Mengapa Retinoic Acid Receptor Responder1 boleh Menggalakkan Perkembangan Penyakit Glomerular?

Responder Reseptor Asid Retinoik1 Menggalakkan Perkembangan Penyakit Glomerular Melalui Laluan Isyarat Faktor Nuklear-kB

Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Katja Mo¨ller-Hackbarth1,2 , Dina Dabaghie1,2 , Emmanuelle Charrin1,2 , Sonia Zambrano1,2, Guillem Genove´ 1,3 , Xidan Li1,3 , Annika Wernerson4 , Mark Lal5 dan Jaakko Patrakka1,2

1 Pusat Metabolik Kardio Bersepadu KI/AZ, Institut Karolinska di Hospital Universiti Karolinska, Huddinge, Stockholm, Sweden; 2 Jabatan Perubatan Makmal, Bahagian Patologi, Institut Karolinska di Hospital Universiti Karolinska, Huddinge, Stockholm, Sweden; 3 Jabatan Perubatan Huddinge, Institut Karolinska di Hospital Universiti Karolinska, Huddinge, Stockholm, Sweden; 4 Jabatan Sains Klinikal, Intervensi dan Teknologi, Bahagian Perubatan Renal, Institut Karolinska, Stockholm, Sweden; dan 5 Biosains Renal, Penyelidikan dan Perkembangan Awal Kardiovaskular, Renal dan Metabolisme (CVRM), R&D Biopharmaceuticals, AstraZeneca, Gothenburg, Sweden

Buah Pinggang Antarabangsa (2021) 100, 809–823; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2021.05.036

Hak Cipta ª 2021, Persatuan Nefrologi Antarabangsa. Diterbitkan oleh Elsevier Inc. Ini ialah artikel akses terbuka di bawah lesen CC BY

Surat-menyurat: Jaakko Patrakka, Jabatan Perubatan Makmal, Bahagian Patologi, Institut Karolinska, Blickagången 6, SE-141 57 Huddinge, Sweden. E-mel: jaakko.patrakka@ki.se Diterima 27 Julai 2020; disemak pada 11 Mei 2021; diterima pada 20 Mei 2021; diterbitkan dalam talian 18 Jun 2021

KATA KUNCI: glomerularsel endothelial; NF-kB; podosit; Rarres1

Laluan radang diaktifkan dalam kebanyakanpenyakit glomerulartetapi mekanisme molekul yang mendorongnya dalam tisu buah pinggang kurang diketahui. Kami mengenal pastiasid retinoikresponder reseptor 1 (Rarres1) sebagai protein yang sangat kaya dengan podocyte dalam buah pinggang yang sihat. Kajian dalam haiwan kalah mati khusus podocyte menunjukkan bahawa Rarres1 tidak diperlukan untuk perkembangan normal atau penyelenggaraan halangan penapisan glomerulus dan tidak memodulasi hasil penyakit buah pinggang dalam model glomerulonephritis. Menariknya, kami mengesan induksi ekspresi Rarres1 dalam sel endothelial kapilari glomerular dan peritubular dalam IgA dan penyakit buah pinggang diabetes, serta dalam vaskulitis yang berkaitan dengan ANCA. Analisis set data RNA yang tersedia secara terbuka menunjukkan bahawa induksi ekspresi Rarres1 adalah mekanisme molekul biasa dalam penyakit buah pinggang kronik. Garisan tetikus ketuk bersyarat, mengekspresikan Rarres1 secara berlebihan secara khusus dalam sel endothelial, tidak menunjukkan sebarang fenotip buah pinggang yang jelas. Walau bagaimanapun, ekspresi berlebihan menggalakkan perkembangan kerosakan buah pinggang dalam model glomerulonephritis. Selaras dengan ini, tikus kalah mati bersyarat, kekurangan Rarres1 dalam sel endothelial, sebahagiannya dilindungi dalam model penyakit. Secara mekanikal, Rarres1 menggalakkan keradangan dan fifibrosis melalui faktor transkripsi Laluan isyarat Faktor Nuklear-kB dengan mengaktifkan reseptor tyrosine kinase Axl. Oleh itu, induksi ekspresi Rarres1 dalam sel endothelial adalah mekanisme molekul yang lazim dalam glomerulopati manusia dan ini nampaknya mempunyai peranan patogen dalam memacu keradangan dan fifibrosis melalui laluan isyarat Nuklear Factor-kB.

Pernyataan Terjemahan

Kami mengenal pasti penyelarasanasid retinoikprotein responder reseptor 1 (Rarres1) dalam sel endothelial (EC) glomerulopati manusia biasa. Induksi nampaknya mempunyai peranan patogenik dalampenyakit glomerularkerana perkembangan glomerulonephritis telah (i) bertambah teruk dalam tetikus yang mengekspresikan Rarres1 secara berlebihan khususnya dalam EC, dan (ii) dipertingkatkan dalam garisan kalah mati Rarres1 khusus EC. Rarres1 boleh menjadi biomarker untuk mengesan kerosakan mikrovaskular dalam penyakit buah pinggang dan berpotensi menjadi sasaran terapeutik baru.

Penyakit glomerularproses adalah punca utama penyakit buah pinggang peringkat akhir. Nefropati diabetik (DN) adalah penyebab paling biasa penyakit buah pinggang peringkat akhir di seluruh dunia, manakala nefropati IgA (IgAN) ialah glomerulonefritis primer (GN) yang paling lazim.1,2 Secara histologi, kerosakan glomerular dalam gangguan biasa ini nyata dalam keadaan yang hampir sama. fesyen. Ini termasuk pengaktifan sel endothelial glomerular (GEC), pengembangan matriks ekstraselular, percambahan sel mesangial, kerosakan podosit, dan akhirnya kehilangan podosit.3

Kajian profil transkrip global dalam biopsi buah pinggang manusia telah menunjukkan tandatangan keradangan yang kuat dalam gangguan glomerular, 4-7 dan kajian tetikus telah menunjukkan bahawa pengaktifan faktor nuklear-kB (NF-kB) dan mengubah faktor pertumbuhan-b (TGF-b) laluan isyarat mempunyai peranan penting dalam perkembangan penyakit.8,9 Yang penting, penyasaran farmaseutikal laluan NF-kB mempunyai kesan renoprotektif dalam model haiwan, menunjukkan bahawa laluan itu adalah sasaran yang berpotensi untuk dirawat.penyakit glomerular.10,11 Dalam podosit, baru-baru ini kami mengenal pasti reseptor G bergandingan protein kelas C kumpulan 5 ahli B sebagai modulator tindak balas keradangan pengantara NF-kB.12 Walau bagaimanapun, pengaktifan laluan keradangan dalam glomerulopati mungkin didorong oleh pelbagai jenis sel . Malah, pengaktifan laluan isyarat NF-kB dikesan dalam GEC dalam banyak penyakit buah pinggang manusia.13,14 Mekanisme molekul yang terlibat dalam pengaktifan NF-kB dalam GEC kurang difahami.

Retinoic Acid Receptor Responder1 boleh Menggalakkan PerkembanganPenyakit Glomerular

Dalam kajian ini, kami menganalisis tandatangan molekul manusiapenyakit glomerulardan mengenal pasti induksi bagiasid retinoikungkapan responder 1 (Rarres1) reseptor dalam GEC sebagai tandatangan molekul biasa dalam DN, IgAN, dan anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody (ANCA) -vaskulitis yang berkaitan. Kajian dalam garis tetikus dengan pengaktifan / penyahaktifan ekspresi Rarres1 dalam sel endothelial (EC) menunjukkan bahawa induksi ini mempunyai peranan patogen dalam model tetikus GN. Secara mekanikal, Rarres1 mengaktifkan reseptor tyrosine kinase Axl, yang membawa kepada pengaktifan laluan isyarat NF-kB. Kami mencadangkan Rarres1 sebagai biomarker baharu kerosakan mikrovaskular yang mungkin menjadi sasaran terapeutik yang menarikpenyakit glomerularproses dengan memodulasi tindak balas keradangan.

