CAR-neutrophil Penghantaran Pengantaraan Tumor Persekitaran Mikro Nanodrug Responsif Untuk Glioblastoma Kemo-imunoterapi

Glioblastoma (GBM) adalah salah satu tumor pepejal yang paling agresif dan maut pada manusia. Walaupun terapeutik yang mujarab, seperti sel reseptor antigen chimeric (CAR)-T dan kemoterapeutik yang muncul, telah dibangunkan untuk merawat pelbagai jenis kanser, keberkesanannya dalam rawatan GBM telah dihalang sebahagian besarnya oleh halangan darah-otak dan halangan tumor darah-otak. Neutrofil manusia secara berkesan melintasi halangan fisiologi dan memaparkan imuniti effector terhadap patogen tetapi jangka hayat yang singkat dan rintangan kepada penyuntingan genom neutrofil primer telah mengehadkan aplikasi luasnya dalam imunoterapi. Di sini kami merekayasa genetik sel stem pluripotent manusia dengan CRISPR/Cas9-pengantara gen knock-in untuk menyatakan pelbagai binaan CAR anti-GBM dengan CD3ζ khusus T atau domain isyarat khusus neutrofil. CAR-neutrofil dengan aktiviti anti-tumor terbaik dihasilkan untuk secara khusus dan bukan invasif menghantar dan melepaskan ubat nano responsif persekitaran mikro tumor untuk menyasarkan GBM tanpa perlu mendorong keradangan tambahan di tapak tumor. Kemo-imunoterapi gabungan ini mempamerkan aktiviti anti-GBM yang unggul dan khusus, mengurangkan penghantaran ubat di luar sasaran, dan memanjangkan jangka hayat pada tikus yang membawa tumor betina. Bersama-sama, sistem penyampaian ubat CAR-neutrofil biomimetik ini adalah platform yang selamat, mujarab dan serba boleh untuk merawat GBM dan mungkin penyakit lain yang memusnahkan.

Kebaikan cistanche tubulosa-Antitumor

Glioblastoma (GBM) dicirikan oleh kadar kematian yang tinggi, jangka hayat yang singkat, dan prognosis yang buruk dengan kecenderungan berulang yang tinggi1,2. Keberkesanan terapeutik kedua-dua pembedahan dan ubat kemo dihalang terutamanya oleh struktur otak halus dan penghalang darah-otak fisiologi (BBB) ​​atau halangan tumor darah-otak (BBTB)3–5. Khususnya, penghantaran ubat ke sistem saraf pusat (CNS) untuk merawat tumor otak adalah sangat mencabar:<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

Kekebalan semula jadi dan keplastikan neutrofil terhadap pelbagai jenis kanser12–16, termasuk GBM, kurang diterokai daripada penggunaannya sebagai pembawa sel dalam penghantaran dadah8–10. Mengedarkan neutrofil dalam darah ke rumah kepada persekitaran mikro tumor hipoksik (TME), di mana ia menjadi neutrofil berkaitan tumor heterogen (TAN), komponen penting TME imunosupresif yang menyumbang kepada perkembangan kanser dan rintangan terapeutik12,17. Sama seperti makrofaj, fenotip TAN anti-tumor N1 dan pro-tumor N2 ditemui dalam TME18-21 hipoksik. Pelbagai strategi terapeutik telah dibangunkan untuk menyasarkan neutrofil secara langsung dengan tumpuan kepada pengurangan atau perencatan neutrofil12,22, yang membawa kepada beberapa ujian klinikal (cth, CCR5 inhibitor Maraviroc dalam NCT03274804). Oleh itu, penggunaan langsung neutrofil yang tidak dirawat sebagai nanocarrier mungkin menimbulkan risiko tambahan kepada pesakit kanser di mana neutrofil pengedaran dadah boleh diprogramkan semula kepada fenotip N2 pro-tumor imunosupresif dalam TME selepas menempatkan tapak tumor13,23. Di samping itu, aktiviti anti-tumor intrinsik neutrofil naif harus diterokai dan dirangsang untuk mencapai keberkesanan terapeutik yang optimum apabila digunakan sebagai pembawa ubat dalam kombinasi dengan kemoterapi.

Kebaikan cistanche tubulosa-menguatkan sistem imun

Pengubahsuaian reseptor antigen chimeric (CAR) telah meningkatkan aktiviti anti-tumor sel T imun atau pembunuh semulajadi (NK) dengan ketara24–27. Walau bagaimanapun, keberkesanannya dalam tumor pepejal masih terhad disebabkan sebahagiannya oleh keupayaan pemerdagangan dan penembusan tumor yang agak rendah. Kehadiran BBB fisiologi dan BBTB seterusnya menghalang keberkesanan terapeutik yang muncul ini terhadap GBM di dalam otak. Kami membuat spekulasi bahawa gabungan kejuruteraan CAR dan neutrofil yang sangat motil mungkin mengekalkan fenotip N1 anti-tumor mereka dan menghasilkan keberkesanan terapeutik yang sangat baik dalam merawat GBM. Neutrofil utama adalah jangka pendek dan tahan terhadap penyuntingan genom28, mengehadkan penggunaannya dalam imunoterapi terarah CAR. Sel stem pluripotent manusia (hPSCs), yang lebih mudah diakses untuk penyuntingan gen dan mampu membezakan neutrofil secara besar-besaran, boleh menyediakan sumber tanpa had neutrofil CAR berkualiti tinggi untuk imunoterapi yang disasarkan di bawah keadaan bebas xeno yang ditakrifkan secara kimia29. Neutrofil juga lebih suka memfagositosis patogen mikrob dengan permukaan kasar atau panjang, seperti S. aureus dan E. coli30, yang harus diambil kira untuk reka bentuk nanopartikel dalam penghantaran ubat pengantara neutrofil. Sesungguhnya, Safari et al. baru-baru ini melaporkan fagositosis pilihan zarah memanjang yang diberikan secara intravena, tanpa pengubahsuaian permukaan yang rumit, dengan mengedarkan neutrofil30. Reka bentuk yang mudah dan bioinspirasi sedemikian dalam nanopartikel yang dimuatkan dadah boleh memaksimumkan pemuatan dadah dalam neutrofil dan membolehkan tahap terapeutik penghantaran ubat di tapak yang disasarkan.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>20% daripada ubat nano yang diberikan dihantar kepada tumor otak oleh neutrofil CAR berbanding 1% oleh ubat nano percuma. Ringkasnya, sistem penyampaian ubat CAR-neutrofil biomimetik kami ialah platform yang selamat, mujarab dan serba boleh untuk merawat GBM dan penyakit yang memusnahkan yang lain.

Kebaikan cistanche tubulosa-Antitumor

Keputusan

Menyaring struktur CAR khusus neutrofil untuk aktiviti anti tumor yang dipertingkatkan

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >90%, dan majoriti klon yang disasarkan adalah heterozigot (Tambahan Rajah 1a-d). Ekspresi CAR pada hPSC kejuruteraan telah disahkan lagi oleh RT-PCR dan analisis sitometri aliran CLTX-IgG4 (Tambahan Rajah 1e-g). Seperti yang dijangkakan, hPSC yang mengekspresikan CAR mengekalkan tahap ekspresi tinggi penanda pluripoten, termasuk OCT4, SSEA4, dan SOX2 (Tambahan Rajah 1f).

Untuk menghasilkan neutrofil CAR de novo, hPSC yang mengekspresikan CAR mula-mula dibezakan kepada hematopoietik multipoten dan kemudian progenitor myeloid dengan rawatan sitokin khusus peringkat35 (Rajah 2c). Penggunaan seterusnya G-CSF dan agonis asid retinoik AM580 menggalakkan pengeluaran neutrofil yang teguh36. Sama seperti rakan mereka dalam darah periferi (PB), neutrofil CLTX-CAR yang berasal dari hPSC membentangkan morfologi neutrofil biasa dan penanda permukaan CD16, CD11b, MPO, CD15, CD66b dan CD18 (Tambahan Rajah 2). Kami seterusnya menentukan kesan ekspresi CAR pada sitotoksisiti anti tumor neutrofil yang berasal dari hPSC dengan membiakkannya bersama sel glioblastoma (GBM) U87MG secara in vitro. Seperti yang dijangkakan, neutrofil CLTX-CAR yang berasal dari hPSC mempersembahkan keupayaan membunuh tumor yang lebih baik berbanding dengan neutrofil PB (Rajah 2d), selaras dengan pemerhatian sebelumnya dalam sel CLTX CAR-T27. Di antara CAR yang berbeza ini, CAR #1 mengantarkan aktiviti pembunuhan tumor yang unggul dalam hPSC-neutrofil. Terutamanya, CAR #4 berasaskan rantai adalah paling kurang berkesan dalam mencetuskan pembunuhan tumor yang dimediasi neutrofil, yang mungkin disebabkan oleh salinan ITAM yang lebih rendah daripada subunit ζ dan ekspresi CAR yang lebih rendah pada permukaan sel28. Neutrofil membebaskan spesies oksigen reaktif sitotoksik (ROS) dan faktor nekrosis tumor- (TNF-) untuk membunuh sel sasaran. Pengeluaran ROS dan TNF- (Rajah 2e, f) daripada neutrofil berbeza bertepatan dengan peningkatan sitolisis mereka. Seperti yang dijangkakan, pengeluaran ROS dan TNF- daripada neutrofil berbeza selepas pengkulturan dengan sel glial SVG p12 normal kekal serendah kumpulan kawalan negatif (Tambahan Rajah 3a, b). Di samping itu, peningkatan sitotoksisiti anti-tumor CAR-neutrofil hanya diperhatikan dalam inkubasi bersama dengan sel GBM, termasuk U87MG, GBM43 dewasa utama dan sel SJ-GBM2 kanak-kanak (Tambahan Rajah 3c), menunjukkan kekhususan tinggi CLTX kami. -KERETA. Terutama, neutrofil CAR mempamerkan biokompatibiliti yang tinggi dengan sel glial SVG p12 normal, hPSC, dan sel yang diperolehi hPSC (Tambahan Rajah 3d), selaras dengan pemerhatian sebelumnya bahawa neutrofil primer yang tidak aktif tidak membunuh sel yang sihat16. Secara kolektif, neutrofil CAR yang diperoleh daripada hPSC, terutamanya neutrofil CAR yang mengandungi CD3ζ, mempersembahkan sitotoksisiti anti-tumor yang dipertingkatkan dan menghasilkan lebih banyak ROS dan TNF- in vitro, menonjolkan potensi mereka dalam imunoterapi yang disasarkan.

