Pengecilan Uveitis Autoimun Eksperimen dalam Tikus Lewis Oleh Betaine

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

Uveitis autoimun eksperimen (EAU) ialah model haiwan uveitis autoimun manusia yang dicirikan oleh penyusupan sel T autoimun dengan peningkatan serentak dalam sitokin pro-radang dan spesies oksigen reaktif. Kajian ini bertujuan untuk menilai sama ada betaine mengawal perkembangan EAU dalam tikus Lewis. EAU diinduksi melalui imunisasi dengan protein pengikat retinoid interphotoreceptor (IRBP) dan pentadbiran oral sama ada kenderaan atau betaine (100 mg/kg) selama 9 hari berturut-turut. Limpa, darah, dan retina telah diambil sampel daripada tikus eksperimen pada masa pengorbanan dan digunakan untuk ujian proliferasi sel T, analisis serologi, tindak balas rantai polimerase masa nyata, dan imunohistokimia. Ujian proliferasi sel T mendedahkan bahawa betaine mempunyai sedikit kesan ke atas percambahan sel T splenik terhadap antigen IRBP dalam ujian in vitro pada hari ke-9 selepas imunisasi. Analisis serologi menunjukkan bahawa tahap serum superoxide dismutase meningkat dalam kumpulan yang dirawat betaine berbanding dengan kumpulan yang dirawat kenderaan.ekstrak cistanche tubulosaKesan anti-radang betaine telah disahkan oleh pengurangan peraturan molekul berkaitan pro-radang, termasuk molekul lekatan sel vaskular I dan interleukin-1 dalam retina tikus dengan EAU. Penemuan histopatologi bersetuju dengan molekul penyesuai pengikat kalsium terion l imunohistokimia, seterusnya mengesahkan bahawa keradangan dalam retina dan badan ciliary telah ditindas dengan ketara dalam kumpulan yang dirawat betaine berbanding dengan kumpulan yang dirawat kenderaan. Keputusan kajian ini menunjukkan bahawa betaine terlibat dalam mengurangkan EAU melalui aktiviti anti-pengoksidaan dan anti-radang.

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Kata kunci:Anti-keradangan, Anti-pengoksidaan, Betaine, Uveitis autoimun eksperimen, Retina

pengenalan

Homing sel T autoreaktif dan penyusupan sel radang, seperti monosit, mencetuskan uveitis dan retinitis dalam EAU [6]. Retina rosak akibat keradangan dengan pengaktifan sel glial yang mengalami tekanan oksidatif[7].

Betaine, juga dipanggil trimethylglycine (CH: NO :), adalah bahan semula jadi alkaloid dan tidak toksik daripada Fructus Lycia, dan bahan antioksidan yang mewakili [8]. Betaine meningkatkan keradangan berkaitan usia pada tikus melalui penglibatan faktor nuklear-kB melalui kinase penggerak faktor nuklear/I kappa B kinase dan kinase protein yang diaktifkan mitogen [9], penyakit kardiovaskular manusia dengan menekan sitokin radang, termasuk interleukin (IL){{ 6}} dan faktor nekrosis tumor-a(TNF-a)[10], dan tumorigenesis kolon yang disebabkan oleh natrium dextran sulfat [11].ulasan cistanche tubulosa,Di samping itu, betaine menghalang angiogenesis/neovaskularisasi patologi pada tikus dengan retinitis diabetik [12] dan melindungi sel ganglion retina untuk meningkatkan ketajaman penglihatan dalam model haiwan glaukoma [13]. Walau bagaimanapun, terdapat sedikit yang diketahui tentang mekanisme tepat yang mendasari kesan betaine dalam uveitis.

Dalam kajian ini, keberkesanan betaine dalam melegakan EAU telah dinilai. Kami menyiasat kesan anti-radang betaine dalam EAU berdasarkan pemeriksaan histopatologi dan pengukuran sitokin. Tambahan pula, mekanisme spesifik betaine sebagai antioksidan dinilai dalam tikus dengan EAU.

