Lipidomics Mendedahkan Perubahan Lipid Renal Akibat Cisplatin Semasa Kecederaan Buah Pinggang Akut Dan Pelemahannya Oleh Cilastatin

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrak:  Nefrotoksisiti adalah komplikasi utama kemoterapi berasaskan cisplatin, yang membawa kepada akutkecederaan buah pinggangdalam ca. 30 peratus pesakit, tanpa campur tangan atau rawatan pencegahan tersedia untuk kegunaan klinikal. Cilastatin telah terbukti memberikan kesan nefroprotektif untuk terapi cisplatin dalam model in vitro dan in vivo, setelah memasuki ujian klinikal baru-baru ini. Pemahaman yang lebih mendalam pada tahap molekul yang disebabkan oleh cisplatinkerosakan buah pinggangdan kesan agen pelindung yang berpotensi boleh menjadi kunci untuk membangunkan terapi nefroprotektif yang berjaya dan untuk mewujudkan penanda bio baru bagikerosakan buah pinggangdannefroprotection. Pendekatan lipidomik yang disasarkan, menggunakan LC-MS/MS, digunakan untuk pengkuantifikasian 108 spesies lipid (terdiri daripada fosfolipid, sphingolipid, dan kolesterol bebas dan esterifikasi) dalambuah pinggangekstrak korteks dan medula daripada tikus yang dirawat dengan cisplatin dan/atau cilastatin. Sehingga 56 dan 63 spesies lipid didapati diubah dalam korteks dan medulla, masing-masing selepas rawatan cisplatin. Rawatan bersama dengan cilastatin melemahkan banyak perubahan lipid ini, sama ada sepenuhnya atau sebahagiannya berkenaan dengan tahap kawalan. Analisis multivariate mendedahkan bahawa spesies lipid boleh digunakan untuk mendiskriminasikerosakan buah pinggangdannefroprotection, dengan ester kolesterol menjadi spesies yang paling membezakan, bersama-sama dengan sulfatida dan fosfolipid. Biomarker diagnostik yang berpotensi disebabkan oleh cisplatin kerosakan buah pinggangdan cilastatinnefroprotectionturut ditemui.

Kata kunci:lipidomik; cisplatin; kecederaan buah pinggang akut; cilastatin; nefroproteksi; biomarker; ester kolesterol; sphingolipid; fosfolipid; kemoterapi

pengenalan Nefrotoksisiti adalah kesan sampingan yang serius daripada kemoterapi cisplatin [1], dengan akutkecederaan buah pinggang(AKI) sedang dibangunkan di ca. 30 peratus daripada pesakit yang dirawat [2]. Ini juga merupakan faktor pengehad dos utama dan kelemahan penting terapi berasaskan cisplatin, salah satu rawatan yang paling relevan untuk tumor pepejal [2]. Cisplatin terkumpul dan menyebabkan kecederaan kepadabuah pinggangsel epitelium tubul proksimal (RPTECs), dan kerosakan terutamanya terletak pada segmen S3 tubul proksimal, menurun daribuah pinggangkorteks ke arah persimpangan corticomedullary dan medula luar [3]. Walau bagaimanapun, kerosakan langsung pada gelung Henle medullary juga telah dicadangkan [4,5]. Satu siri peristiwa selular berlaku berhubung denganbuah pinggangkecederaan sel tubul, berikutan pengambilan cisplatin, termasuk tekanan oksidatif, tekanan nitrosatif, kecederaan vaskular, keradangan, kerosakan mitokondria atau perencatan Na plus , K plus - ATPase dalam membran sel, dan tekanan retikulum endoplasma, diikuti oleh kematian sel tubul proksimal terutamanya oleh apoptosis (kedua-duanya melibatkan laluan intrinsik dan ekstrinsik) atau nekrosis, yang membawa kepada kehilanganfungsi buah pinggang[2,6,7]. Ini ditunjukkan dalam penurunan kadar penapisan glomerular (GFR) dan paras magnesium dan kalium serum, dengan peningkatan nitrogen urea darah (BUN) dan kreatinin serum [2].

Pelbagai pendekatan telah disiasat untuknefroprotectionsemasa terapi cisplatin secara in vitro dan in vivo, berdasarkan beberapa sasaran molekul [7-9]. Walau bagaimanapun, kemungkinan gangguan kesan sitotoksik cisplatin pada sel tumor dan kesan perlindungan yang sering tidak lengkap telah mengehadkan pembangunan renoprotectors [9]. Akibatnya, tiada campur tangan untuk kegunaan klinikal yang berjaya menghalang atau merawat AKI yang disebabkan oleh cisplatin [7]. Pemahaman yang lebih mendalam tentang laluan molekul yang berkaitan dengan AKI yang disebabkan oleh cisplatin dan sasaran yang berpotensi untuknefroprotectionnampaknya penting dalam hal ini.

Cilastatin telah terbukti berkesan melindungibuah pinggangdaripada kerosakan yang disebabkan oleh beberapa agen, termasuk cisplatin [10,11], gentamicin [12], vancomycin [13], cyclosporine A, dan tacrolimus [14], dalam kedua-dua model in vitro dan in vivo. Cilastatin memberikan kesan perlindungannya dengan menghalang secara selektifbuah pinggangdehydropeptidase I (DHP-I) yang terletak di rakit lipid pada sempadan berus RPTECs [11]. Akibatnya, proses yang melibatkan eksternalisasi membran seperti apoptosis ekstrinsik yang dimediasi Fas terjejas oleh cilastatin, dan perkembangankerosakan buah pinggangselepas penghinaan toksik ditahan [11]. Selain daripada kerosakan apoptosis ekstrinsik oleh cilastatin, tekanan oksidatif, keradangan, dan pengumpulan sebatian nefrotoksik semuanya didapati berkurangan [10-13,15,16]. Oleh itu,fungsi buah pinggangkekal dipelihara di bawah rawatan bersama dengan cisplatin dan cilastatin [11]. Baru-baru ini, cilastatin telah berjaya menyelesaikan ujian klinikal fasa I untuk kegunaannya sebagai nephroprotector dan akan memasuki ujian fasa II. Kajian terbaru yang menjanjikan juga mendedahkan bahawa cilastatin (diberikan sebagai imipenem ditambah cilastatin) boleh mencapai kesan renoprotektif pada pesakit dengan karsinomatosis peritoneal semasa rawatan cisplatin intraperitoneal hyperthermic [17].

Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, teknologi omics, terutamanya proteomik [18,19] dan metabolomik [20-23], telah terbukti berguna untuk penemuan biomarker diagnostik awal novel AKI, selain daripada BUN atau kreatinin dalam serum [18,20]. Di samping itu, analisis metabolomik boleh memberikan maklumat yang berharga untuk memahami mekanisme cisplatin nefrotoksisiti [5,24] dan kesan terapeutik nefroprotektor berpotensi [25-27].

Khususnya, lipidomik juga boleh memberikan maklumat yang berkaitan mengenaipenyakit buah pinggang[28], memandangkan lipid membentangkan peranan struktur utama, isyarat sel, dan metabolisme, dan ia boleh diubah dalam sel, tisu, dan biofluida di bawahbuah pinggangkeadaan patologi [29,30]. Dalam hal ini, peningkatan tahap trigliserida dan asid lemak tidak tersterifikasi didapati dalambuah pinggangsemasa rawatan cisplatin [31], sebagai tambahan kepada lipid neutral [32]. Paras sphingolipid yang tinggi—ceramide (Cer) dan hexosyl ceramides (HexCer)—juga diperhatikan dalambuah pinggangkorteks semasa AKI yang disebabkan oleh cisplatin [33]. Sebaliknya, spesies fosfolipid, termasuk phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), dan spesies lysophosphatidylcholine (LPC), juga didapati diubah dalamtisu buah pinggangatau sel semasa rawatan cisplatin [26]. Tahap spesies LPC yang pelbagai juga didapati diubah dalam serum tikus selepas pentadbiran cisplatin [23]. Selain itu, pengimejan spektrometri jisim pendekatan separa kuantitatif tidak disasarkan membenarkan membandingkan taburan lipid dalam tikusbuah pinggangbahagian dan mencadangkan bahawa platin cis membawa kepada perubahan pada pelbagai fosfolipid (PC, PE, fosfatidilgliserol (PG), fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserin (PS), asid fosfatidik (PA)), sulfatida (Sulf), atau kardiolipin) [34] (menunjukkan tingkah laku yang berbeza dalam korteks dan medulla), manakala rawatan bersama dengan cilastatin cenderung untuk melemahkan beberapa perubahan ini [4].