Rajah 1|(Sambungan) (c) Analisis BackSPIN menunjukkan ekspresi Rarres1 secara khusus dalam podosit (PD) dalam data RNAseq tisu buah pinggang murine (data daripada Woroniecka et al.6). (d) Tahap mRNA relatif Rarres1 dalam Tub dan Glom terpencil daripada sampel manusia. Data dinyatakan sebagai perubahan lipatan ungkapan Rarres1 dalam Glom berbanding dengan Tab. *P < 0.05="" berbanding="" tab.="" (e)="" imej="" mikroskopik="" pendarfluor="" fl="" confocal="" perwakilan="" ekspresi="" rarres1="" (hijau)="" oleh="" podosit="" dalam="" glomeruli="" manusia="" daripada="" subjek="" normal.="" (f)="" imej="" mikroskopik="" confocal="" perwakilan="" yang="" menunjukkan="" ekspresi="" rarres1="" dalam="" podosit="" daripada="" subjek="" manusia;="" vimentin="" digunakan="" sebagai="" penanda="" untuk="" proses="" utama="" dan="" nefrin="" sebagai="" penanda="" untuk="" proses="" kaki="" podosit.="" cd31="" digunakan="" sebagai="" penanda="" untuk="" sel="" endothelial,="" dan="" ⍺-aktin="" otot="" licin="" (⍺sma)="" digunakan="" sebagai="" penanda="" sel="" mesangial.="" bar="50/10" mm.="" data="" dinyatakan="" sebagai="" min="" ±="" sem.="" ujian-t="" pelajar="" digunakan="" untuk="" perbandingan="" antara="" 2="" kumpulan.="" untuk="" mengoptimumkan="" paparan="" imej="" ini,="" sila="" lihat="" versi="" dalam="" talian="" artikel="" ini="" di="">

KAEDAH

Pengekstrakan RNA dan tindak balas rantai polimerase masa nyata

Glomeruli telah diasingkan seperti yang diterangkan sebelum ini.15 RNA diekstrak menggunakan reagen TRIzol (Invitrogen) dan RNeasy Kit (Qiagen Inc.). Kit Sintesis cDNA iScript digunakan untuk menjana cDNA. Tindak balas rantai polimerase kuantitatif dilakukan menggunakan Sistem Pengesanan PCR Masa Nyata Sentuh CFX96 dengan SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Primer yang digunakan disenaraikan dalam Jadual Tambahan S1. Tahap ungkapan relatif dikira menggunakan kaedah 2-DDCT.

Kultur sel

Human podocytes were cultured as described.16 JetPEI transfection reagent (Polyplus-transfection SA) was used for stable transfection of pRP[Exp]-CMV>hRARRES1[ORF011242]:T2A: Bsd – plasmid (VectorBuilder Inc. Klon telah berkembang di bawah pemilihan puromycin (Merck KGaA). Transfeksi RNA interfering pendek (siRNA) untuk Axl/Rarres1 dilakukan menggunakan siRNA daripada Origene. Sel telah ditransfeksi dengan 30 siRNA diikuti dengan pengkompleksan dengan reagen transfeksi JetPEI (Polyplus-transfection SA) dengan atau tanpa rangsangan TGF-b1 (10 ng/ml dalam medium kultur).Axl-inhibitor R428 (Selleck Chemicals) telah ditambah 1 jam sebelum rawatan (3 mmol/ l).

Mengapa Retinoic Acid Receptor Responder1 boleh Menggalakkan PembangunanPenyakit Glomerular?

penghapusan Barat

Sel-sel telah dilisiskan dengan penimbal lisis RIPA ditambah dengan koktel perencatan protease/fosfatase (Roche). Protein daripada pecahan nuklear telah diasingkan menggunakan Kit Ekstrak Nuklear (Motif Aktif Eropah). Lysates diasingkan pada 4 peratus –12 peratus Tris-glycine sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel (Invitrogen) dan dipindahkan ke membran polyvinylidene difluoride (Bio-Rad). Membran telah disekat dengan 5 peratus albumin serum lembu (Merck). Inkubasi dengan antibodi primer dilakukan semalaman (antibodi dalam Jadual Tambahan S2). Antibodi sekunder terkonjugasi peroksidase lobak dan Clarity Western ECL Substrat (Bio-Rad) digunakan untuk mengesan isyarat. Analisis Western blot dilakukan sekurang-kurangnya dua kali.

Hibridisasi RNA in situ

Analisis RNAscope dilakukan dalam buah pinggang manusia tertanam parafin mengikut protokol pengilang (ACD). Probe yang digunakan ialah NPHS1 - Cat No. 416071-C2, PECAM1 - Cat No. 487381-C3, dan RARRES1 - customized probe targeting nucleotides {{8 }}.

Penilaian kecederaan buah pinggang

Nisbah albumin dan kreatinin urin dinilai menggunakan Kit Albumin ELISA Mouse (Allbuwell M; Ethos Biosciences) dan Kit Ujian Kreatinin QuantiChrom (Sistem BioAssay). Tisu buah pinggang difiksasi dalam 10 peratus larutan formalin buffer neutral dan dibenamkan dalam parafin, diikuti dengan pemotongan dan pewarnaan asid-Schiff berkala. Mikroskopi elektron dilakukan dalam sampel tetap dalam 2.5 peratus glutaraldehid.

Imunostaining

Tisu tertanam parafin telah ditetapkan selama 24 jam dalam formalin. Bahagian lima mikrometer telah dinyahparafin dan dirawat dengan gelombang mikro sama ada dalam penimbal asid Tris-ethylenediamine tetraacetic (10 mM bes Tris, 1 mM larutan penimbal asid ethylenediaminetetraacetic, 0.05 peratus Tween 20, pH 9.0) atau penimbal natrium sitrat (10 mM natrium sitrat, 0.05 peratus Tween 20, pH 6.0), diikuti dengan permeabilisasi dengan 0.3 peratus Triton X-100 dan disekat dengan 10 peratus serum kambing biasa, 3 peratus hidrogen peroksidase, dan Kit Penyekat Vektor (Makmal Vektor). Slaid telah dibangunkan menggunakan kit substrat DAB peroxidase (horseradish peroxidase), 3,30 -diaminobenzidine (Vector Laboratories).

Untuk bahagian beku, bahagian tetap aseton telah telap dengan 0.1 peratus Antara 20 dan disekat dengan 10 peratus serum kambing biasa. Antibodi utama yang digunakan disenaraikan dalam Jadual Tambahan S1. Antibodi sekunder Alexa-Fluor untuk imunofluoresensi diperoleh daripada Probe Molekul (Life Technologies). Imej diperoleh menggunakan Mikroskop Konfokal Leica SP8 (Leica Microsystems).

Sampel manusia

Biopsi buah pinggang diperoleh dari Hospital Universiti Karolinska (Stockholm, Sweden). Sampel kawalan diperolehi daripada kutub buah pinggang yang sihat bagi individu yang menjalani nephrectomies tumor. Jawatankuasa etika tempatan meluluskan kajian (no. kelulusan 2010/579-31/1, Stockholm, Sweden).

berbanding kawalan (Ctrl.) atau ***P < {{0}}.001="" berbanding="" kawalan="" si-negatif="" (berebut)="" (rarres1,="" n="6" ;="" sirarres1,="" n="4)." (c)="" perwakilan="" dokumen="" western="" blot="" dan="" data="" diringkaskan="" yang="" menunjukkan="" tahap="" protein="" relatif="" pp65="" dalam="" pecahan="" nuklear="" terpencil="" podosit="" yang="" dirawat="" dengan="" 10="" ng/ml="" tgf-b1.="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< {{40}}.001="" berbanding="" podosit="" kawalan="" (ctrl.="" )="" (n="3)." (d)="" perwakilan="" dokumen="" western="" blot="" dan="" data="" ringkasan="" yang="" menunjukkan="" tahap="" protein="" relatif="" pp65="" dalam="" pecahan="" nuklear="" terpencil="" podosit="" yang="" dirawat="" dengan="" 10="" ng/ml="" tgf-b1="" ±3="" mmol/l="" r428,="" n="2." (e)="" perwakilan="" western="" blot="" yang="" menunjukkan="" bahawa="" overexpression="" rarres1="" mengaktifkan="" axl="" secara="" konstitutif.="" *p="">< 0.05="" (n="2)." (f)="" tahap="" mrna="" relatif="" gen="" berkaitan="" emt="" dalam="" podosit="" yang="" mengekspresikan="" rarres1="" (rarres1)="" atau="" podosit="" kawalan="" (ctrl.)="" yang="" ditransfeksi="" dengan="" sirna="" untuk="" axl="" (siaxl),="" kawalan="" si-negatif="" (berebut),="" ##p="">< 0.01,="" ##="" #p="">< 0.001="" berbanding="" scramble,="" n="3," atau="" dirawat="" dengan="" 3="" mmol/l="" r428.="" ##p="">< 0.01,="" ###p="">< 0.001="" berbanding="" ctrl.,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001="" berbanding="" rarres1,="" *p=""><0.05 berbanding="" rarres1,="" n="4." data="" dinyatakan="" sebagai="" min="" ±="" sd.="" ujian="" t="" pelajar="" digunakan="" untuk="" perbandingan="" antara="" 2="" kumpulan.="" ut,="" tidak="">

Rajah 3|Penubuhan tikus Rarres1 khusus podocyte (CreD/Rarres1flfl/flfl) tikus. (a) Penjanaan tikus kalah mati bersyarat di mana Rarres1 secara khusus diablasi dalam podosit dengan menggunakan sistem rekombinasi Cre-LoxP. Exon 3 dipadamkan pada NPHS2-Cre-mediated recombination. (b) Genotaip telah disahkan oleh penyediaan ekor dan tindak balas rantai polimerase pada usia 4 minggu. (Bersambung)

