Pemprofilan Komprehensif Formulasi Rembesan Daripada Sel Stem Cecair Amniotik Manusia Janin dan Perinatal Bahagian 1

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

Abstrak:Kami sebelum ini melaporkan bahawa sel stem terhasil daripada cecair amniotik c-KIT ditambah htaman yang diperoleh daripada sampel sisa diagnosis pranatal trimester Ⅱ rutin (hAFS janin) dikurniakan potensi paracrine regeneratif yang memacu kesan pro-survival, anti-fibrotik dan proliferatif. mungkin juga diasingkan daripada sampel sisa klinikal trimester III semasa bahagian C yang dijadualkan (hAFS perinatal), sekali gus menawarkan alternatif yang lebih mudah diakses jika dibandingkan dengan hAFS janin. Walau bagaimanapun, sedikit yang diketahui tentang profil paracrine hAFS perinatal. Di sini kami menyediakan pencirian terperinci bagi jumlah rembesan hAFS (iaitu, keseluruhan faktor paracrine larut yang dikeluarkan oleh sel dalam medium terkondisi, hAFS-CM) dan vesikel ekstraselular ( hAFS-EV) di dalamnya, daripada sel peranakan Ⅱtrimester janin-berbanding III trimester. hAFS janin dan perinatal dicirikan dan tertakluk kepada prasyarat hipoksik untuk meningkatkan potensi parakrin mereka. Formulasi hAFS-CM dan hAFS-EV dianalisis untuk kandungan protein dan kemokin/sitokin, dan kargo EV disiasat selanjutnya oleh penjujukan RNA. Fenotip hAFS janin dan perinatal, bersama dengan formulasi rembesan yang sepadan, bertindih; namun, hAFS janin menunjukkan aktiviti fosforilasi oksidatif yang tidak matang jika dibandingkan dengan perinatal. Pemprofilan kargo paracrine mereka mendedahkan beberapa perbezaan mengikut peringkat kehamilan dan prasyarat hipoksik. Kedua-dua sumber sel menyediakan formulasi yang diperkaya dengan faktor rangsangan neurotropik, imunomodulator, anti-fibrotik dan endothelial, dan rembesan hAFS janin yang belum matang ditakrifkan oleh profil pro-vaskulogenik, regeneratif, pro-penyelesaian dan anti-penuaan yang lebih ketara. Pemprofilan RNA kecil menunjukkan pengayaan mikroRNA dalam kedua-dua kargo hAFS-EV janin dan perinatal, dengan teras pro-penyelesaian yang dinyatakan secara stabil sebagai tandatangan molekul rujukan. Di sini kami mengesahkan bahawa hAFS mewakili sumber faktor paracrine regeneratif yang menarik; pemilihan sama ada formulasi rembesan hAFS janin atau perinatal untuk terapi paracrine masa hadapan perlu dinilai dengan mengambil kira senario klinikal tertentu.

Kata kunci:cecair amniotik; sel stem; kesan paracrine; vesikel ekstraselular; medium berhawa dingin; kemokin; sitokin; proteomik; penjujukan RNA; mikroRNA

