Dalam Reka Bentuk Siliko Vaksin Multi-epitope Chimeric Promiscuous Terhadap Mycobacterium Tuberculosis Bahagian 1

Abstrak

Tuberkulosis (TB) adalah ancaman kesihatan global, membunuh kira-kira 1.5 juta orang setiap tahun. Pembasmian Mycobacterium tuberculosis, agen penyebab utama TB, semakin mencabar kerana kemunculan strain tahan dadah yang meluas. Vaksinasi dianggap sebagai cara yang berkesan untuk melindungi perumah daripada patogen, tetapi satu-satunya vaksin TB yang diluluskan secara klinikal, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), mempunyai perlindungan terhad pada orang dewasa. Vaksin berbilang epitope didapati meningkatkan imuniti terhadap penyakit dengan menggabungkan epitop secara terpilih daripada beberapa protein calon.

Batuk kering adalah penyakit berjangkit yang disebabkan oleh bakteria Mycobacterium tuberculosis yang kebanyakannya menjejaskan paru-paru tetapi juga boleh menjejaskan organ lain. Imuniti memainkan peranan penting dalam pembangunan dan rawatan TB.

Dalam kes imuniti yang tidak mencukupi, Mycobacterium tuberculosis dengan mudah boleh menyerang tubuh manusia dan berkembang menjadi tuberkulosis. Contohnya, sistem imun yang terjejas akibat penyakit atau rawatan perubatan tertentu meningkatkan risiko jangkitan TB. Di samping itu, faktor seperti kekurangan zat makanan, kualiti hidup yang buruk, dan tekanan yang berlebihan juga boleh melemahkan imuniti, yang membawa kepada perkembangan TB.

Oleh itu, mengekalkan kesihatan yang baik dan menguatkan imuniti adalah sangat penting untuk mencegah batuk kering. Imuniti boleh ditingkatkan melalui diet yang sihat, gaya hidup yang teratur, senaman yang betul, dan tidur yang cukup, yang secara berkesan dapat mengurangkan risiko dijangkiti pelbagai penyakit, termasuk batuk kering.

Kekebalan juga penting untuk rawatan dan pemulihan apabila TB telah berlaku. Lebih kuat sistem imun, lebih berkesan badan dapat mempertahankan dirinya daripada serangan bacillus TB dan menghasilkan antibodi yang cukup untuk melawan penyakit itu. Oleh itu, mengekalkan pemakanan yang mencukupi, senaman yang betul, dan sikap positif boleh meningkatkan imuniti dan menggalakkan pemulihan.

Kesimpulannya, terdapat hubungan yang kuat antara imuniti dan TB. Mengekalkan kesihatan yang baik dan meningkatkan imuniti adalah salah satu cara penting untuk mencegah dan merawat tuberkulosis. Marilah kita hadapi kehidupan secara positif, kekalkan gaya hidup sihat, dan jauhi penyakit. Dari sudut ini, kita perlu meningkatkan imuniti kita. Cistanche boleh meningkatkan imuniti dengan ketara, kerana abu daging mengandungi pelbagai komponen aktif secara biologi, seperti polisakarida, dua cendawan, Huang Li, dll. Komponen ini boleh merangsang sistem imun Pelbagai jenis sel dalam sistem, meningkatkan aktiviti imun mereka.

Klik manfaat kesihatan cistanche

Kajian ini bertujuan untuk mereka bentuk vaksin multi-epitope terhadap TB menggunakan pendekatan immuno-informatik. Melalui pengayaan berfungsi, kami mengenal pasti lapan protein yang dirembeskan oleh M. tuberculosis yang sama ada diperlukan untuk patogenesis, dirembeskan ke dalam ruang ekstraselular, atau kedua-duanya. Kami kemudian menganalisis epitop protein ini dan memilih 16 epitop limfosit T pembantu dengan aktiviti menginduksi interferon, 15 epitop limfosit T sitotoksik, dan 10 epitop Bcell linear, dan menggabungkannya dengan adjuvant dan Pan HLA DR-binding epitope (PADRE) menggunakan yang sesuai. penghubung.

Selain itu, kami meramalkan struktur tertier vaksin ini, potensi interaksinya dengan Reseptor Seperti Tol-4 (TLR4) dan tindak balas imun yang mungkin ditimbulkannya. Keputusan menunjukkan bahawa vaksin ini mempunyai pertalian yang kuat untuk TLR4, yang boleh merangsang dengan ketara sel CD4 plus dan CD8 plus untuk merembeskan faktor imun dan limfosit B untuk merembeskan imunoglobulin, untuk mendapatkan imuniti humoral dan selular yang baik. Secara keseluruhannya, protein berbilang epitope ini diramalkan stabil, selamat, sangat antigenik dan sangat imunogenik, yang berpotensi untuk berfungsi sebagai vaksin global terhadap TB.

1. Pengenalan

Tuberkulosis (TB), penyakit berjangkit yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis, disenaraikan oleh Pertubuhan Kesihatan Sedunia (WHO) sebagai penyebab utama kematian daripada satu agen berjangkit [1–3]. Pada tahun 2021, anggaran jumlah kematian TB dan kes baharu masing-masing mencecah 1.6 juta dan 10.6 juta [4]. Pada masa ini, rawatan klinikal TB agak terhad, dan gabungan pelbagai ubat antimikrob digunakan terutamanya.
Kitaran kemoterapi ini sangat panjang, biasanya mengambil masa sembilan hingga dua belas bulan, atau lebih lama lagi [5], yang meningkatkan risiko mutasi tahan dadah dalam M. tuberculosis [6,7]. Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, kemoterapi telah menjadi kurang berkesan kerana kemunculan dan peningkatan kadar M. tuberkulosis berbilang ubat dan tahan dadah secara meluas [6]. Mencegah TB daripada berkembang mungkin lebih berkesan daripada merawatnya. Vaksinasi terkenal sebagai cara yang berkesan untuk melindungi perumah daripada bakteria patogen [8].

Pada masa ini, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), yang dibangunkan lebih 100 tahun yang lalu, adalah satu-satunya vaksin TB yang diluluskan secara klinikal [9]. Malangnya, BCG hanya melindungi bayi baru lahir dan bayi dan sebahagian besarnya tidak berkesan terhadap remaja dan dewasa [2,10], walaupun WHO melaporkan bahawa 89 peratus daripada kes TB pada tahun 2021 adalah orang dewasa [4]. Oleh itu, terdapat keperluan mendesak untuk membangunkan vaksin anti-TB yang baru dan berkesan, terutamanya untuk remaja dan dewasa.

Pembangunan vaksin TB adalah rumit oleh pelbagai ciri mikobakteria, seperti jangkitan terpendam, kegigihan, dan pengelakan imun [11-13]. Vaksin TB yang ideal harus direka bentuk untuk menyasarkan protein/laluan yang bertanggungjawab terhadap sifat-sifat ini dalam M. tuberculosis dan dapat mendorong dengan cekap tindak balas imun pengantaraan sel CD4 dan CD8 ditambah T [14].

Selain itu, vaksin yang berkesan juga harus menyasarkan kompleks histokompatibiliti utama hos (MHC), yang sangat polimorfik [15]. Ciri-ciri ini mengemukakan keperluan yang sangat tinggi untuk fleksibiliti vaksin, yang jelas tidak dapat dicapai oleh satu protein semulajadi. Vaksin berbilang epitope, protein rekombinan yang terdiri daripada satu siri epitop bertindih (peptida) [16], ialah sejenis calon vaksin baharu yang mungkin menangani isu di atas.

Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, vaksin multi-epitope telah menarik banyak perhatian kerana kelebihan imuniti yang lebih tinggi dan alergenik yang lebih rendah daripada vaksin konvensional [17,18]. Pada masa ini, vaksin berbilang epitope telah direka terhadap banyak mikroorganisma patogen, termasuk Shigella spp. [19], virus penyakit kaki dan mulut [20], Helicobacter pylori [21,22], virus hepatitis B [23], Toxoplasma gondii [24], Leishmania infantum [25], virus Nipah [26], Onchocerca volvulus [27], Pseudomonas aeruginosa [28], dan virus leukosis [29].