Rajah 3|(Sambungan) (c) Perwakilan Western blot yang menunjukkan penurunan ekspresi Rarres1 dalam glomeruli terpencil daripada podocyte-specific Rarres1 kalah mati (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) tikus. (d) Kehilangan spesifik Podocyte Rarres1 tidak menjejaskan tahap albuminuria pada tikus yang dirawat dengan serum nefrotoksik (NTS) seperti yang dianalisis oleh nisbah albumin-ke-kreatinin air kencing dalam kumpulan tikus yang berlainan (NTS-ctrl., n {{1{{ 15}}}}–7; NTS-Rarres1_cKO, n - 7). (e) Fotomikrograf dan kuantifikasi yang menunjukkan perubahan struktur glomerular biasa dalam kumpulan tikus yang berbeza. Lesi glomerular telah dikenalpasti dalam bahagian asid berkala-Schiff-berwarna. #P < 0.0001="" berbanding="" kawalan="" tidak="" dirawat="" (ctrl.)="" (ctrl.,="" n="" -="" 6;="" nts-ctrl.,="" n="" -="" 9;="" nts-rarres1_cko,="" n="9)." (f)="" fotomikrograf="" perwakilan="" dan="" kuantifikasi="" purata="" ketebalan="" membran="" bawah="" tanah="" glomerular="" (gbm)="" dan="" bilangan="" celah="" per="" mm="" gbm="" dalam="" kumpulan="" tikus="" yang="" berbeza="" melalui="" analisis="" mikroskop="" elektron="" penghantaran.="" ##p="">< 0.01,="" ###p="">< 0.001,="" ####p="">< 0.0001="" berbanding="" kawalan="" yang="" tidak="" dirawat="" (ctrl.,="" n="3;" nts-ctrl.,="" n="4;" nts-rarres{="" {33}}cko,="" n="6)." data="" dinyatakan="" sebagai="" min="" ±="" sem.="" analisis="" varians="" sehala="" diikuti="" dengan="" ujian="" pasca="" tukey="" untuk="" pelbagai="" perbandingan="" digunakan="" untuk="" kumpulan="" 3="" atau="" lebih.="" untuk="" mengoptimumkan="" paparan="" imej="" ini,="" sila="" lihat="" versi="" dalam="" talian="" artikel="" ini="" di="">

Garisan tetikus

Tikus Rarres1 yang diflox dengan latar belakang C57Bl/6J (Rarres1flfl/flfl; Cyagen) ialah podocin (B6.Cg-Tg [NPHS2-}cre] 295Lbh/J; Makmal Jackson) dan tikus Tie2 cre (B6.Cg-Tg( Tek-cre)12Flv/J) untuk menjana tikus kalah mati khusus sel. Tikus GT(ROSA)26Sortm1(CAG-Rarres1-T2A EGFP)/J telah dipalangkan dengan garisan Tie2-cre untuk mengaktifkan ungkapan Rarres1 khususnya dalam EC.17 Pembiakan dan genotaip dilakukan mengikut standard prosedur. Semua kajian haiwan telah dijalankan di Makmal Praklinikal (Karolinska Institutet) mengikut garis panduan dan peraturan yang berkaitan dan diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Penyelidikan Penjagaan Haiwan (Linköpings djurförsöksestiska nämd; DNR 1336).

Nefropati yang disebabkan oleh serum nefrotoksik (NTS) pada tikus

Tikus berumur tujuh hingga 9-minggu menerima 50 ml Complete Freund's Adjuvant (Merck) sc, diikuti dengan suntikan NTS (iv; 6 ml/kg berat badan; Probetex Inc.) pada hari 4.18 Air kencing dikumpul 3, 7 , 10, dan 14 hari selepas suntikan, dan tikus dibunuh pada hari ke-14.

Analisis statistik

Analisis statistik telah dilakukan menggunakan perisian Prism 9.0 (GraphPad).

Data pertama kali diperiksa untuk kenormalan (ujian Shapiro-Wilk). Apabila taburan adalah Gaussian, data dianalisis menggunakan ujian parametrik (ujian-t pelajar untuk 2 kumpulan, dan analisis varians dengan ujian pasca Tukey untuk lebih daripada 2 kumpulan). Apabila pengedarannya bukan Gaussian, ujian bukan parametrik (ujian Friedman dengan ujian pasca Dunn untuk lebih daripada 2 kumpulan dan ujian Mann-Whitney U untuk 2 kumpulan) telah digunakan. Perbezaan tersebut dianggap ketara apabila P <>

KEPUTUSAN

Rarres1 dinyatakan oleh podosit

Kami mula-mula menilai corak ekspresi Rarres1 dalam murine dan tisu buah pinggang manusia. Analisis tindak balas rantai polimerase menunjukkan bahawa Rarres1 dinyatakan dengan ketara lebih tinggi dalam glomerular berbanding pecahan tubulointerstitial korteks buah pinggang tetikus (Rajah 1a dan b6). Analisis penjujukan RNA sel tunggal tisu buah pinggang murine mendedahkan bahawa Rarres1 secara eksklusif dinyatakan oleh podosit (Rajah 1c). Pada manusia, Rarres1 juga diperkaya dalam tisu glomerular (Rajah 1d). Dalam imunofluoresensi tisu buah pinggang manusia biasa, Rarres1 menunjukkan isyarat tinggi dalam glomeruli (Rajah 1e). Pewarnaan berganda menunjukkan bahawa Rarres1 terletak "di luar" kereaktifan nefrin dalam gelung kapilari, mencadangkan ekspresi podosit (Rajah 1f). Kolokalisasi dengan vimentin menunjukkan penyetempatan kepada proses utama. Tiada kereaktifan bertindih dilihat untuk penanda EC CD31 atau penanda mesangial -aktin otot licin (Rajah 1f).

Rarres1 menggalakkan isyarat NF-kB dan TGF-b1 melalui reseptor tyrosine kinase Axl

Untuk menjelaskan peranan Rarres1 dalam podosit, kami memanipulasi tahap ekspresinya dalam podosit manusia yang diabadikan.16 Tahap Rarres1 dikawal dengan ketara dalam podosit yang ditransfeksi secara stabil dengan cDNA Rarres1 manusia dan dikawal ke bawah selepas pemindahan dengan siRNA penyasaran Rarres1- 2a). Ekspresi berlebihan Rarres1 mengimbangi ekspresi gen yang berkaitan dengan peralihan epitelium-mesenchymal, manakala downregulation Rarres1 endogen mempunyai kesan yang bertentangan (Rajah 2b). Oleh kerana isyarat NF-kB mempunyai peranan penting dalam peralihan epitelium-mesenchymal yang membawa kepada fifibrosis dan keradangan dalam GN, 19 kami mengukur pengaktifan isyarat NF-kB yang disebabkan oleh TGF-b1 secara in vitro. Ekspresi berlebihan Rarres1 menyebabkan peningkatan pengaktifan laluan NF-kB pada garis dasar dan selepas rangsangan TGF-b1 (Rajah 2c). Oleh kerana Rarres1 telah dilaporkan untuk mengaktifkan reseptor tyrosine kinase Axl, dan dengan cara itu menggalakkan laluan isyarat NF-kB dalam kanser payudara yang meradang,20 kami menilai sama ada Axl ialah rakan kongsi berfungsi berpotensi Rarres1 dalam tisu buah pinggang. Pengaktifan NF-kB yang disebabkan oleh TGF-b1 boleh dihalang oleh R428, perencat molekul kecil terpilih Axl kinase21, 22 (Rajah 2d), dan overexpression Rarres1 berkorelasi positif dengan pengaktifan konstitutif Axl kinase (Rajah 2e). Pengurangan aktiviti Axl dengan R428 tetapi bukan pembungkaman gen Axl oleh siRNA boleh mengurangkan ekspresi teraruh Rarres{38}} gen berkaitan peralihan epitelium-mesenchymal, seperti yang dibuktikan oleh tahap mRNA yang berkurangan (Rajah 2f). Nota, tiada pengaktifan laluan NF-kB bukan kanon dikesan (Tambahan Rajah S1). Oleh itu, Rarres1 mempromosikan isyarat NF-kB dalam podosit berbudaya melalui pengaktifan Axl kinase.

Mengapa Retinoic Acid Receptor Responder1 boleh Menggalakkan Perkembangan Penyakit Glomerular?

Penyahaktifan Rarres1 dalam podosit tidak membawa kepada keabnormalan glomerular atau memodulasi hasil nefropati dalam model GN membran bawah tanah anti-glomerular (GBM)

Untuk menganalisis peranan Rarres1 dalam podocytes in vivo, kami menghasilkan garis tetikus Rarres1flfl/flfl (floxed) novel dan menyeberanginya dengan tikus podocin-Cre untuk menghasilkan tikus Podocin-Cre Rarres1flfl/flfl (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) (Rajah 3a ). Genotip untuk alel floxed / Cre telah dikenal pasti dengan genotaip telinga (Rajah 3b). Analisis tindak balas rantai polimerase bagi pecahan tubulointerstitial dan glomerular, serta tisu hati, mengesahkan penghapusan exon 3 khususnya dalam glomerulus (Rajah Tambahan S2A), dan paras protein Rarres1 dikurangkan dalam glomeruli daripada tikus Creþ/Rarres1flfl/flfl (Rajah). 3c).

