Rintangan Apoptosis Sel Senescent Merupakan Penghalang Intrinsik Untuk Senolisis Yang Disebabkan Oleh Glikosida Jantung

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

AbstrakPenghapusan sasaran sel senescent, analisis, adalah salah satu trend teras dalam terapi anti-penuaan. Glikosida jantung baru-baru ini terbukti sebagai senolitik spektrum luas. Di sini kami menguji sifat senolitik glikosida jantung terhadap sel stem mesenchymal manusia (hMSCs). Glikosida jantung tidak mempunyai keupayaan senolitik terhadap hMSC senescent pelbagai asal usul. Menggunakan pendekatan biologi dan bioinformatik kami membandingkan perkembangan penuaan dalam 'sensitif glikosida jantung'A549 dan '-tidak sensitif'hMSCs. Ketiadaan analisis didapati dimediasi oleh import kalium yang berkesan dan peningkatan rintangan apoptosis dalam hMSC senescent. Melemahkan "pertahanan antiapoptotik" memberi predisposisi hMSC kepada analisis. Kami mendedahkan bahawa rintangan apoptosis, yang sebelum ini diiktiraf sebagai ciri umum penuaan, sebenarnya, bukanlah ciri umum sel senescent. Selain itu, hanya sel senescent apoptosis-prolin yang sensitif terhadap analisis yang disebabkan oleh glikosida jantung. Oleh itu, kita boleh membuat spekulasi bahawa keberkesanan analisis mungkin bergantung pada sama ada sel senescent memang menjadi tahan apoptosis berbanding dengan rakan sejawat mereka yang semakin berkembang.

Kata kunciSel stem. Senolisis·Senescence·Apoptosis·Ketahanan tekanan

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

pengenalan

Hari ini penuaan selular dianggap sebagai tindak balas biasa bagi hampir semua jenis sel yang membiak, termasuk kanser dan sel stem, serta beberapa sel selepas mitosis kepada pelbagai rangsangan tekanan [1-3]. Jenis penuaan selular berikut boleh dibezakan mengikut asal-usul faktor pendorong: replikatif (disebabkan oleh kerosakan DNA pada hujung telomer yang dipendekkan), disebabkan oleh onkogen (sebagai tindak balas kepada pengaktifan isyarat onkogenik yang menyimpang), disebabkan oleh tekanan ( dimediasi oleh kerosakan DNA yang disebabkan oleh tekanan oksidatif, kejutan haba, sinaran UV dan y, dsb.) dan akibat kemoterapi (diaktifkan dalam sel kanser sebagai tindak balas kepada ubat kemoterapi)[4-7]. Terdapat heterogeniti dalam penanda yang dinyatakan oleh sel tua bergantung pada kedua-dua jenis sel dan penghinaan yang digunakan untuk mendorong penuaan. Walau bagaimanapun, terdapat beberapa ciri biasa yang tipikal untuk kebanyakan jenis sel senescent. Ciri penting penuaan untuk sebarang jenis sel pembahagi ialah kehilangan percambahan yang tidak dapat dipulihkan [8].ekstrak cistanche tubulosaKetakterbalikan penangkapan kitaran sel dikawal oleh perencat kinase yang bergantung kepada cyclin (CDK) pl6 dan p21 dan sering dikawal oleh protein penindas tumor p53 [8,9]. Ciri penting lain sel senescent ialah pengaktifan tindak balas kerosakan DNA yang berterusan; hipertrofi sel, yang sering timbul akibat gangguan biogenesis ribosom dan sintesis protein; gangguan degradasi lisosom dan disfungsi sistem degradasi selebihnya; peningkatan aktiviti enzim lisosom khusus - -galactosidase yang berkaitan dengan penuaan; pelbagai perubahan mitokondria; pemerolehan fenotip rembesan (SASP) yang berkaitan dengan penuaan, terdiri daripada faktor pro-radang, enzim merendahkan matriks, spesies oksigen reaktif, dsb.; perubahan landskap epigenetik dan kromatin, termasuk pembentukan fokus heterokromatik yang berkaitan dengan penuaan dan distensi satelit yang berkaitan dengan penuaan [8-10]. Dalam erti kata lain, sel senescent mengekalkan aktiviti metabolik dan kecergasan, tetapi fungsinya berubah dengan ketara berbanding dengan sel asal.