Khususnya, kemunculan pandemik COVID-19 telah mengukuhkan aplikasi teknologi ini [16,30–32]. Bagi TB, beberapa vaksin berbilang epitope telah direka untuk menyasarkan TB yang aktif secara semula jadi [33-39] dan TB terpendam [40,41]. Antaranya, tiga calon vaksin telah direka bentuk dalam bentuk DNA [34,36,40], dan dua daripadanya memasukkan epitop ke dalam tulang belakang protein untuk menghasilkan vaksin rekombinan [34,36].

Perlu diingatkan bahawa protein calon untuk beberapa vaksin berbilang epitope di atas dipilih secara rawak, dan liputan populasi vaksin ini memerlukan kajian lanjut.

Selain itu, dua calon vaksin TB multi-epitope dengan liputan populasi yang luas telah direka, satu epitope dipilih daripada protein vesikel eksosom imunogenik dengan sifat patogenik [39], dan yang lain tidak menumpukan pada protein calon, tetapi secara langsung memilih yang sangat konservatif dan disahkan secara eksperimen. epitope daripada Pangkalan Data Epitop Imun (IEDB) [38]. Walau bagaimanapun, protein calon ini kekurangan pengayaan berfungsi, dan keupayaan calon vaksin untuk mendorong rembesan interferon- (IFN-) masih perlu dipertingkatkan.

Kajian terdahulu telah menyimpulkan bahawa pengoptimuman rasional epitope boleh dicapai dengan gabungan kapasiti mengikat MHC dan keupayaan epitope untuk bertindak balas dengan reseptor sel T [42]. Tambahan pula, mereka meramalkan bahawa vaksin dengan limfosit T sitotoksik (CTL) A1, A2, A3, A24, dan B7 mengikat epitop akan mempunyai liputan hampir 100 peratus dalam kumpulan etnik utama (kulit hitam, Asia, Hispanik dan Kaukasia).

Walau bagaimanapun, sehingga kini tiada pendekatan serupa untuk mereka bentuk vaksin TB. Dalam kajian ini, kami mereka bentuk vaksin TB multi-epitope yang sangat rambang menggunakan pelbagai ciri antigen bagi lapan protein yang diperkaya dengan fungsi. Calon vaksin chimeric mempunyai 15 epitop CTL, 16 epitop limfosit T pembantu (HTL) dengan sifat induksi IFN- -dan 10 epitop sel B linear. Analisis imuno-informatik menunjukkan bahawa calon vaksin ini 'merangkumi semua', menjadikannya batu asas yang berpotensi untuk mencapai 'Strategi The End TB'.

2. Bahan dan kaedah

2.1. Pemilihan protein dan pengambilan urutan

Untuk membina vaksin berbilang epitope terhadap TB, kami mula-mula memilih protein kompleks M. tuberkulosis, yang disimpan dalam pangkalan data IEDB [43] dan telah disahkan sebagai epitop pengikat MHC kelas I dan II. Urutan asid amino (struktur utama) protein daripada strain M. tuberculosis H37Rv diperoleh daripada pangkalan data UniProt [44]. Ramalan bebas penjajaran bagi antigen prospektif berdasarkan sifat fizikokimia diperoleh daripada pelayan VaxiJen 2.0 [45], yang menjalani transformasi automatik dan kovarian silang (ACC) urutan protein menjadi vektor seragam asid amino utama sifat, dengan ambang antigenicity ditetapkan pada 0.4 untuk setiap protein bakteria [45,46].

Anotasi fungsional protein dinilai menggunakan Pangkalan Data untuk Anotasi, Visualisasi, dan Penemuan Bersepadu (DAVID) 6.8 [47]. Protein yang dirahsiakan diperkayakan lagi menggunakan dua kategori: ruang ekstraselular dan patogenesis melalui pangkalan data DAVID dan BioCyc [48], masing-masing. Proteome Homo sapiens GRCh38.p13 telah dimuat turun dalam format FASTA daripada pangkalan data Pusat Maklumat Bioteknologi Kebangsaan (NCBI) [49]. BLASTp digunakan untuk meramalkan homologi (nilai E =1e-5) antara protein yang dirembes dan protein H. sapiens.

2.2. Ramalan epitop sel T

Ramalan dan pemilihan epitop adalah langkah penting dalam pembinaan vaksin berbilang epitop. Molekul MHC I mengikat peptida pendek (9–11 asid amino) kerana celah pengikat peptida molekul MHC I yang terdiri daripada rantai tunggal tertutup [50]. NetMHCpan yang boleh diakses secara bebas-4.1 [51] telah digunakan untuk ramalan epitop CTL, yang menggunakan NNAlign_MA untuk menjana kedudukan peratusan (kedudukan peratus) berdasarkan gabungan pertalian pengikatan MHC I dan ligan tercair .

"Peratus Kedudukan" urutan pertanyaan ditentukan dengan membandingkan skor ramalannya dengan taburan skor ramalan untuk MHC berkaitan yang dikira menggunakan set peptida asli yang dipilih secara rawak. Epitop dengan kedudukan peratus < 0.5 peratus dianggap sebagai pengikat kuat, manakala epitop dengan kedudukan peratus < 2 peratus dianggap sebagai pengikat lemah [51].

Walaupun sehingga 12 supertype MHC kelas I epitop boleh diramalkan pada pelayan, kami hanya menggunakan A1, A2, A3, A24 dan B7 kerana lima supertype ini meliputi 100 peratus daripada bangsa manusia utama [42] . Kami memilih pengikat yang kuat dan meramalkan antigeniknya menggunakan VaxiJen2.0 [45], kemudian, kami meramalkan imunogenisiti kelas I menggunakan Pangkalan Data Epitope Antarabangsa (IEDB) [52], yang menggunakan 3-pengesahan silang kali ganda.

Akhir sekali, kami menyusun epitop yang bersifat antigen dan imunogenik mengikut kedudukan peratus dan memilih 15 epitop berskor rendah, tiga untuk setiap superjenis dan sekurang-kurangnya satu untuk setiap protein calon, kecuali untuk protein calon yang tidak boleh mempunyai epitop pengikat CTL yang kuat iaitu antigenik dan imunogenik. Akhir sekali, nilai IC50 untuk setiap epitope CTL telah diramalkan daripada NetMHC-4.0 [53].
Molekul MHC kelas II mengikat peptida antigen, dan kompleks yang terhasil boleh dikenali oleh HTL. Lazimnya, panjang peptida antigen berkisar antara 12 hingga 20 residu asid amino, tetapi peptida antara 13 dan 16 residu panjangnya kerap diperhatikan [54].

{{0}}mer ialah epitop MHC II yang paling banyak untuk M. tuberculosis dan telah didepositkan dalam IEDB. Hasilnya, kami menggunakan NetMHCIIpan-4.0 [51,55] untuk meramalkan pengikatan 15-peptida mer kepada Human Leukocyte Antigen-DR (HLA-DR), HLADQ, HLA-DP, dan H-2–1 alel. Ramalan itu juga berdasarkan NNAlign_MA dengan kedudukan peratusan masing-masing < 2 peratus dan < 10 peratus dianggap sebagai pengikat kuat dan lemah [51].

Selain itu, kami meramalkan 15-epitop induksi IFN untuk protein calon menggunakan pelayan IFNepitope [56], yang menggunakan pendekatan hibrid mesin vektor sokongan yang membenarkan penyaringan maya IFN- -mendorong peptida/epitope dalam peptida perpustakaan yang terdiri daripada IFN- -pengikat MHC II boleh teraruh dan tidak teraruh yang mengaktifkan sel T-helper. Kami kemudiannya meramalkan antigenisiti epitop yang mendorong IFN [45], dan akhirnya, kami memilih 16 epitop yang paling rambang yang mengikat MHC-II yang kuat, mendorong IFN, dan antigenik.

Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa peptida isyarat telah dikeluarkan daripada protein calon sebelum ramalan epitope. Dalam kajian ini, peptida isyarat telah disaring menggunakan SignalP 5.0 [57] dan TargetP2.0 [58].

2.3. Ramalan epitope sel B linear

Epitop sel B linear (16-mer) telah diramalkan menggunakan ABCpred [59,60] dengan ambang lalai 0.51. Selain itu, untuk meningkatkan kebolehpercayaan hasil ramalan, kami turut menggunakan BepiPred 2.0 [61] untuk meramalkan epitop sel B linear. Epitope yang diperoleh daripada kedua-dua perisian ini selanjutnya tertakluk kepada ramalan antigenisiti menggunakan VaxiJen2.0 [45]. Akhirnya, kami memilih sepuluh epitop sel B linear berdasarkan skor ABCpred yang tinggi dan antigenisiti, dengan sekurang-kurangnya satu epitop dipilih untuk setiap protein calon.

2.4. Pembinaan calon vaksin berbilang epitope dengan sifat chimeric

Vaksin berbilang epitope yang direka bentuk mengandungi satu adjuvant HBHA (hemagglutinin pengikat heparin), satu epitop pengikat DR Pan HLA (PADRE), 15 CTL, 16 HTL, 10 epitop sel B linear, dan satu tag His× 6 (Gamb. 3). Penyambung digunakan untuk menyertai epitop, menghalang pengeluaran epitop persimpangan, dan meningkatkan perarakan dan penjanaan semula epitop individu dalam vaksin chimeric [62].

Untuk pembinaan calon vaksin ini, adjuvant HBHA (UniProt ID: P9WIP9) terletak di terminal-N dan dipautkan ke PADRE hiliran melalui penyambung EAAAK. Kemudian, epitop HTL yang disertai oleh pemaut GPGPG telah dipautkan kepada PADRE. Selain itu, epitop CTL yang disambungkan oleh pemaut AAY telah disambungkan kepada epitop HTL melalui pemaut HEYGAEALERAG, yang turut menyertai unit epitop CTL kepada epitop sel B linear yang dipautkan menggunakan pemaut KK. Akhirnya, tag His× 6 telah dilampirkan pada terminal-C protein chimeric.

2.5. Sifat antigen, alergenik dan fizikokimia

Antigenik bagi vaksin berbilang epitope dan lapan komponen protein telah diramalkan oleh pelayan VaxiJen 2.0 [45], manakala alergenik protein ini diramalkan oleh pelayan AllerTOP 2.0 [ 63]. AllerTOP 2.0 menggunakan E-deskriptor asid amino, transformasi ACC bagi jujukan protein dan jiran terdekat-k (kNN) untuk pengelasan alergen.

Kaedah ini mencapai ketepatan 85.3 peratus dengan 5-pengesahan silang kali ganda. Untuk ramalan sifat fizikokimia seperti separuh hayat, titik isoelektrik, indeks ketidakstabilan, indeks alifatik, dan purata besar hidropatik (GRAVY) bagi vaksin berbilang epitope ini, pelayan ExPASy ProtParam [64] telah digunakan.
Selanjutnya, keterlarutan peptida vaksin berbilang epitope dinilai menggunakan pelayan proteinSol (PROSO II) [65] berdasarkan pengelas yang mengeksploitasi perbezaan halus antara protein tidak larut yang terkenal daripada TargetDB dan protein larut daripada kedua-dua TargetDB dan PDB [ 66]. Apabila dinilai menggunakan 10-pengesahan silang kali ganda, ia mencapai ketepatan 71.0 peratus (kawasan di bawah lengkung ROC=0.785).

2.6. Simulasi imun

Untuk mencirikan profil tindak balas imun dan imunogenisiti vaksin, simulasi imun dalam silico dilakukan menggunakan pelayan C-ImmSim [67]. C-ImmSim meramalkan interaksi imun menggunakan matriks pemarkahan khusus kedudukan yang diperoleh daripada teknik pembelajaran mesin untuk ramalan peptida.
Ia serentak mensimulasikan tiga petak yang mewakili tiga kawasan anatomi berasingan yang terdapat dalam mamalia: (i) sumsum tulang, di mana sel stem hematopoietik telah disimulasikan untuk menghasilkan limfosit dan sel mieloid baharu; (ii) timus, di mana sel T naif dipilih untuk mengelakkan autoimun; dan (iii) organ limfa seperti nodus limfa.