Rajah 4|Penyelarasan Rarres1 dalam sel endothelial kapilari glomerular dan peritubular pada pesakit dengan penyakit buah pinggang kronik. (a) Analisis ekspresi gen Rarres1, kolagen1a2 (COL1A2), dan nephrin (NPHS1) dalam data microarray glomeruli yang diasingkan daripada pesakit dengan nefropati diabetes (DN), vaskulitis, nefropati IgA (IgAN), dan subjek kawalan (Ctrl.). 4,6,24–26 *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0="" .001="" berbanding="" subjek="" kawalan.="" (b)="" analisis="" tindak="" balas="" rantai="" polimerase="" kuantitatif="" untuk="" gen="" rarres1,="" col1a2,="" dan="" nphs1="" dalam="" glomeruli="" terpencil="" daripada="" pesakit="" dengan="" dn="" (n="5)" dan="" kawalan="" (n="5)." **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001="" berbanding="" subjek="" kawalan.="" (c)="" analisis="" ekspresi="" gen="" rarres1="" dan="" col1a2="" dalam="" data="" microarray="" pecahan="" tiub="" yang="" diasingkan="" daripada="" dn,="" vaskulitis,="" igan,="" dan="" pesakit="" kawalan.="" *p=""><0.05, **p=""><0.01, ***p=""><0.001 berbanding="" subjek="" kawalan.="" (d)="" fotomikrograf="" perwakilan="" pewarnaan="" imunohistokimia="" rarres1="" dalam="" tisu="" kortikal="" buah="" pinggang="" manusia="" daripada="" kawalan="" dan="" pesakit="" dengan="" dn="" (n="5)," vaskulitis="" sitoplasmik="" autoantibody="" (anca)="" anti-neutrofil="" (n="4)," dan="" igan="" (="" n="5)." anak="" panah="" menunjukkan="" rarres1-podosit="" (kawalan)="" positif="" dan="" sel="" endothelial="" (ec)="" (dn,="" igan="" dan="" vaskulitis).="">

Rajah 4|(Sambungan) (e) Imej mikroskopik confocal perwakilan menunjukkan ekspresi Rarres1 dalam glomeruli pesakit dengan DN. CD31 digunakan sebagai penanda untuk EC. Bar=50/10 mm. (f) Gambar pendarfluor FL confocal perwakilan RNAscope yang menunjukkan ekspresi gen Rarres1 dalam PECAM1-mengekspresikan sel dalam pecahan tiub pesakit dengan DN. Data dinyatakan sebagai min±SEM. Ujian-t pelajar digunakan untuk perbandingan antara 2 kumpulan. Bar=50/10 mm. Untuk mengoptimumkan paparan imej ini, sila lihat versi dalam talian artikel ini di www.kidney-international.org.

Tikus Creþ/Rarres1flfl/flfl dilahirkan pada nisbah warisan Mendelian yang dijangkakan dan mereka berdaya maju dan subur (data tidak ditunjukkan). Buah pinggang tidak dapat dibezakan daripada rakan sampah kawalan (Cre- / Rarres1flfl/flfl ) seperti yang dianalisis oleh pemeriksaan mikroskopik cahaya dan elektron rutin (Rajah Tambahan S2B dan C). Juga, pengagihan protein podocyte nephrin dan synaptopodin tidak terjejas dalam tikus Creþ / Rarres1flfl / flfl (Rajah Tambahan S2D)

Untuk menjelaskan peranan Rarres1 dalam kecederaan buah pinggang dalam vivo, Creþ/Rarres1flfl/flfl telah dirawat dengan NTS yang membawa kepada deposit IgG dalam GBM, albuminuria, dan GN progresif.23 Tahap Albuminuria adalah serupa dalam kedua-dua Creþ/Rarres1flfl/flfl dan kawalan tikus (Rajah 3d). Pemeriksaan mikroskopik cahaya tidak menunjukkan perbezaan ketara dalam bahagian glomeruli yang terjejas (Rajah 3e). Mikroskopi elektron tidak menunjukkan perbezaan dalam ketebalan GBM atau proses penyingkiran kaki, dan GEC nampaknya turut terjejas dalam kedua-dua kumpulan (Rajah 3f). Penanda podocyte nephrin, Wt1, dan synaptopodin telah terjejas dengan cara yang sama dalam kedua-dua kumpulan (Rajah Tambahan S3A). Juga, pewarnaan untuk EC menggunakan CD31 tidak menunjukkan perbezaan dalam glomeruli atau kapilari peritubular antara kumpulan (Rajah Tambahan S3B dan C). Di samping itu, ekspresi gen yang berkaitan dengan fifibrosis dan keradangan juga meningkat dalam kedua-dua kumpulan yang dirawat dengan NTS (Supplementary Figure S4).

Ekspresi Rarres1 diinduksi dalam EC kapilari glomerular dan peritubular dalam penyakit buah pinggang kronik (CKD)

Untuk meneroka peranan Rarres1 dalam CKD, kami menganalisis ekspresinya dalam set data RNA yang tersedia secara umum. Kami memerhatikan paras Rarres1 yang meningkat dengan ketara dalam glomeruli yang diasingkan daripada pesakit dengan DN, vaskulitis yang berkaitan dengan ANCA, dan IgAN (Rajah 4a), 4, 6, 24-26 manakala gen yang berkaitan dengan podocyte lain, contohnya, nephrin, telah dikurangkan atau tidak berubah dengan ketara. . Analisis tindak balas rantai polimerase kuantitatif kami bagi glomeruli yang diasingkan daripada pesakit dengan DN (n=5) mengesahkan induksi ungkapan Rarres1 (Rajah 4b). Kerana kehilangan podosit, ekspresi gen podosit biasanya menurun secara progresifpenyakit glomerular,6 dan nisbah glomerular Rarres1 kepada ekspresi nefrin meningkat lebih kurang 20-kali ganda dalam DN berbanding glomeruli yang sihat (Rajah 4b). Ekspresi Rarres1 juga dikawal selia dalam set data tisu tubulointerstitial dalam DN, vaskulitis berkaitan ANCA, dan IgAN (Rajah 4c).8–11

Seterusnya, kami menganalisis ekspresi Rarres1 secara imunohistokimia dalam biopsi buah pinggang daripada pesakit dengan DN (n ¼ 5), IgAN (n ¼ 5), dan vaskulitis yang berkaitan dengan ANCA (n ¼ 4). Dalam glomeruli yang berpenyakit, pewarnaan Rarres1 nampaknya disetempatkan kepada GEC seperti yang ditunjukkan oleh imunoreaktiviti pada bahagian dalam dinding kapilari (Rajah 4d, inset), manakala isyarat daripada podosit kelihatan lebih lemah. Dalam ruang tubulointerstitial, pewarnaan dikesan dalam kapilari peritubular (Rajah 4d, inset), mencadangkan ekspresi EC. Imunolabeling berganda dengan CD31 mengesahkan penyetempatan kepada EC dalam kedua-dua glomeruli dan kapilari peritubular (Rajah 4e). Begitu juga, eksperimen RNAscope berganda menunjukkan kolokalisasi mRNA Rarres1 dengan mRNA PECAM1 dalam DN (Rajah 4f). Diambil bersama, induksi ekspresi Rarres1 dalam EC kapilari glomerular dan peritubular adalah fenomena biasa dalam CKD.

Penjanaan dan pencirian garis tetikus yang mengekspresikan Rarres1 secara berlebihan dalam EC

Oleh kerana Rarres1 diinduksi dalam CKD manusia, kami menghasilkan garis tetikus transgenik novel di mana Rarres1 cDNA diperkenalkan ke dalam lokus Rosa26 di bawah promoter CAG, 27 dengan kaset lox-STOP-lox antara tapak penerima sambatan (Rajah 5a). Garisan tersebut telah dipalang dengan garisan Tie2-cre untuk menjana Rarres1_Tie2_KI tetikus, dan tikus dikenal pasti melalui genotaip telinga untuk knockin dan alel Cre (Rajah 5a). Rarres1_Tie2_Tikus KI menunjukkan paras protein Rarres1 yang meningkat dengan ketara dalam tisu buah pinggang (Rajah 5b), dan strategi knockin yang berjaya disahkan lagi dengan analisis ekspresi mRNA Rarres1 dalam GFP-positif yang diisih FACS GEC (Rajah 5c).

Kami memfenotaip buah pinggang Rarres1_Ikat2_tikus KI dan mengawal tikus dalam kumpulan yang dipadankan dengan umur. Dengan pemeriksaan mikroskopik yang ringan, morfologi buah pinggang tidak dapat dibezakan dalam Rarres1_Tie2_KI tikus daripada rakan sampah kawalan (Rajah 5d). Begitu juga, mikroskop elektron menunjukkan ketebalan GBM yang tidak berubah dan lebar proses kaki podosit (Rajah 5e). Selain itu, ungkapan penanda podosit nephrin dan synaptopodin kelihatan tidak terjejas dalam Rarres1 yang mengekspresikan glomeruli yang berlebihan (Rajah 5f). Nota, organ utama lain tidak menunjukkan secara makroskopik atau mikroskopik sebarang keabnormalan yang jelas (data tidak ditunjukkan).