Rajah 1|Skema keberkesanan anti-glioblastoma yang dipertingkatkan menggunakan imunoterapi gabungan CAR-neutrofil dan ubat-ubatan nano responsif persekitaran mikro tumor. Sel stem pluripotent manusia telah direkayasa dengan CAR dan dibezakan kepada CAR-neutrofil yang dimuatkan dengan nanozarah silika kasar (SiO2 NPs) yang mengandungi tirapazamine (TPZ) yang menyasarkan hipoksia atau ubat lain, sebagai imunokimoterapi dwi. b CAR-neutrophil@R-SiO2- TPZ NP yang ditadbir secara sistemik menyerang sel tumor normoksik luaran dengan membentuk sinaps imunologi dan membunuh sel tumor melalui fagositosis. Selepas apoptosis, CAR-neutrophils kemudiannya boleh melepaskan R-SiO2-NPZ NPs, yang diambil alih oleh sel tumor. Selepas itu, nano-prodrugs bertindak balas terhadap persekitaran mikro tumor hipoksik dan membunuh sel tumor dengan berkesan. TEOS tetraethyl orthosilicate, BTES bis[3-(triethoxysilyl) propyl] tetrasulfide, TPZ tirapazamine, BTZ benzotriazinyl.

CAR-neutrophils mengekalkan aktiviti anti-tumor yang unggul di bawah persekitaran mikro tumor imunosupresif

Sama seperti makrofaj, fenotip anti-tumor N1 dan N2 pro-tumor neutrofil yang berkaitan dengan tumor ditemui dalam persekitaran mikro tumor imunosupresif17. Neutrofil N2 pro-tumor memainkan peranan penting dalam angiogenesis tumor, metastasis, dan imunosupresi, tetapi penyasaran terapeutik jenis sel ini telah mencabar.

Daripada strategi pengurangan sistemik22, di sini kami menilai potensi kejuruteraan CAR dalam mengekalkan fenotip anti-tumor neutrofil. CAR hPSC yang diperolehi dan neutrofil PB telah dirawat dengan hipoksia (3% O2) dan TGF , yang menyumbang kepada penindasan imunosupresi persekitaran mikro tumor37,38, untuk menilai aktiviti pembunuhan tumor yang berterusan. Walaupun neutrofil PB membentangkan sitolisis menurun dengan ketara terhadap sel GBM di bawah keadaan imunosupresif, CAR-neutrofil mengekalkan aktiviti pembunuhan tumor yang tinggi (Tambahan Rajah 4a). Pemerhatian yang sama juga dibuat dalam pelepasan TNF dan penjanaan ROS (Tambahan Rajah 4b, c) daripada PB atau CAR-neutrofil di bawah keadaan imunosupresif dan normal. Untuk mengesahkan lagi fenotip neutrofil di bawah keadaan hipoksik dan TGF, kami mengukur ungkapan N{14}}iNOS khusus dan N{15}} N{16}}arginase khusus pada neutrofil terpencil oleh sitometri aliran (Tambahan Rajah. 4d–f). Berbanding dengan normoxia, hipoksia imunosupresif, dan TGF secara signifikan menurunkan tahap ekspresi iNOS dan peningkatan tahap arginase dalam neutrofil PB, manakala neutrofil CAR mengekalkan tahap ekspresi tinggi iNOS. Kajian terdahulu menunjukkan pengaktifan laluan isyarat Syk-Erk membawa kepada pengeluaran ROS39-42. Oleh itu, kami mengesan dan membandingkan pengaktifan Syk-Erk dalam neutrofil yang tidak diubah suai dan neutrofil CAR, dan keputusan kami mencadangkan pengaktifan laluan Syk-Erk yang jauh lebih tinggi dalam neutrofil CAR di bawah hipoksia (Tambahan Rajah 5a-d), yang mungkin mengekalkan pengeluaran ROS CAR-neutrofil yang tidak berubah di bawah hipoksia. Diambil bersama, CAR-neutrophils mengekalkan fenotip anti-tumor dan mengekalkan aktiviti anti-tumor yang tinggi di bawah keadaan meniru persekitaran mikro tumor secara in vitro, menonjolkan potensi mereka dalam imunoterapi yang disasarkan.

Rajah 2|Menyaring struktur reseptor antigen chimeric khusus neutrofil (CAR) dengan aktiviti anti-tumor pengantara neutrofil yang dipertingkatkan. Skema pelbagai struktur CAR. b Skema pembinaan CAR #1 dan strategi ketuk masuk yang disasarkan di lokus pelabuhan selamat AAVS1 sel stem pluripotent manusia (hPSCs). Anak panah menegak menunjukkan sgRNA yang menyasarkan AAVS1. Anak panah mendatar merah dan biru menunjukkan primer untuk menguji kecekapan penyasaran dan homozigositi, masing-masing. HDR: pembaikan gabungan semula homolog. c Skema pembezaan neutrofil yang dioptimumkan daripada hPSC di bawah keadaan yang ditentukan secara kimia. d Ujian sitotoksisiti terhadap sel glioblastoma U87MG dilakukan pada nisbah sasaran neutrofil-ke-tumor yang berbeza menggunakan neutrofil yang ditunjukkan. Data diwakili sebagai min ± SD daripada lima replika biologi bebas, ujian-t Pelajar dua ekor. Penjanaan spesies oksigen reaktif (ROS) (e) dan analisis ELISA pembebasan TNF (f) daripada neutrofil berbeza selepas pengkulturan dengan sel U87MG ditentukan. n=5 sampel bebas biologi. Data diwakili sebagai min ± SD, ujian t Pelajar dua hujung. Data sumber disediakan sebagai fail Data Sumber.

Penyediaan dan pencirian hPSC CAR-neutrofil yang dimuatkan dengan tirapazamine (TPZ) yang mengandungi nanozarah SiO2

Neutrofil PB telah digunakan sebagai pembawa selular untuk menghantar ubat pengimejan dan terapeutik ke dalam tumor otak8-10, walaupun penyusupan neutrofil yang disasarkan memerlukan pembedahan atau keradangan yang disebabkan oleh cahaya dan penghantaran ubat di luar sasaran mungkin menjadi kebimbangan11. Untuk menambah baik lagi aktiviti anti-tumor CAR-neutrofil, kami menyediakan nanozarah silika (SiO2-NP) dengan permukaan yang kasar atau licin untuk memuatkan ubat kemoterapi atau sinaran ke dalam neutrofil. Imej mikroskop elektron penghantaran (TEM) menunjukkan bahawa kedua-dua nanozarah SiO2 tersebar dengan baik dan mempamerkan morfologi sfera dengan saiz seragam (Rajah 3a, Rajah Tambahan 6a). Analisis taburan komposisi melalui pengimbasan TEM (STEM) dengan spektroskopi sinar-X (EDS) tersebar tenaga menunjukkan bahawa unsur sulfur (S) diagihkan sama rata dalam keseluruhan nanozarah SiO2 kasar (R-SiO2) (Rajah 3b). Menggunakan isoterma penjerapan-desorpsi nitrogen (N2) dan analisis taburan saiz liang yang sepadan, saiz liang R- dan SSiO2 NPs diukur sebagai 25 nm dan 35 nm (Rajah 3c, Rajah Tambahan 6b), masing-masing. Memandangkan kawasan permukaan yang tinggi dan saiz liang yang besar, ubat terapeutik boleh dimuatkan dengan berkesan ke dalam kedua-dua NP R- dan S- SiO2, seperti yang ditunjukkan oleh tirapazamine pro-ubat yang responsif terhadap hipoksia (TPZ) (Rajah 3d, Rajah Tambahan 6c) . Selepas pemuatan TPZ, perubahan ketara tidak diperhatikan dalam serakan, morfologi dan saiz R-SiO2-TPZ menggunakan TEM dan analisis serakan cahaya dinamik (Tambahan Rajah 6d, e). Ikatan tetra-sulfida yang digabungkan ke dalam R-SiO2 NPs adalah sensitif terhadap persekitaran reduktif dan boleh terdegradasi dengan cepat oleh sejumlah besar glutation (GSH) yang terdapat dalam sel tumor43. Kami seterusnya menentukan keterdegradasian responsif GSH R-SiO2-TPZ NPs dengan kehadiran 10 mM, 1 mM, dan 10 μM GSH, yang sama dengan keadaan intraselular sel kanser, sel normal, dan persekitaran ekstrasel43, masing-masing. Selepas rawatan 10 mM GSH, struktur sfera awal R-SiO2–TPZ NPs telah musnah teruk selepas 24 jam (Tambahan Rajah 6f, g). Nanopartikel telah hancur sepenuhnya menjadi serpihan kecil selepas 48 jam, menghasilkan pelepasan TPZ dalam cara responsif GSH (Rajah 3e). Serpihan R-SiO2 NPs tidak menyebabkan sebarang sitotoksisiti ketara kepada sel yang diuji secara in vitro (Tambahan Rajah 6h), menunjukkan keselamatan relatif R-SiO2 NPs.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity

【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Kami seterusnya menilai kebolehlaksanaan menggunakan SiO2-TPZ NPs untuk memuatkan ubat terapeutik ke dalam CAR-neutrofil sebagai kemoimunoterapi gabungan untuk mencapai keberkesanan terapeutik yang dipertingkatkan. Selepas sentrifugasi, kami mengukur pengambilan selular NP SiO2–TPZ oleh neutrofil menggunakan mikroskop pendarfluor dan analisis sitometri aliran (Rajah 3f, g), dan mengesan pengambilan selular R-SiO2–TPZ NPs yang lebih ketara daripada S-SiO2– TPZ NPs oleh neutrofil. Kandungan Si selular dalam neutrofil diukur sebagai protein 11.3 dan 19.1 ng Si/ug untuk SiO2 NPs@TPZ (Rajah 3h) yang licin dan kasar, oleh spektrometri jisim plasma (ICP-MS) yang digandingkan secara induktif. Memandangkan kapasiti pemuatan tinggi mereka dalam neutrofil, R-SiO2-TPZ NPs telah digunakan untuk eksperimen seterusnya. Kami kemudiannya berusaha untuk menguji fungsi fisiologi neutrofil CAR selepas memuatkan R-SiO2-TPZ NPs. Tiada perubahan diperhatikan dalam daya maju sel (Rajah 3i, Tambahan Rajah 6i), keupayaan penghijrahan transwell (Rajah 3j), kemotaksis, dan halaju sepadan (Rajah 3k, l) CAR-neutrofil sebelum atau selepas memuatkan R-SiO2 –TPZ NP, menunjukkan biokompatibiliti tinggi mereka. Analisis pemuatan ubat nano bergantung masa juga dilakukan dan kandungan pemuatan maksimum dicapai pada 1 jam selepas pengeraman sel-NP (Tambahan Rajah 7a). Lebih daripada 95% CAR-neutrofil telah berjaya dimuatkan dengan R-SiO2-TPZ NPs (Tambahan Rajah 7b). Tahap ekspresi CD11b, protein permukaan neutrofil yang mengantara fungsi lekatan dan penghijrahan pada rangsangan molekul radang, tidak diubah pada neutrofil CAR dengan atau tanpa pemuatan R-SiO2-TPZ (Tambahan Rajah 7c, d). Superoksida atau spesies oksigen reaktif (ROS) dibebaskan daripada neutrofil aktif untuk membunuh mikrob dan sel tumor44. Seperti yang dijangkakan, penjanaan ROS oleh CAR-neutrophils telah meningkat dengan ketara selepas rawatan N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP), dan perbezaan ketara tidak diperhatikan dalam pengeluaran ROS oleh CAR-neutrophils sebelum dan selepas memuatkan R-SiO2- TPZ (Gamb. 3m). Secara keseluruhan, data kami menunjukkan bahawa neutrofil CAR yang dimuatkan R-SiO2-TPZ mengekalkan aktiviti fisiologi neutrofil jenis liar dan secara aktif boleh berhijrah ke arah rangsangan keradangan, menonjolkan potensinya dalam kemoimunoterapi kanser yang disasarkan.

CAR-neutrofil dimuatkan dengan R-SiO2-nopartikel TPZ membunuh sel glioblastoma dengan berkesan

Kami seterusnya menilai kesan R-SiO2-TPZ pada keupayaan membunuh tumor neutrofil CAR. Interaksi sasaran kesan intim adalah prasyarat untuk sitolisis pengantara neutrofil. Seperti yang dijangkakan, CAR-neutrophils@R-SiO2-TPZ membentuk sinaps imun dengan sel tumor dalam masa 2 jam dan mempamerkan nombor interaksi sasaran effector yang serupa sebagai neutrofil CAR-bebas dadah (Rajah 4a, Rajah Tambahan 8) . Terutamanya, tiada interaksi yang boleh diperhatikan ditemui antara CAR-neutrophils@RSiO2-TPZ dan sel somatik bukan kanser (Tambahan Rajah 8), menonjolkan kekhususan CLTX-CAR terhadap tumor otak. Tambahan pula, NP R-SiO2–TPZ dibebaskan daripada neutrofil ke dalam medium kultur (Tambahan Rajah 9a, b) 12 jam selepas kultur bersama dan memasuki sel tumor yang tinggal (Rajah 4a). Dua puluh empat jam selepas pengeraman bersama CAR-neutrofil yang dimuatkan SiO2–TPZ NP dengan sel tumor, sehingga 95% sel tumor mengandungi NP R-SiO2–TPZ (Rajah 4a, Rajah Tambahan 9c), menunjukkan kejayaan lata pengangkutan yang melibatkan neutrofil pembawa yang menggunakan fungsi sel effectornya dan menjalani apoptosis, dengan itu secara pasif melepaskan R-SiO2-TPZ NPs ke sel tumor sasaran45. Kami juga mengesahkan fungsi responsif hipoksik dan sitotoksisiti pro-ubat TPZ dalam sel tumor melalui analisis spektroskopi elektron paramagnetik resonans (EPR) penjanaan radikal daripada TPZ (Tambahan Rajah 9d) dan analisis sitometri aliran TOPRO-3 pada tumor sel (Tambahan Rajah 9e) di bawah hipoksia dan normoxia. Untuk menentukan sitolisis neutrofil CAR yang dimuatkan R-SiO2–TPZ NP, kami melaksanakan model mencabar semula tumor normoxia-hipoksia in vitro (Rajah 4b). Dua puluh empat jam selepas kultur normoksik, CAR-neutrofil dimuatkan dengan R-SiO2-TPZ NPs atau tidak menunjukkan sitotoksisiti anti-tumor yang serupa (Rajah 4c), dan kedua-duanya lebih tinggi daripada PB-neutrofil yang dimuatkan dengan R -SiO2-TPZ NPs atau tidak dan R-SiO2- TPZ NPs sahaja. Sitotoksisiti yang dipertingkatkan terutamanya disebabkan oleh peningkatan keupayaan penargetan tumor neutrofil selepas kejuruteraan CAR. Selepas tambahan 12 dan 24-h kokultur hipoksik dengan sel tumor, R-SiO2-neutrofil CAR-loaded TPZ NP menunjukkan keupayaan anti-tumor yang unggul berbanding kumpulan lain (Rajah 4d, e). Di samping itu, neutrofil CAR yang dimuatkan dengan R-SiO2-TPZ NPs mempamerkan sitolisis yang sangat baik terhadap sel tumor segar yang dibiji semula (Rajah 4f), menunjukkan keupayaan anti-tumor R-SiO2-TPZ yang dikeluarkan nanopartikel selepas apoptosis neutrofil.