Cistanche boleh anti-penuaan

Kini jelas bahawa sel senescent boleh mengubah suai persekitaran mikro sekeliling yang mempengaruhi kedua-dua sel jiran dan relung selular, yang boleh menyebabkan tisu tidak berfungsi dan oleh itu mungkin berkaitan dengan perkembangan penuaan dan penyakit berkaitan usia [11,12]. Dengan mengingati perkara itu, hari ini lebih banyak perhatian tertumpu pada strategi untuk "pembunuhan" sel senescent yang disasarkan[13-15]. Untuk tujuan ini, kelas baru ubat yang dipanggil senolitik sedang giat berkembang. Senolytics menyasarkan laluan isyarat yang menyumbang kepada rintangan sel senescent terhadap apoptosis, dengan itu mendorong apoptosis secara keutamaan dalam sel senescent [16]. Senarai senolitik sentiasa diisi semula dengan ejen baharu. Sebatian yang paling terkenal dengan aktiviti senolitik yang dinyatakan ialah navitoclax (Bcl-2 perencat keluarga), gabungan dasatinib(perencat berbilang kinase tyrosine) dan quercetin (flavonol semulajadi), perencat Hsp90, perencat MDM2, FOXO{ {8}}Peptida mengganggu p53, pengurai protein keluarga BET, CAR-T khusus uPAR, navitoclax terkonjugasi galakto dan pelbagai sebatian semula jadi senolitik[16-24]. Baru-baru ini, menggunakan saringan ubat berdaya tinggi dua kumpulan penyelidikan bebas mengenal pasti glikosida jantung, terutamanya ouabain, digoxin, dan bufalin, sebagai senolitik spektrum luas [25,26].ulasan cistanche tubulosaPerlu dinyatakan bahawa hampir semua senolitik yang diisytiharkan mempunyai had, seperti kesan sampingan yang tidak diingini atau ketidakberkesanan terhadap beberapa jenis sel. Sel stem mesenchymal (MSCs), yang terdapat hampir dalam semua organ/tisu selepas bersalin, dicirikan oleh keupayaan untuk memperbaharui diri (bahagian simetri) dan untuk membezakan, sekali gus menyumbang kepada penyelenggaraan dan penjanaan semula tisu yang tinggal [27]. Oleh kerana sifat unik ini, bersama-sama dengan fungsi anti-radang dan imunosupresif yang kuat, MSC digunakan secara meluas dalam terapi penggantian sel untuk rawatan pelbagai penyakit, termasuk diabetes Mellitus, multiple sclerosis, infarksi miokardium, dan sebagainya [28]. Walau bagaimanapun, sama dengan keturunan mereka yang dibezakan dan sel-sel unipoten yang lain, MSCs dapat mengalami senesce sama ada replikatif atau pramatang sebagai tindak balas kepada pengaktifan onkogen dan rangsangan tekanan [29, 30]. Senescence MSCs mempunyai banyak kesan yang tidak diingini, antaranya adalah keletihan. kumpulan sel stem, mengurangkan penyelenggaraan dan penjanaan semula tisu, kapasiti pembezaan terjejas, penyebaran penuaan pengantaraan SASP, mengurangkan sifat angiogenik, pengubahsuaian niche sel stem [29,31-33]. Dengan mengambil kira kepentingan biologi fungsi MSC yang betul, MSC senescent mungkin dianggap sebagai sasaran penting untuk analisis. Selaras dengan cadangan ini, beberapa ulasan yang menonjolkan kemungkinan hasil yang berfaedah bagi penyingkiran MSC senescent telah diterbitkan sepanjang tahun lalu [29, 31, 34, 35]. Namun begitu, terdapat hanya beberapa data percubaan mengenai isu ini [36-40].

Dalam kajian ini, kami menunjukkan buat kali pertama bahawa glikosida jantung, iaitu ouabain dan bufalin, gagal memaparkan aktiviti hemolitik terhadap MSC manusia (hMSCs) yang diperoleh daripada endometrium (END-MSCs), tisu adiposa (AD-MSCs), pulpa gigi (DP-MSCs) dan Warton jelly (WJ-MSCs).Selain itu, kami mengesahkan bahawa kedua-dua glikosida jantung mampu mendorong apoptosis secara keutamaan dalam senes-cent A549 dan SK-HEP-1, seperti yang diterangkan sebelum ini dalam kajian rintis [25,26]. Dengan menilai perubahan dalam homeostasis ionik yang disebabkan oleh penyekatan Nat/K plus -ATPase dan tahap ekspresi gen yang berkaitan, kami mendedahkan bahawa ketiadaan analisis yang disebabkan oleh ouabain mungkin dimediasi oleh peningkatan keberkesanan import K plus pampasan dalam senescent END- MSC berbanding dengan A549 senescent. Tambahan pula, menggunakan bioinformatik lanjutan kami menunjukkan bahawa penuaan END-MSC, tahan terhadap analisis yang disebabkan oleh ouabain, disertai dengan pemerolehan fenotip tahan apoptosis, manakala penuaan A549 yang sensitif ouabain tidak. Yang penting, menyekat aktiviti protein antiapoptosis MCL{19}} sebelum rawatan glikosida jantung menghasilkan analisis END-MSC senescent yang tahan apoptosis. Oleh itu, kami memberikan bukti yang jelas bahawa apoptosis-resist-ance bukanlah ciri umum sel senescent. Berdasarkan data yang diperoleh, kami menyimpulkan bahawa keberkesanan pendekatan analitik mungkin bergantung kepada sama ada sel sememangnya menjadi tahan apoptosis semasa perkembangan penuaan.