Rajah 5|Penubuhan tikus Rarres1 knockin (Rarres1_Tie2_KI) khusus sel endothelial. (a) Generasi tikus knockin bersyarat di mana ekspresi Rarres1 secara khusus diinduksi dalam sel endothelial (EC) dengan menggunakan sistem penggabungan semula Cre-LoxP. Tie2-Tetikus Cre telah disilangkan dengan tikus yang menyatakan vektor sasaran (Rarres1_casetteþ), mengandungi kaset lox-STOP-lox antara splice (bersambung)

Rajah 5|(bersambung) tapak penerima dan Rarres1 cDNA di bawah promoter CAG, yang diperkenalkan ke dalam lokus Rosa26, telah dikenal pasti melalui genotaip telinga. Genotip disahkan oleh penyediaan telinga dan tindak balas rantai polimerase (PCR) pada usia 4 minggu. (b) Perwakilan Western blot yang menunjukkan peningkatan ekspresi Rarres1 dalam korteks buah pinggang daripada tikus Rarres1 knockin (Rarres1_Tie2_KI) khusus EC. **P < 0.01="" lawan="" kawalan="" (ctrl.;="" cre-="" arres1_tie2_ki,="" n="5," mann-whitney="" u="" ujian).="" (c)="" pcr="" kuantitatif="" untuk="" rarres1="" dalam="" ec="" terpencil.="" **p="">< 0.01="" berbanding="" kawalan="" (cre-="" arres1_tie2_ki,="" n="3," ujian-t="" pelajar).="" (d)="" fotomikrograf="" perwakilan="" bahagian="" asid="" berkala-schiff="" yang="" menunjukkan="" struktur="" glomerular="" tipikal="" dalam="" kumpulan="" tikus="" yang="" berbeza.="" (e)="" fotomikrograf="" perwakilan="" dan="" kuantifikasi="" purata="" ketebalan="" membran="" bawah="" tanah="" glomerular="" (gbm),="" dan="" bilangan="" celah="" per="" mm="" gbm="" dalam="" kumpulan="" tikus="" yang="" berbeza="" melalui="" analisis="" mikroskop="" elektron="" penghantaran="" (ujian-t="" pelajar).="" (f)="" imej="" mikroskopik="" confocal="" perwakilan="" menunjukkan="" ekspresi="" synaptopodin="" dan="" nephrin="" penanda="" khusus="" podocyte="" dalam="" tikus="" ketuk="" rarres1="" khusus="" ec="" (rarre1_tie2_ki)="" dan="" ctrl.="" tikus.="" bar="10" mm.="" data="" dinyatakan="" sebagai="" min="" ±="" sem.="" untuk="" mengoptimumkan="" paparan="" imej="" ini,="" sila="" lihat="" versi="" dalam="" talian="" artikel="" ini="" di="">

Induksi Rarres1 dalam EC memodulasi laluan isyarat NF-kB dan hasil nefropati dengan mengawal pengaktifan Axl

Untuk menilai sama ada ekspresi Rarres1 dalam EC memodulasi perkembangan penyakit, kami mendorong GN dalam tikus transgenik dan rakan-rakan mereka dengan satu suntikan NTS. Rarres1_- Tie2_Tikus KI mengembangkan paras albuminuria yang jauh lebih tinggi daripada kawalan selepas 3 hari, manakala tiada perbezaan ketara dalam albuminuria dilihat pada 7, 10 dan 14 hari (Rajah 6a). Analisis histologi 14 hari selepas induksi menunjukkan bahawa tikus Rarres1_Tie2_KI tidak mempunyai lebih banyak perubahan glomerular, seperti lesi sklerotik dan bulan sabit (Rajah 6b). Penilaian mikroskopik elektron menunjukkan, walau bagaimanapun, GBM yang lebih tebal dengan ketara dan lebih banyak penyingkiran proses kaki dalam tikus1_Tie{13}}KI Rarres (Rajah 6c). Tambahan pula, tikus Rarres1_Tie2_KI menunjukkan peningkatan tahap -aktin otot licin dalam korteks buah pinggang (Rajah 6d). Analisis penanda podocyte nephrin, synaptopodin, dan WT1 menunjukkan pengurangan yang mendalam yang menunjukkan penyahbezaan dan kehilangan podosit yang ketara (Rajah 6d). Yang penting, Rarres1_Tie2_KI glomeruli menunjukkan lebih sedikit WT1-podosit positif berbanding dengan haiwan kawalan, menunjukkan bahawa EC-express Rarres1 mempromosikan kerosakan podosit. Selain itu, lebih banyak trombi fibrin dikesan dalam Rarres1_Tie2_KI glomeruli (Rajah 6e). Selaras dengan ini, ekspresi gen yang berkaitan dengan keradangan, fifibrosis dan kecederaan tubular renal yang berbeza telah dikawal dengan ketara dalam tikus Rarres1_- Tie2_KI seperti yang ditunjukkan oleh analisis tindak balas rantai polimerase masa nyata untuk Il -1beta, Col1a1, TGF-b1 dan molekul kecederaan buah pinggang-128 dalam tisu korteks buah pinggang (Rajah 6f). Walau bagaimanapun, tiada perbezaan dikesan dalam nitrogen urea darah dan nilai S-kreatinin antara kumpulan (Rajah 6g). Juga, pewarnaan untuk EC menggunakan CD31 tidak menunjukkan perbezaan dalam glomeruli atau kapilari peritubular antara kumpulan (Rajah Tambahan S5A dan B). Diambil bersama, induksi khusus EC bagi ekspresi Rarres1 memburukkan lagi patologi glomerular dalam nefropati yang disebabkan oleh NTS.

Secara mekanikal, kami menganalisis sama ada ekspresi berlebihan Rarres1 dalam EC mempromosikan pengaktifan isyarat Axl dan NF-kB dalam vivo, sama dengan pemerhatian in vitro kami (Rajah 2). Kedua-dua Rarres1_Tie2_KI dan tikus kawalan yang dirawat dengan NTS mempamerkan pengaktifan laluan isyarat Axl seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan fosforilasi Axl (Rajah 6h). Walau bagaimanapun, pengaktifan ini lebih ketara dalam Rarres1_- Tie2_KI tetikus (Rajah 6h). Sejajar dengan itu, pengaktifan laluan NF-kB telah dipromosikan dalam tikus ini seperti yang ditunjukkan oleh bilangan pP{11}}nukleus positif dalam glomeruli (Rajah 6i). Apabila tahap pP65 diukur dengan penghapusan Barat, kami mengesan trend yang sama untuk pengaktifan laluan NF-kB walaupun ini tidak penting, mungkin disebabkan oleh satu outlier (Rajah Tambahan S5C).

Penyahaktifan Rarres1 dalam EC mengurangkan kerosakan glomerular dalam model glomerulonephritis anti-GBM

Untuk mengesahkan peranan patogenik Rarres1 terbitan EC dalam CKD, kami menghasilkan garis tetikus yang Rarres1 dipadamkan dalam EC menggunakan Tie2-Cre (Rajah 7a). Genotip untuk alel flox dan Cre dikenal pasti dengan genotaip telinga (Rajah 7b). Terdapat trend untuk mengawal selia Rarres1 dalam tikus yang dirawat NTS, yang telah dimansuhkan dalam tikus1_Tie2_KO Rarres (Rajah 7c). Tikus tidak menunjukkan sebarang keabnormalan buah pinggang yang jelas (data tidak ditunjukkan). Suntikan NTS menyebabkan albuminuria serupa dalam Rarres1_Tie2_KO dan kawalan (Rajah 7d). Walau bagaimanapun, analisis histologi 14 hari selepas induksi menunjukkan lebih sedikit perubahan glomerular dalam tikus Rarres1_- Tie2_KO (Rajah 7e). Dalam mikroskop elektron, tikus Rarres1_Tie2_KO menunjukkan pengurangan proses kaki dan penebalan GBM (Rajah 7f). Immunostaining tidak menunjukkan perbezaan yang ketara untuk aSMA, nephrin, atau synaptopodin (Rajah 7g). Walau bagaimanapun, bilangan podosit WT1-positif adalah lebih ketara dalam tikus1_Tie2_KO Rarres (Rajah 7g). Pewarnaan untuk pP65 menunjukkan penurunan bilangan nukleus positif dalam glomeruli1_Tie2_KO Rarres yang mencadangkan penglibatan laluan isyarat NF-kB (Rajah 7h).