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

1. Pengenalan

Perubatan regeneratif baru-baru ini berkembang sebagai bidang yang baru muncul untuk menyediakan pemulihan fungsi tisu yang cedera melalui beberapa strategi. Memandangkan pendekatan kejuruteraan tisu telah berkembang dengan ketara dalam beberapa tahun kebelakangan ini, penyiasatan kesan paracrine sel stem telah secara serentak semakin dipergiatkan. Potensi terapeutik sel stem yang ditransplantasikan telah ditunjukkan secara meluas kebanyakannya dimediasi oleh faktor larutnya yang dirembeskan, yang boleh mengatur persekitaran mikro pro-regeneratif dalam tisu perumah sambil mencetuskan pengaktifan mekanisme endogen pemulihan fungsi [1,2]. Oleh itu, sel stem merembeskan keseluruhan molekul trofik paracrine yang dibebaskan oleh sel, serta vesikel ekstraselular yang terikat membran telah semakin dicadangkan sebagai produk perubatan terapi inovatif oleh pelbagai kajian praklinikal bebas yang menyasarkan kardiovaskular, neurologi dan/atau keradangan. penyakit. Sehubungan itu, sel stem boleh dibayangkan sebagai kilang biologi untuk mengeksploitasi rembesan terapeutik mereka dengan menawarkan rawatan regeneratif sedia untuk digunakan dan di luar rak. Dengan menggunakan strategi berasaskan sel, namun bebas sel, banyak aspek mengehadkan yang berkaitan dengan terapi sel kanonik boleh diatasi, sambil masih memastikan kesan yang bermanfaat.apa itu cistancheDalam perspektif ini, sel stromal mesenchymal (MSC) telah diuji secara meluas sebagai calon sel putative? Sesungguhnya, MSC dan sel stem/progenitor telah direkayasa dan/atau dirangsang oleh strategi prakondisi yang berbeza untuk meningkatkan kapasiti regeneratif dan potensi rembesan [3,4] dengan minat yang jelas dalam kaitan biologi vesikel ekstraselular (EV) yang dirembeskan.

EV ialah zarah bersaiz nano yang dibatasi oleh dwilapisan lipid dan dirembes secara aktif oleh semua jenis sel. EV termasuk sangat kecil (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 nm); mereka beroperasi sebagai penghantar biologi kritikal bagi isyarat antara sel dengan menghantar kargo molekul mereka dari sel ibu bapa kepada responden / sasaran [5,6]. Memandangkan potensi paracrine peliknya dalam memberikan kesan berfaedah adalah setanding dengan sel asalnya, EV sel stem telah timbul sebagai pilihan terapeutik yang menarik dalam model penyakit praklinikal, seperti iskemia, keradangan atau kecederaan, seperti yang disemak secara meluas dalam [{{3 }}]. Dari perspektif translasi, selain potensi modulasi sel, kebolehlaksanaan pengasingan dan pembaharuan diri yang tinggi adalah aspek utama sumber EV terapeutik dan faktor larut yang ideal. Dalam senario sedemikian, MSC janin dan perinatal mungkin menawarkan pilihan yang menarik memandangkan potensi proliferatif mereka, dan profil perkembangan yang tidak matang dengan ciri perantaraan antara progenitor somatik embrio dan dewasa [10,11]. MSC janin boleh diasingkan daripada lampiran tambahan embrio semasa kehamilan sebagai pensampelan sisa yang diperoleh semasa pemeriksaan pranatal (iaitu, vili korionik [12-14] dan cecair amniotik [15,16]) atau diperoleh sebagai progenitor perinatal semasa lahir, daripada bahan buangan klinikal (iaitu, membran amniotik dan plasenta [17-21], komponen tali pusat [22-24] dan cecair amniotik jangka [25,26]).

Cistanche boleh anti-penuaan

Terutama, sel stem cecair amniotik manusia (hAFS) telah diketengahkan sebagai strategi terapeutik yang menjanjikan dalam perubatan regeneratif. dan telah terbukti secara meluas multipoten secara in vitro dan in vivo [16,27,28], menyumbang kepada keturunan hematopoietik berikutan dalam pemindahan utero [29], dan terukir dalam organ yang cedera sambil memberikan kesan imunomodulator [26,30] dan mengaktifkan tindak balas reparatif endogen, seperti yang diterangkan secara komprehensif dalam [31]. Pasukan kami dan yang lain telah menunjukkan lagi bahawa hAFS mengeluarkan rembesan yang sangat diperkaya dengan molekul trofik bioaktif yang dapat menyasarkan mekanisme reparatif yang berbeza. Faktor paracrine hAFS telah dilaporkan memberikan rangsangan pro-survival dengan pelindapkejutan keradangan [32], memberikan perlindungan kardio terhadap iskemia yang berpanjangan [33.34], dan kardiotoksisiti [35], dan merangsang angiogenesis tempatan dengan kemasukan semula kitaran sel kardiomiosit [ 34,36]. Memandangkan kebanyakan kesan ini telah ditunjukkan untuk direkapitulasi oleh pentadbiran hAFS-EV sahaja, kajian bebas telah menumpukan pada membedah profil regeneratif mereka terhadap latar belakang patologi yang berbeza, termasuk kecederaan otot rangka dan jantung, penyakit buah pinggang, osteoarthritis, osteoporosis, necrotizing enterocolitis dan neurodegenerative. model [34,37-44].