Bahan dan kaedah

sel

END-MSCs, WJ-MSCs, DP-MSCs, AD-MSCs, A549, dan SK-Help diperoleh daripada Koleksi Budaya Sel Rusia (Institut Cytology, Saint-Petersburg, Rusia). Talian A549 dan SK-Help telah disahkan oleh karyology, tumorigenicity, ujian isoenzyme (LDH dan G6PD), dan analisis STR. Sel telah dikultur dalam medium lengkap DMEM F12(Gibco BRL) ditambah dengan 10 peratus FBS (HyClone), 1 peratus penicillin-streptomycin (Gibco BRL) dan 1 peratus glutamik (Gibco BRL). Semua sel telah diuji secara rutin untuk pencemaran mikoplasma.

Keadaan yang menyebabkan penuaan dan tekanan

Untuk penuaan yang disebabkan oleh tekanan oksidatif, END-MSCs/WJ-MSCs telah dirawat dengan 200 uM/100 uM H O (Sigma) selama 1 jam. Untuk penuaan yang disebabkan oleh doxorubicin, DP-MSCs/A549 telah dirawat dengan 1 μM doxorubicin （Veropharm） selama 3 hari. Dalam setiap kes, sel dianggap tua tidak lebih awal daripada 14 hari selepas rawatan. Untuk penuaan replikatif AD-MSC lebih awal daripada laluan ke-4 dikenal pasti sebagai sel kawalan dan kemudian daripada ke-10 sebagai sel tua. Untuk penuaan akibat etoposide A549/END-MSCs/SK-Help dirawat dengan 2 uM/5 uM/3 uM etoposide(Veropharm) selama 3 hari dan dianalisis tidak lebih awal daripada 7 hari selepas induksi penuaan. Dalam kes ini, reka bentuk rawatan sepenuhnya bertepatan dengan yang diterangkan dalam kajian dari mana data RNA-seq berasal (Wang et al., 2017). Dua glikosida jantung yang kami gunakan sebagai sebatian senolitik——Ouabain (Sigma) dan Bufalin (Calbiochem).

Untuk membandingkan rintangan tekanan antara kawalan dan END-MSC senescent atau A549, sel telah dirawat sama ada dengan 400/800 uM H O2(Sigma) selama 1 jam atau dengan 0.3/1 uM staurosporine (Sigma). Daya tahan sel dianalisis 48 jam selepas induksi tekanan.

Untuk menyekat aktiviti MCL-1 END-MSCs telah diprarawat dengan 10 uM A-1210477(Sigma)selama 3 hari.

Analisis sitometri aliran

Pengukuran daya maju sel, percambahan, saiz sel, auto-pendarfluor, kadar apoptosis, belahan caspase 3/7, potensi membran mitokondria, dan depolarisasi membran telah dijalankan oleh sitometri aliran. Sitometri aliran dilakukan menggunakan CytoFLEX (Beckman Coulter) dan data yang diperolehi dianalisis menggunakan perisian CytExpert versi 2.0. Sel yang melekat dibilas dua kali dengan PBS dan dituai dengan trypsinization. Sel-sel yang terpisah dikumpulkan dan digantung semula dalam medium segar dan kemudian dikira dan dianalisis untuk autofluoresensi. Untuk mengakses daya maju sel, 50ug/ml propidium iodide （Life Technologies） telah ditambahkan pada setiap sampel sejurus sebelum analisis. Saiz sel dinilai oleh penyebaran cahaya ke hadapan sitometrik sel PI-negatif. Induksi apoptosis telah disahkan menggunakan pewarnaan bersama Annexin-V-APC (Invitrogen) dan DAPI (Sigma) mengikut arahan pengilang. Aktiviti Caspase dinilai menggunakan CellEventTM Caspase-3/7 Kit Ujian Sitometri Aliran Hijau (Invitrogen) mengikut protokol pembuatan. Kehilangan potensi membran mitokondria dinilai menggunakan pewarna ratiometrik JC-1 (Invitrogen). Prosedur pewarnaan telah dijalankan mengikut protokol pengeluar. Untuk penyahkutuban membran, kami menggunakan probe pendarfluor DiBAC4(3) (Invitrogen).

Pewarnaan -galactosidase yang berkaitan dengan penuaan

Pewarnaan -Galactosidase (SA- -}Gal) yang berkaitan dengan senescence telah dilakukan menggunakan kit pewarnaan senescence -galactosidase (Teknologi Isyarat Sel) mengikut arahan pengilang. Analisis kuantitatif imej dihasilkan dengan aplikasi pakej MatLab, mengikut algoritma yang diterangkan sebelum ini[41]. Bagi setiap titik eksperimen, tidak kurang daripada 50 sel yang dipilih secara rawak telah dianalisis.