Untuk memupuk dan meningkatkan vaksin dengan berkesan, kami mengikuti pendekatan [68] di mana dua suntikan diberikan selang empat minggu. Semua parameter simulasi telah ditetapkan kepada nilai lalai, dengan langkah masa ditetapkan kepada 10 dan 94 (setiap langkah masa ialah lapan jam).

2.7. Ramalan wilayah bercelaru

Kawasan bercelaru intrinsik (IDR) terdapat dalam banyak protein. Rantau bercelaru telah diramalkan menggunakan DISOPRED3 [69], yang menggunakan DISOPRED2 dan dua modul berasaskan pembelajaran mesin lain yang dilatih pada IDR besar untuk mengenal pasti sisa bercelaru. Mereka kemudian anno

2.8. Ramalan struktur sekunder dan tertiari

Struktur sekunder vaksin yang direka bentuk telah diramalkan oleh pelayan PSIPRED 4.0 [70], yang mula-mula menggunakan PSI-BLAST untuk mengenal pasti jujukan yang berkait rapat dengan protein pertanyaan. Struktur tertier vaksin ini telah diramalkan menggunakan pelayan Iterative Threading Assembly Refinement (I-TASSER) [71].

Terdapat empat langkah utama dalam pemodelan ITASSER; a) pengenalan templat threading; b) simulasi pemasangan struktur berulang; c) pemilihan dan penghalusan model; dan d) anotasi fungsi berasaskan struktur [72,73].

I-TASSER menjana lima model, yang telah disaring menggunakan ProSA-web [74], dan model dengan skor Z terendah telah dipilih untuk diperhalusi selanjutnya. ProSA-web membandingkan skor model yang diperoleh daripada struktur yang disahkan secara eksperimen yang disimpan dalam PDB. Plot skor kualiti tempatan membantu mengenal pasti kawasan bermasalah dalam model, dan skor yang sama diwakili menggunakan kod warna pada pembentangan struktur 3D. Ini berguna untuk penentuan dan penghalusan struktur awal.

2.9. Penapisan struktur tertier

Model 3D "kasar" calon vaksin yang diperoleh oleh ITASSER telah diperhalusi dalam dua langkah menggunakan dua pelayan; pertama dengan ModRefiner [75] diikuti oleh GalaxyRefine [76]. ModRefiner menggunakan jejak C untuk menjejaskan pembinaan dan penghalusan protein yang diperolehi dengan pengecilan tenaga tahap atom dua langkah.

Pertama, jejak C digunakan untuk membina rantai utama, diikuti dengan penghalusan pemutar rantai sisi dan atom tulang belakang menggunakan medan daya komposit berasaskan fizik dan pengetahuan. GalaxyRefine menggunakan berbilang templat untuk menjana struktur teras yang boleh dipercayai, manakala gelung atau terminal yang tidak boleh dipercayai dihasilkan oleh pemodelan berasaskan pengoptimuman.

2.10. Pengesahan struktur tertier

Struktur halus calon vaksin telah disahkan oleh plot Ramachandran yang dihasilkan daripada pangkalan data PROCHECK [77] dan MolProbity [78]. Plot Ramachandran menilai konformasi tulang belakang protein dengan membahagikan sisa asid amino kepada dua kawasan: dibenarkan dan tidak dibenarkan. PROCHECK menggunakan stereokimia untuk menilai kualiti bersih struktur protein dengan membandingkannya dengan struktur yang ditapis pada resolusi yang sama dan kemudian membentangkan kawasan yang memerlukan analisis lanjut.

