenik yang diketahui RNA yang diperolehi Alu 11, keputusan kami mencadangkan bahawa penyelarasan khusus unsur-unsur AluY muda apabila perencatan KRAS(G12C) sekurang-kurangnya sebahagiannya bertanggungjawab untuk pengawalseliaan kuat ISG dalam spheroid kanser paru-paru yang dirawat ARS. Terutamanya, pengayaan gen berkaitan IFN yang ketara sebagai tindak balas kepada rawatan perencat KRAS(G12C) tidak termasuk pengawalseliaan lanjut ISG sensor RNA seperti MDA-5, RIG-I atau PKR, yang pada mulanya menjadi dikawal selia dalam sel paru-paru sebagai tindak balas kepada isyarat KRAS onkogenik 2,3.
Kami sebelum ini telah menunjukkan bahawa isyarat KRAS mutan sahaja mencukupi untuk mendorong regulasi TE RNA dalam sel paru-paru manusia yang telah diubah secara in vitro 2, 3 , dan keputusan kami yang diterangkan di sini memanjangkan pemerhatian ini kepada sel-sel kanser paru-paru dengan mutasi KRAS mengaktifkan yang berbeza. Mutasi KRAS (G12D) atau KRAS (G12V) kedua-duanya mendorong pengawalseliaan ketara subfamili LTR12C dalam sel paru-paru yang diubah 3, tetapi kami tidak melihat pengayaan ketara TE RNA yang diperolehi LTR12C dalam sferoid kanser paru-paru KRAS (G12C) kami. Sebaliknya, kami melihat penyeliaan LTR51, LTR1B0, LTR14B dan LTR28B, menunjukkan bahawa mutasi perolehan fungsi yang pelbagai dalam KRAS mengawal aspek berbeza transkrip RNA TE.
Kerja kami menyediakan penilaian komprehensif tentang cara transkrip RNA bukan pengekodan/TE bertindak balas secara dinamik kepada perencatan KRAS(G12C). Kajian masa depan mungkin memberikan pandangan baharu tentang potensi peranan RNA bukan pengekodan/TE dalam mekanisme rintangan perencat KRAS(G12C). Tambahan pula, RNA TE yang dirembeskan daripada sel kanser apabila perencatan KRAS boleh berfungsi sebagai biomarker RNA ekstraselular 2,3,5,18,19 tindak balas dan/atau penentangan terhadap terapi perencat KRAS 20.
BAHAN DAN KAEDAH
Talian sel
Barisan sel kanser paru-paru H358 yang mengandungi mutasi KRAS(G12C) telah dibiakkan dalam medium RPMI 1640 (Invitrogen) ditambah dengan 10% serum lembu janin (Sigma) pada 37 darjah, 5% CO2 dalam inkubator yang dilembapkan. Semua garisan sel diuji negatif untuk mycoplasma. Talian sel telah dibeli daripada American Type Culture Collection (ATCC).
Ujian daya maju sel
Untuk ujian daya maju spheroid, 10,000 sel/telaga telah disemai dalam plat telaga bulat 96-lekatan rendah dan diinkubasi pada 37 darjah , 5% CO2 selama 24 jam. Kemudian ARS yang dicairkan secara bersiri- 1620 atau DMSO ditambahkan pada sel dan plat diinkubasi dalam keadaan kultur standard selama 72 jam, dengan media ARS dan DMSO segar diganti setiap hari. Daya tahan sel diukur menggunakan kit Ujian Daya Daya Sel Bercahaya Sel Titer-Glo® (Promega) mengikut protokol pengilang. Isyarat luminescence sampel yang dirawat ARS telah dinormalisasi kepada kawalan DMSO. Luminescence diukur pada peranti molekul SpectraMax iD3.
Pengasingan RNA
Jumlah RNA pukal telah diasingkan daripada kira-kira 100 spheroid H358 (setiap keadaan) menggunakan kit Penyediaan Mini-RNA Cepat (Zymogen) mengikut protokol pengilang. RNA telah dikira melalui NanoDrop-8000 Spectrophotometer.