BAHAN DAN KAEDAH

Haiwan

Kedua-dua jantina tikus Lewis (7~9 minggu; Orient Bio Inc, Gyeonggi-do, Korea) ditempatkan di kemudahan kami dalam keadaan makmal (12-h kitaran terang/gelap, suhu 23±2 darjah ). Semua prosedur percubaan telah dilakukan mengikut Garis Panduan Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal Universiti Kebangsaan Jeju (nombor kebenaran:2020-0012). Semua protokol haiwan mematuhi undang-undang antarabangsa dan dasar NIH, termasuk Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal (penerbitan NIH no.85-23,1985, disemak 1996).

Induksi EAU

Tikus-tikus telah diimunisasi dengan 200 ul emulsi campuran yang terdiri daripada jumlah yang sama protein interphotoreceptor retinoid-binding protein (IRBP)(I mg/ml; PTARSVGAADGSS-WEGVGVVPDV, Kombiotech, Seoul, Republik Korea) dan bahan pembantu lengkap Freund (CFA) Freund. )ditambah dengan saya mg/mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra(Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) pada tapak kaki kaki belakang mereka.

Kumpulan eksperimen

Untuk menilai kesan betaine(Gamb.1A) pada EAU, empat kumpulan eksperimen telah ditetapkan seperti berikut: kawalan normal (n=8); Kawalan CFA (n=8);EAU campur Kenderaan (n=8);dan EAU campur Betaine(n=8).Dos dalam rawatan untuk menguji kesan terapeutik betaine(1 0 mg/kg berat badan/hari, B2629, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) telah dipilih berdasarkan kajian terdahulu [14]. Tikus telah dirawat secara lisan 9 dengan betaine dari hari 0 selepas imunisasi sehingga hari 9 selepas imunisasi.

Penyediaan tisu

Tikus telah dikorbankan di bawah bius dalam melalui penyedutan gas CO2 pada hari ke-9 selepas imunisasi.cistanche UKTisu untuk pemeriksaan histopatologi telah dibenamkan dalam lilin parafin dan dibelah

dengan mikrotom (RM 2135; Leica, Nussloch, Jerman) hingga ketebalan 5 um dan diwarnai dengan hematoxylin dan eosin. Darah dan retina disimpan pada -80 darjah untuk analisis serum dan analisis tindak balas rantai polimerase (PCR) masa nyata.

Ujian percambahan sel T

Sel mononuklear limpa dari haiwan dalam setiap kumpulan telah dipisahkan dan digantung seperti yang diterangkan dalam kajian terdahulu kami [15]. Kemudian, 10 ug/ml IRBP (kepekatan akhir) telah ditambah ke dalam telaga. Selepas 48 jam rangsangan dengan IRBP, sel telah diinkubasi dalam 1 μCi 'H-methyl thymidine (aktiviti khusus 42 Ci/mmol; Amersham, Arlington Heights, IL, Amerika Syarikat) selama 18 jam. Kemudian, sel-sel dituai untuk mengukur penggabungan timidin.

Cistanche boleh anti-penuaan

Analisis serologi

Tikus telah dikorbankan pada tarikh pensampelan, dan darah dikumpulkan melalui jantung. Sampel darah keseluruhan diasingkan kepada serum dan sel darah menggunakan emparan (VS-5500CFN; Vision Scientific, Daejeon, Republik Korea). Aktiviti superoxide dismutase (SOD) dalam serum dinilai menggunakan kit SOD (ab65354; Abcam, Cambridge, UK).

Imunohistokimia

Imunohistokimia dilakukan menggunakan protokol yang sama seperti yang diterangkan dalam kajian terdahulu kami [16]. Antibodi utama termasuk molekul penyesuai pengikat kalsium terion (Ibal)(1:1,000;019-19741, Wako Pure Chemical Industries,Ltd,Osaka, Jepun),CD68(ED1;1:800;MCA341,Serotec,Kidlington,UK), dan glutamin synthetase(GS)(1:5,000;MAB302,Chemicon In -ternasional, Temecula, CA, USA) digunakan sebagai penanda untuk mikrog-lia, makrofaj dan sel Müller, masing-masing.