Molprobity mengesahkan model makromolekul tempatan dan global (protein dan asid nukleik) dengan gabungan kriteria sinar-X, NMR, pengiraan dan cryoEM [79]. Kuasa dan kepekaan untuk mengoptimumkan peletakan hidrogen dan analisis sentuhan semua atom digunakan secara meluas dalam versi terkini geometri kovalen dan kriteria sudut kilasan [80].

2.11. Epitop sel B tidak selanjar

Epitop sel B yang tidak berterusan dalam struktur protein asli telah diramalkan menggunakan ElliPro [81]. ElliPro melaksanakan tiga algoritma untuk menganggarkan bentuk protein sebagai ellipsoid, mengira indeks tonjolan sisa (PI) dan mengelompokkan sisa jiran berdasarkan nilai PInya. ElliPro menyediakan setiap epitop keluaran dengan skor yang diterangkan sebagai nilai PI purata untuk sisa epitop. Ellipsoid dengan nilai PI 0.9 terdiri daripada 90 peratus daripada sisa protein yang terkandung, manakala baki 10 peratus sisa terletak di luar ellipsoid. Bagi setiap sisa epitope, nilai PI dikira dari pusat jisim sisa yang terletak di luar ellipsoid terbesar yang mungkin.

2.12. Docking molekul protein chimeric

Docking molekul vaksin (ligan) yang direka bentuk dengan Reseptor Serupa Toll-4 (TLR4) (ID PDB: 3FXI) telah dilakukan menggunakan Patchdock [82]. 10 model teratas kemudiannya diperhalusi menggunakan FireDock [83]. PatchDock menggantikan perwakilan permukaan titik Connolly bagi molekul dengan tompok cekung, cembung dan rata.

Model-model tersebut kemudiannya diberi markah berdasarkan padanan geometri dan penyahan atom. [82]. FireDock mengoptimumkan konformasi rantai sisi dan orientasi badan tegar dan menjana output kompleks 3D yang ditapis berdasarkan tenaga pengikat [83]. Kami memilih model pertama Firedock berdasarkan tenaga global sebagai kompleks dok. Akhirnya, kandungan tenaga pengikat dan pemisahan dalam kompleks dok telah diramalkan menggunakan pelayan PRODIGY [84].

2.13. Simulasi dinamik molekul

Simulasi dinamik molekul telah dilakukan pada protein menggunakan pelayan web yang pantas dan boleh diakses secara bebas, koordinat dalaman pelayan analisis mod biasa (iMODS) [85], dan keputusan dok yang konsisten dan optimum diperoleh daripada pelayan PatchDock-FireDock. Dalam koordinat dalaman, Analisis Mod Normal (NMA) menjana gerakan kolektif yang kritikal untuk fungsi makromolekul. iMODS membentangkan mekanisme untuk meneroka mod ini sebagai analisis getaran, animasi gerakan, dan trajektori morphing yang dijalankan hampir secara interaktif pada resolusi yang berbeza [85].

2.14. Terjemahan songsang, pengoptimuman kodon, dan pengklonan dalam siliko vaksin

Untuk mengekspresikan calon vaksin dalam sel Escherichia coli dengan berkesan, cDNA dijana dalam silico melalui pengoptimuman kodon dan terjemahan terbalik menggunakan Alat Penyesuaian Kodon Java (JCAT) [86].

Pengoptimuman yang terlibat (i) mengelakkan penamat transkripsi bebas rho, ii) mengelakkan tapak pengikatan ribosom prokariotik, (iii) mengelakkan tapak belahan enzim sekatan NcoI dan XhoI, yang berfungsi sebagai tapak sekatan terminal-N dan terminal-C untuk memasukkan cDNA templat vaksin, dan (iv) hanya pengoptimuman separa untuk menggunakan mutagenesis terarah tapak. Indeks Adaptasi Kodon (CAI) dan kandungan GC meramalkan kualiti cDNA dengan kodon hentian opal (TGA) yang dimasukkan selepas tag His× 6. Kemudian, serpihan DNA yang dioptimumkan bagi calon vaksin chimeric telah disepadukan ke dalam helai terbalik pET-28a( tambah ) menggunakan alat SnapGene [87].

For more information:1950477648nn@gmail.com