Penyediaan perpustakaan RNA-seq
Protokol Smart-seq3 13 yang disesuaikan telah digunakan untuk menjana perpustakaan RNA-seq daripada jumlah RNA untuk mengira dan menilai molekul RNA panjang penuh. Secara ringkas, 10ng daripada jumlah RNA telah ditranskripsi terbalik menggunakan primer oligoDT berkod bar (125nM) diikuti dengan penukaran templat dengan suis templat berkod bar oligo (125nM). Urutan oligo ini berfungsi sebagai primer untuk penguatan PCR. Kit HT Nextera (Illumina) digunakan untuk menukar perpustakaan cDNA kepada perpustakaan penjujukan dengan penambahan primer khusus UMI untuk menguatkan hujung cDNA yang mengandungi kod bar molekul seperti yang diterangkan dalam protokol Smart-seq3. kualiti cDNA dan perpustakaan dinilai menggunakan cip kepekaan tinggi DNA bioanalyzer Agilent dan dikira menggunakan ujian DNA sensitiviti tinggi pada Qubit 3.0.
penghapusan Barat
Kira-kira 100 spheroid H358 (setiap keadaan) telah diasingkan selepas rawatan ARS atau DMSO. Spheroids kemudian diinkubasi pada ais dalam penampan RIPA ditambah dengan perencat protease selama 15 minit. Lysates kemudiannya dipusing pada 10,000 RCF selama 10 minit. Supernatan kemudiannya dipindahkan ke tiub baru untuk persediaan sampel SDS-PAGE berikutnya dalam penimbal Laemmli, direbus selama 5 minit pada suhu 95 C untuk kepekatan akhir 1mg/ml. SDS PAGE dilakukan untuk memisahkan protein mengikut saiz diikuti dengan pemindahan seterusnya ke membran PVDF. Membran diinkubasi dengan antibodi p-ERK (CST) dan HSP90 (CST) primer semalaman pada suhu 4 C. Antibodi sekunder (Abcam) kemudiannya diinkubasi pada 3 kali membran yang dibasuh TBST dalam penampan menyekat untuk pengimejan seterusnya.
manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun
deduplikasi UMI
Bacaan illumina hujung berpasangan telah dipangkas menggunakan FastP 21 dengan tetapan lalai. UMI telah diekstrak daripada bacaan dan dialihkan ke nama baca menggunakan _alat_umi daripada pakej UMI-tools 22 dengan corak kod bar ditetapkan kepada "NNNNNNNN". Bacaan yang dikeluarkan oleh UMI telah diselaraskan dengan HG38 menggunakan penjajar STAR dengan set anotasi GENCODE v38. Bacaan sejajar telah dinyahduplikasi menggunakan "UMI-tools dedup" dengan tetapan lalai.
Analisis RNA-seq
Semua fail fastq telah dipangkas dengan Trimmomatic 2 (0.38) 23 dan fail dipangkas yang terhasil dinilai dengan FastQC 24 dan kemudian diproses dengan saluran paip analitik berikut: Salmon (1.3.0): penjajaran semu RNA -seq bacaan dilakukan dengan Salmon 25 menggunakan argumen berikut: {{1{{20}}}}validateMappings –gcBias --seqBias --recoverOrphans --rangeFactorizationBins 4 using indeks yang dicipta daripada fail fasta transkriptom GENCODE versi 35 menggunakan jujukan umpan untuk mendayakan penjajaran terpilih. Indeks tambahan, TE-sedar dicipta dengan cara yang sama tetapi ditambah dengan jujukan yang dijana daripada runut UCSC Repeat Masker. DESeq2 (1.32.0): Output salmon telah diimport ke dalam objek DESeq menggunakan tximport 26 dan analisis ungkapan pembezaan dilakukan dengan argumen standard 27. Semua keputusan telah ditapis untuk mempunyai padj < 0.05. Di mana data kiraan digunakan, ia telah dinormalisasi merentas sampel menggunakan DESeq.
Analisis pengayaan set gen
Gen yang dinyatakan secara berbeza disenaraikan oleh nilai log2FoldChange yang mengecut yang dihasilkan oleh DESeq2. Set gen telah diperoleh menggunakan pakej R msigdbr (7.4.1) dan ditapis untuk hanya mengandungi set gen dengan status 'Hallmark'. Pakej R fgsea (1.18.0) telah digunakan untuk menjana anggaran Pengayaan Set Gen yang ditapis kepada hasil dengan nilai p terlaras < 0.05.