PCR masa nyata

Jumlah RNA dalam bola mata dalam semua kumpulan (n=5 setiap kumpulan) telah diasingkan dengan TRIzol RNA Isolation Reagent (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA) dan cDNA telah disediakan menggunakan CellScript M All-in -Satu 5X Campuran Induk Sintesis cDNA Standard Pertama (CellSafe, Gyeonggi-do, Republik Korea). Maklumat asas disenaraikan dalam Jadual 1. PCR telah dilakukan dengan pelumba MIC (BMS, Queensland, Australia) menggunakan 2x SYBR Green (PhileKorea, Seoul, Republik Korea) dan program berikut: 55 kitaran denaturasi(5 s,95 darjah ), penyepuhlindapan (20s, 60 darjah), dan lanjutan (10s,72 darjah).

Analisis Western blot

Analisis blot Barat dilakukan oleh protokol yang sama seperti yang diterangkan dalam kajian terdahulu kami [16].cistanche wirkungAntibodi utama termasuk protein 1 yang berkaitan dengan ECH seperti Kelch (Keap1)(1:1,000;abl19403,abcam,MA,USA), dan faktor nuklear erythroid-2-re-lated factor2(Nrf2 )(1:1,000;sc-722,Santa cruz,CA,USA).

Analisis statistik

Semua ukuran dilaporkan sebagai purata tiga eksperimen bebas. Semua nilai dibentangkan sebagai ralat piawai min bagi min (SEM). Keputusan dianalisis menggunakan analisis varians sehala diikuti dengan ujian posthoc Student-Newman-Keuls untuk pelbagai perbandingan. Satu nilai p<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" significance.="" immunostaining="" was="" analyzed="" semi-quantitatively="" based="" on="" the="" positive="" areas="" in="" the="" photographs="" using="" imagej="" software="" (national="" institutes="" of="" health,="" bethesda,="" md,="" usa).eau="" was="" histopathologically="" evaluated="" using="" a="" method="" modified="" from="" a="" previous="" study="" [17].="" antibody-positive="" areas="" were="" measured="" as="" follows:(1)three="" different="" sections="" from="" each="" rat="" (n="3" animals="" per="" group)="" were="" used;="" then,="" (2)="" the="" percentage="" of="" the="" stained="" area="" [(positive="" area/total="" area)x100(%)]="" was="" calculated.="" the="" total="" area="" included="" all="" layers="" of="" the="" retina.="" these="" results="" are="" presented="" as="" the="">

KEPUTUSAN

Betaine had no immunomodulatory function in EAU The T cell proliferation assay was performed to determine whether betaine affected the proliferation of IRBP-specific T cells (Fig.1B). No significant changes were observed between the EAU-induced groups in medium only and those that were IRBP-stim-ulated (medium only, p>0.05 vs.EAU+Vehicle; IRBP stimulation, p>0.05 lwn.EAU plus Kenderaan). Data ini menunjukkan bahawa betaine tidak terlibat dengan sel T khusus IRBP atau autoreaktivitinya.

Betaine meningkatkan tahap SOD serum dalam EAU

Kami menilai kerosakan oksidatif dalam serum, menggunakan SOD sebagai penanda pengubahsuaian oksidatif. Tiada perbezaan yang ketara diperhatikan antara kumpulan normal dan CFA. Aktiviti SOD menurun dengan ketara dalam kumpulan EAU plus Vehicle, berbanding tahap dalam kumpulan kawalan dan CFA biasa. Rawatan betaine dengan ketara memulihkan tahap aktiviti SOD kepada kawalan biasa dan kumpulan CFA (Rajah 2). Keputusan ini menunjukkan bahawa rawatan betaine menekan tekanan oksidatif pada tikus dengan EAU.

Betaine mengurangkan penyusupan sel Ibal-positif dalam badan ciliary dan retina tikus yang disebabkan oleh EAU