Rajah 6|(bersambung) kuantifikasi purata ketebalan membran bawah tanah glomerulus (GBM) dan bilangan celah per mm GBM dalam kumpulan tikus yang berbeza melalui bahagian analisis mikroskop elektron penghantaran (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n { {3}}; NTS-Rarres1_Ikatan2_KI, n=12). (d) Imej mikroskopik confocal perwakilan menunjukkan ekspresi nefrin, synaptopodin, ⍺-aktin otot licin (⍺Sma), dan WT1 dalam buah pinggang daripada kumpulan tikus yang berbeza. Bar {{10}}/10 mm. Kawasan ⍺Sma-positif dikira setiap keratan rentas kortikal dan WT1 dikira setiap glomerulus (Ctrl., n=2; NTS-ctrl., n=3; NTS-Rarres{{18} }Ikatan2_KI, n {{20}}). (e) Kehadiran trombi fibrin dalam glomeruli seperti yang dikesan oleh pewarnaan trikoma (dikira setiap keratan rentas glomerular) (Ctrl., n=3; NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres{{ 26}}Ikatan2_KI, n=5). (f) Tahap mRNA relatif bagi gen yang berkaitan dengan keradangan, fifibrosis, dan kecederaan tiub renal yang berbeza dalam korteks buah pinggang tikus yang dirawat NTS (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n=6 –10; NTS-Rarres1_Tie2_KI, n=6–10). (g) Tahap kreatinin serum dan nitrogen urea darah (BUN) dalam NTS-ctrl. (n=3) dan NTS-Rarres1_Tie2_KI (n=3) tikus. (h) Perwakilan dokumen Western blot dan data ringkasan yang menunjukkan tahap protein relatif Paxil dalam korteks buah pinggang dalam kumpulan tikus yang dirawat NTS yang berlainan (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres1_ Ikat2_KI, n=5). (i) Fotomikrograf perwakilan pewarnaan imunohistokimia pP65 dalam tisu kortikal buah pinggang daripada kumpulan tikus yang dirawat NTS yang berlainan. pP65-nukleus positif per glomeruli dikira dalam kumpulan tikus yang berbeza (Ctrl., n=7; NTS-ctrl., n=8; NTS-Rarres1_Tie 2_KI, n=14). Tikus masuk Rarres1 khusus EC (Rarres1_Tie2_KI); tikus dengan kaset Rarres1 dan tanpa ekspresi Cre (Ctrl.) digunakan sebagai kawalan. #P < 0.05,="" ##p="">< 0.01,="" ###p="">< 0.001="" berbanding="" kawalan="" tidak="" dirawat="" (ctrl.),="" *p=""><0.05 berbanding="" kawalan="" dirawat="" nts="" (nts-ctrl.).="" data="" dinyatakan="" sebagai="" min="" ±="" sem.="" ujian-t="" pelajar="" digunakan="" untuk="" perbandingan="" antara="" 2="" kumpulan.="" analisis="" varians="" sehala="" diikuti="" dengan="" ujian="" pasca="" tukey="" untuk="" pelbagai="" perbandingan="" digunakan="" untuk="" kumpulan="" 3="" atau="" lebih.="" untuk="" mengoptimumkan="" paparan="" imej="" ini,="" sila="" lihat="" versi="" dalam="" talian="" artikel="" ini="" di="">

PERBINCANGAN

Rarres1 pertama kali dikenal pasti dalam kultur rakit kulit yang dirawat dengan tazarotene29 dan telah terbukti bertindak sebagai penindas pencerobohan dalam saluran sel kanser prostat.30 Dalam kanser payudara yang meradang, Rarres1 mengawal in vitro pencerobohan sel kanser melalui pengantaraan laluan isyarat Axl . Secara terperinci, Rarres1 menstabilkan Axl dengan menghalang degradasi Axl yang bergantung kepada proteasome. Tambahan pula, pengurangan Rarres1 dalam sel SUM149 merendahkan ekspresi Axl dan menyahaktifkan NF-kB, membawa kepada pengurangan pencerobohan sel kanser payudara yang meradang.20 Selain itu, ekspresi Rarres1 diinduksi pada pesakit dengan fifibrosis lanjutan, dan peranan profibrotik Rarres1 telah dicadangkan dalam model fifibrosis paru-paru tikus dan semasa pengaktifan fibrogenik sel-sel stellate hepatik.31 Diambil bersama, kajian in vitro sebelumnya mencadangkan peranan Rarres1 dalam fifibrosis, keradangan, dan pencerobohan kanser.

Pada mulanya, Rarres1 menimbulkan minat kami kerana ia sangat diperkaya dalam sel podocyte. Kami boleh menunjukkan bahawa Rarres1 menggalakkan isyarat radang dan profibrotik dalam podosit melalui pengaktifan laluan NF-kB yang dimediasi Axl. Sebaliknya, haiwan kalah mati khusus podocyte gagal menunjukkan sebarang perbezaan yang jelas berbanding dengan kawalan di bawah keadaan sihat serta dalam model tetikus GN. Ini mungkin disebabkan oleh mekanisme pampasan kerana laluan isyarat NF-kB dikawal oleh beberapa molekul dan proses biologi.

Profil molekul pesakit dengan diabetes menunjukkan bahawa Rarres1 telah diinduksi dalam EC kapilari glomerular dan peritubular dalam DN. Yang penting, ungkapan Rarres1 tidak dikesan dalam EC pada pesakit diabetes tanpa nefropati. Oleh itu, kami membuat spekulasi bahawa Rarres1 boleh menjadi penanda baru untuk penyakit mikrovaskular diabetes, dan kajian dalam sampel plasma dan air kencing ditunjukkan untuk meneroka kemungkinan Rarres1 sebagai biomarker bukan invasif. Kami mengenal pasti induksi Rarres1 juga pada pesakit dengan IgAN dan vaskulitis. Sangat menggoda untuk membuat spekulasi bahawa Rarres1 mempunyai peranan patogen dalam glomerulopati ini dan menyumbang kepada perkembangan penyakit. Secara fungsional, kami menunjukkan bahawa induksi Rarres1 dalam EC menambah kecederaan buah pinggang dalam model murine GN, manakala ketidakaktifan Rarres1 dalam EC memperbaiki kecederaan. Analisis fenotip menunjukkan bahawa podosit telah terjejas pada tikus yang terlalu mengekspresikan Rarres1 dalam EC. Ini mungkin kesan langsung Rarres1 kepada podosit kerana bentuk Rares yang boleh larut telah diterangkan.32 Sebagai alternatif, kecederaan podosit mungkin sekunder kepada kerosakan penghalang penapisan glomerulus.

Sebelum ini, pengaktifan NF-kB endothelial telah ditunjukkan memainkan peranan patogenik dalam perkembangan penyakit buah pinggang dalam vaskulitis.13 Terutamanya, perencatan laluan NF-kB endothelial dalam model GN bulan sabit membatalkan perkembangan itu. Inhibitor Axl telah terbukti bermanfaat dalam eksperimen nefritis anti-GBM. Tikus yang dirawat dengan perencat molekul kecil yang paling selektif, R428, menunjukkan pemeliharaan fungsi buah pinggang yang ketara dan penurunan pengeluaran sitokin radang.33 Ini menunjukkan bahawa laluan itu boleh menjadi pilihan terapeutik untukpenyakit glomerularproses. Walau bagaimanapun, kerana kedua-dua Axl dan NF-kB memodulasi beberapa proses selular yang berbeza di seluruh badan, ia tidak mungkin menjadi calon yang baik untuk penyasaran farmaseutikal dalam CKD. Rarres1 boleh memberikan sasaran yang lebih berkaitan dengan buah pinggang.

Tie2-Cre telah ditunjukkan untuk memacu ekspresi dalam subpopulasi sel hematopoietik.34 Sesetengah sel ini mungkin memodulasi tindak balas keradangan dalam model yang disebabkan oleh NTS, dan oleh itu kita tidak boleh mengecualikan bahawa Rarres1 yang diperolehi sel hematopoietik menyumbang kepada perkembangan penyakit dalam Tie2-garisan Cre. Walau bagaimanapun, kerana kami tidak mengesan sebarang ekspresi Rarres1 yang jelas dalam sel imun yang menyusup, kami berpendapat bahawa ini kurang berkemungkinan.

Semasa manuskrip ini dalam penyediaan, Chen et al.32 melaporkan bentuk larut Rarres1 yang menggalakkanpenyakit glomerularperkembangan. Mereka mengenal pasti, sama seperti kami, pengawalan Rarres1 dalam penyakit glomerular manusia biasa. Kajian ini menyokong penemuan kami bahawa peningkatan ekspresi Rarres1 berkorelasi dengan penurunan fungsi buah pinggangpenyakit glomerular manusia. Walau bagaimanapun, berbeza dengan keputusan kami, mereka menyimpulkan bahawa regulasi Rarres1 adalah disebabkan oleh overexpression dalam podosit. Kami tidak boleh mengecualikan kemungkinan itu, tetapi kami mengesan dalam penyakit manusia induksi ekspresi Rarres1 yang berbeza dalam EC. Satu mekanisme yang menjelaskan penemuan kami adalah bahawa bentuk larut Rarres1 yang dihasilkan oleh podosit diambil oleh GEC. Walau bagaimanapun, keputusan yang kami mengesan mRNA Rarres1 dalam EC dengan hibridisasi in situ dan Rarres1 juga diinduksi dalam EC kapilari peritubular sangat menyokong idea bahawa ungkapan Rarres1 dalam penyakit buah pinggang adalah terutamanya dari asal endothelial.