Walaupun bukti mungkin menyokong terjemahan klinikal hAFS-EVs untuk terapi paracrine masa hadapan, adalah penting untuk mempertimbangkan bahawa kebanyakan kajian ini telah menyiasat potensi modulasi hAFS janin yang diperoleh semasa pemeriksaan pranatal Ⅱ trimester Sesungguhnya, profil lengkap rembesan daripada perinatal mempunyai pasangan (iaitu, dari bahagian c trimester III) masih belum diterokai secara terperinci. hAFS perinatal trimester ketiga telah menunjukkan sifat pengawalseliaan imun yang tersendiri berbanding dengan saya dan trimester II [26], sambil mengekalkan potensi regeneratif endothelial yang relevan [25].berapa banyak cistanche yang perlu diambilDaripada nota, laporan baru-baru ini mengenai morfologi heterogen hAFS janin [45] telah memberikan pandangan baharu ke dalam profil ekspresi gen dan stem mereka.bioflavonoidIni sama sekali telah memberi penerangan baharu tentang nilai penjanaan semula bagi pecahan selular yang berbeza bagi hAFS[46]. Oleh itu, pencirian komprehensif bagi subpopulasi yang berbeza bagi hAFS menarik perhatian yang semakin meningkat. Kami sebelum ini melaporkan bahawa rangsangan hipoksik dan bebas serum 24 jam mewakili strategi yang berkesan untuk meningkatkan potensi paracrine hAFS janin Ⅱ trimester [34,35,37]. Memandangkan sedikit diketahui tentang komposisi rembesan daripada hAFS trimester III, di sini kami melaporkan perbandingan komprehensif Ⅱ berbanding Ⅲ trimester hAFS dan pecahan rembesannya (termasuk topi-EV), untuk menangani pengaruh peringkat kehamilan dan sel hipoksik prasyarat pada ciri sel dan rahsia.

2. Keputusan

2.1.Perinatal hAFS Mempersembahkan Padanan Fenotip yang rapat kepada Fetal mempunyai

Tiada perbezaan yang relevan secara statistik dihargai dalam umur penderma antara sampel cecair amniotik trimester Il janin dan trimester III perinatal. c-KIT* hAFS janin (f-hAFS daripada sampel cecair amniotik trimester II) dan c-KIT* hAFS perinatal (p-hAFS daripada sisa klinikal cecair amniotik trimester III) mengesahkan ciri yang serupa dengan morfologi seperti fibroblast dan bulat bujur (Rajah 1A) dan fenotip stromal mesenchymal (data tidak ditunjukkan), seperti yang dilaporkan sebelum ini [16, 25]. Kedua-dua f-hAFS dan p-hAFS yang dikultur secara in vitro sehingga laluan 5 menunjukkan tahap penuaan yang boleh diabaikan daripada pengaktifan galaktosidase (SA- -Gal) yang berkaitan dengan penuaan dalam kira-kira 4 peratus sel(Rajah 1B) . Kedua-dua f-hAFS dan p-hAFS membentangkan tahap tinggi ekspresi bersama penanda mesenchymal CD107a dan CD146, yang baru-baru ini dilaporkan untuk menentukan fenotip yang sangat rembesan [47]. CD107at CD146* sel mewakili majoriti populasi f-hAFS (kira-kira 64 peratus ,*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