Badan ciliary adalah tapak penyusupan sel radang utama kerana banyaknya saluran darah[18]. Hanya beberapa sel jenis bulat dikesan dalam badan ciliary dalam kumpulan normal dan CFA (Rajah 3A, 3B), manakala penyusupan beberapa sel jenis bulat telah disahkan dalam kumpulan yang disebabkan oleh EAU (anak panah dalam Rajah 3C). ,3D). Kumpulan normal (Rajah 3E) dan CFA (Rajah 3F) secara konsisten memaparkan keputusan yang serupa dengan yang diperhatikan untuk imunoreaktiviti Ibal. Imunoreaktiviti Ibal-positif meningkat dalam kumpulan EAU plus Vehicle dan EAU plus Betaine (mata anak panah dalam Rajah.3G, 3H). Walau bagaimanapun, bilangan sel Ibal-positif menurun dengan ketara dalam kumpulan EAU plus Betaine berbanding kumpulan EAU plus Vehicle (Rajah 3I). Kami juga menganalisis penyetempatan EDI sebagai pendekatan lanjut untuk menilai lokasi tepat penyusupan sel radang dalam badan ciliary. Sel-sel positif ED{16}} jarang dikesan dalam normal (Rajah 3G) dan CFA (Rajah 3K )kumpulan. Sebaliknya, banyak sel ED1-positif dikesan dalam kumpulan EAU plus Vehicle dan EAU plus Betaine (kepala anak panah berganda dalam Rajah.3L,3M).bioflavonoid sitrusAnalisis separa kuantitatif bilangan sel positif ED1-mengesahkan bahawa rawatan betaine menghalang penyusupan sel radang dalam badan silia tikus yang disebabkan oleh EAU.

Seterusnya, kami menyiasat perubahan histopatologi dalam retina (Rajah 4). Beberapa sel radang dikesan dalam retina dengan EAU, tetapi tidak dalam retina tikus normal dan CFA (Rajah 4A~4D). Lesi telah dijaringkan secara histopatologi mengikut keterukan EAU [17], mendedahkan kelegaan keradangan retina (Rajah 4E). Pengaktifan sel mikroglial dan Müller yang menunjukkan keradangan retina telah disahkan berdasarkan global (Rajah 4F~4I) dan imunoreaktiviti GS (Rajah 4K~4N), masing-masing. Penyetempatan Ibal dalam mikroglia sangat jarang berlaku dalam kumpulan normal dan CFA (masing-masing anak panah dalam Rajah 4F, 4G). Pengaktifan mikroglia telah dihalang dalam tikus EAU (anak panah dalam Rajah.4H) oleh rawatan betaine (Rajah 4I, 4J). Keputusan imunoreaktiviti GS-positif adalah serupa dengan hasil global dalam retina (Rajah 4K~4N). Sel Müller yang diaktifkan dalam kumpulan EAU plus Vehicle mempunyai tahap imunoreaktiviti GS yang lebih rendah (Rajah 40).

Betaine menindas molekul lekatan dan mediator pro-radang di EAU

Seterusnya, kami memeriksa ekspresi molekul lekatan menggunakan PCR masa nyata (Rajah 5A). Penurunan mendadak dalam tahap molekul lekatan sel vaskular 1(VCAM1) mRNA dalam kumpulan EAU ditambah Betaine telah diperhatikan (p<0.05 vs.eau+vehicle).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,interleukin-1β(il-1β),="" tumor="" necrosis="" factor-alpha="" (tnf-a),="" inducible="" nitric="" oxide="" synthase(inos),="" and="" cyclooxygenase="" at-2(cox-2)as="" pro-inflammatory="" mediators,="" were="" assessed="" to="" confirm="" the="" inflammatory="" condition="" (fig.="" 5b).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,="" il-1β,="" tnf-a,="" cox-2="" were="" significantly="" downregulated="" in="" the="" eau+betaine="" group="" compared="" with="" that="" of="" vehicle-treated="" eau="" group="" (fig.5b).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" betaine="" treatment="" suppressed="" the="" upregulation="" of="" pro-inflammatory="">

Betaine mengawal selia enzim antioksidan catalase (CAT) danSODinEAU

Kajian tahap kerosakan oksidatif dalam serum mendorong kami untuk menyiasat status tindak balas antioksidan enzim antioksidan, termasuk CAT, SOD1, SOD2, dan SOD3 (Rajah 5C). Kami memerhatikan tahap ekspresi CAT, SOD1, SOD2 dan SOD3 yang dikawal dengan ketara dalam bola mata kumpulan EAU plus Betaine berbanding kumpulan EAU plus Vehicle.