Kami kemudian melakukan analisis penjujukan RNA (RNA-seq) pada sel tumor untuk menjelaskan mekanisme molekul yang berpotensi yang mendasari sitolisis anti-tumor neutrofil yang dipertingkatkan oleh ekspresi CAR dan R-SiO2-TPZ NPs. Analisis ekspresi gen menunjukkan bahawa berbanding kawalan dan R-SiO2-TPZ NPs, CAR-neutrophils yang dimuatkan dengan atau tanpa R-SiO2-TPZ NPs telah mengurangkan ekspresi gen sitoplasma dan membran dalam sel tumor dengan ketara ( Tambahan Rajah 10a, Rajah 4g), seterusnya menyokong fagositosis sel tumor semasa kultur. Walaupun semua kumpulan eksperimen meningkatkan tekanan oksidatif selular dalam sel tumor, neutrofil CAR yang dimuatkan R-SiO2-TPZ mengatasi kumpulan lain dalam mencetuskan isyarat tekanan oksidatif. Selain itu, neutrofil CAR yang dimuatkan R-SiO2-TPZ dengan ketara menggalakkan apoptosis dan mengurangkan percambahan dalam sel tumor. Untuk memahami lebih lanjut aktiviti anti-tumor yang dipertingkatkan R-SiO2-neutrofil CAR-loaded TPZ, kami menggunakan perencat fagositosis cytochalasin D dan spesies oksigen reaktif (ROS) penghapus N-acetyl-cysteine ​​(NAC) dan perencat ROS GSK2795039 kepada kokultur tumor-neutrofil. Sitolisis sel tumor oleh CAR-neutrophils telah dikurangkan dengan ketara sebanyak 5 μM cytochalasin D, 5 mM NAC, dan 100 nM GSK2795039 (Tambahan Rajah 10b, c), menunjukkan peranan penting fagositosis dan ROS dalam pengantaraan tumor CAR neutrophil. membunuh. Baki 40%-50% lisis sel tumor dengan kehadiran neutrofil dan NAC atau GSK2795039 menunjukkan penglibatan mekanisme bebas ROS dalam pembunuhan tumor pengantaraan neutrofil yang patut disiasat lebih lanjut.

Rajah 3|Penyediaan dan pencirian hPSC CAR-neutrofil yang dimuatkan dengan tirapazamine (TPZ) yang mengandungi nanozarah SiO2. a–e Mikroskop elektron penghantaran (TEM) (a) dan imej pemetaan unsur spektroskopi penyebaran tenaga (EDS) (b) nanozarah SiO2 kasar ditunjukkan. c Isoterma penjerapan-desorpsi nitrogen bagi nanozarah SiO2 kasar bersama-sama plot taburan saiz liang Barrett-JoynerHalenda (BJH) ditunjukkan. Tiga kali ganda biologi dilakukan secara bebas. Kandungan pemuatan TPZ dalam nanopartikel SiO2 (d) dan glutation (GSH)--pelepasan TPZ responsif (e) diukur pada masa yang dinyatakan. n=3 sampel bebas biologi. Analisis varians sehala (ANOVA) untuk (e). Imej pendarfluor (f) dan analisis sitometri aliran (g) neutrofil yang dimuatkan dengan SiO{12}}TPZ yang licin dan kasar. Tiga kali ganda biologi dilakukan secara bebas. h Kandungan SiO2 selular dalam CAR-neutrofil yang berasal dari hPSC diukur. n=5 sampel bebas biologi, ujian-t Pelajar dua hujung. Daya maju selular (i), n=3 sampel bebas biologi, transmigrasi (j), n=5 sampel bebas biologi, kebolehan chemoattraction (k, l), n=20 sampel bebas biologi dan Keupayaan penjanaan ROS (m) neutrofil CAR terbitan hPSC yang dimuatkan dengan atau tanpa SiO kasar2-TPZ ditunjukkan, n=5 sampel bebas biologi, ujian t Pelajar dua ekor. PMA: phorbol myristate acetate. Semua data dalam rajah ini diwakili sebagai min ± SD. Data sumber disediakan sebagai fail Data Sumber.

Penilaian fungsional neutrofil CAR yang dimuatkan dengan ubat nano menggunakan model glioblastoma biomimetik secara in vitro

Untuk menilai lebih lanjut aktiviti neutrofil CAR yang dimuatkan R-SiO2-TPZ NP, kami melaksanakan model tumor penghalang darah-otak (BBB) ​​berasaskan transwell menggunakan sel endothelial mikrovaskular serebrum manusia (Rajah 5a, Rajah Tambahan). 11a). Seperti yang dijangkakan, neutrofil CAR yang dimuatkan R-SiO2-TPZ NP mempamerkan keupayaan transmigrasi yang sangat baik merentas model BBB in vitro (Rajah 5b), dengan berkesan membunuh sel tumor yang disasarkan selepas pemindahan di bawah kedua-dua keadaan normoksik dan hipoksik (Rajah 5c). , d), dan melepaskan lebih banyak sitokin radang (Rajah 5e) yang mungkin menarik sel efektor lain untuk membunuh sel tumor. Di samping itu, neutrofil CAR tidak banyak menjejaskan daya maju sel endothelial selepas pemindahan (Tambahan Rajah 11b). R-SiO2-neutrofil CAR-loaded TPZ NP mengekalkan keupayaan transmigrasi yang sangat baik semasa percubaan transmigrasi kedua (Rajah 5f) dan keupayaan anti-tumor yang unggul berbanding kumpulan lain (Rajah 5g). Model sferoid tumor tiga dimensi (3D) kemudiannya digunakan untuk menilai kapasiti penembusan tumor R-SiO2-neutrofil CAR yang dimuatkan TPZ NP (Rajah 5h). CAR-neutrofil secara beransur-ansur berhijrah ke arah pusat sferoid tumor dan diedarkan secara seragam dalam sferoid selepas 8 jam pengeraman (Rajah 5i). Tahap penyetempatan bersama yang tinggi antara neutrofil CAR dan R-SiO2-NPZ NPs telah diperhatikan (Tambahan Rajah 12a–c), menunjukkan bahawa R-SiO2-NPZ NPs terkapsul secara stabil dalam CAR -neutrofil semasa penyusupan tumor sebelum sitolisisnya. Tanpa penghantaran pengantaraan neutrofil, R-SiO2-NPZ NP hanya ditemui pada lapisan luar sferoid tumor. Berbanding dengan R-SiO2-NPZ NPs dan CAR-neutrophils, R-SiO2-neutrofil CAR yang dimuatkan TPZ NP mempamerkan sitolisis anti-tumor yang unggul dalam model tumor 3D (Rajah 5j). NP CAR-neutrophils@R-SiO2 juga boleh digunakan untuk menghantar ubat lain, termasuk temozolomide klinikal (TMZ) dan JNJ- 64619187, ke dalam model tumor 3D dan membunuh sel GBM dengan cekap (Tambahan Rajah 12d–f). Diambil bersama, gabungan neutrofil CAR dan ubat nano mempamerkan aktiviti anti-tumor yang sangat baik dalam persekitaran mikro tumor biomimetik yang meniru keadaan in vitro, menonjolkan potensi terapeutik kemoimunoterapi berasaskan neutrofil gabungan.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Taburan in vivo bagi R-SiO2-TPZ yang dihantar neutrofil CAR

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >20% daripada ubat nano yang diberikan dihantar kepada tumor otak oleh CAR-neutrofil berbanding 1% oleh nanodrug percuma yang konsisten dengan laporan sebelumnya6. Penghantaran sasaran R-SiO2-TPZ NPs ke otak hos merentas BBB oleh CAR-neutrophils juga telah disahkan oleh analisis histologi (Rajah 6d). Sebaliknya, NP R-SiO2-TPZ sahaja kebanyakannya terkumpul di dalam hati dan limpa. Secara kolektif, data kami menunjukkan penyampaian disasarkan yang dipertingkatkan bagi R-SiO{11}}TPZ NPs oleh neutrofil CAR tanpa perlu mendorong keradangan tambahan di tapak tumor, menyerlahkan kebolehlaksanaan dan keselamatan kemoimunoterapi berasaskan neutrofil dalam rawatan kanser.

Kemoimunoterapi gabungan CAR-neutrofil dan R-SiO2-nopartikel TPZ mempamerkan aktiviti anti glioblastoma yang sangat baik dalam vivo