Rajah 1. Fetal mempunyai dan perinatal mempunyai penilaian fenotip. (A) Imej perwakilan hAFS janin (f-hAFS, panel kiri) dan hAFS perinatal (p-hAFS, panel kanan) yang dikultur secara in vitro dalam keadaan standard; bar skala: 200 um. (B) Analisis penanda senescent beta-galactosidase(SA- -Gal, dalam warna biru) melalui pewarnaan sitokimia pada f-hAFS dan p-hAFS selepas 5 petikan dalam kultur; imej perwakilan dilaporkan dalam panel kiri, bar skala: 200 um. Peratusan sepadan sel/medan -Gal-positif dilaporkan dalam graf dalam panel kanan (f-hAFS:4.12±0.58 peratus dan p-hAFS:3.88±2.10 peratus ;p=0.1424,n{ {24}} eksperimen).(C)Imunofenotip hAFS yang menyatakan penanda mesenkim CD146 dan CD107a. Plot sitometri aliran perwakilan f-hAFS dan p-hAFS (panel kiri) dan nilai yang sepadan dirujuk kepada CD107a positif berganda tambah CD146 tambah sel; CD107a campur CD146* f-hAFS:63.68±5.82 peratus ,*p=0.016berbanding baki36.32±5.82 peratus f-hAFS (Lain);CD107at CD146 tambah p-hAFS:52.07±6.76 peratus dengan baki 42.07±6.76 peratus 93±56.76 peratus p-hAFS (Lain-lain);CD107a tambah CD146 tambah f-hAFS lwn CD107a tambah CD146 tambah p-hAFS p{=0.2403,n=4 percubaan. Lain-lain: jumlah baki CD107a-CD146~hAFS,CD107a~CD146*hAFS dan CD107pada CD146-hAFS. Semua nilai dinyatakan sebagai min ± sem eksperimen bebas. SA- -Gal: Senescence-Associated- -galactosidase.

2.2. hAFS Fetal Menunjukkan Metabolisme Berbeza daripada hAFS Perinatal

Untuk menilai sama ada peringkat kehamilan boleh mempengaruhi metabolisme mitokondria, f-hAFS dan p-hAFS dianalisis dalam keadaan kultur in vitro standard oleh analisis biokimia. Penilaian metabolisme aerobik menunjukkan bahawa kadar penggunaan oksigen (OCR) dan sintesis ATP adalah lebih rendah dalam f-hAFS berkenaan dengan p-hAFS, kedua-duanya apabila dirangsang dengan piruvat ditambah malat (P/M;***p<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3. Prakondisi Hipoksik Tidak Menjejaskan Janin dan Perinatal mempunyai Daya Mampu dan Mengekalkan Aktiviti Rembesannya

Untuk menentukan formulasi rembesan hAFS, sel telah dibiakkan dalam keadaan bebas serum untuk mengelakkan sebarang pencemaran daripada FBS. Kami sebelum ini menunjukkan bahawa keadaan kultur hipoksia 24 jam tanpa serum (SF) dan 1 peratus O2 tidak banyak mengubah daya maju hAFS janin Ⅱtrimester (f-hope), sementara mereka menyokong pembebasan faktor paracrine regeneratif dalam medium terkondisi sel mereka. (hAFS-CM) dan dalam vesikel ekstraselular (hAFS. EVs)[34,35,37,49]. Di sini, sebagai tambahan kepada memprofilkan pecahan rembesan p-hAFS untuk kali pertama, kami menilai sama ada p-telah membentangkan tingkah laku yang sama di bawah rejim prasyarat yang sama, menggunakan keadaan kultur normoksik sebagai kawalan. Daya maju f-hAFS dan p-hAFS dianalisis selepas 24 jam dalam tetapan berikut: keadaan normoksik (20 peratus O2) dalam medium kultur kawalan lengkap(Ctrl) (Ctrlf-hAFSnormo dan Ctrl p-hAFSnormo), keadaan normoksik dalam medium SF (SF f-hAFSnormo dan SF p-hAFSnormo), keadaan hipoksik (1 peratus O2) dalam medium kawalan lengkap (Ctrlf-mempunyai hipo dan Ctrl p-hAFSnypo), dan keadaan hipoksik dalam medium SF (SF f-mempunyai hypo dan SF p -mempunyai hipo, Rajah 3A). Kami mengesahkan bahawa daya maju f-mempunyai tidak berubah dalam kedua-dua keadaan Ctrl dan SF dan di bawah rangsangan hipoksik, dengan lebih daripada 80 peratus (sehingga hampir 88 peratus ) daripada jumlah sel tidak terjejas. Sel apoptosis awal dan lewat berjulat dari ca. 13 peratus hingga 18 peratus dalam keadaan SF, tanpa sebarang kaitan yang signifikan secara statistik. Begitu juga, daya maju perinatal berada dalam julat 80-92 peratus, dan sel apoptosis awal dan lewat mewakili sehingga 18 peratus dalam keadaan SF. p-hAFS sedikit dipengaruhi hanya di bawah keadaan hipoksik dan SF gabungan; sesungguhnya, sementara prasyarat tidak mempengaruhi survival sel apabila p-hAFS dibiakkan dalam medium yang lengkap, keadaan SF yang sepadan menunjukkan peningkatan sebanyak ca. 4-lipat (* hlm<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

