Pengenalpastian ACOT13 Dan PTGER2 Sebagai Gen Calon Novel Penyakit Ginjal Polikistik Dominan Autosomal Melalui Penjujukan Seluruh Exome

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Na Du¹, Dan Dong³, Luyao Sun¹, Lihe Che¹, Xiaohua Li¹, Yong Liu^2*†dan Bin Wang^1*†

Abstrak

latar belakang:Polikistik dominan autosomalbuah pinggangpenyakit (ADPKD) adalah monogenik yang paling biasabuah pingganggangguan. Separuh daripada pesakit perlahan-lahan akan berkembang menjadi penyakit buah pinggang peringkat akhir. Walau bagaimanapun, sasaran berpotensi untuk rawatan ADPKD masih kurang.

Kaedah:EmpatADPKDpesakit dan dua ahli keluarga yang sihat telah dimasukkan dalam kajian ini. Sampel darah periferal diperoleh dan diuji oleh penjujukan seluruh exome (WES). Mutasi autosomal dalam pesakit ADPKD dikekalkan sebagai tapak calon. Gene Ontology (GO), Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Kyoto, dan analisis rangkaian interaksi protein-protein (PPI) dilakukan oleh pakej roller roller R. Satu set data yang mengandungi 18 pesakit ADPKD dan tiga sampel biasa telah dimuat turun daripada pangkalan data Gene Expression Omnibus (GEO) dan dianalisis menggunakan pakej limma R.

Kaedah:EmpatADPKDpesakit dan dua ahli keluarga yang sihat telah dimasukkan dalam kajian ini. Sampel darah periferal diperoleh dan diuji oleh penjujukan seluruh exome (WES). Mutasi autosomal dalam pesakit ADPKD dikekalkan sebagai tapak calon. Gene Ontology (GO), Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Kyoto, dan analisis rangkaian interaksi protein-protein (PPI) dilakukan oleh pakej roller roller R. Satu set data yang mengandungi 18 pesakit ADPKD dan tiga sampel biasa telah dimuat turun daripada pangkalan data Gene Expression Omnibus (GEO) dan dianalisis menggunakan pakej limma R.

Kesimpulan:Melalui gabungan WES, ekspresi gen, dan analisis rangkaian PPI, kami mengenal pasti ACOT13 dan PTGER2 sebagai berpotensiADPKD-gen berkaitan.

Kata kunci:Penjujukan keseluruhan exome, Mutasi gen, Polikistikbuah pinggangpenyakit, ACOT13, PTGER2

Cistanche tubulosa mencegah penyakit buah pinggang, klik di sini untuk mendapatkan sampel

pengenalan

Polikistikbuah pinggangpenyakit (PKD) ialah sekumpulan gangguan monogenik dan merupakan punca biasa penyakit buah pinggang peringkat akhir. Kebanyakan pesakit dewasa dipengaruhi oleh bentuk dominan autosomal (ADPKD), manakala polikistik resesif autosomalbuah pinggangpenyakit (ARPKD) adalah bentuk yang jarang berlaku yang biasanya muncul secara perinatal atau pada peringkat awal kanak-kanak [1]. Mutasi dalam PKD1 dan PKD2, yang mengekod protein polycystin 1 dan 2 (PC1 dan PC2), adalah punca ADPKD yang paling biasa. PC2, saluran kation, adalah ahli keluarga potensi reseptor sementara (TRP) bagi saluran ion [2]. Telah dilaporkan bahawa kecacatan dalam PKD2 mencetuskan perubahan dalam metabolisme tenaga mitokondria [3]. peranan kompleks PC1 dan PC1PC2 kurang difahami [4]. Walaupun PKD diwarisi secara monogenik, ia adalah heterogen dalam fenotip, gen, dan alel [1], dan 7 peratus daripadaADPKDkeluarga secara genetik tidak dapat diselesaikan [5]. Selain itu, mekanisme molekul yang mendasaribuah pinggangdisfungsiakibat daripada mutasi dalam gen PKD dan fungsi fisiologi protein polycystin juga masih tidak jelas [6].