RUJUKAN
1. Burns, KH (2017). Unsur boleh alih dalam kanser. Nat Rev Cancer 17, 415-424. 10.1038/nrc.2017.35.
2. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L., Kim, E., Malik, S., Fernandes, J., et al. (2020). Pemrograman semula epigenomik RNA bukan pengekodan berulang dan gen yang dirangsang IFN oleh KRAS mutan. bioRxiv, 2020.2011.2004.367771. 10.1101/2020.11.04.367771.
3. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Hrabeta-Robinson, E., Behera, A., Peddu, V., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L ., et al. (2022). KRAS Mutant mengawal RNA unsur transposable dan imuniti semula jadi melalui gen zink-jari KRAB. Laporan Sel 40. 10.1016/j.celrep.2022.111104.
4. Kim, DH, Marinov, GK, Pepke, S., Penyanyi, ZS, He, P., Williams, B., Schroth, GP, Elowitz, MB dan Wold, BJ (2015). Analisis transkriptom sel tunggal mendedahkan perubahan dinamik dalam ekspresi lncRNA semasa pengaturcaraan semula. Sel Stem Sel 16, 88-101. 10.1016/j.stem.2014.11.005.
5. Reggiardo, RE, Maroli, SV dan Kim, DH (2022). LncRNA Biomarker Keradangan dan Kanser. Adv Exp Med Biol 1363, 121-145. 10.1007/978-3-030-92034-0_7.
6. Schmitt, AM, dan Chang, HY (2016). RNA Bukan Pengekodan Panjang dalam Laluan Kanser. Sel Kanser 29, 452-463. 10.1016/j.ccell.2016.03.010.
7. Rinn, JL, and Chang, HY (2020). RNA Bukan Pengekodan Panjang: Modaliti Molekul kepada Fungsi Organisme. Annu Rev Biochem 89, 283-308. 10.1146/annurev-biochem- 062917-012708.
8. Slack, FJ dan Chinnaiyan, AM (2019). Peranan RNA Bukan pengekodan dalam Onkologi. Sel 179, 1033-1055. 10.1016/j.sel.2019.10.017.
9. Chiappinelli, Katherine B., Strissel, Pamela L., Desrichard, A., Li, H., Henke, C., Akman, B., Hein, A., Rote, Neal S., Cope, Leslie M. , Snyder, A., et al. (2015). Menghalang Metilasi DNA Menyebabkan Tindak Balas Interferon dalam Kanser melalui dsRNA Termasuk Retrovirus Endogen. Sel 162, 974-986. 10.1016/j.sel.2015.07.011.
10. Roulois, D., Loo Yau, H., Singhania, R., Wang, Y., Danesh, A., Shen, Shu Y., Han, H., Liang, G., Jones, Peter A., Pugh, Trevor J., et al. (2015). Agen Penyahmetilasi DNA Mensasarkan Sel Kanser Kolorektal dengan Mendorong Mimik Viral oleh Transkrip Endogen. Sel 162, 961-973. 10.1016/j.sel.2015.07.056.
11. Mehdipour, P., Marhon, SA, Ettayebi, I., Chakravarthy, A., Hosseini, A., Wang, Y., de Castro, FA, Loo Yau, H., Ishak, C., Abelson, S ., et al. (2020). Terapi epigenetik mendorong transkripsi SINE terbalik dan pergantungan ADAR1. Alam 588, 169-173. 10.1038/s41586-020-2844-1.
12. Ostrem, JM, Peters, U., Sos, ML, Wells, JA, dan Shokat, KM (2013). Perencat K-Ras(G12C) mengawal secara alosteri pertalian GTP dan interaksi efektor. Alam Semula Jadi 503, 548- 551. 10.1038/alam12796.
13. Hagemann-Jensen, M., Ziegenhain, C., Chen, P., Ramskold, D., Hendriks, GJ, Larsson, AJM, Faridani, OR, dan Sandberg, R. (2020). RNA sel tunggal mengira pada resolusi alel dan isoform menggunakan Smart-seq3. Nat Biotechnol 38, 708-714. 10.1038/s41587-020- 0497-0.
14. He, X., Ashbrook, AW, Du, Y., Wu, J., Hoffmann, HH, Zhang, C., Xia, L., Peng, YC, Tumas, KC, Singh, BK, et al. (2020). RTP4 menghalang tindak balas IFN-I dan meningkatkan eksperimen malaria serebrum dan neuropatologi. Proc Natl Acad Sci USA 117, 19465- 19474. 10.1073/pnas.2006492117.
15. Pereira, C., Gimenez-Xavier, P., Pros, E., Pajares, MJ, Moro, M., Gomez, A., Navarro, A., Condom, E., Moran, S., Gomez- Lopez, G., et al. (2017). Pemprofilan Genomik Xenograf Terbitan Pesakit untuk Kanser Paru-Paru Mengenalpasti Penyahaktifan B2M Menjejaskan Imunorecognition. Clin Cancer Res 23, 3203-3213. 10.1158/1078-0432.CCR-16-1946.
16. Sen, C., Freund, D., dan Gomperts, BN (2022). Model tiga dimensi paru-paru: masa lalu, sekarang dan masa depan: tinjauan mini. Biochem Soc Trans 50, 1045-1056. 10.1042/BST20190569. 17. Mugarza, E., van Maldegem, F., Boumelha, J., Moore, C., Rana, S., Llorian Sopena, M., East, P., Ambler, R., Anastasiou, P., Romero -Clavijo, P., et al. (2022). Perencatan KRAS (G12C) terapeutik memacu imuniti antitumor pengantara interferon yang berkesan dalam kanser paru-paru imunogenik. Sci Adv 8, eabm8780. 10.1126/sciadv.abm8780.
18. Khojah, R., Reggiardo, RE, Ozen, M., Maroli, SV, Carrillo, D., Demirci, U., dan Kim, DH (2022). Tandatangan RNA ekstraselular sel adenokarsinoma paru-paru KRAS(G12C) mutan. bioRxiv, 2022.2002.2023.481574. 10.1101/2022.02.23.481574.
19. Wang, J., Ma, P., Kim, DH, Liu, BF, dan Demirci, U. (2021). Ke Arah Pengasingan dan Pengesanan Eksosom Berasaskan Mikrofluid untuk Terapi Tumor. Nano Hari Ini 37. 10.1016/j.nantod.2020.101066.
20. Moore, AR, Rosenberg, SC, McCormick, F., dan Malek, S. (2021). Terapi yang disasarkan RAS. Nat Rev Drug Discov. 10.1038/s41573-021-00220-6.
21. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., dan Gu, J. (2018). fastp: prapemproses FASTQ semua-dalam-satu ultra-pantas. Bioinformatik 34, i884-i890. 10.1093/bioinformatik/bty560.
22. Smith, T., Heger, A., dan Sudbery, I. (2017). UMI-tools: memodelkan ralat penjujukan dalam Pengecam Molekul Unik untuk meningkatkan ketepatan kuantifikasi. Genome Res 27, 491- 499. 10.1101/gr.209601.116.
23. Bolger, AM, Lohse, M., dan Usadel, B. (2014). Trimmomatik: pemangkas fleksibel untuk data jujukan Illumina. Bioinformatik 30, 2114-2120. 10.1093/bioinformatik/btu170.
24. Brown, J., Pirrung, M., dan McCue, LA (2017). Papan Pemuka FQC: menyepadukan hasil FastQC ke dalam alat kawalan kualiti FASTQ berasaskan web, interaktif dan boleh diperluaskan. Bioinformatik. 10.1093/bioinformatik/btx373.
25. Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA, dan Kingsford, C. (2017). Salmon menyediakan kuantifikasi transkrip yang cepat dan sedar berat sebelah. Kaedah Nat 14, 417-419. 10.1038/nmeth.4197.
26. Soneson, C., Love, MI, dan Robinson, MD (2015). Analisis pembezaan untuk RNA-seq: anggaran peringkat transkrip meningkatkan inferens peringkat gen. F1000Res 4, 1521. 10.12688/f1000research.7563.2.