Betaine mengaktifkan laluan Keapl-Nrf2

Untuk menyokong kesan anti-oksidatif betaine, laluan Keapl-Nrf2 telah diperiksa (Rajah 6). Tahap protein Keapl (0.75±0.05 kali ganda perubahan,p<0.05,fig.6a)and nrf2(0.79±0.04fold=""><0.05,fig.6b)in eau+vehicle="" group="" were="">

berbanding dengan kawalan biasa. Sebaliknya, Keapl dan Nrf2 menunjukkan sama ada 1.46±0.00 perubahan lipatan atau 1.13±0.34 kali ganda perubahan kepada kumpulan EAU plus Vehide (p<0.01 and=""><0.001,>

PERBINCANGAN

Ini adalah kajian pertama yang melaporkan bahawa betaine mengurangkan perkembangan patogenesis EAU melalui kesan anti-radang dan anti-oksida, tetapi bukan dengan menyekat percambahan sel T (ilustrasi skematik dalam Rajah 7).

Kesan pengawalseliaan betaine dalam penyakit autoimun seperti yang dibuktikan menggunakan EAU, prototaip penyakit autoimun, dianggap disebabkan oleh pengurangan tekanan oksidatif dan mediator pro-radang, tetapi bukan percambahan sel T, oleh betaine [19]. Begitu juga, kajian ini mendedahkan bahawa betaine mempunyai sedikit kesan ke atas percambahan sel T dan profil sitokin dalam supernatan kultur dalam model EAU, menunjukkan bahawa betaine tidak mempengaruhi tindak balas imun percambahan sel T autoimun dalam EAU. Uvea ialah organ sasaran dalam EAU. Uvea dan retina adalah organ terpencil secara imunologi tanpa limfa [20]. Sel T autoimun dalam EAU diserang melalui cabang arteri ciliary dan oftalmik [21]. Tekanan oksidatif adalah isyarat kritikal kepada perkembangan tindak balas keradangan dan peningkatan spesies oksigen reaktif menyebabkan disfungsi endothelial dan kecederaan tisu [22]. Sel-sel endothelial yang terganggu membawa kepada promosi laluan sel-sel radang dan molekul keradangan [22]. Mediator dan sel radang dalam uvea dicetuskan dalam sel epitelium pigmen retina, yang mengganggu persimpangan antara sel rod dan kon dan sel epitelium berpigmen, yang membawa kepada retina yang terlepas [23]. Badan ciliary adalah tapak masuk untuk keradangan okular. Keradangan retina biasa terlibat dalam pengaktifan mikroglia pemastautin dan penyusupan sel-sel radang kerana pecahan penghalang darah-retina [24]. Di bawah keadaan neuropatologi, termasuk tumor otak [25], axotomy [26], dan jangkitan virus [27], makrofaj dan mikroglia yang diaktifkan dibezakan oleh Ibal. Di samping itu, mikroglia pemastautin yang diaktifkan terlibat dalam perubahan patologi yang berlaku dalam penyakit degeneratif retina dan melepaskan mediator keradangan yang memburukkan lagi proses penyakit [28]. Keputusan ini menunjukkan bahawa betaine memberikan kesan anti-radang dalam uvea dan badan ciliary, sasaran utama EAU, dan boleh mengurangkan tekanan oksidatif dalam serum. Walau bagaimanapun, mekanisme yang tepat masih perlu dikaji.