Western blotting

Western blotting telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [41]. Elektroforesis SDS-PAGE, pemindahan ke membran nitroselulosa, dan immunoblotting dengan pengesanan ECL (Thermo Scientific) dilakukan mengikut protokol pengilang standard (Bio-Rad Laboratories). Antibodi terhadap protein berikut telah digunakan: gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenase (GAPDH)(klon 14C10), fosfo-p53(Ser15), p21(klon 12D1), fosfo-Rb (Ser807/811) , HMGB1(klon D3E5), serta lobak pedas peroksidase-konjugasi kambing antiarnab IgG. Kadar pencairan adalah 1:1000 untuk semua antibodi primer dan 1:7000 untuk antibodi sekunder. Semua antibodi dibeli daripada Cell Signaling. Scion Image 4.0(Scion Corporation) telah digunakan untuk memilih dan menentukan ketumpatan tolak latar belakang jalur dalam semua gel dan tompok.

Analisis transkriptomik

Sampel daripada tiga set data Gene Expression Omnibus (GEO)RNA-seq berikut telah digunakan dalam analisis: GSE102639(GSM2742113-GSM2742114 dan GSM2742121-GSM2742122forcontrol and senescentA549cells, sewajarnya); GSE122081(GSM3454482-GSM3454484 dan GSM3454500-GSM3454502 untuk kawalan dan sel IMR-90 senescent, sewajarnya); dan set data kami GSE160702 (GSM4877895-GSM4877898 dan GSM4877907-GSM4877910 untuk kawalan dan END-MSC senescent, masing-masing). Data untuk semua set data telah diproses dengan cara yang sama.

Data bacaan mentah menjalani penapisan berkualiti dan pemangkasan penyesuai melalui skrip FilterByTile dan BBDuk daripada pakej BBtools (versi 38.75) menggunakan pilihan lalai. Bacaan selebihnya telah ditapis dan dipangkas tambahan dengan penggunaan skrip trimester daripada pek-age FastqPuri (versi 1.0.7).cistanche UKOperasi pemangkasan digunakan untuk kedua-dua hujung bacaan jika ia mengandungi N atau kualitinya berada di bawah ambang kualiti yang ditetapkan kepada 27, semua bacaan yang lebih pendek daripada 25 tapak telah dibuang. Kawalan kualiti pemangkasan telah diadakan dengan perisian FastQC (versi 0.11.7) dan skrip FastqPuri. Bacaan, setelah melepasi semua operasi, terdiri tidak kurang daripada 90 peratus daripada data awal.

Kelimpahan transkrip dianggarkan menggunakan pemetaan ringan Salmon (versi 1.1.0)yang berjalan dalam mod penjajaran terpilih. Senarai umpan telah dijana berdasarkan genom rujukan manusia Gencode GRCh38.p13 (keluaran 33) dan digunakan selanjutnya untuk membina indeks pada fail rujukan transkriptom dan genom Gencode yang digabungkan (keluaran 33) menggunakan saiz kmer 21. Operasi pemetaan dijalankan dengan bendera tambahan——numBootstraps 30——labuci——gcBias——sahkan pemetaan. Kadar pemetaan yang terhasil adalah sekitar 70 peratus .

Pemprosesan data selanjutnya dilakukan menggunakan R versi 3.6.3 dengan koleksi pakej Tidyverse (versi 1.3.0). Anggaran kiraan gen, metadata dan julat transkrip telah dimuatkan ke dalam R dan diringkaskan kepada tahap gen menggunakan tximeta (versi 1.4.5). Matriks kiraan yang terhasil telah ditapis untuk mengandungi baris yang mempunyai sekurang-kurangnya 5 kiraan anggaran merentas semua sampel, matriks yang terhasil mengandungi 20,400 gen.

