Selain Aktiviti Menggalakkan Jangka Hayat MET dalam Pelbagai Model Organisma

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

PENGENALAN

Sel epitelium kanta (LEC) membentuk satu lapisan sel yang melapisi kapsul anterior kanta dan memanjang ke haluan kanta khatulistiwa [1, 2]. Pembinaan dan fungsi normal LEC adalah penting untuk mengekalkan ketelusan dan homeostasis metabolik keseluruhan kanta[3]. Bukti yang semakin meningkat menunjukkan bahawa penuaan LEC boleh menyebabkan pengubahsuaian, denaturasi dan pengagregatan protein kanta termasuk enzim dan kristal, dengan itu akhirnya membawa kepada kelegapan kanta atau malah katarak [3-5]. Katarak berkaitan usia (ARC) kekal sebagai punca utama kecacatan penglihatan dan buta, yang menjejaskan kualiti hidup individu yang lebih tua [6]. Pada masa ini, tiada strategi berkesan untuk mencegah perkembangan ARC. Oleh itu, adalah perlu untuk membangunkan campur tangan farmakologi yang boleh meningkatkan ketelusan kanta dan melambatkan perkembangan ARC.

Sejak beberapa dekad yang lalu, saintis telah mencapai kemajuan yang luar biasa dalam meningkatkan kesihatan dan memanjangkan jangka hayat menggunakan beberapa intervensi genetik, pemakanan dan farmakologi [7]. Metformin (MET) adalah salah satu agen anti-penuaan yang dikaji secara meluas. Kajian besar mencadangkan bahawa MET boleh mengurangkan penuaan dan memanjangkan jangka hayat yang sihat dalam pelbagai sistem model haiwan. MET bukan sahaja boleh memanjangkan jangka hayat Caenorhabditis elegans tetapi juga meningkatkan kesihatan dan kecergasannya [8]. MET boleh mengurangkan pengumpulan kerosakan DNA yang berkaitan dengan usia dan tekanan oksidatif dalam sel stem Drosophila midgut untuk memanjangkan jangka hayat mereka [9]. Kajian terdahulu juga menunjukkan bahawa pentadbiran MET dos rendah kronik meningkatkan kesihatan dan jangka hayat tikus [10]. Selain itu, bukti yang muncul menunjukkan bahawa apabila pesakit diabetes dirawat dengan MET, mereka menunjukkan manfaat kelangsungan hidup, walaupun jika dibandingkan dengan kawalan yang tidak menghidap diabetes [11].

KSL09

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Sebagai tambahan kepada aktiviti penggalakan jangka hayat MET dalam pelbagai organisma model, MET menyasarkan berbilang laluan isyarat selular untuk memperbaiki penyakit berkaitan usia. MET telah ditunjukkan untuk memodulasi autophagy terutamanya melalui pengaktifan protein kinase (AMPK) diaktifkan adenosine monophosphate (AMP) dan mencegah neurodegeneration dan neuroinflammation untuk memainkan peranan neuroprotektif dalam penyakit Parkinson [12]. Begitu juga, MET memperbaiki perubahan berkaitan usia dalam sel endothelial sinusoidal hati melalui laluan AMPK dan nitrik oksida endothelial [13].dos cistanche redditSelain itu, pengaktifan AMPK kronik oleh MET menghalang kardiomiopati dengan mengawal autophagy dalam tikus OVE26 dengan diabetes [14]. Di samping itu, MET mengurangkan kemerosotan kardiovaskular yang berkaitan dengan usia dengan meningkatkan autophagy dan sekatan kalori [15]. Tambahan pula, rawatan MET boleh menghalang aterosklerosis yang berkaitan dengan usia dalam ApoE-7-tikus dan arnab yang disebabkan oleh diet tinggi lemak, dengan ketara menghalang kalsifikasi plak aterosklerotik, mengurangkan tahap protein C-reaktif sensitiviti tinggi dan menekan pengaktifan laluan faktor nuklear kappa B(NF-kB) dalam saluran darah [16-18].