Mikroglia yang diaktifkan adalah sumber utama sitokin pro-radang di bawah keadaan degeneratif retina [29]. Sitokin pro-radang, termasuk IL dan TNF, sangat dikaitkan dengan keradangan okular [30] dan retinitis [6,29]. Selain mikroglia, sel Müller diaktifkan di bawah semua kejadian patologi yang berlaku di retina [31]. Sel Müller yang diaktifkan terlibat dalam kesan neuroinflamasi dalam retina dengan mensintesis dan melepaskan molekul yang berkaitan dengan keradangan [31]. Kami menganggap bahawa betaine mengurangkan tindak balas keradangan dalam tikus yang disebabkan oleh EAU dengan menekan pengaktifan sel mikroglia dan Müller. Penyelarasan VCAMl sangat terlibat dalam penyusupan sel radang [32]. VCAMl dipercepatkan kepada CD4 Tlym-phagocytes melalui cross-talk dengan antigen lewat-4[3]. Selain itu, Serpina3n, enzim yang memulakan keradangan [34], telah dikesan dalam sel Müller, astrocytes, dan epithelia pigmen retina bagi retina yang rosak cahaya [35] dan mempunyai tahap pembolehubah yang ketara dalam retina Nrl'mouse dengan sel kon terjejas [36]. Serpina3n meningkat dalam EAU tikus dengan keradangan retina yang teruk tetapi menurun dengan ketara dalam kumpulan EAU yang dirawat betaine. Penemuan serupa telah dilaporkan untuk skizofrenia dengan neuroinflammation [34], kerana murine Serpina3n adalah ortolog manusia Serpina3 [37]. Tambahan pula, peningkatan dalam IL-1 diperhatikan dalam kecederaan retina yang disebabkan oleh fruktosa tinggi [38]. Kami mengandaikan bahawa kesan anti-radang betaine dikaitkan dengan peraturan turun VCAM1, Serpina3n dan IL-1 dalam tikus yang disebabkan oleh EAU. Laluan Keep-Nrf2 digunakan untuk memantau tekanan oksidatif [39]. Betaine telah dikenali sebagai molekul anti-oksidan, yang dikaitkan dengan laluan Keapl-Nrf2 dalam model kecederaan hati akut yang disebabkan oleh acetaminophen [40]. Selain itu, pemprofilan ekspresi gen hepatik dilakukan selepas rawatan 3H-1,2-dithiole-3-thione, yang berperanan meningkatkan detoksifikasi karsinogen dan melindungi daripada neoplasia [4]. Hasil pemprofilan ini mendedahkan bahawa gen Keap1-Nrf2 mengawal selia nrf2-3H-1,2-dithiole-3-thione-inducible gen, termasuk AF033381, sebagai betaine homocysteine ​​​​methyl transferase, telah meningkat, dan terlibat dengan detoksifikasi dan anti-pengoksidaan [41]. Tindak balas keradangan dalam EAU disebabkan oleh penyusupan sel radang, seperti sel T dan makrofaj [42], dan pengeluaran tekanan oksidatif, terutamanya dalam mitokondria fotoreseptor peringkat awal [43]. Menurut keputusan ini, rawatan betaine adalah calon untuk melegakan kerosakan tisu yang disebabkan oleh EAU melalui modulasi laluan Keap1-Nrf2, sebagai laluan utama kepada pengawalan tekanan oksidatif.

Kesan antioksidan betaine telah dinilai secara meluas dalam model kecederaan akibat radikal [44]. Dalam otak kerosakan oksidatif yang disebabkan oleh levodopa, betaine telah dipertingkatkan kepada tahap CAT dan SOD, yang merupakan enzim antioksidan yang mewakili [4]. SOD1, SOD2, dan SOD3 diaktifkan oleh mekanisme yang berbeza dan dilokalkan dalam sitoplasma, mitokondria, dan matriks ekstraselular, masing-masing [45]. Betaine, sebagai molekul anti-oksidatif, terlibat dalam mengurangkan kerosakan oksidatif [46]. Tekanan oksidatif yang berkurangan diperluaskan untuk menyelesaikan keradangan, yang ditunjukkan oleh makrofaj/mikroglia positif Ibal dalam banyak penyakit, termasuk penyakit Alzheimer, penyakit Parkinson, dan sklerosis berganda [47]. Rawatan betaine telah dikawal selia kepada tahap mRNA penanda tekanan oksidatif, berbanding dengan kumpulan EAU plus Vehicle. Keputusan ini menunjukkan bahawa rawatan betaine mengurangkan tekanan oksidatif dalam sistem peredaran darah tanpa mengganggu percambahan sel T dalam organ imun model EAU tikus.

Secara kolektif, kajian ini menunjukkan bahawa betaine boleh mengurangkan keradangan dalam retina dan badan ciliary tikus yang disebabkan oleh EAU, mungkin melalui mekanisme anti-pengoksidaan dan anti-keradangan.

Artikel ini diekstrak daripada https://doi.org/10.5607/en21011