Dalam kerja ini, kami telah melangkah lebih jauh dan melihat lebih dekat pada lipid struktur penting dalambuah pinggang, seperti fosfolipid (PC, LPC dan PE), sphingolipid (Sulf, sphingomyelins (SM), dihydrosphingomyelins (dhSM), Cer, dihydroceramides (dhCer), HexCer, dihydrohexosylceramides (dhHexCer)), dan kolesterol bebas (FC) dan disterifikasikannya. bentuk (ester kolesterol (CE)), meliputi kelas dan spesies lipid baharu dan menggunakan pendekatan kuantitatif sasaran yang lebih dipercayai berdasarkan kromatografi cecair yang digabungkan dengan analisis spektrometri jisim tandem (LC-MS/MS). Sebanyak 108 spesies lipid telah dikira kedua-duanya padabuah pinggangekstrak korteks dan medula daripada tikus yang dirawat, untuk lebih memahami kesan nefrotoksik cisplatin dan kesan nefroprotektif cilastatin. Maklumat baharu tentang kesan cisplatin yang berkaitan dengan AKI padabuah pinggangspesies lipid diperolehi dan pandangan tambahan diperolehi tentang kesan perlindungan cilastatin, yang membawa kepada pengecilan beberapa perubahan lipid spesifik yang disebabkan oleh cisplatin sama ada dalambuah pinggangkorteks atau medula. Pelbagai biomarker berpotensi yang disebabkan oleh cisplatinkerosakan buah pinggangdannefroprotectiondengan cilastatin juga dijumpai.

Keputusan

Kesan Perlindungan Cilastatin terhadap Kerosakan Buah Pinggang Akibat Cisplatin

Penilaianfungsi buah pinggangdalam tikus yang dirawat cisplatin dan/atau cilastatin adalah pertama kali dijalankan dengan menggunakan beberapa penunjuk biokimia dalam serum dan air kencing. Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 1, kreatinin serum, BUN, protein air kencing, isipadu air kencing, dan perkumuhan pecahan natrium dan kalium telah meningkat dengan ketara disebabkan oleh rawatan cisplatin berbanding dengan kumpulan kawalan, manakala rawatan bersama dengan cilastatin dan cisplatin menyebabkan penurunannya berbanding dengan tahap kawalan. Sebaliknya, GFR telah menurun dalam tikus yang dirawat cisplatin berkenaan dengan sampel kawalan, manakala pentadbiran bersama cilastatin mengurangkan kesan ini. Keputusan ini mengesahkankerosakan buah pinggangdisebabkan oleh cisplatin dan perlindungan oleh cilastatin. Cilastatin sahaja tidak menunjukkan sebarang kesan ke atasfungsi buah pinggangparameter.

Analisis histopatologi juga dilakukan dalam bahagian hematoxylin/eosin untuk mengkaji perubahan morfologi yang berkaitan dengankerosakan buah pinggang. Rajah 1 menunjukkan tanda-tanda kerosakan akibat cisplatin pada proksimalbuah pinggangtubul, termasuk pembengkakan tubul, detasmen serpihan sel, atau kehilangan membran sempadan berus (Rajah 1C, G, I). Pengumpulan tuangan protein juga diperhatikan dalam korteks dan tubul medulla (Rajah 1C, G, masing-masing). Ini berbeza dengan morfologi biasa yang diperhatikan dalam kumpulan kawalan atau cilastatin dalam korteks (Rajah 1A, B, masing-masing) dan medula (Rajah 1E, F, masing-masing). Rawatan bersama Cilastatin dengan cisplatin mengakibatkan pengurangan jelas semua perubahan yang disebabkan oleh cisplatin ini dalam korteks dan medulla (Rajah 1D, H, J).

Pengubahan Cisplatin Kelas Lipid Renal Global dalam Korteks dan Medula. Kesan Perlindungan Cilastatin

Jumlah tahap kelas lipid yang berbeza, termasuk sterol (CE, FC), fosfolipid (LPC, PC, PE), dan sphingolipid (Cer, dhCer, HexCer, dhHexCer, Sulf, SM, dhSM) telah ditentukan dilombong dalambuah pinggangkorteks dan medulla, untuk menilai kesan global cisplatin pada lipid semasa AKI. Keputusan lengkap analisis lipid didapati dalam Jadual S1. Seperti yang dapat dilihat dalam Rajah 2A, B, trend yang agak serupa diperhatikan dalam korteks dan medula untuk semua kumpulan. CE dan Cer meningkat dengan ketara, manakala SM, dhSM, dan PE telah menurun, kedua-duanya dalam korteks dan medulla semasa rawatan cisplatin, berkenaan dengan kumpulan kawalan. Antaranya, Cer dan CE mengalami perubahan yang paling ketara akibat cisplatin yang diperhatikan. Selain itu, dhCer dan HexCer telah meningkat dengan ketara dalam medulla, manakala dalam korteks, dhHexCer meningkat dan LPC dan Sulf telah menurun semasa rawatan cisplatin.

Rajah 1. Analisis histopatologi bagi hematoxylin/eosin diwarnakanbuah pinggangbahagian menunjukkan perlindungan cilastatin terhadap kerosakan akibat cisplatin. Imej ditunjukkan pada pembesaran 20 × untuk (A) kawalan korteks; (B) korteks cilastatin; (C) korteks cisplatin; (D) cisplatin ditambah korteks cilastatin; (E) mengawal medula; (F) medula cilastatin; (G) medula cisplatin; dan (H) cisplatin ditambah cilastatin medula. Bar skala dari A hingga H mewakili 100 µm. Imej terperinci daripadabuah pinggangtubul pada pembesaran 60× dipaparkan untuk (I) cisplatin dan (J) cisplatin ditambah cilastatin. Bar skala untuk I dan J mewakili 25 µm.buah pinggangpenunjuk kerosakan diwakili: →: pengumpulan tuangan protein dalambuah pinggangtubulus. & rantau: bengkak tubul. *: kehilangan membran sempadan berus. #: detasmen serpihan sel.

Pentadbiran bersama cilastatin dan cisplatin cenderung untuk melemahkan beberapa perubahan lipid yang disebabkan oleh cisplatin ini, menyebabkan tiada perbezaan berkenaan dengan kumpulan kawalan dalam kes tahap Cer dan dhHexCer dalam korteks, atau dhCer, HexCer, SM, dhSM, dan PE tahap dalam medula. Tambahan pula, dalam kes peningkatan CE yang disebabkan oleh cisplatin dalam korteks, cilastatin yang ditadbir bersama dengan cisplatin membawa kepada penurunan tahap yang ketara berbanding dengan kumpulan cisplatin, walaupun pemulihan adalah separa berkenaan dengan kumpulan coiatrol. Selebihnya kelas lipid yang diubah oleh cisplatin kekal dengan rawatan bersama durirtg cilastatisi. Sebaliknya, cilastatin sendiri tidak mempunyai kesan pada korteks dan lipicts medulla, kecuali untuk LPC dan dhCer dalam korteks, yang nampaknya menurun dan meningkat, masing-masing, berbanding dengan kumpulan kawalan. Jumlah tahap FC, PC, dan dhHexCer tidak menunjukkan perubahan ketara dalam korteks dan medula selepas rawatan cisplatin.

Rajah 2C, D memaparkan peta haba korelasi untuk kelas lipid dalam korteks dan medula, masing-masing, menawarkan arah aliran yang sama.

Alitrasi Spesies Lipid Renal Individu dengan Rawatan Cisplatin. Cilastatin Attenuating Egect

Kolestesol EsterAnalisis lima spesies CE individu (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4, dan CE 22:6) dijalankan dalambuah pinggangkorteks dan medulla mendedahkan bahawa cisplatin meningkat dengan ketara setiap daripada mereka berbanding dengan tahap kawalan (Rajah 3). Sebaliknya, pentadbiran bersama cilastatin dan cisplatin membawa kepada penurunan umum dalam tahap spesies CE individu berkenaan dengan rawatan cisplatin, yang secara statistik signifikan untuk semua spesies CE dalam korteks dan CE 18:2 dalam medula, seperti yang boleh dilihat dalam Rajah 3. Pemulihan dalam spesies CE korteks disebabkan oleh penempatan bersama cilastatin adalah separa berbanding dengan tahap kumpulan kawalan, manakala tiada pemulihan yang signifikan secara statistik dalam kebanyakan spesies CE medella (kecuali CE 18:2) diperhatikan untuk pentadbiran bersama cilastatin. berbanding dengan cisplatin. Keputusan analisis statistik lengkap mengenai spesies lipid korteks dan medula ditunjukkan dalam Jadual S2 dan S3, masing-masing.