27. Love, MI, Huber, W., and Anders, S. (2014). Anggaran sederhana perubahan lipatan dan penyebaran untuk data RNA-seq dengan DESeq2. Genome Biol 15, 550. 10.1186/s13059-014- 0550-8.
PENGHARGAAN
Kami berterima kasih kepada ahli Kim Lab atas perbincangan yang berguna. Kerja ini disokong oleh dana daripada Baskin School of Engineering (kepada DHK). DC disokong oleh Anugerah Predoctoral Fellowship daripada Program Penyelidikan Penyakit Berkaitan Tembakau (T30DT0997), RER disokong oleh F99/K00 NIDDK KUH Predoctoral to Postdoctoral Fellow Transition Award daripada National Institutes of Health (1F99DK{ {7}}), dan VP disokong oleh Anugerah Predoctoral Fellowship daripada Program Penyelidikan Penyakit Berkaitan Tembakau (T32DT4904).
SUMBANGAN PENULIS
Penyelidikan berkonsepkan DHK, penyelidikan reka bentuk DC dan DHK, DC, JL dan GM melakukan eksperimen, data analisis RER dan VP, dan DC dan DHK menulis kertas dengan input daripada pengarang.
ANGKA
Rajah 1. Perencatan KRAS(G12C) mengubah transkrip pengekodan dan bukan pengekodan A. Skema eksperimen. B. Taburan kiraan yang diberikan kepada pengekodan GENCODE, lncRNA dan TE/ulang superfamili dalam pustaka sferoid RNA-seq kanser paru-paru yang dirawat ARS (ars) atau DMSO (dmso), di mana setiap lajur mewakili replika biologi. C. Keputusan Analisis Pengayaan Set Gen yang ketara diperhatikan dalam sferoid kanser paru-paru yang dirawat DMSO (kanan, NES positif) atau dirawat ARS (kiri, NES negatif) menggunakan gen yang dinyatakan secara berbeza yang disenaraikan mengikut skor pengayaan normal (NES).
Rajah 2. Perencatan KRAS(G12C) secara koordinat mendorong ISG dan unsur AluY muda
A. Plot gunung berapi yang menggambarkan ekspresi pembezaan ketara yang diperhatikan dalam set gen utama antara sferoid kanser paru-paru yang dirawat DMSO (kanan, perubahan lipatan positif) atau ARS (kiri, perubahan lipatan negatif). B. Plot gunung berapi yang menggambarkan ekspresi pembezaan ketara yang diperhatikan dalam superfamili TE antara sferoid kanser paru-paru yang dirawat DMSO (kanan, perubahan lipatan positif) atau ARS (kiri, perubahan lipatan negatif).
Rajah 3. Perencatan KRAS(G12C) mengecilkan RNA bukan pengekodan yang panjang
A. Plot gunung berapi bagi ekspresi pembezaan ketara RNA pengekodan protein GENCODE dan lncRNA antara sferoid kanser paru-paru yang dirawat DMSO (kanan, perubahan lipatan positif) atau ARS (kiri, perubahan lipatan negatif). B. Plot kotak ekspresi pembezaan ketara RNA pengekodan protein GENCODE dan lncRNA antara spheroid kanser paru-paru (Wilcoxon) yang dirawat DMSO (perubahan lipatan positif) atau ARS (perubahan lipatan bawah, negatif).
TOKOH TAMBAHAN
Rajah S1.
A. H358 3D sferoid kanser paru-paru dirawat dengan ARS atau DMSO. B. Western blot untuk p-ERK dan HSP90 menggunakan sferoid kanser paru-paru H358 3D yang dirawat dengan ARS atau DMSO. C. Ukuran diameter (dalam mikrometer) (plot kiri) dan daya maju sel (daya maju sel luminescent Cell Titer-Glo® dalam unit pendarfluor relatif) (plot kanan) sferoid kanser paru-paru H358 3D dirawat dengan ARS atau DMSO selepas 3 atau 5 hari rawatan (500 nM ARS-1620 atau DMSO). D. Ukuran diameter (dalam mikrometer) sferoid kanser paru-paru H358 3D dirawat dengan kepekatan ARS-1620 (nM) yang berbeza selama 7 hari.