Untuk menentukan keberkesanan terapeutik neutrofil CAR yang dimuatkan R-SiO2-TPZ NP, model xenograf in situ glioblastoma telah ditubuhkan dalam tikus NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) menggunakan sel luciferase yang mengekspresikan U87MG. Tikus pembawa tumor ditadbir secara intravena 5 × 106 neutrofil setiap minggu (Rajah 7a), dan beban tumor dalam perumah diukur dan dikira (Rajah 7b, c). Berbanding dengan tikus yang dirawat PBS atau PB-neutrophil, rawatan dengan CAR-neutrophils dan CAR neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs berkesan memperlahankan pertumbuhan tumor. CAR neutrophils@R-SiO2-TPZ NPs menunjukkan sitotoksisiti anti-tumor yang lebih tinggi daripada mana-mana kumpulan eksperimen lain. Sebaliknya, PB-neutrofil dengan ketara menggalakkan pertumbuhan tumor dalam otak, mengakibatkan kematian tikus yang membawa tumor seawal hari ke-23 (Rajah 7d), menunjukkan bahawa neutrofil yang tidak direkayasa mungkin menimbulkan risiko tambahan. Kami seterusnya mengukur pelepasan sitokin manusia dalam plasma kumpulan tetikus eksperimen yang berbeza (Rajah 7e). Semua kumpulan eksperimen bukan PBS menghasilkan TNF dan IL-6 yang boleh dikesan dalam plasma dari hari ke-5 hingga hari ke-26, mencadangkan pengaktifan neutrofil manusia apabila rangsangan tumor. Selaras dengan kadar pertumbuhan tumor yang lebih tinggi yang diperhatikan, neutrofil yang tidak diubah suai secara beransur-ansur mengeluarkan lebih banyak IL-6 dan TNF, yang mungkin membawa kepada sindrom pelepasan sitokin pada pesakit dan memerlukan kajian keselamatan yang lebih mendalam dengan penyekat IL-646,47 . Terutama, CAR-neutrophils@RSiO2-TPZ NPs menunjukkan penurunan keupayaan pengeluaran sitokin pada titik masa kemudian (hari ke-19 dan hari ke-26), mencadangkan risiko rendah sindrom pelepasan sitokin pada pesakit yang dirawat dengan kemoimunoterapi berasaskan CAR-neutrophil. Biokompatibiliti gabungan CAR-neutrofil dan R-SiO2-TPZ NPs dinilai melalui pengukuran mingguan berat badan dan pemantauan perubahan patologi dalam organ utama tikus. Tiada perbezaan diperhatikan dalam berat badan antara tikus yang dirawat CAR neutrophils@R-SiO2–TPZ NP dan mana-mana kumpulan eksperimen lain (Rajah 7f), menunjukkan ketoksikan sistemik yang minimum dan biokompatibiliti cemerlang CAR-neutrophils@R-SiO2-TPZ NPs dalam 28 hari rawatan. Analisis histologi pada organ utama yang dihiris daripada tikus pada hari ke-30 menunjukkan bahawa tikus yang dirawat CAR-neutrophils@R-SiO2-TPZ NP tidak menyebabkan keabnormalan yang ketara atau kerosakan organ dalam jantung, hati, limpa, paru-paru, dan buah pinggang (Tambahan Gambar 1). 13), seterusnya mengesahkan keselamatan gabungan CAR-neutrofil dan R-SiO2-TPZ NPs.

Rajah 4|Neutrofil CAR yang dimuatkan dengan nanozarah R-SiO2-TPZ membunuh sel glioblastoma dengan berkesan. Imej perwakilan sinaps imunologi yang ditunjukkan oleh pengumpulan F-aktin terpolarisasi pada antara muka antara CAR-neutrofil dan sel tumor pada 6, 12, dan 24 jam ditunjukkan. Nanopartikel R-SiO2-TPZ yang dibebaskan daripada neutrofil CAR apabila fagositosis sel tumor telah diambil oleh sel tumor. Rangkap tiga dilakukan secara bebas. b Skema ujian sitotoksisiti anti-tumor pengantara neutrofil. Sitotoksisiti terhadap sel glioblastoma U87MG dilakukan pada nisbah sasaran neutrofil-ke-tumor yang berbeza menggunakan neutrofil yang ditunjukkan pada 24 jam (c), 36 jam (d), 48 jam (e), dan 72 jam (f). n=3 sampel bebas biologi. Data diwakili sebagai min ± SD, analisis varians sehala (ANOVA). g Analisis penjujukan RNA pukal telah dilakukan pada sel U87MG di bawah pelbagai keadaan. Peta haba menunjukkan tahap ekspresi sitoplasma, membran, tekanan oksidatif, apoptosis dan gen berkaitan percambahan terpilih dalam sel glioblastoma yang ditunjukkan. n=2 sampel bebas biologi. Data sumber disediakan sebagai fail Data Sumber.

Rajah 5|Penilaian fungsional neutrofil CAR yang dimuatkan dengan nanopartikel R-SiO2-TPZ menggunakan model biomimetik glioblastoma (GBM) secara in vitro. Skema model tumor in vitro GBM kami dengan penghalang darah-otak (BBB), yang terdiri daripada sel endothelial pada membran sisipan sel dan sel tumor di bahagian bawah transwell yang sama. b Analisis penghijrahan transwell neutrofil pada 12 jam ditunjukkan. Sitotoksisiti anti-GBM neutrofil yang ditunjukkan pada 24 jam (c) dan 36 jam (d) diukur dan dikira. e Analisis ELISA IL-6 dan TNF yang dikeluarkan daripada neutrofil yang ditunjukkan pada 36 jam telah dilakukan. f Penghijrahan kedua neutrofil berbeza pada 48 jam ditunjukkan. g Sitotoksisiti anti-GBM neutrofil yang ditunjukkan pada 60 jam diukur dan dikira. h–j Skema model tumor tiga dimensi (3D) yang menyusup neutrofil secara in vitro ditunjukkan dalam (h). Imej pendarfluor perwakilan neutrofil yang menyusup dalam model tumor 3D ditunjukkan. DAPI digunakan untuk mengotorkan nuklear sel dan CD45 digunakan untuk mengotorkan neutrofil. Bar skala, 200 μm. Tiga kali ganda biologi dilakukan secara bebas. j Keupayaan membunuh tumor yang sepadan bagi neutrofil yang ditunjukkan diukur dan dikira menggunakan kit sitotoksisiti. Data diwakili sebagai min ± SD daripada lima replika biologi bebas, analisis varians sehala (ANOVA). Data sumber disediakan sebagai fail Data Sumber.

Walaupun CAR-neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs dengan ketara memperlahankan pertumbuhan tumor dalam tikus xenograf, perbezaan dalam survival haiwan dalam kumpulan eksperimen CAR-neutrophils, SiO2-TPZ NPs dan CAR-neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs adalah tidak penting. (p > 0.05), yang mungkin disebabkan oleh kematian neutrofil jangka pendek semasa penyediaan dan suntikan sel. Kami seterusnya memberi tumpuan kepada ketiga-tiga kumpulan ini dan menentukan sama ada mengurangkan masa penyediaan sel dan meningkatkan dos CAR-neutrofil dan ubat nano akan membuat sebarang perbezaan dalam kemandirian haiwan (Rajah 7g). Apabila diberikan secara sistemik 6 kali, CAR-neutrophil@R-SiO2–TPZ NPs mengatasi dua kumpulan lain dalam memanjangkan jangka hayat tikus yang membawa tumor (Rajah 7h), manakala perbezaan kemandirian haiwan dalam kumpulan CAR-neutrofil dan SiO2– TPZ NP kekal tidak penting. Walaupun lengkung kelangsungan hidup yang serupa bagi kumpulan R-SiO2- TPZ telah diperhatikan di antara dua kajian haiwan bebas ini, mengurangkan masa dalam pengasingan sel dan penyediaan untuk suntikan daripada jumlah ~4 jam kepada 1 jam semasa 4 neutrofil pertama. dos membawa kepada kemandirian haiwan yang lebih baik dalam kumpulan CAR-neutrofil sebelum hari ke 32. Secara kolektif, data kami menunjukkan kepentingan penyediaan neutrofil dan pengoptimuman dos dalam aplikasi klinikal terapeutik neutrofil pada masa hadapan.