Sphingolipids : Cer, dhCer, HexCer, dhHexCer, SM, dhSM dan SulfSebanyak 43 spesies sphingolipid telah dikira dalambuah pinggangkorteks dan medula untuk menilai kesan rawatan cisplatin dan cilastatin pada tahapnya, seperti yang dipaparkan dalam Rajah 4. Berkenaan spesies Cer (Rajah 4A), dhCer (Rajah 4B), HexCer (Rajah 4C) dan, dhHexCer (Rajah 4D), sebagai dapat dilihat, rawatan cisplatin menghasilkan peningkatan yang ketara dalam 19 spesies daripada empat kelas anda dalambuah pinggangkorteks dan medula. Sekali lagi, rawatan bersama dengan cisplatin dan cilastatin menunjukkan kecenderungan untuk mengurangkan kesan cisplatin, dengan penurunan umum dalam tahap lipid yang diubah cisplatin dalam korteks dan medulla. Malah, bagi spesies dhCer (Rajah 4B) dan dhHexCer (Rajah 4D), tiada perbezaan diperhatikan antara kumpulan cisplatin ditambah cilastatin yang dirawat dan groujts kawalan untuk spesies yang diubah cisplatin tersebut, menunjukkan pemulihan sepenuhnya. Dalam kes Cer (Rajah 4A) dan HexCer (Rajah 4C), recoeery ini juga berlaku untuk beberapa spesies yang diubah, seperti HexCer 34:1 (korteks dan medula) dan HexCer 38:1 dan HexCer 42:1 (medulla). ); Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1, dan Cer 42:2 dalam korteks; dan Cer 34:1 dan Cer 42:2 dalam medula, sama ada pulih sepenuhnya atau sebahagian. Sebaliknya, rawatan cisplatin ditambah cilastatin masih menunjukkan perbezaan yang ketara berkenaan dengan kumpulan kawalan untuk Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1, dan HexCer 36:1 dalam medula, tanpa pemulihan, menunjuk kepada kesan pemulihan yang lebih baik yang diberikan oleh cilastatin dalam korteks daripada di medula untuk Cer dan HexCer.

Dalam kes spesies SM (Rajah 4E) dan dhSMt (Rajah 4F), cisplatin membawa kepada penurunan dalam korteks dan medula untuk spesies rantai terpendek dan terpanjang, yang signifikan secara statistik untuk SM 34:1, dhSM 34:{{ 5}}, SM 42:2, SM 42:1, dan dhSM 42:1. Sebaliknya, kesan yang diperhatikan untuk rawatan cisplatin pada rantai perantaraan SM dan spesies dhSM dalam korteks dan medula adalah peningkatan, yang secara statistiknya signifikan untuk dhSM 36:0 (kedua-duanya dalam korteks dan medula) dan dhSM 4{{ 15}}:0, SM 36:1, SM 38:1, dan SM 40:1 dalam medula. Pentadbiran bersama cisplatin dan cilastatin cenderung untuk menormalkan tahap spesies SM dan dhSM dalam banyak kes, dengan SM 34:1, SM 36:1, SM 38:1, SM 40:1, SM 42:2, SM 42:1, dhSM 36:0, dhSM 40:0, dan dhSM 42:1 tidak menunjukkan perbezaan berkenaan dengan kumpulan kawalan dalam medula. Akhirnya, beberapa spesies Sulf juga telah diubah oleh rawatan cisplatin dalambuah pinggangkorteks dan medula, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4G. Walaupun Sulf 40:1 didapati meningkat dengan ketara dalam kedua-dua korteks dan medula selepas rawatan cisplatin, spesies lain seperti Sulf-OH 40:1 atau Sulf-OH 42:2, Sulf-OH rantai panjang 42:2 telah berkurangan dalam korteks, dengan Sulf 42:0 dan Sulf-OH 42:1 juga berkurangan dalam kedua-dua korteks dan medula. Cilastatin yang ditadbir bersama dengan cisplatin membawa sekali lagi kepada kesan pemulihan ringan, terutamanya untuk Sulf 40:1 (korteks dan medulla) dan Sulf 40:2 dan Sulf-OH 42:1 (medulla), tidak menunjukkan perbezaan berbanding dengan kumpulan kawalan.

Fosfolipid: PC, PE dan LPCKuantifikasi 60 spesies fosfolipid (28 PC, 20 PE, dan 12 LPC) telah dijalankan dalambuah pinggangkorteks dan medula untuk penilaian potensi perubahan yang disebabkan oleh cisplatin dan kesan renoprotektif cilastatin. Keputusan untuk spesies PC ditunjukkan dalam Rajah 5A, B, masing-masing. Seperti yang dapat dilihat, cisplatin telah mengubah dengan ketara sehingga 19 spesies PC sama ada dalam korteks atau medula. Kebanyakan spesies PC ini telah dikurangkan oleh cisplatin, dengan pengecualian PC 40:2, PC 40:4, dan PC 34:2, yang meningkat dalam korteks. Pecahan spesies PC yang sangat tidak beraturan telah berkurangan dengan ketara dalam kedua-dua medula dan korteks, manakala pecahan spesies yang mengandungi dua ikatan berganda meningkat dengan ketara, seperti yang boleh dilihat dalam Rajah 5C, D. Rawatan dengan kedua-dua cisplatin dan cilast atin menunjukkan kesan yang sama dengan yang diperhatikan sebelum ini, dengan beberapa kesan pelemahan diperhatikan, dalam beberapa kes membawa kepada pemulihan penuh tahap PC, tanpa perbezaan ketara dengan kumpulan kawalan, atau kepada pemulihan separa. Pemulihan ini terutamanya diperhatikan dalam Keputusan untuk penentuan spesies PE dalam korteks dan medula ditunjukkan dalam Rajah 6A, B, masing-masing. Sebanyak 16 spesies PE telah diubah dengan ketara oleh cisplatin sama ada dalam korteks atau medulla, dengan bilangan spesies berubah tertinggi terdapat dalam medula. Dalam kebanyakan kes, spesies PE telah dikurangkan dengan rawatan cisplatin, kecuali untuk PE 38:2, PE 40:6, dan PE 40:4, yang meningkat sama ada dalam korteks, medula, atau kedua-dua korteks dan medula, masing-masing. Sehubungan itu, memandangkan jumlah panjang rantai asid lemak dalam spesies PE dalam medula, jumlah PE dengan 34, 36, dan 38 C telah berkurangan dengan ketara dengan cisplatin, manakala spesies 40 C telah meningkat, seperti yang digambarkan dalam Rajah 6C. . Rawatan bersama Cilastatin dengan cisplatin melemahkan kebanyakan perubahan yang disebabkan oleh cisplatin dalam spesies PE individu yang terdapat dalam medula, menawarkan tahap tanpa perbezaan yang ketara berbanding dengan kumpulan kawalan dalam 11 daripada 15 spesies yang diubah cisplatin dalam medula, dengan 2 lagi spesies PE sebahagiannya pulih. Walau bagaimanapun, dalam korteks, hanya 2 daripada 11 spesies yang diubah cisplatin telah dipulihkan dengan cilastatin untuk mengawal tahap, dengan 2 spesies PE tambahan telah dipulihkan sebahagiannya. Sama seperti pemerhatian untuk spesies PC, pecahan spesies PE sangat tak tepu telah berkurangan dengan ketara dalam medula, manakala pecahan spesies yang mengandungi 1-3 ikatan berganda meningkat dengan ketara, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6D.

Mengenai analisis spesies LPC, kebanyakan perubahan yang disebabkan oleh cisplatin yang diperhatikan didapati dalambuah pinggangkorteks, di mana LPC 16:1, LPC 16:0, LPC 18:1, LPC 18:0 , LPC 20:3, LPC 22:6 dan LPC 22:5 telah menurun dengan ketara dengan berkenaan dengan sampel kawalan, seperti yang boleh dilihat dalam Rajah 7A. Sebaliknya, LPC 17:1 dan LPC 18:2 didapati meningkat dalam medula semasa rawatan cisplatin (Rajah 7B). Rawatan bersama dengan cisplatin dan cilastatin tidak mempunyai kesan pemulihan pada spesies LPC korteks. Sebaliknya LPC 17:1 dan LPC 18:2 telah dipulihkan dalam medula, tanpa perbezaan yang ketara berbanding dengan sampel kawalan.