Berdasarkan pemerhatian ini, kajian ini cuba meneroka sama ada MET boleh melambatkan penuaan ARC dan mekanisme molekul yang mendasari. Penemuan kami adalah seperti berikut:(i) rawatan MET dos rendah kronik melambatkan penuaan LEC dalam tikus yang berumur secara semula jadi, dengan itu menghalang kelegapan kanta;(i) laluan AMPK dinyahaktifkan, dan fluks autofagik telah terjejas dalam LEC tua;(i ) rawatan MET dos rendah kronik melambatkan penuaan LEC dalam tikus yang berumur secara semula jadi dengan mengaktifkan laluan AMPK dan meningkatkan autophagy. Penemuan kami menyokong peranan anti-penuaan MET dan memberikan bukti yang mencukupi bahawa MET mungkin terbukti menjadi pilihan terapeutik yang mungkin untuk ARC.

KEPUTUSAN

Senescence LEC dikaitkan dengan ARC pada tikus yang berumur secara semula jadi

Pelbagai mekanisme potensi ARC, termasuk kesan penuaan, telah disiasat secara meluas.faedah ekstrak cistanche,Walau bagaimanapun, hubungan antara penuaan LEC dan ARC dalam vivo masih tidak jelas. Kami membuat hipotesis bahawa penuaan LEC boleh mengakibatkan ARC in vivo. Oleh itu, kami membina model tetikus ARC. Keputusan kami mendedahkan bahawa ketelusan kanta dalam tikus yang berumur secara semula jadi (tikus yang lebih tua) telah menurun dengan ketara berbanding dengan yang dalam kumpulan kawalan (tikus muda) (Rajah 1a). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah.1b, kejadian katarak dalam kumpulan umur semulajadi ialah 95.23 peratus. Ujian pewarnaan H&E menunjukkan bahawa LEC dalam kumpulan kawalan adalah berbentuk bulat dan disusun secara teratur, dan ketumpatan LEC biasa adalah agak tinggi, manakala LEC tikus yang berumur secara semula jadi berbentuk rata dan disusun tidak sekata, dan ketumpatan LEC senescent telah berkurangan dengan ketara (Rajah 1c). Selain itu, pewarnaan SA- -Gal menunjukkan bahawa nisbah LEC tua telah dinaikkan dalam tikus yang berumur secara semula jadi (Rajah 1d). Tambahan pula, kami menganalisis ekspresi protein penanda yang berkaitan dengan penuaan melalui pewarnaan IHC dan analisis blot barat. Pewarnaan IHC mendedahkan bahawa ekspresi p21 dan p53 telah meningkat dalam LEC tikus yang berumur secara semula jadi berbanding dengan tikus muda (Rajah 1e, f). Begitu juga, kami selanjutnya mendapati bahawa ekspresi protein p21 dan p53 adalah lebih tinggi dalam kapsul kanta tikus tua secara semula jadi berbanding kapsul kanta tikus muda (Rajah 1g). Keputusan ini mencadangkan bahawa penuaan LEC dikaitkan dengan ARC pada tikus yang berumur secara semula jadi.

KSL10

Cistanche boleh anti-penuaan

Pentadbiran MET dos rendah kronik meningkatkan ketelusan kanta dan mengurangkan penuaan LEC Sebelum kami menguji kesan metformin pada ARC, kami menentukan sama ada pentadbiran MET dos rendah kronik selamat untuk tikus. Selepas rawatan MET selama 10 bulan, 28 tikus (18 dalam kumpulan tua secara semula jadi dan 10 dalam kumpulan MET) mati kerana sebab semula jadi. Kami mendapati bahawa tikus hidup dalam kedua-dua kumpulan adalah sihat, dan tidak terdapat perbezaan yang signifikan dalam berat badan dan berat organ antara kedua-dua kumpulan (Jadual 1). Oleh itu, keputusan ini menunjukkan bahawa dos metformin yang digunakan dalam kajian adalah selamat untuk haiwan dan boleh digunakan untuk eksperimen seterusnya.