Perbincangan

Neutrofil tetikus telah ditunjukkan sebagai pembawa yang kuat untuk menghantar nanodrug dengan cekap kepada tumor otak selepas pembedahan yang meradang8,9. Namun, kebolehlaksanaan dan keselamatan menggunakan neutrofil manusia dalam penghantaran ubat masih sukar difahami. Jumlah neutrofil tetikus yang besar (10 kali lebih tinggi daripada jumlah neutrofil yang beredar dalam tikus11) yang digunakan dalam kajian ini untuk mencapai faedah terapeutik boleh menghalang lagi terjemahan klinikal mereka kerana pengekstrakan sejumlah besar neutrofil daripada pesakit kanser boleh menyebabkan neutropenia dan menimbulkan. risiko lain. Untuk menangani cabaran ini, kami memanfaatkan kuasa hPSC yang memperbaharui diri dalam mendapatkan neutrofil manusia de novo tanpa had29. Kami membangunkan sistem penyampaian ubat pengantara neutrofil bioinspirasi yang berkuasa dengan kejuruteraan CAR29 dan menggunakan neutrofil CAR manusia kejuruteraan sebagai pembawa nano dengan aktiviti anti-tumor yang menarik. NP SiO2 kasar berfungsi lebih baik daripada NP SiO2 licin dalam pembawa CAR-neutrofil, selaras dengan pemerhatian sebelumnya bahawa neutrofil lebih suka memfagositosis patogen mikrob kasar30. Neutrofil dilaporkan menggalakkan percambahan dan perkembangan sel glioma48. Kami memerhatikan kesan pro-tumor yang serupa dari neutrofil yang tidak diubah suai dalam kajian haiwan kami, menonjolkan keperluan kejuruteraan CCAR atau pengubahsuaian lain dalam neutrofil untuk memastikan keselamatannya dalam penghantaran ubat dan aplikasi terapeutik lain. Terutama, penghantaran ubat pengantara CAR-neutrophil kami bergantung semata-mata pada keupayaan penarik kemo asli GBM, tetapi bukan isyarat keradangan selepas pembedahan yang diperkuat, menunjukkan kekhususan tinggi dan potensi terapeutik sistem penghantaran ubat kami dalam membasmi glioma yang menyusup dalam. yang tidak boleh dikeluarkan melalui pembedahan. Memandangkan reseksi pembedahan dan kemoterapi/radioterapi adjuvant ialah campur tangan klinikal utama untuk GBM12, rawatan gabungan dengan pembawa nano neutrofil CAR dan pembedahan/radioterapi boleh mencapai keberkesanan terapeutik yang optimum dan bernilai penyiasatan lanjut. Pembinaan CAR khusus sel T dan NK telah digunakan secara meluas untuk meningkatkan aktiviti anti-tumor sel T dan NK, tetapi CAR khusus neutrofil yang meningkatkan fungsi anti-tumor neutrofil belum diterangkan. Reseptor imun CD4ζ dan CD4 chimeric dilaporkan sebelum ini meningkatkan sitolisis neutrofil terhadap sel yang ditransmisikan HIVenv secara in vitro. Namun, kecekapan lisis hanya ~10% pada nisbah effector-to-target (E: T) 10:128. Fc RIIA (CD32a) ialah reseptor transmembran rantai tunggal pertalian rendah untuk IgG monomerik yang sangat dinyatakan dalam neutrofil (30,000 hingga 60,000 molekul/sel31), dan pengikatannya mendorong Fc - fungsi bergantung dalam neutrofil, seperti pembebasan kandungan granul, mobilisasi Ca{44}}, sitotoksisiti anti-tumor dan fagositosis49. Memandangkan peranan penting CD32a dalam pengaktifan dan fungsi neutrofil, kami mereka bentuk dan menguji binaan CAR berasaskan CD32a. Walau bagaimanapun, keputusan kami menunjukkan bahawa CD3ζ mengantara sitolisis yang jauh lebih baik daripada CD32a apabila dinyatakan dalam neutrofil yang diperolehi hPSC, yang mungkin sebahagiannya disebabkan oleh salinan ITAM yang lebih tinggi dalam CD3ζ daripada CD32a : tiga dan satu salinan, masing-masing, dan tahap ekspresi yang lebih tinggi bagi ζ daripada pada permukaan sel neutrofil28. Seperti CD32a, Fc RIII (CD16b) ialah satu lagi reseptor pertalian rendah untuk IgG monomerik dan dinyatakan pada tahap yang lebih tinggi daripada CD32a pada neutrofil31. Walaupun pemautan silang CD16b hanya mendorong mobilisasi dan degranulasi Ca2+, tetapi bukan fagositosis dan sitolisis dalam neutrofil28,50, kajian akan datang masih menarik minat untuk melakukan perbandingan sistematik tentang kebolehan CD3ζ- dan CD16b -CAR dalam mencetus dan meningkatkan fungsi anti-tumor neutrofil.

Rajah 6|Taburan in vivo R-SiO{3}}TPZ yang dihantar oleh neutrofil CAR{3}} (NPs). Skema NP yang ditadbir secara intravena Cy5-berlabel CAR neutrophil@R-SiO2 dan NP R-SiO2 untuk kajian pengesanan sel in vivo. Sel U87MG yang mengekspresikan 5 × 105 luciferase (Luci) telah ditanam secara stereotaktik ke otak depan kanan tikus NRG. Selepas 4 hari, tikus dirawat secara intravena dengan PBS, 5 × 106 Cy5-berlabel CAR neutrophil@R-SiO2 NPs dan R-SiO2 NPs. b Taburan bio bergantung masa bagi neutrofil Cy5+ dalam seluruh badan, otak dan organ lain ditentukan dan dikira melalui pengimejan pendarfluor pada jam yang dinyatakan. c Taburan bio CAR neutrophil@R-SiO2 NPs dan R-SiO2 NPs pada tikus pada 24 jam selepas suntikan telah dianalisis oleh spektrometri pelepasan plasma-optik (ICP-OES) yang digabungkan secara induktif berdasarkan unsur Si, dan data dinyatakan sebagai peratusan daripada dos yang disuntik setiap gram tisu (%ID/g). n=5 sampel bebas biologi. Data diwakili sebagai min ± SD. Data sumber disediakan sebagai fail Data Sumber. d Imej pendarfluor perwakilan CD45 dan SiO2 dalam xenograf glioblastoma yang ditunjukkan yang diasingkan daripada tikus yang membawa tumor ditunjukkan. Bar skala, 100 μm. Tiga kali ganda biologi dilakukan secara bebas.

Rajah 7|Aktiviti anti-tumor in vivo gabungan CAR-neutrofil dan R-SiO2-TPZ nanopartikel (NPs) dinilai melalui suntikan intravena. Skema PBS, PB-neutrofil, CAR-neutrophils dan CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs yang diberikan secara intravena untuk kajian membunuh tumor in vivo. Sel U87MG yang mengekspresikan 5 × 105 luciferase (Luci) telah ditanam secara stereotaktik ke otak depan kanan tikus NRG. Selepas 4 hari, tikus dirawat secara intravena dengan neutrofil yang ditunjukkan setiap minggu selama sebulan. Beban tumor yang bergantung pada masa ditentukan (b) dan dikira (c) oleh pengimejan bioluminescent (BLI) pada hari yang dinyatakan. Data ialah min ± SD untuk tikus dalam (b) (n=5), analisis varians sehala (ANOVA). d Keluk Kaplan-Meier yang menunjukkan kemandirian kumpulan eksperimen yang ditunjukkan (n=5) telah ditunjukkan. Faktor nekrosis tumor manusia yang dikeluarkan- (TNF ) dan IL-6 dalam darah periferi (e) dan berat badan (f) kumpulan tikus yang berbeza diukur pada hari yang dinyatakan. Data ialah min ± SD, n=5 sampel bebas biologi. g, h Aktiviti anti-tumor daripada peningkatan kekerapan dos CAR-neutrofil dan RSiO2-TPZ NPs telah dinilai. g Skema CAR-neutrophils, R-SiO{29}}TPZ NPs dan CAR-neutrophil@ R-SiO{32}}TPZ NPs yang ditadbir secara intravena untuk kajian pembunuhan tumor in vivo. h Keluk Kaplan-Meier yang menunjukkan kemandirian kumpulan eksperimen yang ditunjukkan telah ditunjukkan (n=5). Keluk Kaplan-Meier dianalisis oleh ujian peringkat log. Data sumber disediakan sebagai fail Data Sumber.

Kami juga membentangkan di sini platform penyampaian ubat neutrofil hPSC modular dan serba boleh yang mungkin direka bentuk semula dan ditala pada masa hadapan untuk menyokong usaha berasaskan neutrofil lain untuk merawat penyakit manusia yang lain. Pertama, kejuruteraan CAR lebih mudah diakses dalam hPSC berbanding sel T imun primer dan neutrofil. Ia hanya memerlukan penyuntingan genom sekali sahaja untuk mencapai ekspresi stabil dan homogen pelbagai CAR29. Sebagai tambahan kepada CAR CLTX, kami juga membina garisan hPSC yang stabil yang menyatakan anti-fluorescein (FITC)51 atau anti-PD-L1 CAR52 sejagat, yang kedua-duanya boleh dimanfaatkan untuk mendapatkan nanocarrier CAR-neutrofil penyasaran tumor pepejal sejagat. Pengubahsuaian genetik lain, seperti fibrosis yang menyasarkan anti-FAP CARs53, juga boleh dilakukan untuk mengarahkan pembawa nano neutrofil untuk merawat penyakit degeneratif yang membawa maut, termasuk trauma otak dan fibrosis jantung. Tambahan pula, hPSC yang mengekspresikan CAR juga boleh disesuaikan dengan mudah untuk menghasilkan sel CAR-T atau CAR-NK29, dan gabungan imunoterapi ini dengan nanocarriers CAR-neutrophil boleh mencapai faedah anti-tumor terapeutik yang optimum. Akhir sekali, sistem nanodrug responsif tumor glutathione (GSH) bioinspired kami ialah platform modular dan serba boleh untuk memuatkan ubat kemoterapeutik atau radioaktif yang menjanjikan ke dalam neutrofil CAR untuk penghantaran ubat yang disasarkan, seperti yang ditunjukkan oleh TMZ klinikal, JNJ64619187, dan TPZ pro-ubat. Kajian masa depan tentang ujian nanopartikel lain mungkin menghasilkan pemuatan ubat yang dioptimumkan dalam neutrofil dan mencapai keberkesanan terapeutik in vivo maksimum.