Lipid Renal sebagai Pembolehubah Pengelasan untukKerosakan Buah Pinggangdan Perlindungan 

Analisis multivariate dilakukan menggunakan semua pembolehubah lipid yang diukur dalam korteks dan medula untuk menilai sama ada spesies ini boleh berfungsi untuk pengelasan kumpulan dan arif yang disebabkan oleh cisplatin.kerosakan buah pinggangdannefroprotectionoleh cilastatin. Analisis komponen utama (PCA) dan unjuran ortogon kepada analisis diskriminasi struktur terpendam (OPLS-DA) telah dijalankan menggunakan secara berasingan sama ada lipid korteks atau medula, seperti yang dipaparkan dalam Rajah 8. Analisis PCA bagi korteks (Rajah 8A) dan medula (Rajah 8B) lipid menawarkan model keupayaan untuk menunjukkan pemisahan yang jelas bagi kumpulan cisplatin berkenaan dengan kumpulan kawalan dan cilastatin, dua yang terakhir berkelompok rapat. Sebaliknya, kumpulan cisplatin ditambah cilastatin yang dirawat cenderung untuk memisahkan daripada kumpulan cisplatin dan terletak di antara kumpulan kawalan dan cisplatin, mencadangkan perbezaan antara kumpulan. Semua model PCA mempersembahkan R2 lebih tinggi daripada 0.7 dan nilai Q2 lebih tinggi daripada 0.5.

Analisis OPLS-DA berbilang kumpulan juga menunjukkan pengelompokan kumpulan berbeza yang dipisahkan dengan jelas menggunakan pembolehubah lipid korteks (Rajah 8C) atau medula (Rajah 8D). Model OPLS-DA mempersembahkan nilai Q2 dan nilai R2 yang boleh diterima lebih tinggi daripada 0.7 dan terbukti sah semasa ujian pilih atur untuk 100 lelaran, seperti ditunjukkan dalam Rajah 8E,F. Ciri-ciri dengan kepentingan berubah-ubah dalam unjuran (VIP) skor yang lebih tinggi daripada 1 boleh didapati dalam Rajah 8G,H, masing-masing menunjukkan korteks atau lipid medula, yang mempunyai kesan yang lebih tinggi pada pemisahan kumpulan. Ini terdiri daripada spesies lipid yang pelbagai daripada kelas CE, sphingolipid, dan fosfolipid. Untuk menentukan perbezaan lipid spesifik antara kumpulan individu yang berkaitan dengan rawatan cisplatin dannefroprotection, analisis OPLS-DA selanjutnya dilakukan secara berasingan dengan lipid korteks dan medula, seperti yang boleh dilihat dalam Rajah 9 dan 10, masing-masing. Model OPLS-DA dibina untuk cisplatin berbanding dengan kumpulan kawalan, cisplatin ditambah cilastatin berbanding dengan cisplatin, serta cisplatin ditambah cilastatin berbanding dengan kumpulan kawalan. Model OPLS-DA yang paling diskriminasi ialah model antara kawalan dan sama ada cisplatin atau cisplatin ditambah kumpulan yang dirawat cilastatin, dengan mengambil kira nilai R2 dan Q2 tertinggi mereka, dengan pengesahan yang betul berdasarkan keputusan ujian pilih atur dengan 100 kitaran (Rajah 9A,B,D, E dan Rajah 10A,B,D,E).

Sebaliknya, model OPLS-DA untuk kumpulan cisplatin ditambah cilastatin dan cisplatin, kedua-duanya menggunakan lipid korteks (Rajah 9C) atau medula (Rajah 10C), juga membenarkan negara diskriminasi kumpulan, dengan nilai R2 dan Q2 yang munasabah dan hasil pengesahan yang bersesuaian daripada 100-ujian pilih atur kitaran (Rajah 9F dan 10F), dengan lipid medula adalah yang menunjukkan kebolehramalan yang lebih baik. S-plot untuk model OPLS-DA yang berbeza disertakan dalam Rajah 9G,H,I dan Rajah 10G,H,I, sama ada untuk ciri-ciri lipid korteks atau medula. Spesies dengan |p(corr)| lebih tinggi daripada 0.5 dan skor VIP lebih tinggi daripada 1 telah ditandakan dalam plot-S sebagai ciri yang paling relevan untuk diskriminasi kumpulan. Data lengkap termasuk nilai p(corr) dan VIP daripada model OPLS-DA, bersama-sama dengan statistik univariat untuk setiap spesies lipid, boleh didapati dalam Jadual Tambahan S2 (lipid korteks) dan S3 (lipid medulla). Nampak jelas itubuah pingganglipid korteks dan medula boleh berfungsi sebagai kriteria yang membezakan untuk disebabkan oleh cisplatinkerosakan buah pinggangdan untuk cilastatinnefroprotectionsemasa rawatan cisplatin.

Lipid Renal sebagai Biomarker Berpotensi Kerosakan Renal Akibat Cisplatin Untuk memilih biomarker lipid yang berpotensi untuk kerosakan buah pinggang

disebabkan oleh cisplatin, gabungan berbilang kriteria bagi nilai-p yang signifikan secara statistik daripada analisis univariat cisplatin berbanding kumpulan kawalan, serta nilai p(corr) dan VIP yang terdapat dalam model OPLS-DA corre sponding, telah digunakan. Lipid terpilih dengan nilai-p < 0.05;="" fdr="">< 0.1;="" |p(corr)|=""> 0.5 dan VIP > 1 boleh didapati dalam Jadual 2 (lipid korteks) dan Jadual 3 (lipid medulla), di mana perubahan lipatan (FC) dan kawasan di bawah lengkung (AUC) untuk lengkung ciri pengendalian penerima (ROC) turut disertakan.

Seperti yang dapat dilihat, sehingga 40 lipid daripada medula dan 27 lipid daripada korteks, yang terdiri daripada spesies CE, sphingolipid dan fosfolipid, masing-masing dipilih dalam Jadual 2 dan 3. Nilai AUC untuk lengkung ROC yang diperoleh untuk setiap lipid adalah lebih tinggi daripada 0.85 dan, dalam kebanyakan kes, hampir 1, menunjukkan keupayaan diskriminasi yang baik bagi spesies antara cisplatin dan kumpulan kawalan. Hebatnya, spesies CE yang bertambah cisplatin (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4, dan CE 22:6) nampaknya paling mendiskriminasikan. ciri dalam medula dan korteks, menunjukkan nilai FC, VIP, p(corr) dan AUC tertinggi. dhHexCer 34:0 adalah satu lagi peningkatan lipid dalam korteks dengan skor FC tinggi dan relevan. Sebaliknya, sulfatida seperti Sulf 42:0, Sulf-OH 40:1, atau Sulf-OH 42:1 juga agak relevan dalam korteks, manakala PE 36:5, PE 38:6, PE 38:5 PC 36:5, atau PC 36:6 ​​juga sangat penting dalam medula, semuanya berkurangan semasa rawatan cisplatin.

Lipid Renal sebagai Biomarker Berpotensi Cilastatin Nephroprotection

Untuk memilih biomarker lipid berpotensi perlindungan cilastatin terhadap ketoksikan cisplatin nephro, pendekatan berbilang kriteria yang sama seperti dalam Bahagian 2.5, telah digunakan menggunakan analisis univariat bagi kumpulan cisplatin ditambah cilastatin berbanding cisplatin, dan nilai p(corr) dan VIP yang terdapat dalam OPLS- yang sepadan. model DA. Lipid terpilih dengan nilai-p < 0.05;="" fdr="">< 0.1;="" |p(corr)|=""> 0.5, dan VIP > 1 boleh didapati dalam Jadual 4 (lipid korteks) dan Jadual 5 (lipid medulla), di mana FC dan AUC untuk lengkung ROC juga dikira.