Protein 1 dan 2 (PC1 dan PC2) adalah punca ADPKD yang paling biasa. PC2, saluran kation, adalah ahli keluarga potensi reseptor sementara (TRP) bagi saluran ion [2]. Telah dilaporkan bahawa kecacatan dalam PKD2 mencetuskan perubahan dalam metabolisme tenaga mitokondria [3]. peranan kompleks PC1 dan PC1PC2 kurang difahami [4]. Walaupun PKD diwarisi secara monogenik, ia adalah heterogen dalam fenotip, gen, dan alel [1], dan 7 peratus daripada keluarga ADPKD secara genetik tidak dapat diselesaikan [5]. Selain itu, mekanisme molekul yang mendasari disfungsi buah pinggang akibat mutasi dalam gen PKD dan fungsi fisiologi protein polycystin juga masih tidak jelas [6].

Di sini, kami melakukan WES menggunakan sampel darah empat pesakit ADPKD dan dua ahli keluarga yang sihat untuk menganalisis variasi gen mereka. Di samping itu, set data ekspresi gen yang mengandungi 18 pesakit ADPKD dan tiga sampel normal diperoleh daripada pangkalan data Gene Expression Omnibus (GEO). Melalui analisis bersepadu mutasi gen, ekspresi gen, pengayaan fungsi gen, dan interaksi protein-protein (PPI), kami mengenal pasti dua gen (ACOT13 dan PTGER2) yang berpotensi dikaitkan dengan patogenesis ADPKD.

Bahan dan kaedah

Maklumat klinikal

Kajian ini telah diluluskan oleh jawatankuasa etika tempatan (nombor kelulusan: 2019-307). Seorang pesakit ADPKD telah dirawat di hospital kami dan lima ahli keluarga ini telah dimasukkan dalam kajian ini. Pesakit ini mempunyai sejarah polikistikbuah pinggang penyakit, penyakit hati polikistik, dan batu karang selama 13 tahun (Fail tambahan 1: Jadual S1). Silsilah keluarga ini ditunjukkan dalam Rajah 1A. Te N_2 ialah proband ini. Te N_4, N_5 dan N_6 adalah semua pesakit ADPKD (hitam), manakala N_3 dan N_1 ialah orang yang sihat (putih) . Secara keseluruhan, terdapat empat pesakit ADPKD dan dua kawalan sihat dalam kajian kami. Gejala klinikal proband ini termasuk demam, sakit belakang, dan hematuria. Pemeriksaan tomografi (CT) terkira N{10}} mendedahkan berbilang sista dalam hati dan buah pinggang polikistik dua hala. Sesetengah lesi adalah sista kompleks, dengan perubahan dalam eksudasi perirenal kanan yang mempunyai garis luar yang kabur dan peningkatan ketumpatan (Rajah 1B).

Penjujukan exome keseluruhan

DNA genom telah diekstrak daripada sampel darah periferi menggunakan kit pengekstrakan DNA (Tiangen Biotech, Beijing, China), dan exomes telah ditangkap menggunakan kit Agilent SureSelect Human All Exon V6 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) mengikut arahan. daripada kit. Penjujukan seluruh exome telah dilakukan menggunakan instrumen Illumina Novaseq6000 dengan bacaan jujukan bp 150-akhir berpasangan. Bacaan jujukan mentah telah dipraproses untuk mengalih keluar asas berkualiti rendah dan membaca menggunakan pantas [11], prapemproses FASTQ semua-dalam-satu ultra-pantas dan parameter lalai telah diterima pakai. Bacaan urutan diselaraskan dengan genom manusia (Build-UCSC hg19) menggunakan perisian BWA (Burrow-Wheeler Aligner, http://bio-bwa.sourceforge.net/). Sepuluh, polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) dan Insertion/deletion (Indel) telah dikenal pasti dengan perisian SAMtools (//samtools.sourceforge.net/). Menggunakan perisian ANNOVAR (http://annovar.openbioinformat ics.org/en/latest/user-guide/download/), anotasi berfungsi telah dilakukan untuk SNP dan Indel yang dikenal pasti untuk menyiasat lokasi genomik dan maklumat variasi mereka (Fail tambahan 2 : Jadual S2).

Penapisan calon SNP/Indel untuk ADPKD

Kami mula-mula mengalih keluar mutasi dengan frekuensi lebih tinggi daripada 1 peratus dalam sekurang-kurangnya satu daripada empat pangkalan data (1000g_semua, esp6500si_semua, gnomAD_SEMUA dan gnomAD_ EAS). Sepuluh, mutasi dalam kedudukan eksonik atau penyambungan (10 bp hulu dan hilir exon) dikekalkan. Serpihan kecil (<10 bp)="" non-frameshifting="" indel="" mutations="" in="" the="" repeat="" region="" were="" also="" removed.="" in="" addition,="" mutations="" that="" met="" one="" of="" the="" following="" conditions="" were="" retained:="" (a)="" te="" sites="" that="" were="" considered="" as="" harmful="" by="" at="" least="" half="" of="" the="" four="" software="" sift="" [12],="" polyphen="" [13],="" mutationtaster="" [14],="" and="" cadd="" [15]="" basing="" on="" the="" scores;="" (b)="" mutations="" that="" were="" predicted="" to="" affect="" the="" splicing="" by="" dbscsnv="" [16].="" ten,="" the="" genetic="" mutations="" that="" were="" classified="" into="" pathogenic="" and="" likely="" pathogenic="" ones="" according="" to="" the="" criteria="" and="" guidelines="" for="" grading="" clinical="" significance="" of="" single-gene="" mutations="" of="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" and="" genomics="" (acmg,="" https://www.acmg.net/)="" were="" selected="" as="" candidate="" sites.="" for="" the="" screening="" of="" dominant="" genetic="" pattern,="" on="" the="" basis="" of="" mutation="" site="" filtering,="" the="" sites="" showing="" autosomal="" mutations="" in="" adpkd="" patients,="" which,="" however,="" could="" not="" be="" detected="" in="" normal="" controls="" were="" retained="" as="" candidate="">

Pengayaan fungsional dan analisis PPI

Data profil ekspresi mRNA GSE7869 [18] telah dimuat turun daripada pangkalan data GEO (https://ncbi.nlm. nih.gov/geo), yang telah dikesan berdasarkan Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array . Dataset GSE7869 mengandungi 18 sampel ADPKD dan tiga sampel biasa. Data profil ekspresi mRNA dianalisis menggunakan pakej fungsi limma dalam R [19]. Gen yang dinyatakan secara berbeza (DEG) telah dipilih menggunakan ambang nilai mutlak ungkapan pembezaan (|Log2FC|) > 0.5 dan nilai P <>

Analisis statistik

Analisis statistik dilakukan menggunakan perisian R v3.5.2. P-value < 0.05="" dianggap="" signifikan="" secara="" statistik="" dalam="" semua="" analisis="">

Results

Mutatipadaal landscape

Jumlah bilangan SNP dalam enam sampel tertumpu antara 100,000 dan 150,000, dan mereka terletak terutamanya di rantau intron, rantau ekson dan rantau intergenik (Rajah 2A). Jumlah bilangan Indel dalam enam sampel tertumpu antara 15,000 dan 20,000, dan Indel ini diedarkan terutamanya di kawasan intron dan intergenik (Rajah 2B). Kami seterusnya meneroka landskap mutasi yang terletak di kawasan pengekodan. Akibatnya, SNP bagi enam sampel dalam kawasan pengekodan terutamanya termasuk mutasi tanpa nama, missense dan stop-loss, yang nombor kumulatifnya hampir 21,000 (Rajah 2C). Indels enam sampel dalam rantau pengekodan terutamanya terdiri daripada pemadaman_nonframeshift dan nonframeshift_sisipan (Gamb. 2D)

Mutasi dan gen yang berpotensi untuk ADPKD

Enam gen mutan, termasuk AGRN, ACOT13, ADCY4, HEATR5A, PTGER2, dan ADAM21, telah disaring menggunakan corak genetik yang dominan. Mereka bermutasi secara heterozigot dalam sampel ADPKD tetapi tidak bermutasi dalam sampel biasa. Kebanyakan gen ini tidak dilaporkan berkaitan dengan kejadian ADPKD. Sementara itu, 19 gen juga dipilih mengikut kemudaratan mutasi, termasuk MUTYH, USH2A, HBS1L, GLI3, SBDS, SND1, ABCA2, RPS6KA4, FLVCR1, ATIC, SCN11A, ATP6V1A, GLRA1, PRMT8, PKD1, INHSL3, SUPERT. , dan GPR143. Untuk mengkaji hubungan antara mutasi gen tersebut dan ADPKD, kami mula-mula menganalisis kesan mutasi gen pada protein. Akibatnya, semua gen tersebut mempunyai sekurang-kurangnya satu mutasi yang boleh menjejaskan pengekodan protein, yang menunjukkan potensi peranan mutasi tersebut (Jadual 1).

Laluan KEGG yang diperkaya dengan ketara dan istilah GO bagi gen berkaitan ADPKD yang berpotensi

Keputusan analisis pengayaan GO dan KEGG bagi 25 gen berpotensi yang dikaitkan dengan ADPKD ditunjukkan dalam Rajah 3A (Proses Biologi), Rajah 3B (Komponen Selular), Rajah 3C (Fungsi Molekul) dan Rajah 3D (KEGG) . Analisis GO menunjukkan bahawa 25 gen ini diperkaya dengan ketara dalam proses biologi (BP) proses selular organisma tunggal dan tindak balas terhadap rangsangan, komponen sel (CC) membran plasma dan pinggiran sel, dan fungsi molekul (MF) pengikatan anion. Di samping itu, analisis laluan KEGG mendedahkan bahawa 25 gen ini terutamanya diperkaya dalam laluan dan laluan isyarat adenosin monofosfat (cAMP) kitaran dalam kanser.

ACOT13 dan PTGER2 mungkin gen calon yang dikaitkan dengan ADPKD

Analisis rangkaian PPI dilakukan untuk meneroka persatuan antara 25 gen berkaitan ADPKD yang berpotensi. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3E, kebanyakan gen tersebut adalah bebas dalam rangkaian. ACOT13 mempunyai interaksi langsung dengan kedua-dua SBDS dan ATIC; PTGER2, ADCY4, dan INSL3 diramalkan untuk berinteraksi antara satu sama lain (Rajah 3E). Lebih-lebih lagi, ACOT13, PTGER2, dan ADCY4 adalah gen yang hanya bermutasi dalam pesakit ADPKD. , berdasarkan data ekspresi yang dimuat turun daripada pangkalan data GEO, kami membandingkan tahap ekspresi ACOT13, PTGER2 dan ADCY4 antara pesakit ADPKD dan kawalan biasa. Berbanding dengan kawalan biasa, tahap ekspresi ACOT13 adalah jauh lebih rendah dalam pesakit ADPKD (Rajah 4A), manakala PTGER2 menunjukkan tahap ekspresi yang lebih tinggi dalam pesakit ADPKD (Rajah 4B). ADCY4 tidak menunjukkan perbezaan ekspresi yang ketara antara pesakit ADPKD dan sampel biasa (Rajah 4C). Menggabungkan maklumat, kami membuat spekulasi bahawa ACOT13 dan PTGER2 mungkin gen calon yang dikaitkan dengan ADPKD.

Perbincangan

ADPKD disebabkan oleh mutasi dalam satu daripada dua gen-78 peratus kes disebabkan oleh mutasi dalam PKD1 pada kromosom 16 dan 15 peratus kes disebabkan oleh mutasi dalam PKD2 pada kromosom 4 [20]. Penyakit buah pinggang kistik juga dipanggil ciliopathies. Protein Te PC1 dan PC2, yang dikodkan oleh PKD1 dan PKD2, kedua-duanya terletak pada silia primer dan bertindak sebagai penderia aliran dalam buah pinggang [21]. Dalam kajian ini, mutasi berbahaya dalam PKD1, serta 18 gen berbahaya lain yang diketahui, telah dikesan dalam sampel pesakit ADPKD. Selain itu, enam mutan, termasuk AGRN, ACOT13, ADCY4, HEATR5A, PTGER2, dan ADAM21, telah disaring menggunakan corak genetik yang dominan dan kebanyakannya tidak pernah diiktiraf sebelum ini sebagai gen patogenik berkaitan ADPKD.

Protein patogenik dalam ADPKD bertanggungjawab terutamanya untuk menghantar maklumat dari persekitaran luaran ke sel [22]. Kami menganalisis potensi fungsi 25 gen yang dikenal pasti oleh analisis pengayaan GO dan KEGG. Keputusan menunjukkan bahawa BPs proses selular organisma tunggal, tindak balas terhadap rangsangan, serta CC membran plasma dan pinggiran sel telah diperkaya dengan ketara. Selain itu, sel ADPKD boleh mengalihkan mod pengeluaran tenaga mereka daripada fosforilasi oksidatif ke laluan lain, dan perubahan dalam metabolisme sel ini telah muncul sebagai ciri ADPKD [6]. Perubahan dalam modulasi pengeluaran dan penggunaan tenaga dalam ADPKD bergantung kepada beberapa laluan isyarat selular dalaman, seperti kinase protein diaktifkan AMP (AMPK), isyarat kalsium pada membran yang berkaitan dengan mitokondria, sasaran mamalia kompleks rapamycin 1 (mTORC1), cAMP, dan pengangkutan ion pengantara transmembran fibrosis fibrosis (CFTR) [23, 24]. Di sini, laluan isyarat cAMP dikenal pasti sebagai laluan yang diperkaya dengan ketara dalam sampel ADPKD ini. Keputusan ini menyokong kebolehpercayaan mutasi yang kami saring. Sementara itu, walaupun maklumat berfungsi sebahagiannya didedahkan oleh analisis pengayaan, lebih banyak butiran mengenai 25 gen yang dikenal pasti patut diterokai lebih lanjut dalam ADPKD pada masa hadapan.

Analisis PPI dan ekspresi pembezaan menunjukkan bahawa berbanding dengan orang biasa, ACOT13 dan PTGER2 telah bermutasi dan dinyatakan secara berbeza dalam pesakit ADPKD, dan mungkin gen berpotensi yang dikaitkan dengan ADPKD. Protein ACOT13 ialah ahli enzim acyl-CoA thioesterases (Acts), yang memangkinkan tindak balas hidrolisis molekul asil-CoA lemak menjadi asid lemak bebas ditambah CoASH. ACOT13 diperkaya dalam tisu oksidatif dan dikaitkan dengan mitokondria [25]. Lin et al. melaporkan bahawa PC1 menjejaskan morfologi dan fungsi mitokondria, yang mungkin memainkan peranan penting dalam mengawal fungsi mitokondria dan metabolisme selular [26]. Untuk pengetahuan kami, belum ada laporan mengenai hubungan antara ACOT13 dan ADPKD. Ekspresi PTGER2 mempengaruhi tingkah laku biologi pelbagai jenis tumor malignan [27-29], yang sepatutnya dikaitkan dengan pengayaan laluan dalam kanser dalam analisis KEGG. Jika tidak, peranan prostaglandin E (2) (PGE2) dalam cystogenesis dalam model ADPKD bukan nonorthologous genetik telah pun dikaji. Liu et al. mendapati bahawa PGE2 boleh mengaktifkan laluan isyarat menyimpang dalam epitelium kekurangan-1-PC, dan mengantara percambahan dan rembesan klorida dalam epithelia buah pinggang kistik ADPKD [30]. Elberg et al. telah menunjukkan peranan PTGER2 dalam pengantaraan kesan PGE2 pada mendorong pembentukan sista melalui analisis biokimia, farmakologi, dan fungsi gabungan dalam ADPKD [31]. Ini mengesahkan lagi kebolehpercayaan pendekatan kami terhadap pemeriksaan gen patogen dalam ADPKD, yang mungkin boleh digunakan dalam penyakit lain. Ia juga secara tidak langsung menyokong kebolehpercayaan ACOT13 sebagai gen berkaitan ADPKD yang berpotensi. Walau bagaimanapun, fungsi biologi asas ACOT13 dalam ADPKD masih memerlukan kajian lanjut.

Kesimpulan

Dalam kajian ini, kami mengenal pasti dua gen berkaitan ADPKD yang berpotensi, termasuk ACOT13 dan PTGER2, dengan menganalisis keputusan WES empat pesakit ADPKD dan dua ahli keluarga yang sihat digabungkan dengan data ekspresi gen dari pangkalan data GEO. Keputusan kami mungkin membantu untuk kajian lanjut dalam punca patologi yang mendasari ADPKD. Walau bagaimanapun, disebabkan bilangan pesakit yang kecil dalam kajian kami, masih terdapat beberapa ketidakpastian tentang potensi peranan ACOT13 dan PTGER2, yang masih memerlukan kajian lanjut.

Rujukan

1. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, Horie S, Peters DJM, Torres VE. Penyakit buah pinggang polikistik. Nat Rev Dis Primers. 2018;4(1):50. https://doi. org/10.1038/s41572-018-0047-y.

2. Grieben M, Pike AC, Shintre CA, Venturi E, El-Ajouz S, Tessitore A, Shrestha L, Mukhopadhyay S, Mahajan P, Chalk R, et al. Struktur penyakit buah pinggang polikistik saluran TRP Polycystin-2 (PC2). Nat Struct Mol Biol. 2017;24(2):114–22.

3. Chumley P, Zhou J, Mrug S, Chacko B, Induk JM, Challa AK, Wilson LS, Berryhill TF, Barnes S, Kesterson RA, et al. Memotong PKHD1 dan

Mutasi PKD2 mengubah metabolisme tenaga. Am J Physiol Fisiol Renal. 2019;316(3): F414–25.

4. Kim DY, Park JH. Mekanisme genetik ADPKD. Adv Exp Med Biol. 2016;933:13–22.

5. Cornec-Le GE, Olson RJ, Besse W, Heyer CM, Gainullin VG, Smith JM, Audrezet MP, Hopp K, Porath B, Shi B, et al. Mutasi monoallelik kepada DNAJB11 menyebabkan penyakit buah pinggang polikistik dominan autosomal atipikal. Am J Hum Genet. 2018;102(5):832–44.

6. Padovano V, Podrini C, Boletta A, Caplan MJ. Metabolisme dan mitokondria dalam penyelidikan dan terapi penyakit buah pinggang polikistik. Nat Rev Nephrol. 2018;14(11):678–87. https://doi.org/10.1038/s41581-018-0051-1.

7. Bergmann C. Kemajuan terkini dalam diagnosis molekul penyakit buah pinggang polikistik. Pakar Rev Mol Diagn. 2017;17(12):1037–54. https://doi. org/10.1080/14737159.2017.1386099.

8. Yang Y, Muzny DM, Xia F, Niu Z, Person R, Ding Y, Ward P, Braxton A, Wang M, Buhay C, et al. Penemuan molekul dalam kalangan pesakit yang dirujuk untuk penjujukan keseluruhan exome klinikal. JAMA. 2014;312(18):1870–9.

9. Mallawaarachchi AC, Hort Y, Cowley MJ, McCabe MJ, Minoche A, Dinger ME, Shine J, Furlong TJ. Penjujukan genom keseluruhan mengatasi homologi pseudogen untuk mendiagnosis penyakit buah pinggang polikistik dominan autosomal. Eur J Hum Genet. 2016;24(11):1584–90. https://doi.org/10.1038/ ejhg.2016.48.

10. Braun DA, Schueler M, Halbritter J, Gee HY, Porath JD, Lawson JA, Airik R, Shril S, Allen SJ, Stein D, et al. Penjujukan keseluruhan exome mengenal pasti mutasi penyebab dalam kebanyakan kes yang berkaitan atau kekeluargaan dengan peningkatan echogenicity buah pinggang pada permulaan kanak-kanak. Buah Pinggang Int. 2016;89(2):468–75.

11. Chen S, Zhou Y, Chen Y, Gu J. cepat: prapemproses FASTQ semua-dalam-satu yang sangat pantas. Bioinformatik. 2018;34(17):i884–90.

12. Kumar P, Henikof S, Ng PC. Meramalkan kesan pengekodan varian bukan sinonim pada fungsi protein menggunakan algoritma SIFT. Nat Protoc. 2009;4(7):1073–81.

13. Flanagan SE, Patch AM, Ellard S. Menggunakan SIFT dan PolyPhen untuk meramalkan mutasi kehilangan fungsi dan keuntungan fungsi. Biomarker Ujian Genet Mol. 2010;14(4):533–7.

14. Schwarz JM, Rodelsperger C, Schuelke M, Seelow D. MutationTaster menilai potensi penyebab penyakit bagi perubahan urutan. Kaedah Nat. 2010;7(8):575–6.

15. Itan Y, Shang L, Boisson B, Ciancanelli MJ, Markle JG, Martinez-Barricarte R, Scott E, Shah I, Stenson PD, Gleeson J, et al. Potongan kepentingan mutasi: ambang tahap gen untuk ramalan varian. Kaedah Nat. 2016;13(2):109–10.

16. Liu X, Wu C, Li C, Boerwinkle E. dbNSFP v3.0: pangkalan data sehenti ramalan dan anotasi berfungsi untuk SNV bukan sinonim dan tapak splice manusia. Hum Mutat. 2016;37(3):235–41.