Walaupun kami telah menunjukkan konsep terapeutik menggunakan CAR-neutrofil untuk secara khusus dan cekap menyampaikan ubat kemo kepada tumor otak di seluruh BBB, terdapat beberapa batasan dalam kajian ini. Pertama, 4-inokulasi sel tumor hari mungkin tidak mencukupi untuk mewujudkan tumor yang meniru senario klinikal untuk penyiasatan terapeutik, dan kerja masa hadapan dengan tempoh inokulasi tumor yang berbeza adalah perlu untuk menyusun semula peringkat perkembangan glioblastoma dan tindak balas terapeutik yang berbeza dalam berbeza. pesakit54,55. Kedua, tikus immunodeficient yang kami gunakan di sini tidak mempunyai imuniti adaptif, dan model praklinikal lain dengan sistem imun yang utuh, seperti anjing peliharaan dengan glioma56 spontan, diperlukan untuk menilai dengan lebih baik keselamatan dan keberkesanan neutrofil CAR yang dihasilkan secara in vitro. Khususnya, pemprofilan ketoksikan luar sasaran neutrofil CAR dengan atau tanpa memuatkan ubat nano dalam haiwan yang diselitkan, termasuk sindrom pelepasan sitokin, neurotoksisiti, dan ketoksikan luar tumor atas sasaran yang diperhatikan dalam sel CAR-T57, diperlukan, walaupun jangka hayat pendek. daripada neutrofil. Walaupun pendekatan yang boleh dilaksanakan, seperti penderma sejagat hipoimunogenik kejuruteraan hPSCs58–61 dan perpustakaan hPSC antigen leukosit manusia (HLA) perbankan homozigot62, tersedia untuk mengelakkan potensi risiko penyakit graft-versus-host (GvHD), model haiwan praklinikal dengan sistem imun yang utuh masih diperlukan untuk menilai potensi translasi terapeutik neutrofil kami. Akhirnya, sitotoksisiti anti-tumor terhad dan lanjutan jangka hayat haiwan terapeutik nanodrug CAR-neutrophil diperhatikan. Oleh itu, penerokaan masa depan ubat kemoterapi atau radiosensitizer yang lebih berkesan, dan terapi gabungan dengan CAR-T klasik dan reseksi pembedahan adalah penting untuk mencapai keberkesanan anti-tumor maksimum terapeutik CAR-neutrophil. Sebagai contoh, kajian terbaru mengenai reka bentuk berasaskan mekanisme telah membawa kepada ubat KL-50 yang lebih berkesan yang mengatasi rintangan yang diperoleh seperti yang diperhatikan dalam ubat TMZ klinikal63 dan dengan itu boleh digabungkan ke dalam platform nanodrug CAR-neutrofil modular kami untuk berpotensi keberkesanan terapeutik yang lebih baik. Memanjangkan jangka hayat neutrofil kepada 5 hari melalui rawatan CLON-G (caspases-lisosomal membran permeabilisasi-pengoksidaan-nekroptosis serta faktor perangsang koloni granulosit64) dan/atau menggunakan sistem pelepasan ubat terkawal jangka panjang dalam CAR-neutrofil juga boleh mencapai keberkesanan anti-tumor in vivo yang berkekalan selepas apoptosis neutrofil. Secara kolektif, penemuan kami dengan jelas menunjukkan bahawa neutrofil CAR yang dimuatkan R-SiO2-TPZ boleh mengekalkan fenotip N1 anti-tumor dan dengan cekap membunuh sel-sel tumor di bawah pelbagai keadaan seperti tumor secara in vitro. Neutrofil CAR berfungsi juga boleh dihasilkan dalam kuantiti yang banyak daripada hPSC yang direka bentuk untuk menyampaikan dengan tepat ubat nano responsif persekitaran mikro tumor untuk menyasarkan GBM dalam vivo, yang membawa kepada kemoimunoterapi gabungan dengan aktiviti anti-GBM yang mantap dan khusus serta penghantaran ubat di luar sasaran yang minimum yang jangka hayat yang berpanjangan dalam tikus yang membawa tumor.

Rujukan

1. Yang F. et al. Imunoterapi sinergistik glioblastoma dengan penyasaran dwi IL-6 dan CD40. Nat. Commun. 12, 3424 https://doi.org/ 10.1038/s41467-021-23832-3 (2021).

2. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C. & Weller, M. Keadaan semasa imunoterapi untuk glioblastoma. Nat. Rev. Clin. Oncol. 15, 422–442 (2018).

3. Agliardi, G. et al. Penghantaran IL-12 intratumoral memperkasakan imunoterapi sel CAR-T dalam model glioblastoma pra-klinikal. Nat. Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20599-x (2021).

4. Németh, T., Sperandio, M. & Mócsai, A. Neutrofil sebagai sasaran terapeutik yang muncul. Nat. Rev. Drug Discov. https://doi.org/10.1038/ s41573-019-0054-z (2020).

5. Subhan, MA & Torchilin, VP Neutrophils sebagai sasaran terapeutik yang muncul dan alat untuk terapi kanser. Life Sci. https://doi.org/ 10.1016/j.lfs.2021.119952 (2021).

6. Cheng, YH, He, C., Riviere, JE, Monteiro-Riviere, NA & Lin, Z. Meta-analisis penghantaran nanozarah kepada tumor menggunakan pendekatan pemodelan dan simulasi farmakokinetik berasaskan fisiologi. ACS Nano 14, 3075–3095 (2020).

7. Wilhelm, S. et al. Analisis penghantaran nanopartikel kepada tumor. Nat. Rev. Mater. 1, 1–12 (2016).

8. Xue, J. et al. Penghantaran ubat antikanser yang dimediasi neutrophil untuk penindasan kambuhan glioma malignan selepas operasi. Nat. Nanoteknol. 12, 692–700 (2017).

9. Wu, M. et al. Penjejakan pengimejan MR neutrofil kejuruteraan yang boleh diaktifkan keradangan untuk terapi sasaran glioma yang dirawat melalui pembedahan. Nat. Commun. 9, 1–13 (2018).

10. Chu, D., Dong, X., Zhao, Q., Gu, J. & Wang, Z. Penyebuan fotosensitisasi bagi persekitaran mikro tumor meningkatkan penghantaran nanoterapeutik melalui penyusupan neutrofil. Adv. Mater. 29, (2017).

11. Osuka, S. & Van Meir, EG Terapi kanser: Trafik neutrofil dalam nanodrugs kanser. Nat. Nanoteknol. 12, 616–618 (2017).

12. Lin, YJ, Wei, KC, Chen, PY, Lim, M. & Hwang, TL Peranan neutrofil dalam glioma dan metastasis otak. Depan. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.701383 (2021).

13. Fridlender, Z. et al. Polarisasi fenotip neutrofil yang berkaitan dengan tumor oleh TGF-beta: "N1" berbanding "N2" TAN. Sel Kanser (2009).

14. Blaisdell, A. et al. Neutrofil menentang karsinogenesis epitelium rahim melalui debridement sel tumor hipoksik. Sel Kanser 28, 785–799 (2015).

15. Mahiddine, K. et al. Melegakan hipoksia tumor melepaskan potensi tumor neutrofil. J. Clin. Melabur 130, 389–403 (2020).

16. Yan, J. et al. Neutrofil polimorfonuklear manusia secara khusus mengenali dan membunuh sel-sel kanser. Onkoimunologi 3, e950163 (2014).

17. Jaillon, S. et al. Kepelbagaian dan keplastikan neutrofil dalam perkembangan dan terapi tumor. Nat. Rev. Kanser 20, 485–503 (2020).

18. Li X. et al. Kemajuan penyelidikan tentang sel stem glioma dalam persekitaran mikro imun glioma. Depan. Pharmacol. https://doi.org/10. 3389/fphar.2021.750857 (2021).

19. Gieryng A., Pszczolkowska, D., Walentynowicz, KA, Rajan, WD & Kaminska, B. Persekitaran mikro imun glioma. Makmal. Menyiasat. https://doi.org/10.1038/labinvest.2017.19 (2017).

20. Jung E. et al. Keplastikan sel tumor, heterogeniti, dan rintangan dalam ceruk persekitaran mikro yang penting dalam glioma. Nat. Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21117-3 (2021).

21. Dunn GP et al. Imunoterapi yang muncul untuk glioma malignan: Dari imunogenomik kepada terapi sel. Neuro. Oncol. (2020). https://doi.org/10.1093/neuonc/noaa154

22. Yee PP et al. Ferroptosis yang disebabkan oleh neutrofil menggalakkan nekrosis tumor dalam perkembangan glioblastoma. Nat. Commun. 11, (2020).

23. Sagiv, JY et al. Kepelbagaian fenotip dan keplastikan dalam subpopulasi neutrofil yang beredar dalam kanser. Sel Rep. 10, 562–573 (2015).

24. Li, Y., Hermanson, DL, Moriarity, BS & Kaufman, DS Sel pembunuh semula jadi yang berasal dari iPSC manusia yang direka bentuk dengan reseptor antigen chimeric meningkatkan aktiviti anti-tumor. Sel Stem Sel 23, 181–192.e5 (2018).

25. Kim, GB et al. Sel T CAR yang disasarkan Interleukin{2}} mutant pertalian tinggi meningkatkan penghantaran nanozarah pendarfluor biodegradasi boleh klik kepada glioblastoma. Bioact. Mater. 5, 624–635 (2020).

26. Nguyen, V. et al. Sistem penyampaian ligan baru untuk menggambarkan secara tidak invasif dan mengeksploitasi secara terapeutik biomarker terhad tumor IL13R 2. Neuro. Oncol. 14, 1239–1253 (2012).