Untuk perwakilan PCA dan peta haba, kiraan bacaan telah dinormalkan menggunakan transformasi log daripada pakej DESeq2 (versi 1.26.0).cistanche wirkungPeta haba telah dibina dengan penggunaan penapis gen(versi 1.38.0) dan peta haba(versi 1.0.12)R pakej. Pengesahan sampel pembahagian mengikut pembolehubah penuaan telah dijalankan melalui subtetapan kiraan bacaan ternormal oleh gen yang berkaitan dengan istilah Ontologi Gen "Senescence Cellular"(GO 0090398). Analisis ekspresi pembezaan dan anggaran perubahan lipatan log telah dikira menggunakan DESeq2 untuk pembolehubah terakhir dalam formula reka bentuk kawalan-ling untuk status penuaan sel, tindak balas rawatan ouabain, dan interaksi faktor yang ditunjukkan. Untuk mengukuhkan ujian ungkapan pembezaan, pembetulan perubahan lipatan log menggunakan gabungan penganggar pengecutan suai daripada pakej sawit (versi 1.8.0) dan menetapkan ambang perubahan lipatan log tambahan bersamaan dengan 0.667 telah digunakan. Anggaran susut yang terhasil digunakan selanjutnya untuk pemeringkatan gen dan menjalankan Analisis Pengayaan Set Gene menggunakan profil kluster (versi 3.14.3) dan pakej fius (versi 1.12.0) R dengan nilai p diselaraskan untuk berbilang perbandingan mengikut kaedah Benjamin-Hochberg. Sampel microarray Affymetrix untuk kawalan dan senes-cent AD-MSCs diperoleh daripada pangkalan data GEO (GSE66236) dan diproses dengan aplikasi web Phantasus dengan log2 dan penormalan bilangan kuantil. Analisis Pengayaan Set Gen dilakukan dengan menggunakan pakej fius (versi 1.12.0)R.

Pengekstrakan RNA, transkripsi terbalik, dan PCR masa nyata

Pengekstrakan RNA, transkripsi terbalik, dan PCR masa nyata telah dilakukan seperti yang diterangkan dalam kajian terdahulu kami [32]. Reagen untuk pengekstrakan RNA (reagen ExtractRNA), transkripsi terbalik (kit MMLV RT), dan PCR masa nyata (kit HS SYBR) diperoleh daripada Evrogen. Tahap ekspresi gen dinilai menggunakan penguat PCR BioRad CFX-96 masa nyata (BioRad) dengan program berjalan berikut untuk semua gen yang disiasat: 40 kitaran lebur selama 10 saat pada 95 darjah, penyepuhlindapan selama 15 saat pada 57.5 darjah , dan sintesis selama 15 s pada 72 darjah . Analisis keluk lebur digunakan untuk mengawal kekhususan tindak balas. Analisis data yang diperolehi berikut telah dilakukan menggunakan perisian Pengurus CFX Bio-Rad (BioRad) dengan kaedah kuantifikasi standard 2deltaCt dengan menggunakan ungkapan GAPDH sebagai rujukan. Urutan primer disenaraikan dalam Jadual 1.

Analisis statistik

Untuk mendapatkan kepentingan dalam perbezaan antara dua kumpulan Ujian-t Pelajar atau ujian-t Welch telah digunakan. Untuk pelbagai perbandingan antara kumpulan, ANOVA dengan HSD Tukey telah digunakan. Melainkan dinyatakan sebaliknya, semua data kuantitatif ditunjukkan sebagai min±SD dan asterisk menunjukkan perbezaan ketara seperti berikut: ns, tidak signifikan,*p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">

Keputusan

H2O2-END-MSC yang dirawat memasuki penuaan pramatang

Dalam kajian ini, kami menggunakan sel stem mesenchymal manusia yang diasingkan daripada endometrium desquamated (END-MSCs), yang memenuhi kriteria minimum yang dicadangkan oleh ISCT untuk menentukan hMSCs [41]. Sebelum ini, kami telah membangunkan model eksperimen yang boleh dipercayai untuk mengkaji pelbagai aspek penuaan pramatang END-MSCs [30]. Iaitu, kami telah menunjukkan bahawa END-MSC yang tertakluk kepada tekanan oksidatif sublethal secara beransur-ansur memperoleh semua ciri tipikal sel senescent, termasuk fokus kerosakan DNA yang berterusan dan tindak balas kerosakan DNA aktif, penangkapan kitaran sel tidak dapat dipulihkan yang dimediasi oleh p53/p21/Rb klasik laluan, kehilangan percambahan, hipertrofi sel, penampilan SA- -Pewarnaan gal dan perkembangan fenotip rembesan yang berkaitan dengan penuaan [30, 32, 42]. Di sini kami menggunakan model yang direka untuk mengkaji kesan senolitik ouabain serta untuk mendedahkan perubahan intraselular yang mendasari dalam homeostasis ion. Pada mulanya, dengan menganggar parameter yang paling biasa, kami mengesahkan bahawa rawatan dos tunggal（1 jam, 200 μM）H O adalah mencukupi untuk mendorong penuaan dalam END-MSCs. Yang penting, END-MSC yang tertekan dianggap senescent dua minggu selepas tekanan oksidatif; oleh itu, semua penanda senescence dinilai tidak lebih awal daripada 14 hari selepas rawatan H-Oz. Sesungguhnya, rawatan H-Oz END-MSC membawa kepada blok percambahan, hipertrofi sel seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan saiz sel, pengumpulan lipofuscin yang dikesan oleh ketinggian autofluoresensi, penampilan SA- -Gal, pengaktifan Laluan p21/Rb dan kehilangan HMGB1 bersama-sama menyokong penubuhan penuaan di bawah keadaan eksperimen yang dipilih (Rajah ac, e, f).

Kesan paling berbahaya sel senescent pada tahap tisu dan organisma dipercayai akibat daripada daya hidup yang berpanjangan. Selaras dengan perkara ini, END-MSC yang dirawat HO? mengekalkan daya maju yang tinggi walaupun pada peringkat akhir perkembangan penuaan (daya maju END-MSC senescent dinilai 17 hari (14 hari＋3 hari) selepas tekanan oksidatif awal)(Gamb.1d ). Ringkasnya, rawatan HO sublethal2-untuk END-MSCs ialah model yang sesuai bagi penuaan pramatang dan relevan untuk menyiasat kesan sebatian senolitik pada END-MSC.

Ouabain glikosida jantung tidak mempunyai aktiviti senolitik terhadap END-MSCs senescent dalam julat kepekatan yang luas

Bukti terkini menunjukkan bahawa glikosida jantung, termasuk ouabain, digoxin, dan bufalin, mewakili keluarga sebatian dengan aktiviti hemolitik [25,26]. Walaupun hari ini glikosida jantung dianggap sebagai senolitik spektrum luas, data mengenai kesannya terhadap hMSC senescent adalah kurang. Oleh itu, di sini kami menguji sama ada ouabain mempunyai potensi untuk mendorong kematian secara selektif dalam END-MSCs senescent. Untuk berbuat demikian, kami menilai daya maju kawalan dan END-MSC senes-cent selepas rawatan dengan ouabain pada julat kepekatan yang luas (dari 10-' hingga 10~ M). Menariknya, tiada kepekatan yang digunakan menyebabkan penurunan ketara dalam daya maju kedua-dua sel kawalan dan senescent pada hari pertama selepas penggunaan ouabain (Rajah 2 dan Rajah Tambahan S1).

Walau bagaimanapun, pada hari ketiga selepas rawatan ouabain, kami mendedahkan penurunan yang bergantung kepada dos yang ketara dalam daya maju kawalan END-MSCs (Rajah 2a dan Rajah Tambahan S1). Tanpa diduga, sel senescent ternyata lebih tahan terhadap ouabain pada setiap kepekatan yang diuji. Selaras dengan keputusan ini,10-M ouabain menyebabkan kematian apoptosis yang lebih terdedah dalam sel kawalan(20.75 peratus An tambah /PI-dan 36.47 peratus An tambah /PI tambah ) berbanding dengan yang tua(15.01 peratus An＋/PI -dan 12.15 peratus Satu tambah /PI tambah )(Gamb.2b). Keputusan yang diperolehi dengan jelas menunjukkan bahawa dalam konteks senescent END-MSCs ouabain tidak mempunyai aktiviti senolitik.

Untuk mengecualikan kemungkinan kesan yang berkaitan dengan kebolehubahan rangsangan yang mendorong penuaan pada tindakan senolitik ouabain, kami melakukan satu set eksperimen tambahan. Iaitu, kami merawat END-MSC dengan etoposide dan bukannya tekanan oksidatif untuk mendorong penuaan pramatang.bioflavonoid sitrusEND-MSC yang dirawat Etoposide memaparkan semua ciri khas untuk sel senescent (Rajah 3a-e).

Yang penting, ouabain tidak mempunyai tindakan hemolitik terhadap END-MSC senescent yang dirawat etoposide (Rajah 3f dan Rajah S2). Data ini memberikan pengesahan tambahan untuk keputusan di atas dan bukti bahawa kekurangan analisis yang disebabkan oleh ouabain bukanlah akibat daripada pencetus penuaan konkrit yang digunakan untuk mendorong penuaan.

Rajah.1 Pengesahan model penuaan pramatang END-MSC yang disebabkan oleh tekanan oksidatif. Senescent END-MSCs percambahan longgar, b mengalami hipertrofi, c memperoleh autofluoresensi yang tinggi, mengekalkan daya maju sel yang tinggi d dan e memaparkan aktiviti SA- -Gal berbanding dengan kawalan. f Tahap fosforilasi p53 dan Rb dan tahap ekspresi p21 dan protein HMGBI dalam kawalan dan senescent END-Ouabain tidak mempunyai tindakan hemolitik terhadap sel stem mesenchymal manusia pelbagai asal Untuk meluaskan pemerhatian kami mengenai ketiadaan analisis yang disebabkan oleh ouabain dalam END-MSCs , kami menganalisis kesan ouabain pada hMSC yang diasingkan daripada sumber lain termasuk tisu adiposa, pulpa gigi dan jeli Wharton. Untuk mengukuhkan lagi data kami, kami menggunakan model penuaan yang berbeza——penuaan replikatif untuk AD-MSC, penuaan akibat doxorubicin untuk DP-MSC dan penuaan akibat tekanan oksidatif untuk WJ-MSC (Rajah 4a-f).

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah.4g, pelbagai jenis hMSC berbeza dalam daya maju semasa rawatan ouabain, sebagai contoh, kedua-dua kawalan dan DP-MSC senescent adalah lebih tahan terhadap tindakan ouabain daripada WJ-MSCs (Rajah 4g dan Rajah Tambahan S3b, c). Namun begitu, ouabain tidak dapat mendorong senolisis dalam kedua-dua jenis hMSC senescent (Rajah 4g dan Rajah Tambahan S3). Bersama-sama, data yang diperoleh menunjukkan ketiadaan analisis yang disebabkan oleh ouabain adalah ciri biasa untuk pelbagai jenis hMSC. MSC. Nilai yang dibentangkan ialah min±SD. Untuk perbandingan berbilang kumpulan pada a dan d, ANOVA sehala telah digunakan, n=3, ns tidak ketara,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">

GAPDH digunakan sebagai kawalan pemuatan

Bufalin glikosida jantung gagal membunuh END-MSCS senescent

Untuk mengesahkan ketiadaan tindakan senolitik glikosida jantung terhadap hMSC, kami menggunakan bufalin, sebatian lain dengan aktiviti senolitik yang dinyatakan milik keluarga glikosida jantung [25]. Bufalin hampir tidak mempunyai kesan ke atas daya maju kawalan dan H2O2-senes-cent END-MSCs yang dirawat dalam julat kepekatan yang luas (dari 10-7 hingga 10-5 M) (Rajah 5a dan Tambahan Rajah S4a).

Sama seperti apa yang kita perhatikan untuk rawatan ouabain, ketiadaan analisis ke atas bufalin adalah bebas daripada rangsangan yang mendorong penuaan, kerana daya maju ESC yang terkumpul sama ada sebagai tindak balas kepada tekanan oksidatif atau etoposide tidak terjejas (Rajah 5a, b, Rajah Tambahan). S4a, b). Keputusan yang diterangkan di atas mengesahkan bahawa glikosida jantung ternyata tidak berkesan untuk induksi kematian yang disasarkan dalam END-MSCs senescent. MSC. Nilai yang dibentangkan ialah min±SD. Untuk perbandingan berbilang kumpulan pada a dan d, ANOVA sehala telah digunakan, n=3, ns tidak ketara,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">

Bufalin glikosida jantung gagal membunuh END-MSCS senescent

Untuk mengesahkan ketiadaan tindakan senolitik glikosida jantung terhadap hMSC, kami menggunakan bufalin, sebatian lain dengan aktiviti senolitik yang dinyatakan milik keluarga glikosida jantung [25]. Bufalin hampir tidak mempunyai kesan ke atas daya maju kawalan dan H2O2-senes-cent END-MSCs yang dirawat dalam julat kepekatan yang luas (dari 10-7 hingga 10-5 M) (Rajah 5a dan Tambahan Rajah S4a).

Sama seperti apa yang kita perhatikan untuk rawatan ouabain, ketiadaan analisis ke atas bufalin adalah bebas daripada rangsangan yang mendorong penuaan, kerana daya maju ESC yang terkumpul sama ada sebagai tindak balas kepada tekanan oksidatif atau etoposide tidak terjejas (Rajah 5a, b, Rajah Tambahan). S4a, b). Keputusan yang diterangkan di atas mengesahkan bahawa glikosida jantung ternyata tidak berkesan untuk induksi kematian yang disasarkan dalam END-MSCs senescent.

Rajah.2 Ouabain tidak mempunyai aktiviti hemolitik terhadap HO2-senes-cent END-MSCs dalam julat kepekatan yang luas. Daya maju sel relatif ( peratus ) kawalan dan END-MSC senescent dalam 3 hari selepas rawatan dengan 1077,10~6,10-5 M ouabain. b Induksi apoptosis dalam END-MSC apabila 10-6 M ouabain dinilai dengan pewarnaan berganda Annexin V/DAPI. n{13}} percubaan bebas. Semua data sepadan dengan min±SD. Kepentingan statistik dinilai oleh ujian-t Welch: ns tidak signifikan,***p<>

Kedua-dua glikosida jantung ouabain dan bufalin mampu menyebabkan kematian sel secara selektif dalam sel A549 dan SK-Hep1 senescent

Dengan mengambil kira fakta bahawa keputusan kami tidak sepadan dengan bukti yang diterbitkan baru-baru ini mengenai tindakan senolitik spektrum luas glikosida jantung, kami memutuskan untuk menghasilkan semula kesan ini menggunakan model selular yang diterangkan dalam kajian yang berkaitan [25,26]. Oleh itu, kami melakukan satu siri eksperimen menggunakan kawalan dan sel karsinoma paru-paru A549 senescent. Senescence dalam sel A549 telah diinduksi oleh rawatan etoposide. Penuaan akibat Etoposide bagi sel A549 adalah model penuaan yang disebabkan oleh terapi yang kerap digunakan dan dengan itu dicirikan dengan baik [4]. Selain itu, ouabain ditunjukkan secara selektif membunuh sel A549 senescent yang dirawat etoposide[25]. Untuk membuktikan penuaan dalam A549, kami menilai kadar percambahan, saiz sel, pengumpulan lipo-halus, pewarnaan SA- -Gal, status pengaktifan daripada laluan p53/p21/Rb, dan tahap ekspresi HMGB1 (Rajah 6a-e).

Untuk mengesahkan aktiviti hemolitik ouabain terhadap sel kanser tua, kami mula-mula menganggarkan daya maju sel yang bergantung kepada dos. Selaras dengan keputusan kami yang diterangkan di atas, kami tidak dapat mengesan sebarang penurunan ketara dalam bilangan kawalan berdaya maju atau sel A549 senescent dalam masa 24 jam selepas penggunaan ouabain (Tambahan Rajah S5a). Walau bagaimanapun, dalam 3 hari selepas rawatan, ouabain telah mengurangkan daya maju sel A549 senescent dengan cara yang bergantung kepada dos, manakala bilangan sel kawalan A549 berkurangan ke tahap yang lebih rendah (Rajah 7a dan Rajah Tambahan S5a). Iaitu, kira-kira 90 peratus sel kawalan mengekalkan daya maju di 10- M ouabain berbanding 50 peratus sel A549 senescent yang dirawat dengan dos yang sama (Gamb.7a). Selain itu, sel A549 senescent lebih terdedah kepada kematian sel yang disebabkan oleh bufalin berbanding rakan kawalan mereka (Rajah.7b)(Rajah.5b dan Rajah Tambahan.S5b).

Menurut data yang diterbitkan, ouabain mencetuskan apoptosis bergantung -3-caspase dalam sel A549 senescent [26]. Sesungguhnya, kami mendedahkan peningkatan ketara dalam dua kali ganda positif dan/atau pecahan PI dalam sel kanser tua yang dirawat dengan 10-6M ouabain (Rajah 7c). Tambahan pula, menggunakan ujian pendarfluor kami memerhatikan pengaktifan caspase-3 dalam sel A549 senescent yang dirawat ouabain (Rajah 7d). Diambil bersama, keputusan ini benar-benar konsisten dengan data yang diterangkan oleh pengarang lain dan mengesahkan aktiviti hemolitik ouabain terhadap A549.

Juga, kami menggunakan doxorubicin dan bukannya etoposide untuk menyebabkan penuaan dalam A549 (Rajah 8a-e). Seperti yang dijangkakan, senescent A549 yang dirawat doxorubicin, serta rawatan etoposide menunjukkan kepekaan yang lebih tinggi untuk kedua-dua ouabain dan bufalin berbanding rakan kawalan mereka (Rajah 8g dan Rajah Tambahan S6). Yang terakhir mengesahkan bahawa kesan senolitik glikosida jantung adalah bebas daripada rangsangan yang mendorong penuaan. Oleh itu, glikosida jantung sememangnya mempunyai senolitik

Rajah.3 Ouabain tidak dapat mendorong senolisis dalam END-MSC senescent yang dirawat etoposide. Pengesahan model penuaan akibat episod untuk END-MSC: keupayaan percambahan, saiz sel b, tahap autofluoresensi dan d SA- -aktiviti Gal, tahap fosforilasi Rb dan tahap ekspresi protein p21 dan HMGBI. f Daya maju sel relatif ( peratus ) kawalan dan sel senescent selepas rawatan dengan 10-6 ouabain. Nilai ialah min±SD. Untuk perbandingan berbilang kumpulan pada ANOVA sehala telah digunakan,n=3, ns tidak ketara,***p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">

Akhirnya, kami memutuskan untuk menghasilkan semula eksperimen analisis pada sel kanser hati yang dirawat etoposide SK-Help, model sel lain dengan kesan senolitik glikosida jantung yang terbukti mengikut Guerrero et al. kajian [25] (Gamb.9a-e). SK-Help yang dirawat dengan Etoposide menunjukkan kepekaan yang lebih tinggi kepada kedua-dua agen berbanding dengan rakan kawalan mereka, membuktikan tindakan hemolitik glikosida jantung terhadap jenis sel ini (Rajah 9f dan Rajah Tambahan S7).

Bersama-sama bukti data ini bahawa selektiviti hemolisis yang disebabkan oleh glikosida jantung lebih bergantung pada sifat sel daripada pada pencetus penuaan konkrit.

Artikel ini diekstrak daripada Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x