Rajah 2. Pencirian metabolik janin dan perinatalhAFS. (A) Kadar penggunaan oksigen (OCR), sintesis ATP melalui F1-F.ATP sintase, dan nisbah P/O dalam f-have dan-have dengan kehadiran piruvat tambah malat (P/M) atau suksinat (Succ);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistanche AustraliaPerbandingan peratusan perencatan sintesis OCR dan ATP dalam f-dan-hAFS disebabkan oleh perencat yang ditunjukkan di atas dilaporkan dalam panel bawah B. Untuk eksperimen OCR: hAFS ditambah Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

Kami kemudian menilai hasil pecahan rahsia yang diperoleh daripada f-hAFS berbanding p-hAFS berdasarkan pengayaan protein. Jumlahnya mempunyai rahsia, kerana keseluruhan faktor paracrine yang dirembeskan oleh sel, di sini diwakili oleh hAFS-CM. Kepekatan protein f-hAFS-CM dan p-hAFS-CM dalam medium SF berikutan prakondisi sel hipoksik vs keadaan normoksik kawalan sebagai garis dasar (iaitu, f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo, dan p -hAFS-CMHypo,) telah dinilai oleh ujian BCA dan diukur mengikut 10§ sel.sistanchKeputusan yang diperoleh mencadangkan bahawa f-has-CM dan p-hAFS-CM menunjukkan trend positif yang sama dalam pengayaan protein berikutan penyebuan hipoksik (f-hAFS-CMnypo'166.10±22.13 ug/10 sel darjah;p-hAFS-CMNypo∶182.30±29.71 ug/10 sel darjah） berbanding sel-sel normoksiknya (f-hAFS-CMnormo:105.50±19.89 ug/10 darjah sel; p- hAFS-CMhypoi 91.12±24.39 ug/10 darjah sel） Begitu juga, kepekatan protein permukaan hAFS-EVs diukur dalam f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-hAFS-EVSnormo dan p-hAFS-EVShypo EV menunjukkan hasil yang setanding apabila diperoleh daripada f-hAFS atau p-hAFS. Bagi formulasi hAFS-CM, trend positif dalam peningkatan kandungan protein pada f-hAFS-EV dan p-hAFS. EV dihargai selepas rangsangan hipoksik ke atas keadaan normoksik yang sepadan （f-hAFS-EVSHypo∶2.03±0.67 ug/10 darjah sel dan p-hAFS-EVSHypo∶1.85±0.47 ug/10 sel darjah;f-have-EVsnormo∶1.28±0.36 darjah sel dan p/10 -hAFS-EVsnormo∶1.19±0.31 ug/10 sel darjah, Rajah 3C).