27. Wang D. et al. Sel T CAR yang diarahkan klorotoxin untuk penyasaran glioblastoma yang spesifik dan berkesan. Sci. Terjemahan Med. 12, (2020).

28. Roberts, MR et al. Sitolisis khusus antigen oleh neutrofil dan sel NK yang menyatakan reseptor imun chimeric yang mengandungi domain isyarat zeta atau gamma. J. Immunol. 161, 375–384 (1998).

29. Chang, Y. et al. Kejuruteraan neutrofil reseptor antigen chimeric daripada sel stem pluripotent manusia untuk imunoterapi kanser yang disasarkan. Sel Rep. 40, 111128 (2022).

30. Safari H. et al. Neutrofil lebih suka memfagositosis peluang zarah yang memanjang untuk penyasaran terpilih dalam penyakit radang akut. Sci. Adv. 6, (2020).

31. Wang, Y. & Jönsson, F. Ungkapan, peranan, dan peraturan reseptor neutrofil Fc. Depan. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu. 2019.01958 (2019).

32. Németh T. et al. Kepentingan fc reseptor -rantaian ITAM Tyrosines dalam pengaktifan neutrofil dan in vivo autoimun arthritis. Depan. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00252 (2019).

33. Peranan neutrofil Fc RIIa (CD32) dan Fc RIIIb (CD16) bentuk polimorfik dalam fagositosis IgG1- dan IgG3-opsonized manusia dan eritrosit. Transfus. Med. Rev. https://doi.org/10.1016/ s0887-7963(05)80094-x (1995).

34. Tsuboi, N., Asano, K., Lauterbach, M. & Mayadas, TN Reseptor neutrofil manusia Fc memulakan dan memainkan peranan bukan berlebihan khusus dalam penyakit radang yang dimediasi antibodi. Kekebalan. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2008.04.013 (2008).

35. Chang, Y. et al. Penjanaan endothelium hemogenik manusia yang ditentukan secara kimia dan sel progenitor hematopoietik muktamad. Biobahan 285, 121569 (2022).

36. Brok-Volchanskaya, VS et al. Penjanaan neutrofil berfungsi yang berkesan dan pantas daripada sel stem pluripoten teraruh menggunakan ETV2-mRNA diubah suai. Rep. Sel Stem 13, 1099–1110 (2019).

37. Emami Nejad A. et al. Peranan hipoksia dalam persekitaran mikro tumor dan perkembangan sel stem kanser: pendekatan baru untuk membangunkan rawatan. Int Sel Kanser. https://doi.org/ 10.1186/s12935-020-01719-5 (2021).

38. Lequeux A. et al. Kesan persekitaran mikro tumor hipoksik dan keplastikan sel tumor pada ekspresi pusat pemeriksaan imun. Kanser Lett. (2019). https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.05.021 39. Takano, T., Sada, K. & Yamamura, H. Peranan protein-tirosin kinase Syk dalam isyarat tekanan oksidatif dalam sel B. Isyarat Redoks Antioksidan. https://doi.org/10.1089/15230860260196335 (2002).

40. Zhang J. et al. Isyarat selular pengantara ROS dan ROS. Oksida. Med. sel. Panjang umur. https://doi.org/10.1155/2016/4350965 (2016).

41. Kawakami Y. et al. A Laluan pengaktifan Ras bergantung kepada fosforilasi Syk protein kinase C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. https://doi.org/10.1073/pnas.1633695100 (2003).

42. Mócsai, A., Ruland, J. & Tybulewicz, VLJ The SYK tyrosine kinase: Pemain penting dalam pelbagai fungsi biologi. Nat. Rev. Immunol. https://doi.org/10.1038/nri2765 (2010). 43. Liu B. et al. Nanokomposit responsif tumor-mikropersekitaran untuk gas hidrogen sulfida dan Terapi dinamik enzim yang dipertingkatkan trimodal. Adv. Mater. https://doi.org/10.1002/adma. 202101223 (2021).

44. Nguyen, GT, Green, ER & Mecsas, J. Neutrofil kepada ROScue: Mekanisme pengaktifan NADPH oksidase dan rintangan bakteria. Depan. sel. Jangkitan. mikrobiol. https://doi.org/10.3389/fcimb.2017. 00373 (2017).

45. Che J. et al. Neutrofil membolehkan penghantaran liposom tempatan dan bukan invasif kepada otot rangka yang meradang dan jantung iskemia. Adv. Mater. 32, (2020).

46. ​​Le, RQ et al. Ringkasan kelulusan FDA: tocilizumab untuk rawatan reseptor antigen chimeric T yang disebabkan oleh sindrom pelepasan sitokin yang teruk atau mengancam nyawa. Pakar onkologi 23, 943–947 (2018).

47. Morris, EC, Neelapu, SS, Giavridis, T. & Sadelain, M. Sindrom pelepasan sitokin dan neurotoksisiti yang berkaitan dalam imunoterapi kanser. Nat. Rev. Immunol. 22, 85–96 (2022).

48. Liang, J. et al. Neutrofil menggalakkan fenotip glioma malignan melalui S100A4. Clin. Kanser Re. 20, 187–198 (2014).

49. Nagarajan S. et al. Sel-spesifik, peraturan bergantung kepada pengaktifan fungsi pengikat ligan CD32A neutrofil. Darah https://doi.org/ 10.1182/blood.v95.3.1069.003k14_1069_1077 (2000).

50. Fanger, MW, Shen, L., Graziano, RF & Guyre, PM Sitotoksisiti yang dimediasi oleh reseptor Fc manusia untuk IgG. Immunol. Hari ini. https:// doi.org/10.1016/0167-5699(89)90234-X (1989).

51. Lee, YG et al. Kawal selia ketoksikan seperti sindrom pelepasan sitokin pengantara sel T CAR menggunakan penyesuai berat molekul rendah. Nat. Commun. 10, 2681 (2019).

52. Kagoya, Y. et al. Reseptor antigen chimeric novel yang mengandungi domain isyarat JAK-STAT mengantara kesan antitumor yang unggul. Nat. Med. 24, 352–359 (2018).

53. Aghajanian H. et al. Menyasarkan fibrosis jantung dengan sel T yang direka bentuk. alam semula jadi. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1546-z (2019).

54. Zhang C. et al. ErbB2/HER2-sel NK khusus untuk terapi sasaran glioblastoma. J. Natl. Kanser Inst. https://doi.org/10.1093/jnci/ djv375 (2016).

55. Akhavan D. et al. Sel T CAR untuk tumor otak: Pelajaran yang dipelajari dan jalan ke hadapan. Immunol. Rev. https://doi.org/10.1111/imr.12773 (2019).

56. Omar, NB et al. Data keselamatan dan survival interim selepas pentadbiran intrakranial M032, HSV onkolitik kejuruteraan genetik-1 yang menyatakan IL-12, dalam anjing peliharaan dengan glioma sporadis. Pembedahan saraf. Fokus 50, 1–11 (2021).

57. Larson, RC & Maus, MV Kemajuan dan penemuan terkini dalam mekanisme dan fungsi sel T CAR. Nat. Rev. Kanser 21, 145–161 (2021).

58. Wang, B. et al. Penjanaan sel T hipoimunogenik daripada sel stem pluripoten yang disebabkan oleh alogenik manusia yang direka bentuk secara genetik. Nat. Berbiomed. En. 5, 429–440 (2021).

59. Deuse, T. et al. Derivatif hipoimunogenik sel stem pluripoten teraruh mengelakkan penolakan imun dalam penerima alogenik imunokompeten sepenuhnya. Nat. Bioteknol. 37, 252–258 (2019).

60. Han X. et al. Penjanaan sel stem pluripotent manusia hipoimunogenik. https://doi.org/10.1073/pnas.1902566116

61. Kwon YW et al. Penyuntingan Genom HLA DR dengan TALEN dalam iPSC manusia menghasilkan sel dendritik yang tahan imun. Sel Stem Int. https://doi.org/10.1155/2021/8873383 (2021).

62. Morizane A. et al. Padanan MHC mempertingkatkan penggabungan neuron yang diperolehi iPSC dalam primata bukan manusia. Nat. Commun. https://doi. org/10.1038/s41467-017-00926-5 (2017).

63. Lin, K. et al. Reka bentuk agen berasaskan mekanisme yang secara selektif menyasarkan glioma tahan dadah. Sci. (80-.) 377, 502–511 (2022).

64. Peminat Y. et al. Menyasarkan laluan kematian berbilang sel memanjangkan jangka hayat dan mengekalkan fungsi neutrofil manusia dan tetikus untuk transfusi. Sci. Terjemahan Med. 13, (2021).

65. Chang Y. et al. Penunjuk pendarfluor untuk pelaporan berterusan dan khusus keturunan bagi fasa kitaran sel dalam sel stem pluripoten manusia. Bioteknol. Bioeng. sedikit.27352. https://doi.org/10.1002/bit. 27352 (2020).

66. Jung, J. et al. Penjanaan yang ditakrifkan secara kimia bagi sel stem hematopoietik dan progenitor definitif manusia. Protokok STAR. 4, 101953 (2023).