Rajah 7|Ablasi khusus endothelial Rarres1 melemahkan kecederaan buah pinggang dalam tikus yang dirawat serum nefrotoksik (NTS). (a) Penjanaan tikus kalah mati bersyarat di mana Rarres1 secara khusus diablasi dalam sel endothelial menggunakan sistem rekombinasi Cre-LoxP. Exon 3 dipadamkan pada Tie2-Cre-mediated gabungan. (b) Genotaip telah disahkan oleh penyediaan ekor dan tindak balas rantai polimerase pada (bersambung)

Rajah 7|(bersambung) umur 4 minggu. (c) Perwakilan dokumen Western blot dan data ringkasan yang menunjukkan tahap protein relatif Rarres1 dalam korteks buah pinggang dalam kumpulan tikus yang dirawat NTS yang berlainan (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres1_ Ikat2_KO, n=4) dan tikus yang tidak dirawat (Kawalan [Ctrl.], n {{10}}). **P < 0.01.="" (d)="" uacr="" (nisbah="" albumin-ke-kreatinin="" air="" kencing)="" dalam="" kumpulan="" tikus="" yang="" berbeza="" pada="" rawatan="" nts="" (ctrl.,="" n="7–11;" rarres1_tie2_ko,="" n="" {="" {19}}–8).="" (e)="" fotomikrograf="" dan="" kuantifikasi="" yang="" menunjukkan="" perubahan="" struktur="" glomerular="" biasa="" dalam="" kumpulan="" tikus="" yang="" berbeza.="" lesi="" glomerular="" dikenal="" pasti="" dalam="" bahagian="" bernoda="" asid-schiff="" (ctrl.,="" n="3;" kawalan="" dirawat="" nts="" [nts-ctrl.],="" n="12;" nts="" rarres1_tie{="" {27}}ko,="" n="8)." (f)="" fotomikrograf="" perwakilan="" dan="" kuantifikasi="" purata="" ketebalan="" membran="" bawah="" tanah="" glomerular="" (gbm)="" dan="" bilangan="" celah="" per="" mm="" gbm="" dalam="" kumpulan="" tikus="" yang="" berbeza="" melalui="" bahagian="" analisis="" mikroskop="" elektron="" penghantaran="" (ctrl.,="" n="6;" nts-ctrl.="" ,="" n="13;" nts-rarres1_ikatan2_ko,="" n="16)." (g)="" imej="" mikroskopik="" confocal="" representatif="" menunjukkan="" ekspresi="" nefrin,="" synaptopodin,="" -aktin="" otot="" licin="" (sma),="" dan="" wt1="" dalam="" buah="" pinggang="" daripada="" kumpulan="" tikus="" yang="" berbeza.="" bar="50/10" mm.="" kawasan="" sma-positif="" dikira="" setiap="" keratan="" rentas="" kortikal="" (nts-ctrl.,="" n="8;" nts-rarres1_tie2_ko,="" n="4)." (="" h="" )="" fotomikrograf="" perwakilan="" pewarnaan="" imunohistokimia="" pp65="" dalam="" tisu="" kortikal="" buah="" pinggang="" daripada="" kumpulan="" tikus="" yang="" dirawat="" nts="" yang="" berlainan.="" pp65-nukleus="" positif="" per="" glomeruli="" dikira="" dalam="" kumpulan="" tikus="" yang="" berlainan="" (nts-ctrl.,="" n="7;" nts-rarres1_tie2_ko,="" n="" {{="" 56}}).="" ####p="">< 0.001="" berbanding="" ctrl.="" yang="" tidak="" dirawat,="" *p="">< 0.05="" berbanding="" nts-ctrl.="" data="" dinyatakan="" sebagai="" min±="" sem.="" ujian-t="" pelajar="" digunakan="" untuk="" perbandingan="" antara="" 2="" kumpulan.="" analisis="" varians="" sehala="" diikuti="" dengan="" ujian="" pasca="" tukey="" untuk="" pelbagai="" perbandingan="" digunakan="" untuk="" kumpulan="" 3="" atau="" lebih.="" untuk="" mengoptimumkan="" paparan="" imej="" ini,="" sila="" lihat="" versi="" dalam="" talian="" artikel="" ini="" di="">

Terdapat beberapa batasan dalam kajian ini yang harus diakui. Pertama, kajian in vitro telah dilakukan dalam podosit, sedangkan dalam vivo kami memanipulasi ungkapan dalam EC. Oleh itu, kami tidak boleh memautkan Rarres1 secara langsung kepada pengaktifan Axl dalam EC. Kedua, walaupun kami boleh mengenal pasti pengaktifan Rarres1- (bergantung kepada Axl) bagi isyarat NF-kB dalam podosit, kami tidak menyiasat mekanisme molekul di sebalik proses ini. Lebih banyak kajian diperlukan untuk meneroka penemuan sebelumnya bahawa Rarres1 menggalakkan pengaktifan Axl dengan menghalang degradasi yang bergantung kepada proteasomnya. Akhirnya, kami mencabar haiwan kalah mati kami hanya dengan model nefropati yang disebabkan oleh NTS. Oleh itu, lebih banyak kajian dalam model haiwan ditunjukkan untuk melihat sama ada Rarres1 mempunyai peranan patogen juga dalam proses penyakit lain.

Untuk meringkaskan, kajian kami menunjukkan bahawa dalam glomerulopati manusia biasa, protein yang diperkaya podocyte Rarres1 diinduksi dalam EC, yang membawa kepada keradangan, kecederaan podocyte, dan fifibrosis. Ini berpotensi dimediasi dengan meningkatkan laluan isyarat NF-kB melalui pengaktifan reseptor tyrosine kinase Axl (Rajah 7). Rarres1 ialah biomarker baharu kecederaan mikrovaskular dan berpotensi menjadi sasaran terapeutik baru untuk menindas keradangan dan fifibrosis dalam CKD

PENDEDAHAN

ML ialah pekerja AstraZeneca, Gothenburg, Sweden. Penyelidikan JP disokong oleh AstraZeneca. Semua pengarang lain mengisytiharkan tiada kepentingan bersaing.

PENGHARGAAN

Kajian ini disokong oleh KM-H dari Diabetes Wellness Sverige dan kepada JP dari KI/AZ Integrated Metabolic Center, Marianne och Marcus Wallenberg Foundation, Swedish Diabetes Foundation, Swedish Kidney Foundation dan Centre for Innovative Medicine.

SUMBANGAN PENULIS

KM-H, ML, dan JP mereka bentuk penyelidikan; KM-H, DD, EC, SZ, dan GG melakukan penyelidikan; KM-H dan XL menganalisis data; AW menyediakan sampel manusia; dan KM-H dan JP menulis kertas itu.

Mengapa Retinoic Acid Receptor Responder1 boleh Menggalakkan Perkembangan Penyakit Glomerular?

BAHAN TAMBAHAN

Fail Tambahan (PDF)

Jadual S1. Pasangan primer gen sasaran digunakan untuk RT-PCR masa nyata dalam kajian ini.

Jadual S2. Antibodi digunakan dalam kajian ini. Fail Tambahan (PowerPoint)

Rajah S1. Ekspresi berlebihan Rarres1 tidak mengaktifkan laluan isyarat NF-kB bukan kanonikal. Dokumen Western blot perwakilan dan data ringkasan menunjukkan bahawa ekspresi berlebihan Rarres1 tidak mengaktifkan p100/p52 dalam podosit yang dirawat dengan 10 ng/ml TGF-b1 (n=2). Data dinyatakan sebagai min ± SD. Ujian-t pelajar digunakan untuk perbandingan antara dua kumpulan. UT, tidak dirawat.

Rajah S2. Penubuhan tikus Rarres1 khusus podocyte (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) tikus. (A) Analisis PCR konvensional dalam pecahan tiub dan glomerular, serta dalam tisu hati. (B) Pemeriksaan histologi (pewarnaan PAS) patologi buah pinggang dalam tikus Cre– /Rarres1flfl/flfl dan Creþ/Rarres1flfl/flfl. (C) Mikrograf elektron penghantaran perwakilan (TEM) dan kuantifikasi purata ketebalan membran bawah tanah glomerular (GBM) dan bilangan celah per mm GBM dalam kumpulan tikus yang berbeza (n=3). (D) Imej mikroskopik confocal perwakilan menunjukkan ekspresi penanda khusus podocyte, synaptopodin, dan nephrin, dalam kalah mati Rarres1 khusus podocyte (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) dan kawalan (Cre– /Rarres1flfl/flfl ) tikus. Bar=10 mm.

Rajah S3. Tahap ekspresi penanda podocyte dan CD31 dalam buah pinggang tikus yang dirawat NTS. (A) Imej mikroskopik confocal representatif yang menunjukkan ekspresi nefrin, WT-1, dan synaptopodin dalam podosit daripada tikus kalah mati spesifik podocyte Rarres1 yang dirawat NTS (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) dan rakan sampah kawalan (Cre–/Rarres1flfl flfl). Bar=10 mm (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl , n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl , n=5). (B) Perkadaran CD{15}}kapilari positif dalam kawasan peritubular. Tiga puluh kawasan peritubular dinilai setiap tetikus. (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl , n= 4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl , n=4). Ujian t pelajar. (C) Pemarkahan separa kuantitatif bagi isyarat CD31 dalam glomeruli: 0=tiada isyarat, 1=isyarat lemah, 2=isyarat sederhana, 3=isyarat kuat. Sepuluh glomeruli dinilai daripada setiap tetikus (NTS Cre–/ Rarres1flfl/flfl , n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl , n=4). Ujian t pelajar.

Rajah S4. Tahap ekspresi untuk penanda fifibrosis, keradangan, dan kecederaan tiub dalam buah pinggang tikus yang dirawat NTS. (A) Imej mikroskopik confocal representatif yang menunjukkan ekspresi -Sma dalam buah pinggang daripada tikus kalah mati khusus podocyte Rarres1 yang dirawat NTS (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) dan rakan sampah kawalan (Cre– /Rarres1flfl/flfl ). Bar=100 mm. (B) Tahap mRNA relatif gen-gen yang berkaitan dengan keradangan-, fifibrosis-, dan kecederaan tiub renal yang berbeza dalam korteks buah pinggang tikus yang dirawat NTS. #P < 0.05,="" ##p="">< 0.01="" berbanding="" kawalan="" (ctrl.);="" data="" dinyatakan="" sebagai="" min="" ±="" sem.="" ujian-t="" pelajar="" digunakan="" untuk="" perbandingan="" antara="" 2="" kumpulan="" (sham="" n="2;" nts–="" cre–="" arres1flfl/flfl,="" n="3;" nts-creþ/rarres1flfl/flfl="" ,="" n="3">

Rajah S5. Ekspresi C31 dan mengaktifkan P65 dalam buah pinggang yang dirawat NTS. (A) Perkadaran CD31-kapilari positif dalam kawasan peritubular. Tiga puluh kawasan peritubular dinilai setiap tetikus (NTS Cre–/ Rarres1flfl/flfl, n=4; NTS Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4). Ujian-t pelajar. (B) Pemarkahan separa kuantitatif bagi isyarat CD31 dalam glomeruli: 0=tiada isyarat, 1=isyarat lemah, 2=isyarat sederhana, 3 =isyarat kuat. Sepuluh glomeruli telah dinilai daripada setiap tetikus (NTS Cre –/Rarres1flfl/flfl, n =4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n= 4). Ujian-t pelajar. (C) Perwakilan dokumen Western blot dan data diringkaskan yang menunjukkan tahap protein relatif pP65 dalam korteks buah pinggang dalam kumpulan tikus yang dirawat NTS dan kawalan yang tidak dirawat (ctrl.) (ctrl., n=3; NTS-ctrl. , n=9; NTS-Rarres1_Tie2_KI, n=10). Data dinyatakan sebagai min ± SEM. Ujian-t pelajar digunakan untuk perbandingan antara 2 kumpulan.

RUJUKAN

1. Reidy K, Kang HM, Hostetter T, Susztak K. Mekanisme molekul penyakit buah pinggang diabetik. J Clin Invest. 2014;124:2333–2340.

2. Lai KN, Tang S, Schena F, et al. Nefropati IgA. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16001.

3. Lal MA, Patrakka J. Memahami biologi podocyte untuk membangunkan terapeutik buah pinggang baru. Endokrinol hadapan (Lausanne). 2018;9:409.

4. Ju W, Greene C, Eichinger F, et al. Mentakrifkan kekhususan jenis sel pada tahap transkrip dalam penyakit manusia. Genome Res. 2013;23:1862–1873.

5. Ju W, Nair V, Smith S, et al. Pengenalpastian faktor pertumbuhan epidermis yang didorong oleh transkrip tisu sebagai biomarker penyakit buah pinggang kronik. Sci Transl Med. 2015;7:316ra193.

6. Woroniecka KI, Park A, Mohtat T, et al. Analisis transkrip penyakit buah pinggang diabetes manusia. kencing manis. 2011;60:2354–2369.

7. Wiggins JE, Patel S, Shedden K, et al. NFkappaB menggalakkan keradangan, pembekuan, dan fifibrosis dalam glomerulus penuaan. J Am Soc Nephrol. 2010;21:587–597.

8. Prakoura N, Kavvadas P, Korman R, et al. Periostin yang disebabkan oleh NFkappaB mengaktifkan isyarat integrin-beta3 untuk menggalakkan kecederaan buah pinggang dalam GN. J Am Soc Nephrol. 2017;28:1475–1490.

9. Chang AS, Hathaway CK, Smithies O, Kakoki M. Mengubah faktor pertumbuhan-beta1 dan nefropati diabetik. Am J Physiol Fisiol Renal. 2016;310:F689–F696.

10. Mudge SJ, Paizis K, Auwardt RB, et al. Pengaktifan faktor nuklear-kappa B oleh podosit dalam fasa autologous nefritis Heymann pasif. Buah Pinggang Int. 2001;59:923–931.

11. Tomita T, Takano M, Tomita R, et al. Umpan faktor transkripsi untuk NFkappaB menghalang ekspresi molekul sitokin dan lekatan dalam sel sinovial yang diperoleh daripada arthritis rheumatoid. Rheumatologi (Oxford). 2000;39:749–757.

12. Zambrano S, Möller-Hackbarth K, Li X, et al. GPRC5b memodulasi tindak balas keradangan dalampenyakit glomerularmelalui laluan NF-kappaB. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1573–1586.

13. Choi M, Schreiber A, Eulenberg-Gustavus C, et al. Sekatan NF-kappaB endothelial membatalkan GN yang disebabkan oleh ANCA. J Am Soc Nephrol. 2017;28:3191–3204.

14. Zheng L, Sinniah R, Hsu SI. Ekspresi glomerular in situ NF-kappaB diaktifkan dalam nefritis lupus manusia dan satu lagi glomerulopati proteinurik bukan proliferatif. Gerbang Virchows. 2006;448:172–183.

15. Takemoto M, He L, Norlin J, et al. Pengenalpastian berskala besar gen yang terlibat dalam perkembangan dan fungsi glomerulus buah pinggang. EMBO J. 2006;25:1160–1174.

16. Saleem MA, O Hare M, Reiser J, et al. Barisan sel podosit manusia yang diabadikan secara bersyarat yang menunjukkan ekspresi nefrin dan podocin. J Am Soc Nephrol. 2002;13:630–638.

17. Kisanuki YY, Emoto N, Ohuchi T, et al. Tekanan darah rendah dalam endothelial sel-spesifik endothelin 1 tikus kalah mati. Hipertensi. 2010;56:121–128.

18. McAdoo SP, Pusey CD. Penyakit membran bawah tanah anti-glomerular. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12:1162–1172.

19. Qi XM, Wang J, Xu XX, et al. FK506 mengurangkan albuminuria melalui peningkatan nefrin podocyte dan ekspresi podocin dalam tikus diabetes. Inflamm Res. 2016;65:103–114.

20. Wang X, Saso H, Iwamoto T, et al. TIG1 menggalakkan perkembangan dan perkembangan kanser payudara yang meradang melalui pengaktifan Axl kinase. Kanser Re. 2013;73:6516–6525.

21. Holland SJ, Pan A, Franci C, et al. R428, perencat molekul kecil terpilih Axl kinase, menyekat penyebaran tumor dan memanjangkan kelangsungan hidup dalam model kanser payudara metastatik. Kanser Re. 2010;70:1544–1554.

22. Myers SH, Brunton VG, Uniti-Broceta A. perencat AXL dalam kanser: perspektif kimia perubatan. J Med Chem. 2016;59:3593–3608.

23. Salant DJ, Darby C, Couser WG. Eksperimen glomerulonefritis membran dalam tikus. Kajian kuantitatif pembentukan deposit imun glomerular dalam glomeruli terpencil dan seluruh haiwan. J Clin Invest. 1980;66:71–81.

24. Berthier CC, Bethunaickan R, Gonzales-Rivera D, et al. Analisis rangkaian transkrip silang spesies mentakrifkan tindak balas keradangan yang dikongsi dalam nefritis murine dan lupus manusia. J Immunol. 2012;189:988–1001.

25. Grayson P, Eddy S, Taroni J, et al. Laluan metabolik dan imunometabolisme dalam penyakit buah pinggang yang jarang berlaku. Ann Rheum Dis. 2018;77: 1226–1233.

26. Liu P, Lassen E, Nair V, et al. Pemprofilan transkriptomik dan proteomik memberikan gambaran tentang fungsi sel mesangial dalam nefropati IgA. J Am Soc Nephrol. 2017;28:2961–2972.

27. Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Pemilihan yang cekap untuk transfektan ekspresi tinggi dengan vektor eukariotik novel. gen. 1991;108:193–199.

28. Loefffler I, Wolf G. Peralihan epitelium-ke-mesenchymal dalam nefropati diabetik: fakta atau fiksyen? sel. 2015;4:631–652.

29. Nagpal S, Patel S, Asano A, et al. Gen 1 yang disebabkan oleh Tazarotene (TIG1), sebuah novelasid retinoikgen responsif reseptor dalam kulit. J Invest Dermatol. 1996;106:269–274.

30. Jing C, El-Ghany M, Beesley C, et al. Ekspresi gen 1 (TIG1) yang disebabkan oleh Tazarotene dalam karsinoma prostat dan hubungannya dengan tumorigenisiti. J Natl Cancer Inst. 2002;94:482–490.

31. Teufel A, Becker D, Weber SN, et al. Pengenalpastian RARRES1 sebagai pengawal selia teras dalam fibrosis hati. J Mol Med (Berl). 2012;90:1439–1447.

32. Chen A, Feng Y, Lai H, et al. RARRES1 yang larut mendorong apoptosis podosit untuk dipromosikanpenyakit glomerularperkembangan. J Clin Invest. 2020;130:5523–5535.

33. Zhen Y, Lee IJ, Finkelman FD, Shao WH. Perencatan sasaran Axl reseptor tyrosine kinase memperbaiki nefritis seperti lupus yang disebabkan oleh anti-GBM. J Autoimun. 2018;93:37–44.

34. Tang Y, Harrington A, Yang X, et al. Sumbangan keturunan Tie2þ kepada sel hematopoietik primitif dan definitif. Kejadian. 2010;48:563–567