2.4. Fetal-and Perinatal hAFS Keluaran EV dengan Morfologi Analogi dan Taburan Saiz

Analisis morfologi melalui mikroskop elektron penghantaran (TEM) meningkatkan prolife rembesan EV yang tinggi bagi kedua-dua f-hAFS dan p-hAFS (Rajah 4). Kami selanjutnya menyiasat saiz dan kawasan f-hAFS-EVs dan p-hAFS-EVs (Rajah 4B) berikutan prakondisi hipoksik berbanding garis dasar normoksik. Fetal- dan perinatal telah mengeluarkan EV bersaiz heterogen, dalam julat 40-250 nm, oleh itu termasuk kedua-dua eksosom/EV kecil dan mikrovesikel/vesikel penumpahan. Saiz purata EV/medan dalam kumpulan berbeza adalah setanding, hAFS-EV janin diukur 90-100 nm (f-hAFS-EVsnormo:104.00 ±3.00 nm;f -have-EVSHvpo:97.10±10.10 nm)dan perinatal diukur 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo:94.60±19.53 nm; p-hAFS-EVShypo:76.43±4.86 nm, Rajah 4B, panel kiri). Bagi hasil, hAFS yang dirangsang di bawah hipoksia menunjukkan trend positif dalam peningkatan jumlah EV kecil, walaupun peningkatan ini tidak ketara secara statistik. f-hAFS-EVStypo mengukur 40-70 nm yang hampir dua kali ganda berbanding rakan sejawat normoksiknya. Perinatal-has-EVSHypo yang mengukur 40-70 nm,70-100 nm dan 100-130 nm adalah hampir tiga kali ganda jumlah yang diperolehi dalam kultur normoksik (Rajah 4B).

Analisis penjejakan nanopartikel (NTA) menunjukkan bilangan zarah yang tinggi dalam kedua-dua persediaan f-hAFS-EV dan p-hAFS-EV, dan mengesahkan peningkatan EV dalam sampel hipoksik, seperti yang juga diperhatikan daripada analisis sebelumnya (f-hAFS- EVsnormo:182±0.10'zarah/10 sel darjah; f-have-EVshypo: 3.30±0.22×10 darjah zarah/10 sel darjah ;p-hAFS-EVsnormo:2.43±0.80×10 darjah zarah/10 darjah sel;p-hAFS-EVshypo:3.05±0.62×10 darjah zarah/10 darjah sel, Rajah 4C).

Rajah 4. Pencirian morfologi EV janin dan perinatal. (A) Imej perwakilan mikroskop elektron penghantaran (TEM) f-hAFS dan p-hAFS (masing-masing panel kiri atas dan bawah, dengan anak panah hitam menunjukkan badan multi-vesikular intracytoplasmic dengan EV/eksosom kecil di dalamnya), dan f -hAFS-EVs dan p-hAFS-EVs (masing-masing panel atas dan bawah kanan) dikeluarkan dalam keadaan bebas serum dan di bawah prakondisi normoksik berbanding hipoksik (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo; dan f-hAFS-EVshypo, masing-masing), bar skala: 200 nm. (B)Panel kiri: Analisis TEM bagi taburan saiz hAFS-EV; panel kanan: pengedaran bilangan f-hAFS-EVs dan p-hAFS-EVs setiap selang saiz medan dari 40 nm hingga 250 nm telah dipertimbangkan; nilai dinyatakan sebagai min±sem bagi n=3 percubaan bebas. (C) Analisis penjejakan nanopartikel untuk saiz dan pengedaran hAFS. Panel kiri: imej perwakilan output grafik; panel kanan: kepekatan hAFS-EV diukur sebagai zarah 10 darjah setiap sel rembesan 10 darjah; nm: nanometer; mL: mililiter.

2.5.Pencirian Proteomik hAFS Fetal vs Perinatal Menyerlahkan Perbezaan dalam Komposisi Rembesannya Mengikut Umur Gestational dan Prasyarat Hipoksik