Selepas itu, MET dos rendah kronik telah diberikan untuk menilai sama ada MET boleh menghalang kelegapan kanta dan melegakan penuaan LEC yang berkaitan dengan usia dalam tikus tua secara semula jadi. Seperti yang dijangkakan, ketelusan kanta dalam kumpulan MET telah bertambah baik berbanding dengan ketelusan kanta dalam kumpulan berumur semula jadi (Rajah 2a). Di samping itu, pemerhatian morfologi mengesahkan bahawa kanta kumpulan MET menunjukkan pengurangan kelegapan. Insiden katarak dalam kumpulan umur semulajadi ialah 95.23 peratus , manakala dalam kumpulan MET ialah 19.00 peratus (Rajah.2b). Ujian pewarnaan H&E mendedahkan bahawa ketumpatan LEC dalam kumpulan MET adalah lebih tinggi. berbanding tikus yang berumur secara semula jadi (Rajah 2c). Lebih-lebih lagi, LEC kumpulan MET mempunyai bentuk yang agak bulat berbanding dengan kumpulan berumur semula jadi (Rajah 2c). SA- -Pewarnaan gal menunjukkan bahawa nisbah LEC senescent telah menurun dengan ketara dalam kumpulan MET berbanding dengan dalam kumpulan tua secara semula jadi (Gamb.2d). Analisis IHC mendedahkan bahawa ekspresi p21 dan p53 telah menurun lebih banyak dalam LEC kumpulan MET berbanding kumpulan tua secara semula jadi (Rajah 2e, f). Begitu juga, analisis western blot mendedahkan bahawa ekspresi protein p21 dan p53 telah berkurangan dengan ketara dalam kapsul kanta kumpulan MET berbanding dengan kumpulan yang berumur semula jadi (Rajah 2g). Keputusan ini menandakan bahawa pentadbiran MET dos rendah kronik boleh meningkatkan ketelusan kanta dan mengurangkan penuaan LEC.

KSL11

Pentadbiran MET dos rendah kronik melemahkan penuaan LEC dalam tikus yang berumur secara semula jadi melalui pengaktifan AMPK Sejumlah besar data menyokong kesimpulan bahawa mengaktifkan AMPK adalah mencukupi untuk memanjangkan jangka hayat dalam organisma model, meningkatkan daya tarikannya sebagai sasaran jangka hayat [19,20] . Memandangkan teori ini, kami menilai ekspresi laluan AMPK dalam LEC tikus. Tahap mRNA FAS relatif telah dikurangkan dalam kumpulan tua secara semula jadi dan meningkat dalam kumpulan MET (Rajah 3a). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah.3b, c, ekspresi AMPKa terfosforilasi (Thr172) dan ACC terfosforilasi (Ser79) telah dikurangkan dalam LEC tikus yang berumur secara semula jadi berbanding dengan tikus muda. Walau bagaimanapun, ekspresi AMPKa terfosforilasi (Thr172) dan ACC terfosforilasi (Ser79) telah dinaikkan dalam LEC kumpulan MET berbanding dengan kumpulan umur semulajadi. Di samping itu, analisis western blot mendedahkan bahawa ekspresi protein AMPKa terfosforilasi (Thr172) dan ACC terfosforilasi (Ser79) telah dikurangkan dengan ketara dalam kapsul kanta orang tua secara semula jadi, dan tahap ekspresi protein AMPKa terfosforilasi (Thr172) dan ACC terfosforilasi ( Ser79) telah meningkat dalam kapsul kanta Kumpulan MET (Rajah 3d). Data ini mendedahkan bahawa laluan AMPK telah dinyahaktifkan dalam LEC tikus yang berumur secara semula jadi. Tambahan pula, pentadbiran MET dos rendah kronik melemahkan penuaan LEC dalam tikus yang berumur secara semula jadi melalui pengaktifan AMPK.

Pentadbiran MET dos rendah kronik memulihkan fluks autofagik untuk mengurangkan penuaan LEC pada tikus yang berumur secara semula jadi Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa autophagy mungkin memainkan peranan penting dalam memerangi kesan buruk penuaan [21,22]. Untuk menganalisis lebih lanjut perubahan molekul dan selular dalam kanta selepas rawatan MET, kami menentukan ungkapan LC3 dan p62 kerana ia diterima secara meluas sebagai biomarker tahap autophagy. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4a, paras ekspresi mRNA p62 relatif meningkat dengan ketara dalam kumpulan tua secara semula jadi berbanding dengan kumpulan kawalan; walau bagaimanapun, tahap ekspresi mRNA relatif p62 telah dikawal selia dengan ketara dalam kumpulan MET berbanding dengan kumpulan yang berumur secara semula jadi.cistanche genghis khanDi samping itu, pewarnaan IHC mendedahkan bahawa tahap protein 1 rantai ringan 3(LC3-}L) dan p62 yang berkaitan dengan mikrotubule telah meningkat dalam LEC tikus yang berumur secara semula jadi. Tambahan pula, keputusan kami menggambarkan bahawa tahap LC3-II/l dan p62 telah menurun dengan ketara dalam LEC Kumpulan MET (Rajah 4b, c). Tahap protein LC3-ll dan p62 telah meningkat dengan ketara dalam kapsul kanta kumpulan tua secara semula jadi (Rajah 4d). Secara keseluruhannya, kami membuat spekulasi bahawa fluks autofagik telah terjejas dalam LEC tikus yang berumur semula jadi dan boleh dipulihkan oleh pentadbiran MET dos rendah kronik untuk mengurangkan penuaan LEC dalam tikus yang berumur secara semula jadi.

PERBINCANGAN

Katarak yang tidak dirawat adalah penyebab utama kebutaan di seluruh dunia yang dicirikan oleh kelegapan kanta kristal [23]. Kajian epidemiologi telah menunjukkan bahawa usia adalah faktor risiko dominan untuk katarak, yang dikenali sebagai ARC, dan satu-satunya rawatan adalah pembuangan pembedahan [24]. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa penuaan LEC adalah punca utama ARC [25]. Sehingga kini, tiada agen terapeutik yang berkesan untuk menghalang kekeruhan kanta dan melemahkan penuaan LEC tanpa kesan sampingan yang tidak diingini. Tumpuan kajian ini adalah untuk menilai asas biologi molekul untuk penuaan LEC dan mekanisme melindungi LEC biasa daripada penuaan. Keputusan kami mendedahkan bahawa ketidakaktifan AMPK dan kemerosotan autophagy dikaitkan dengan penuaan LEC dan ARC. Tambahan pula, kami mendapati bahawa MET mungkin melindungi LEC daripada penuaan dan menghalang kekeruhan kanta dengan mengaktifkan AMPK dan meningkatkan autophagy.

Senescence adalah proses biologi asas yang disertai dengan penurunan umum dalam fungsi tisu. Apabila jangka hayat meningkat, disfungsi berkaitan usia seperti ARC menjadi kesihatan yang serius

isu [26]. Senescence LECs telah dilaporkan terlibat dalam kejadian dan pembangunan ARC [5]. Keputusan kami mendedahkan bahawa LEC tikus yang berumur secara semula jadi adalah berbentuk rata dan disusun tidak sekata, dan ketumpatan LEC menurun dengan ketara (Rajah 1c, d). Di samping itu, ekspresi gen yang berkaitan dengan penuaan (p21 dan p53) telah dikawal selia dalam LEC tikus yang berumur secara semula jadi (Rajah 1e, f, g). Keputusan kami menunjukkan bahawa penuaan LEC dikaitkan dengan kejadian dan perkembangan ARC. Oleh itu, pemahaman yang tepat tentang mekanisme molekul yang mendasari penuaan LEC mungkin diperlukan untuk menyediakan rasional untuk strategi rawatan baharu.

MET ialah ubat hipoglisemik oral yang paling banyak ditetapkan untuk diabetes jenis 2 di seluruh dunia. Bukti yang muncul menunjukkan bahawa MET mempunyai kesan yang baik terhadap kesihatan melebihi yang dikaitkan dengan peningkatan dalam glikemia [27]. Telah disahkan bahawa mekanisme MET adalah penting untuk menyasarkan laluan asas dalam penuaan biologi, seperti mengaktifkan AMPK, menambah autophagy, menghalang keradangan, dan memberikan kesan anti-oksidatif [28]. Pada manusia, MET telah digunakan dalam amalan klinikal selama lebih daripada 60 tahun; ia mempunyai profil keselamatan yang tinggi dan mempunyai kedudukan unik untuk campur tangan dalam beberapa laluan penting yang bertanggungjawab untuk penuaan dan penyakit berkaitan usia. Walau bagaimanapun, kesan MET pada ARC dan mekanisme pengawalseliaan kesan tersebut tidak pernah dilaporkan. Akibatnya, dalam kajian kami, pentadbiran MET dos rendah kronik dalam tikus tua secara semula jadi meningkatkan ketelusan kanta (Rajah 2a) dan melemahkan penuaan LEC dalam vivo (Rajah 2).

KSL12

Secara meluas diakui bahawa MET mengaktifkan laluan AMPK yang merupakan mekanisme potensi MET untuk memberikan kesan anti-penuaan [29]. AMPK, sensor tenaga selular, memainkan peranan penting dalam mengawal keseimbangan tenaga selular [30]. Beberapa kajian telah menggambarkan bahawa AMPK berfungsi sebagai penyepadu dan pengantara beberapa laluan dan proses yang mengaitkan energetik dengan umur panjang. Dalam kajian kami, kami mendapati bahawa penyahaktifan AMPK adalah ciri LEC senescent dalam tikus yang berumur secara semula jadi (Rajah 3). Selepas itu, MET ditunjukkan untuk merangsang laluan AMPK untuk menghalang penuaan LEC (Rajah 3). Sebagai pengaktif AMPK yang ditubuhkan, peranan MET dalam pencegahan penuaan biasanya dikaitkan dengan kesannya pada memodulasi laluan isyarat hiliran, seperti pemulihan autophagy, pengaktifan Sirt1 dan Foxo1 dan penindasan mTOR [31,32]. Kajian kami menyediakan barisan bukti baharu yang menekankan kepentingan fungsi AMPK yang diaktifkan oleh MET dalam mencegah kejadian ARC.

Seperti yang dinyatakan di atas, AMPK berkomunikasi dengan banyak laluan dan protein untuk memberikan kesan anti-penuaan, termasuk pembesaran autophagy. Autophagy, yang muncul sebagai proses teras untuk jaminan umur panjang, telah menarik minat yang meluas sebagai sasaran terapeutik yang berpotensi untuk penyakit berkaitan usia. Autophagy adalah cecair, proses biologi kompleks pelbagai langkah. Proses lengkap autophagy dipanggil fluks autofagik, yang digunakan secara meluas untuk mencerminkan tahap autophagy. Sebagai penunjuk autophagy, LC3-Il terikat rapat pada membran autofagosom yang didegradasi oleh enzim lisosom.lanjutan hayat cistancheBegitu juga, p62, substrat khusus autophagy, biasanya terdegradasi dalam autophagolysosome, dan ekspresinya secara tidak langsung mencerminkan tahap autophagy. Dalam kajian ini, penemuan kami menunjukkan bahawa tahap autophagy menurun dengan jelas dalam LEC senescent (Rajah 4), manakala MET membalikkan kemerosotan autophagy yang berkaitan dengan usia (Rajah 4). Mekanisme molekul anti-penuaan MET dikaitkan dengan fungsi utama AMPK dalam sel kerana ia secara amnya meningkatkan autophagy melalui pengaktifan AMPK [33]. Selain itu, MET ditunjukkan untuk menambah autophagy secara langsung, dengan itu menyumbang kepada pencegahan penuaan [34]. Walau bagaimanapun, kajian yang lebih terperinci diperlukan untuk menjelaskan mekanisme asas, membuktikan bahawa MET menambah autophagy melalui laluan AMPK bebas atau bergantung.

Telah ditunjukkan bahawa kelaziman ARC tidak dikaitkan dengan jantina dalam populasi yang berasal dari Asia [35, 36]. Oleh itu, kami tidak menganggap seks sebagai faktor yang boleh menjejaskan ARC. Kajian kami harus ditafsirkan dengan mengambil kira batasan yang disebutkan di atas.

KESIMPULAN

Ringkasnya, kami membuktikan bahawa ketidakaktifan laluan AMPK dan kemerosotan autophagy yang berkaitan dengan usia mungkin menyumbang kepada penuaan LEC dan kejadian ARC. Di samping itu, data daripada eksperimen kami mendedahkan bahawa MET secara berkesan menangguhkan penuaan LEC dan pembentukan ARC melalui pengaktifan laluan AMPK dan penambahan autophagy. Penemuan kami adalah garis asas untuk penyiasatan lanjut mengenai mekanisme molekul yang berguna dalam peranan MET semasa proses penuaan ARC dan akan menjadi bermaklumat untuk kajian yang lebih intensif mengenai pembangunan strategi baharu terhadap kejadian dan perkembangan ARC.

BAHAN DAN KAEDAH Reagen

MET telah dibeli daripada Syarikat Bristol-Myers Squibb(China). Antibodi terhadap p21 (ab188224), p53 (ab131442), AMPKa(p-AMPK) berfosforilasi(Thr172)(ab133448), AMPKa1(ab32047), -actin (ab8226) dan SQSTM1/p62 (3340-1)diperolehi daripada Abcam(MA, USA).Antibodi terhadap LC3 (12741)dan fosfo-asetil CoA karboksilase (p-ACC)(Ser79)(3661)dibeli daripada Teknologi Isyarat Sel ( MA, Amerika Syarikat).

Haiwan dan rawatan

Tikus jantan C57BL6J yang berumur 3 dan 8 bulan telah dibeli daripada Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd.(Beijing, China). Tikus ditempatkan dalam keadaan terkawal suhu (suhu, 20-25 darjah dan kelembapan relatif, 55±15 peratus ) dengan kitaran cahaya/gelap 12 jam, dengan akses percuma kepada makanan dan air. Semua prosedur dan protokol yang dijalankan ke atas haiwan telah diluluskan oleh jawatankuasa etika Universiti Perubatan Harbin.

Tikus dibahagikan kepada tiga kumpulan berikut:(i) kumpulan kawalan yang mempunyai tikus muda (3 bulan, berat badan=29.72± 1.66 g, n =40)menerima diet dan air tetikus tulen standard ad libitum; Apabila tikus berumur 10 bulan, 120 tikus dibahagikan secara rawak kepada dua kumpulan: kumpulan umur semulajadi dan kumpulan MET. (i) kumpulan tua semula jadi (tikus tua, 20 bulan, berat badan=32.98±1.93g, n=60) menerima diet tikus tulen standard dan air ad libitum;(ii)kumpulan MET ( Berumur 20 bulan, berat badan=31.21±2.81 g,n=60)dikekalkan mengikut diet dan air tetikus tulen standard sehingga tikus mencapai umur 10 bulan; selepas itu, rawatan dimulakan. Tikus dalam kumpulan MET diberi makanan yang ditambah dengan 0.1 peratus MET (Bristol Myers Squibb, China) dan air secara percuma selama 10 bulan.

pengasingan kanta dan kapsul kanta

Tikus-tikus telah disingkirkan melalui terkehel serviks. Seluruh mata dipotong serta-merta dari semua haiwan eksperimen dan diletakkan dalam garam steril. Saraf optik diletakkan ke atas dan diperbaiki dengan pinset. Insisi kemudian dibuat pada saraf optik yang memasuki mata, dan sklera ditarik ke belakang untuk mendedahkan kanta.cistanche nzSelepas itu, kami menggunakan pinset untuk mengeluarkan perlahan-lahan serpihan badan ciliary yang melekat pada satah khatulistiwa kanta. Foto kanta segar telah diambil serta-merta, dan kanta itu dibetulkan dengan cepat dengan 4 peratus paraformaldehid pada suhu bilik. Keseluruhan kapsul kanta telah dikupas dengan cepat daripada kanta yang tinggal, dibekukan dalam nitrogen cecair, dan disimpan pada 80 darjah C untuk eksperimen seterusnya.

Haematoxylin dan eosin (H&E)

Kanta segar segera dibetulkan dengan 4 peratus paraformaldehid pada suhu bilik dan dibenamkan dalam parafin. Untuk pemeriksaan histologi, tisu dipotong menjadi kepingan 4-μm. Selepas penyahparafinan dan penghidratan semula, bahagian parafin yang disediakan telah diwarnakan dengan larutan hematoksilin (H) selama 8 minit, diikuti dengan 5 celupan dalam 1 peratus etanol asid (1 peratus HCI dalam 70 peratus etanol)

dan bilas dengan air suling. Selepas itu, bahagian tersebut diwarnai dengan larutan eosin (E) selama 3 minit, diikuti dengan dehidrasi dengan alkohol gred dan pembersihan dengan xilena. Perubahan morfologi diperhatikan di bawah mikroskop (Nikon, Eclipse, Jepun).

Ujian -galactosidase berkaitan senescence (SA- -Gal) Aktiviti -galactosidase (SA- -}Gal) berkaitan senescence diukur dengan menggunakan kit pewarnaan SA- -Gal (Sigma, CS{ {12}}030). Mengikut arahan pengilang, bahagian tisu, selepas beberapa siri rawatan, dibasuh dengan garam penimbal fosfat(PBS) selama 5 minit (tiga kali) dan kemudian diinkubasi dalam larutan pewarna SA- -gal (pH 6.0) pada 37 darjah tanpa CO2 selama 24 jam. Imej-imej itu ditangkap di bawah mikroskop cahaya (Nikon, Eclipse, Jepun). Peratusan sel SA- -positif dianggarkan sebagai purata bilangan sel positif/min bilangan jumlah sel.

Tindak balas rantai polimerase masa nyata kuantitatif (gRT-PCR)Jumlah RNA daripada kapsul kanta tikus telah diekstrak menggunakan reagen TRlzol. Transkripsi terbalik dilakukan dengan Kit Reagen ExScript RT (Invitrogen). Analisis tindak balas rantai transkripsi-polimerase terbalik kuantitatif (qRT-PCR) dilakukan menggunakan SYBR Green Supermix

kit (Takara, Tokyo, Jepun), dengan -actin sebagai kawalan endogen. Transkripsi telah disiasat untuk beberapa gen sasaran, termasuk FAS (ke hadapan, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3'dan terbalik,5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3'), p62 (ke hadapan,5'-GGCGCACTACCGCGATGAGGA{{ 10}} dan terbalik,5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') dan -actin (ke hadapan, 5 '-TCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3'dan terbalik,5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG-3'. Relatif tahap setiap ekspresi gen adalah

kaedah. dinormalkan kepada -aktin dan dikira menggunakan pewarnaan 2-△△ct r Immunohistochemical (IHC)Sebanyak 5 bahagian yang mewakili setiap satu daripada 10 kanta terpilih bagi setiap kumpulan telah digunakan untuk analisis imunohistokimia (IHC) untuk menilai ungkapan p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3 dan p62. Selepas sampel yang disediakan diinkubasi pada 6{17}} darjah selama 2 jam, ia disalurkan melalui xilena dan siri alkohol gred untuk penyahparafinan. Selepas itu, sampel telah direbus dalam 0.1 M asid sitrik (pH 6.1) selama 30 minit dan disejukkan ke suhu bilik. Selepas mencuci tiga kali dengan PBS, sampel direndam dengan 0.3 peratus H O, untuk menghalang aktiviti peroksidase endogen. Selepas itu, antibodi primer ditambah dan disejukkan pada 4 darjah C, semalaman. Antibodi sekunder yang sepadan telah diinkubasi selama 1 jam pada 37 darjah C. Selepas mencuci dengan PBS, sampel diinkubasi dalam diaminobenzidine (DAB) sehingga intensiti noda yang dikehendaki berkembang. Imej sel imunostain telah ditangkap menggunakan mikroskop Nikon Eclipse (Nikon, Eclipse, Jepun).

Analisis Western blot

Jumlah protein daripada kapsul kanta tikus telah diekstrak menggunakan penimbal radio-immunoprecipitation assay (RIPA) dengan koktel perencat protease (Pierce, USA), dan kit asid bicinchoninic (BCA) (Thermo Fisher Scientific, USA) digunakan untuk mengukur kepekatan protein. . Jumlah protein （40 ug） telah dianalisis menggunakan elektroforesis gel sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) dan dipindahkan secara elektroforesis ke membran penapis polyvinylidene difluoride (PVDF) (Millipore, Jerman). Membran diinkubasi semalaman dengan antibodi primer pada 4 darjah C. Keesokan harinya, membran diinkubasi dengan antibodi sekunder yang sepadan selama 1 jam pada 37 darjah C. Jalur imunoreaktif telah divisualisasikan menggunakan kaedah substrat chemiluminescent dengan Super Signal West Pico. kit (Pierce Biotechnology, USA). Tiga eksperimen bebas telah dilakukan.

Analisis statistik

Data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai (SD). Analisis statistik telah dijalankan menggunakan perisian GraphPad Prism 7.0 dan Microsoft Excel. Protein dikira menggunakan perisian Image J. Ujian-t Pelajar dan analisis varians (ANOVA) digunakan untuk mengira kepentingan statistik data eksperimen. Perbezaan dengan nilai P<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">