Seperti yang dapat dilihat dalam Jadual 4, semua spesies CE (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4, dan CE 22:6) dalam korteks boleh dianggap sebagai penunjuk paling berkuasa bagi perlindungan yang diberikan oleh cilastatin, dengan ketara mengurangkan, pada masa yang sama, perubahan yang disebabkan oleh cisplatin. PE 36:5 dan dhHexCer 34:0 dalam korteks juga merupakan biomarker berpotensi penting bagi perlindungan cilastatin, terutamanya yang terakhir, yang mengalami pemulihan total disebabkan cilastatin ke arah tahap kawalan. Mengenai lipid medulla, seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 5, jumlah biomarker berpotensi perlindungan cilastatin yang lebih tinggi didapati daripada dalam korteks. Terutama, Sulf 40:2 nampaknya merupakan spesies yang paling mendiskriminasi dalam medula, dengan mengambil kira skor FC dan VIP tertingginya. Spesies PC dan PE yang pelbagai juga ditemui, termasuk PE 36:5, PE 38:5, PE 38:6, PE 36:4, PE 34:3, dan PC 36:6, untuk menamakan beberapa, sebagai tambahan kepada Cer 42:2, dhHexCer 36:0, dan HexCer 34:1, sebagai biomarker penting perlindungan cilastatin dalam medula. Dalam semua kes, lipid ini dikaitkan dengan sama ada pemulihan tahap kawalan yang disebabkan oleh cilastatin separa atau keseluruhan berbanding dengan tahap yang diubah oleh cisplatin. Untuk semua spesies, nilai AUC untuk lengkung ROC yang diperoleh adalah lebih tinggi daripada 0.85, membuktikan keupayaan diskriminasi yang baik mereka

PerbincanganDalam kerja ini, kami telah mengkuantifikasi sejumlah 108 spesies lipid yang terdiri daripada lipid struktur penting seperti fosfolipid, sphingolipid, dan kolesterol bersama-sama dengan bentuk tersterifikasinya, padabuah pinggangkorteks dan medula daripada tikus yang dirawat dengan cisplatin dan/atau cilastatin. Ini dilakukan untuk lebih memahami kesan nefrotoksik cisplatin dan kesan perlindungan cilastatin. Sehingga 63 spesies lipid didapati telah diubah dengan ketara dalam medula oleh rawatan cisplatin, manakala 56 spesies lipid telah terjejas dalam korteks, mencerminkankerosakan buah pinggangdi kedua-dua wilayah. Walaupun, secara tradisinya, kebanyakan kajian AKI yang disebabkan oleh cisplatin memberi tumpuan kepada sel tubul proksimal danbuah pinggangkerosakan korteks, di mana pengumpulan dadah terutamanya tertumpu, kajian baru-baru ini menunjukkan fakta bahawa kecederaan di medulla mungkin sama teruk seperti di korteks, berdasarkan ujian apoptosis TUNEL [5]. Ini mungkin berkaitan dengan pengumpulan cisplatin dalam segmen S3 tubulus proksimal [3,5], menurun ke arah medula luar, selain daripada potensi kerosakan langsung dan sekunder gelung Henle [4]. Di samping itu, medula telah ditunjukkan sebagai yang paling sensitifbuah pinggangkawasan untuk melihat perubahan metabolit global yang berkaitan dengan cisplatin berbanding dengan korteks [5]. Keputusan kami sebelum ini juga menunjukkan kerosakan langsung sel medulla (selain daripada kerosakan sekunder) oleh cisplatin, dicerminkan dalam pelbagai perubahan fosfolipid dan kardiolipin [4]. Keputusan baharu ini memperluaskan pemerhatian tersebut dengan spesies dan kelas lipid tambahan yang diubah oleh cisplatin dan mengukuhkan kaitan kerosakan medula dalam AKI yang disebabkan oleh cisplatin.

Walaupun FC masukbuah pinggangtidak diubah dengan ketara oleh rawatan cisplatin, kedua-dua jumlah CE dan semua spesies CE individu yang diukur telah meningkat dengan ketara dalam kedua-dua korteks (peningkatan lapan kali ganda untuk jumlah CE) dan medula (peningkatan empat kali ganda untuk jumlah CE) bersamaan dengan yang disebabkan oleh cisplatin.kerosakan buah pinggang.Kolesterol adalah komponen utama membran plasma, saling bersinggungan antara fosfolipid dan mempengaruhi kecairan, cas permukaan, dan interaksi kumpulan kepala kutub [35,36]. Kehadirannya juga penting dalam rakit lipid, mewujudkan interaksi hidrofobik dengan SM, dan menjadi penting untuk pengasingan molekul dan mengawal interaksinya dengan komponen lain dalam membran [37]. Sel mengekalkan keseimbangan kolesterol antara sintesis de novo dalam retikulum endoplasma (ER) dan pengambilan pengantara LDL. Kebanyakan kolesterol terletak di dalam membran plasma, tetapi juga boleh berkitar kembali ke ER di mana FC boleh ditukar (melalui pengesterifikasian pengantara ACAT) kepada CE, yang dianggap sebagai bentuk simpanan sitosol kolesterol [36]. CE juga boleh dihidrolisiskan kembali kepada FC, membentuk kitaran ester kolesterol [36]. Fakta bahawa FC tidak berubah semasa rawatan cisplatin, tetapi CE meningkat dalam kedua-dua korteks dan medula, mencadangkan perubahanbuah pinggangmetabolisme kolesterol yang dikaitkan dengan AKI yang disebabkan oleh cisplatin. Kajian terdahulu menunjukkan pemerhatian yang agak serupa dalam kedua-dua HK-2 sel tubul proksimal manusia dan dalam korteks buah pinggang daripada tikus, semasa iskemia akutkecederaan buah pinggang, dengan FC tidak berubah dan tahap CE meningkat [36]. Dalam kes itu, kecederaan membran plasma, yang mencetuskan peningkatan pemerdagangan FC dari membran ke ER, nampaknya merupakan penjelasan yang paling munasabah, mengakibatkan penjanaan CE yang semakin meningkat. Dalam hal ini, kerosakan pada rakit lipid yang kaya dengan kolesterol dan bukannya membran plasma kelihatan lebih berkesan dalam peningkatan pemerdagangan kolesterol ke ER [36]. Peranan cytoprotektif CE juga telah tersirat dalam kajian terdahulu tersebut. Peningkatan tahap CE juga dilaporkan dalam tikusbuah pinggangkorteks semasa nefropati diabetik peringkat awal [29]. Hasilnya juga selaras dengan peningkatan global dalam lipid neutral dalambuah pinggangtubul proksimal dilaporkan semasa rawatan cisplatin [32]. Keputusan kami menunjukkan untuk pertama kalinya peningkatan global dalam jumlah CE sebagai tambahan kepada spesies CE individu, kedua-duanya dalambuah pinggangkorteks dan medula, semasa AKI yang disebabkan oleh cisplatin. Cilastatin sendiri, sebaliknya, nampaknya meningkat sedikit CE 18:0 dan CE 22:6 sahaja dalam korteks, walaupun jumlah tahap FC atau CE tidak diubah. Kesan sedikit ini mungkin disebabkan oleh fakta bahawa sasarannya, DHP-I, terletak dalam rakit lipid dalam tubul proksimal (terutamanya dalam korteks), dan beberapa gangguan kecil pada membran mungkin tersirat semasa interaksinya. Pemberian bersama cisplatin dan cilastatin, sebaliknya, membawa kepada pengurangan dalam semua spesies CE yang meningkat cisplatin dalam korteks, manakala dalam medula, hampir tiada kesan pemulihan diperhatikan, dengan hanya pemulihan separa CE18:2 . Ini menunjukkan tindakan spesifik cilastatin dalam sel tubul proksimal, memberikan perlindungan yang signifikan terhadap pengembangan kematian sel yang berkaitan dengan kerosakan langsung cisplatin pada membran plasma dan rakit lipid dalam korteks, manakala kerosakan sel yang berkaitan dengan ketidakseimbangan kolesterol dalam keseluruhan medula nampaknya. untuk kekal sebahagian besarnya tidak dilindungi.

Sphingolipid adalah lipid aktif terutamanya ditemui dalam membran sel dan cukup kaya dengan rakit lipid [37]. Ceramides ialah metabolit pusat metabolisme sphingolipid, yang melibatkan pelbagai molekul dan enzim dengan peranan penting dalam proses selular, termasuk pertumbuhan sel, apoptosis, pembezaan, rintangan dadah, dan penuaan [38,39]. Selain itu, sphingolipid mengambil bahagian dalam laluan yang berkaitan dengan kematian sel kanser cisplatin dan AKI [33]. Ceramides boleh dihasilkan oleh beberapa laluan, termasuk sintesis de novo, hidrolisis sphingomyelin, atau kitar semula sphingolipid kompleks [38]. Sintesis de novo ialah laluan utama, dan berlaku di ER, daripada palmitoyl-CoA dan serine, melalui satu siri laluan enzimatik untuk menghasilkan sphinganine, yang membawa kepada dihydroceramides melalui dihydroceramide synthase (CerS). Akhirnya, nyahturasi dhCer menjana Cer [40]. SM juga boleh dihidrolisiskan oleh sphingomyelinases, menghasilkan Cer. Cer boleh diubah menjadi sphingolipid yang lebih kompleks dalam radas Golgi: terfosforilasi untuk menghasilkan Cer-1-P, molekul isyarat; ditukar kepada SM oleh tindakan SM synthase; atau glikosilasi untuk menghasilkan hesoxylceramides (glucosyl- or galactosyl-ceramides), prekursor sulfatida [38]. Cer juga boleh direndahkan kepada sphingosine, prekursor sphingosine{11}}fosfat (S1P), dengan peranan penting dalam kemandirian dan percambahan sel, keradangan dan rintangan dadah [39]. Akhirnya, degradasi S1P kepada etanolamin dan heksadesenal adalah laluan keluar laluan ini [38].

Semasa pengiraan spesies sphingolipid, peningkatan global dalam jumlah tahap Cer, dhCer, HexCer, dan dhHexCer telah diperhatikan semasa rawatan cisplatin, yang sangat relevan untuk Cer. Perbezaan berkenaan dengan kawalanbuah pingganglebih jelas apabila subspesies individu dikira, dengan 19 daripada 22 spesies meningkat sama ada dalam korteks (11 spesies) dan/atau medula (18 spesies) dengan rawatan cisplatin. Ini adalah bersetuju dengan pemerhatian sebelumnya yang menunjukkan peningkatan dalam Cer dan HexCer dalam tetikusbuah pinggangkorteks yang dikaitkan dengan rawatan cisplatin [33], tetapi di sini, kami telah mendapati bahawa medula juga dipengaruhi oleh kesan ini.

Pemerhatian ini boleh mencerminkan peningkatan pengeluaran metabolik Cer/dhCer dan HexCer/dhHexCer. Di satu pihak, ini boleh berlaku melalui peningkatan aktiviti CerS, berdasarkan pemerhatian sebelumnya dalambuah pinggangkorteks, di mana aktiviti CerS rantaian panjang diukur semasa rawatan cisplatin dan perencatan CerS membawa kepada pengurangan dalam pengumpulan Cer / HexCer yang diperhatikan [33]. Selain itu, pengurangan yang disebabkan oleh cisplatin dalam tahap SM / dhSM yang terdapat dalam korteks dan medulla mencadangkan peningkatan pengeluaran tambahan Cer / dhCer oleh hidrolisis SM / dhSM melalui laluan sphingomyelinase (SMase) [38], dengan kesan khas pada rantai panjang Cer/dhCer, semuanya memudaratkan dalam model AKI [40]. Ini juga akan bersetuju dengan fakta bahawa spesies Cer rantai panjang nampaknya relevan semasa AKI [40] dan dengan pemerhatian sebelumnya terhadap peningkatan aktiviti SMase dalambuah pinggangkorteks semasa rawatan cisplatin [33]. Cer terlibat dalam apoptosis yang disebabkan oleh cisplatin melalui isyarat dalam kedua-dua laluan intrinsik dan ekstrinsik [39]. Dalam laluan mitokondria intrinsik, cisplatin menyebabkan permeabilisasi membran luar mitokondria. Peningkatan dalam Cer, bersama-sama dengan metabolit hilirannya, boleh menyumbang kepada permeabilisasi ini, dan pembentukan saluran oleh Cer memudahkan apoptosis dalam membran mitokondria, membenarkan kemasukan Bax ke dalam bran mem luar mitokondria, serta pengaliran keluar sitokrom C [39]. Tambahan pula, apoptosis ekstrinsik yang dimediasi Fas menggunakan reseptor Fas yang terletak di rakit lipid, dengan pengelompokannya dimediasi oleh pengaktifan SMase yang disebabkan oleh cisplatin dan ketinggian Cer [39]. Oleh itu, Cer menentukan apoptosis dalam AKI yang disebabkan oleh cisplatin, manakala perataannya melalui transformasi mereka kepada HexCer nampaknya melindungi [33] dan dikaitkan dengan rintangan kepada cisplatin [39]. Cer yang dihasilkan dalam jumlah yang besar juga boleh menjejaskan sifat fizikal membran dan boleh menggantikan kolesterol dan memacu pengesterannya [35]. Sebaliknya, SM terutamanya terdapat dalam membran plasma dan mempunyai kaitan langsung dengan molekul kolesterol, terutamanya penting dalam rakit lipid [41]. Kekurangan penjanaan semula SM boleh menjadi negatif untuk fungsi membran yang betul [41].

Sulfa banyak terdapat dibuah pinggang,terutamanya dalam membran apikal tubulus distal [42]. Walaupun mereka tidak penting untuk normalfungsi buah pinggang, kekurangan Sulf telah didapati dikompensasikan oleh peningkatan penjanaan glikolipid sulfat dan choles terol [42]. Sulfatida ialah ligan L-selectin utama dalambuah pinggang,dengan peranan penting dalam penyusupan monosit ke dalambuah pingganginterstitium [42]. Sebaliknya, protein mielin dan limfosit yang berkaitan dengan rakit lipid (MAL) membentuk kompleks dengan sulfatida dan glikosfingolipid dalambuah pinggangmembran, menyumbang kepada penstabilan dan pengasingan mikrodomain yang diperkaya glikosfingolipid [42]. Keputusan kami mengenai perubahan Sulfa dalam korteks dan medulla mengesahkan kajian terdahulu di mana spesies sulfatida yang pelbagai juga dianggap diubah oleh cisplatin dalam buah pinggang [34].

Semua spesies Cer, dhCer, HexCer dan dhHexCer yang diubah dalam korteks oleh cisplatin sebahagian atau keseluruhannya dipulihkan dengan pentadbiran bersama cilastatin, manakala dalam medula, sejumlah besar spesies Cer tidak dipulihkan, dengan pemulihan hampir lengkap dhCer , HexCer dan dhHexCer. Memandangkan penglibatan spesies Cer dalam apoptosis ekstrinsik yang dimediasi Fas dan penyumbatannya oleh cilastatin yang mengikat DHP-I dalam rakit lipid di tubul proksimal, ini dapat menjelaskan kesan perlindungan dan pemulihan Cer berlaku terutamanya dalam sel korteks. Bagi SM, dhSM, dan Sulf, pemulihan cilastatin nampaknya lebih relevan di medula daripada di korteks, menunjukkan bahawa kerosakan sekunder terjejas oleh tindakan cilastatin dalam tubul proksimal yang mencapai medula luar, di mana kebanyakankerosakan buah pinggangtertumpu [4].

Fosfolipid adalah spesies yang paling banyak dalam membran sel, di mana PC dan, pada tahap yang lebih rendah, PE mendominasi, dengan kehadiran PC yang lebih tinggi di bahagian luminal dan PE lebih banyak dalam risalah sitosol [35,43]. Lysophospholipids adalah, sebaliknya, spesies isyarat yang boleh dihasilkan daripada hidrolisis gliserofosfolipid termasuk LPC [35]. Kebanyakan daripada 60 spesies PC, PE, dan LPC yang diukur didapati telah diubah oleh rawatan cisplatin, sama ada dalam korteks atau medula, dengan PC dan LPC menunjukkan jumlah perubahan yang lebih tinggi dalam korteks, manakala perubahan berkaitan PE adalah lebih banyak. dan menonjol di medula. Perubahan daripadabuah pinggangSpesies PC, PE atau LPC sebagai hasil daripada rawatan cisplatin adalah menurut pemerhatian yang dilaporkan sebelum ini dalambuah pinggangsemasa AKI [4,5,26,34,44]. Keputusan kami menunjukkan bahawa kebanyakan spesies PE, PC, dan LPC yang diubah telah dikurangkan oleh cisplatin dalam kedua-dua korteks dan medulla. Berkenaan dengan kesan nefroprotektif cilastatin, secara ketara, tahap kesan pemulihan separa atau keseluruhan yang lebih tinggi diperhatikan dalam medula untuk lipid yang diubah cisplatin daripada di korteks. Satu lagi fakta menarik ialah semua spesies PC, PE, dan LPC yang meningkat cisplatin dalam korteks dan medulla telah dipulihkan oleh cilastatin, manakala kebanyakan spesies berkurangan cisplatin dalam korteks masih diubah semasa rawatan bersama dengan cilastatin. Ini mungkin menunjukkan tahap kerosakan langsung yang lebih tinggi yang disebabkan oleh pengumpulan cisplatin dalam korteks, kekal tidak dilindungi oleh cilastatin, dan membawa kepada kematian sel dan PC yang berkaitan, PE (komponen utama membran sel), dan pelepasan LPC dalam badan apoptosis dan, oleh itu, pengurangan tahap mereka. Sebaliknya, kerosakan sekunder yang berkaitan dengan apoptosis ekstrinsik dan pengumpulan tuangan protein yang berbangkit dalam tubul proksimal boleh dilindungi oleh cilastatin. Ini akan membayangkan bahawa spesies PC, PE, dan LPC berkurangan dalam medulla dan lebih berkaitan dengan kerosakan sel sekunder yang didorong oleh cisplatin. Sebaliknya, peningkatan spesies PC, PE dan LPC mungkin dikaitkan dengan sama ada penjanaan semula membran sel atau proses isyarat, yang, menurut keputusan ini, mungkin lebih berkaitan dengan kerosakan yang disebabkan oleh cisplatin apoptosis ekstrinsik sekunder yang dilindungi oleh cilastatin.

Di samping itu, penurunan yang disebabkan oleh cisplatin dalam peratusan spesies PC dan PE dengan rantaian lemak sangat tak tepu juga diperhatikan, yang boleh dikaitkan dengan proses peroksidasi lipid, dan akan dikurangkan oleh cilastatin [4,10,11].

Secara global, dalam spesies lipid yang dikira di sini, kesan pemulihan cilastatin diperhatikan dalam 26 daripada 56 lipid yang diubah cisplatin dalam korteks, dan dalam 50 daripada 63 lipid yang diubah cisplatin dalam medulla. Mungkin, ini mencerminkan tahap perubahan lipid yang tinggi yang berkaitan dengan kerosakan mitokondria langsung tanpa perlindungan yang dilakukan oleh cisplatin terutamanya dalam korteks berbanding dengan medula, dengan lebih banyak perubahan lipid yang dikaitkan dengan perlindungan kerosakan sekunder yang dikesan dalam keseluruhan medula. Selain itu, analisis multivariate membenarkan pengenalpastian biomarker lipid baharu yang berpotensi untuk kedua-dua AKI dan cilastatin yang disebabkan oleh cisplatin.nefroprotection, termasuk spesies CE, Sulf, PE, PC, Cer atau HexCer, seperti yang diterangkan dalam Bahagian 2.5 dan 2.6. Daripada penemuan kami, CE 18:2 dan PE 36:5 adalah biomarker calon yang mungkin dapat membezakan kerosakan cisplatin dan cilastatin pada masa yang samanefroprotectiondalam kedua-dua korteks dan medula. Walau bagaimanapun, kerana pemulihan kedua-dua spesies dengan cilastatin ini adalah separa, spesies yang lebih sesuai sebagai biomarker ialah dhHexCer 34:0 dalam korteks dan Sulf 42:0 dalam medula, dapat membezakan kedua-duanya.kerosakan buah pinggangdan perlindungan, dengan cilastatin memulihkan sepenuhnya tahap cisplatin yang diubah kepada kumpulan kawalan. Ini boleh diekstrapolasi kepada mana-mana kecederaan buah pinggang pengantara ligan Fas/Fas, tetapi harus disahkan dalam kajian akan datang. Beberapa biomarker baru AKI telah dicadangkan dalam beberapa tahun kebelakangan ini, terutamanya protein (cth, KIM-1 [45] atau NGAL [46]). Hakikat bahawa kami telah menemui biomarker baru yang berpotensi untuk AKI yang disebabkan oleh cisplatin dan perlindungan cilastatin yang berkaitan, sifat lipid dalambuah pinggangtisu, mengembangkan pengetahuan sedia ada dan menyediakan pilihan pelengkap untuk diagnosis, prognosis dan susulan yang lebih baik. Malah, gabungan pengesanan biomarker mungkin berpotensi digunakan sebagai petunjuk AKI tertentu yang disebabkan sama ada oleh nefrotoksik tertentu (seperti cisplatin) atau punca lain, malah membezakan keadaan/perkembangan penyakit. Satu lagi langkah selanjutnya ialah menentukan sama ada keputusan kami pada diubahbuah pinggangcorak lipid juga dicerminkan dalam lipid beredar dalam darah atau dalam air kencing. Ini akan menjadikan pengesanan biomarker untuk AKI dan cilastatin yang disebabkan oleh cisplatinnefroprotectionlebih boleh dilaksanakan pada pesakit.

Perubahan berkaitan AKI yang disebabkan oleh cisplatin dalam tahap lipid adalah banyak dan pelbagai, yang terdiri daripada lipid struktur penting pada tahapbuah pinggangstruktur: korteks dan medula. Pengecilan banyak perubahan ini oleh cilastatin menunjukkan potensi besarnya untuk bertambah baikfungsi buah pinggangdan mengurangkan perubahan struktur berkaitan lipid, dalam korelasi dengan normalbuah pinggangmorfologi. Sekali lagi, cilastatin telah terbukti berguna untuk membezakan kerosakan sel langsung tanpa perlindungan yang disebabkan oleh cisplatin dan perubahan sekunder yang berkaitan dengan kerosakan primer, yang boleh terjejas dalam tubul proksimal oleh penyumbatan cilastatin pada laluan apoptosis yang dimediasi Fas.

Bahan dan Kaedah

ReagenCilastatin (disediakan dengan baik oleh Merck Sharp dan Dohme SA, Madrid, Sepanyol) dan cisplatin (Pharmacia Nostrum (Madrid, Sepanyol) telah digunakan. {{0}}}.9 peratus larutan NaCl (Braun Medical SA, Barcelona, Sepanyol) telah digunakan untuk penyediaan penyelesaian ubat untuk pentadbiran. N-dodecanoyl-D-erythro-sphingosylphosphorylcholine [SM 30:1 (d18:1/12:0)], D-glucosyl- ß-1,10-N-dodecanoyl-D-erythro-sfingosine [HexCer 30:1 (d18:1/12:0)], N-dodecanoyl D -erythro sphinganylphosphorylcholine [dhSM 3{{50}}:0 (d18:0/12:0)], 1,2-dimyristoleoyl-sn glycero-3- phosphocholine [PC 28:2 (14:1/14:1)], 1-heptadecanoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3- phosphocholine [LPC (17:0)] dan 1, 2- dipalmitoleoil-sn-glycero-3-phosphoethanolamine [PE 32:2 (16:1/16:1)] telah dibeli daripada Avanti Polar Lipid (Alabaster, Alabama, USA). Deuterated N-tetracosanoyl- D-erythro-sfingosine [Cer 42:1-d7 (d18:1/24:0)], N-stearoyl D-erythro-dihydrosphingosine [dhCer (36:0-d3)] , dan C16-30-sulfogalactosylceramide [Sulf 34:1(d18:1/16:0)] telah diperoleh daripada Matreya LLC (State College, PA, USA). Cholesterol-d7 (FC-d7) dan cholesteryl-d7 palmitate [CE (16:0-}d7)] adalah daripada Sigma-Aldrich.

Pelarut dan reagen gred HPLC atau LC-MS digunakan secara eksklusif, termasuk metanol (MeOH), asetonitril (ACN), dan isopropanol (iPrOH) (VWR International Eurolab, Barcelona, ​​Sepanyol), serta kloroform, diklorometana dan ammonium untuk pasangan (NH4COOH) (Sigma-Aldrich, Merck Life Science SL, Madrid, Sepanyol). Air ultratulen diperoleh daripada sistem penulenan Milli-Q (Millipore, Merck Life Science SL, Madrid, Sepanyol).

Model HaiwanTikus wistar jantan dewasa (WKY, Criffa, Barcelona, ​​Sepanyol) dibiakkan di Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón (IiSGM, Madrid, Sepanyol). Ini disimpan di bawah keadaan suhu, cahaya dan kelembapan terkawal dengan akses percuma kepada makanan dan air. Rawatan diberikan secara intraperitoneal seperti yang diterangkan sebelum ini [4,11] kepada empat kumpulan tikus (n=6 haiwan setiap kumpulan): Kumpulan 1: Kawalan (CNT)—0.9 peratus NaCl disuntik ke tikus dengan cara yang sama seperti rawatan untuk kumpulan 3 dan 4; Kumpulan 2: Cilastatin (CIL)- disuntik (150 mg kg 1 berat badan (bw) sehari); Kumpulan 3: Cisplatin (CISPL)-disuntik (dos unik 5 mg kg 1 bw pada hari 0); dan Kumpulan 4: Cisplatin plus cilastatin (CISCIL)- disuntik 5 mg kg 1 bw pada hari 0 dan cilastatin-disuntik (150 mg kg 1 bw sehari). Haiwan dikorbankan lima hari selepas rawatan dimulakan. Sebelum ini, 24 jam air kencing dikumpulkan dalam sangkar metabolik dari setiap tikus. Serum darah juga diasingkan dengan sentrifugasi. Buah pinggang dikeluarkan selepas perfusi dengan larutan garam 0.9 peratus pada 4 ◦C, diikuti dengan penyahkapsulan. Korteks dan medula sebelah kiribuah pinggangdan separuh keratan melintang sebelah kananbuah pinggangtelah dipotong, dibekukan dalam cecair N2, dan disimpan secara fifina pada t 80 ◦C. Separuh lagi sebelah kananbuah pinggangtelah difiksasi dalam 4 peratus paraformaldehid dan paraffifin-tertanam untuk kajian histologi.

Kajian HistologiPewarnaan hematoxilin/eosin (Sigma-Aldrich, Steinhem, Jerman) dilakukan pada tikus sagittal 5 µmbuah pinggangbahagian. Mikroskop IX70 terbalik (Olympus, Hamburg, Jerman) digunakan untuk mengambil mikrofotograf pada pembesaran 20× dan 60×, untuk pemeriksaan histologi.

Penunjuk Fungsi RenalAutoAnalyzer Cobas 711 (Roche, Basel, Switzerland) telah digunakan untuk penentuan BUN, kreatinin, natrium dan kalium dalam sampel serum. Kadar pelepasan kreatinin digunakan untuk pengiraan GFR. Jumlah protein ditentukan dalam air kencing menggunakan kaedah asid sulfosalicylic [47].

Penghomogenan Tisu  buah pinggangtisu korteks dan medula (kira-kira 50 mg setiap satu) telah ditambah kepada 1.5 mL tiub plastik penutup skru yang mengandungi 800 µL larutan penimbal lisis: 50 mM Tris–HCl pH 7.5, 125 mM NaCl, 5 mM NaF, 1.4 mM Na4O7P3, 1.4 mM Na4O7P2, 1 mM dan perencat protease (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA), dan manik zirkonium 1.5 mm. Tisu telah diasingkan pada BeadBug-6 Homogenizer (Benchmark D1036-E, Bechmark Scientific, Sayreville, NY, USA) pada 4500 rpm, dalam tiga kitaran 90 s. Homogenat telah disonikkan lagi selama 40 s pada 10 peratus amplitud dan disentrifugasi pada 600 × g selama 1 minit pada 4 ◦C. Satu alikuot supernatan terhasil telah dicairkan 1:10 untuk jumlah penentuan protein oleh ujian protein asid bicinchoninic (BCA) (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, USA). Selebihnya ekstrak protein disimpan pada t 80 ◦C sehingga analisis lipidomik.

Analisis Lipidomik oleh LC-MS/MSLipid telah diekstrak daripada tisu (bersamaan dengan 25{15}} µg jumlah protein) mengikut kaedah Folch [48]. Sepuluh mikroliter campuran standard dalaman (IS) telah ditambah sebelum pengekstrakan lipid untuk mendapatkan kuantifikasi molar relatif spesies lipid, seperti yang diterangkan sebelum ini [49]. Campuran IS terdiri daripada yang berikut: CE (16:0-d7), FC-d7, Cer (42:{{10}} d7), HexCer (30 :1), LPC (17:0), PC (28:2), PE (32:2), SM (30:1), dhSM (30:0), dhCer (35:0), dan Sulf (34 :1), dalam kepekatan yang diberikan dalam Jadual S4. Ekstrak lipid telah dikeringkan di bawah aliran nitrogen dan disusun semula dalam 250 µL asetonitril/isopropanol (1:1, vol:vol), disonikasi selama 10 minit, dan kemudian dipindahkan ke botol suntikan.

Lima mikroliter ekstrak lipid telah disuntik pada sistem LC Exigent UltraLC{{0}} (AB-Sciex LLP, Framingham, MA, USA). Spesies telah dipisahkan pada lajur Kinetex C18 (100 × 2.1 mm, 1.7 µm; Phenomenex, Macclesfifield, UK) yang beroperasi pada 55 ◦C. Elusi digunakan menggunakan campuran binari pelarut A (60 peratus asetonitril dalam air, 10 mM NH4COOH) dan pelarut B (90 peratus isopropil alkohol dalam asetonitril, 10 mM NH4COOH) dan kecerunan linear daripada 60 peratus A hingga 100 peratus B dalam 12 min dan 100 peratus B hingga 60 peratus A dalam 8 min, pada kadar alir 0.4 mL min悆 1 . Instrumen QTrap 4000 (AB-Sciex LLP, Framingham, MA, USA) telah digunakan untuk pengesanan lipid, dengan perisian Analyst 1.6.2. Nitrogen digunakan sebagai gas pengering (T: 500 ◦C, tekanan: 30 psi) dan sebagai gas nebulisasi (50 psi). Pengesanan telah ditetapkan dalam mod positif elektrospray (ESI) untuk semua kelas lipid dengan pengecualian Sulf, yang dianalisis dalam mod negatif ESI. CE dan FC dianalisis menggunakan sumber pengionan kimia tekanan atmosfera (APCI) dalam mod ion positif. Pendekatan yang disasarkan digunakan untuk pengesanan lipid menetapkan peralihan pemantauan tindak balas berganda (MRM) untuk setiap spesies lipid pada masa pengekalan mereka (Jadual S5). Kromatogram puncak LC-MS/MS telah diproses menggunakan perisian Skyline versi 4.1 (MacCoss Lab, Seattle, WA, USA) [50]. Spesies lipid dikira dengan perbandingan langsung kawasan untuk setiap spesies dengan luas IS untuk kelas lipid mereka, seperti yang diterangkan sebelum ini [49]. Hasilnya dinyatakan sebagai nmol / mg protein. Jumlah tahap kelas lipid ditentukan sebagai jumlah spesies kelas lipid individu yang dikira. Spesies lipid telah ditetapkan mengikut notasi yang disyorkan [51].

Analisis statistikNilai dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai. SPSS 11.5 (SPSS, Chicago, IL, USA) digunakan untuk statistik deskriptif dan menilai perbezaan statistik dalam pembolehubah antara kumpulan dengan analisis varians. Untuk perbandingan dua kumpulan tidak berpasangan bagi pembolehubah lipid, sama ada ujian parametrik (t Student tidak berpasangan dua ekor) atau bukan parametrik (Mann– Whitney) telah dilakukan selepas ujian normaliti (Shapiro-Wilk). Kaedah Benjamini-Hochberg digunakan untuk pembetulan kadar penemuan palsu (FDR) bagi nilai-p apabila membandingkan pelbagai spesies individu lipid. Nilai p dua belah < 0.05="" dan="" fdr="">< 0.1="" telah="" dipertimbangkan="" untuk="" mengenal="" pasti="" perbezaan="" ketara="" secara="" statistik="" untuk="" mengelakkan="" calon="" penanda="" bio="" yang="" berpotensi="" hilang.="" perubahan="" lipatan="" kumpulan="" x="" berbanding="" kumpulan="" y="" dikira="" sebagai="" nisbah="" nilai="" min="" bagi="" pembolehubah="" kumpulan="" masing-masing="">

Analisis data berbilang variasi (MVDA) dilakukan menggunakan SIMCA versi 14.1 (MKS Umetrics, Uppsala, Sweden) dan MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca (diakses pada 30 2 September {{20}}21)) [52], termasuk PCA tanpa pengawasan dan OPLSDA yang diselia. Nilai yang hilang telah digantikan menggunakan kaedah k-nerest neighbors. Pembolehubah telah diubah log dan berskala pareto sebelum MVDA. Model dinilai mengikut nilai R2 dan Q2 mereka. OPLS-DA telah disahkan oleh ujian pilih atur (100 kitaran). Skor VIP dan S-plot daripada model OPLS-DA digunakan untuk mengenal pasti pembolehubah yang berkaitan dalam CISPL lawan CNT, CISCIL lawan CNT dan CISCIL lawan CISPL diskriminasi kumpulan. Pematuhan serentak dengan VIP > 1, pemuatan diskalakan sebagai pekali korelasi |p(corr)| > 0.5, dan dua sisi p-value < 0.05="" dan="" fdr="">< 0.1="" untuk="" perbandingan="" dua="" kumpulan="" adalah="" kriteria="" yang="" digunakan="" untuk="" pemilihan="" biomarker="" yang="" berpotensi.="" nilai="" auc="" diperoleh="" daripada="" plot="" lengkung="">

PatenPaten berikut sebahagiannya berkaitan dengan kerja yang dibentangkan dalam manuskrip ini: "Penggunaan cilastatin untuk mengurangkan nefrotoksisiti pelbagai sebatian" (nombor paten EP2,143,429 B1; US ​​9,216,185 B2; US 9,522,128 B2; dan US9,757,349 B2). Ini diberikan kepada Fundación para la Investigación Biomédica Hospital Gregorio Marañón (FIBHGM) dan dilesenkan oleh FIBHGM kepada Telara Pharma SL Telara Pharma SL kini telah memeterai perjanjian pelesenan dengan Arch Biopartners.