Pencirian proteomik kedua-dua formulasi rembesan f-hAFS dan p-hAFS dilakukan melalui platform bebas label senapang patah, berdasarkan gandingan kromatografi cecair nano dan spektrometri jisim resolusi tinggi (nLC-HRMS). Empat puluh lapan profil proteomik telah diperoleh melalui analisis pendua bagi tiga replika biologi hAFS-CM dan have-EV daripada f-hAFS dan p-hAFS yang menjalani prasyarat sel hipoksik berbanding keadaan normoksik sebagai kawalan. Sejumlah 4179 kumpulan protein yang berbeza telah dikenal pasti dengan sekurang-kurangnya satu peptida unik dan dengan berat molekul antara 2 hingga 3900 kDa dan titik isoelektrik dari 3.6 hingga 13. Ekspresi protein purata yang lebih tinggi dalam hAFS-EVs diperhatikan jika dibandingkan dengan hAFS-CM . Penjajaran semua senarai protein yang diperolehi telah dijalankan berdasarkan protein yang dikenal pasti. Bagi setiap keadaan percubaan, senarai unik telah dibuat untuk menormalkan dan merata [50] nilai padanan spektrum peptida (PSM) yang dikaitkan dengan protein, yang mewakili bilangan spektrum jisim yang diberikan kepada setiap satu dan secara tidak langsung mewakili kelimpahannya dalam sampel. Senarai lengkap protein yang dikenal pasti dalam formulasi hAFS-CM dan have-EV dilaporkan dalam Jadual S1.

Penggunaan analisis diskriminasi linear (LDA[51]) pada senarai induk ini membenarkan pengekstrakan protein yang signifikan secara statistik (Fratio Lebih besar daripada atau sama dengan 4.5 dan** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 dalam formulasi hAFS-CM dan have-EV dipertimbangkan secara berasingan. Walaupun kira-kira 69.5 peratus dan 69.9 peratus protein dikongsi di antara keadaan hAFS-EV dan hAFS-CM masing-masing, kandungan selebihnya kelihatan eksklusif dalam perkadaran berbeza, antara 3.7 peratus hingga 13.4 peratus, antara formulasi.

Untuk mengkaji secara kuantitatif perubahan proteomik, analisis pembezaan bebas label telah dilakukan dengan menggunakan perisian MAProMa buatan sendiri dan menggunakan dua algoritma, DAve (Purata Perbezaan) dan DCI (Indeks Keyakinan Berbeza, mewakili nisbah dan keyakinan dalam ekspresi pembezaan, masing-masing), pada PSM setiap protein tunggal antara kedua-dua istilah yang dibandingkan. Menggunakan penapis ketat untuk DAve dan DCI untuk memaksimumkan keyakinan pengecaman dan untuk mempertimbangkan protein dengan variasi yang lebih besar daripada perubahan lipatan 1.5, perbandingan berpasangan bagi f-hAFS-CM berbanding p-hAFS-CM dan f-hAFS-EVs berbanding p-hAFS-EVs dibuat mengikut peringkat kehamilan sel. Sebanyak 58 dan 109 protein didapati dinyatakan secara berbeza dalam petak has-CM dan have-EV di atas, (Rajah S1B, C untuk butiran terpilih dan Jadual S2-S3 dalam bentuk lanjutan). Di antara ini, 30 protein menghasilkan terkawal dalam f-hAFS-CM dan 28 telah dikawal selia dalam p-hAFS-CM (Rajah S1B); begitu juga, 44 protein berbeza menghasilkan terkawal dalam f-have-EVs dan 65 telah dikawal selia dalam p-hAFS-EVs (Rajah S1C). Terutamanya, protein yang menghasilkan terkawal dalam f-have akan dianggap terkawal turun dalam p-have dan sebaliknya.

nilai dilaporkan; lihat Jadual S2 untuk senarai lengkap dan parameter terperinci protein yang dilaporkan. (C) Analisis pengayaan proses biologi bagi protein yang dikenal pasti dengan kekerapan sekurang-kurangnya 2 dalam hAFS-CM janin (panel kiri) dan perinatal have-CM (panel kanan) mengikut prakondisi hipoksik sel. Berdasarkan alat FunRich, istilah ontologi gen ditunjukkan dalam carta bar yang melaporkan peratusan gen yang diperkaya untuk setiap kategori (bar merah jambu untuk-have-CMnormo, bar ungu untuk bar biru muda f-hAFS-CMhypor untuk p-hAFS-CMnormo, dan bola biru untuk p-hAFS-CMhypo).beli cistancheHanya istilah ontologi gen dengan Bonferroni dibetulkan dengan*p<0.05 are="">

Artikel ini dipetik daripada Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms