CD73 Overexpression dalam Podocytes: Penanda Novel Kecederaan Podocyte dalam Penyakit Buah Pinggang Manusia
Feb 26, 2022
Abstrak:Laluan CD73 adalah mekanisme anti-radang penting dalam pelbagai tetapan penyakit. Pemerhatian dalam model tetikus mencadangkan bahawa CD73 mungkin mempunyai peranan perlindungan dalamkerosakan buah pinggang; Walau bagaimanapun, tiada bukti langsung tentang peranannya dalam manusiapenyakit buah pinggangtelah diterangkan setakat ini. Di sini, kami membuat hipotesis bahawa kecederaan podocyte pada manusiapenyakit buah pinggangmengubah ungkapan CD73 yang boleh memudahkan diagnosis podocytopathies. Kami menilai ekspresi CD73 dan salah satu sasaran penting fungsionalnya, C-C chemokine reseptor tipe 2 (CCR2), dalam podocytes dariBuah pinggangbiopsi 39 pesakit dengan podocytopathy (termasuk glomerulosklerosis segmen fokus (FSGS), penyakit perubahan minimum (MCD), glomerulonephritis membranous (MGN) dan amyloidosis) dan kumpulan kawalan. Ungkapan Podocyte CD73 dalam setiap kumpulan penyakit meningkat dengan ketara berbanding dengan kawalan (p< 0.001–p="">< 0.0001).="" moreover,="" there="" was="" a="" marked="" negative="" correlation="" between="" cd73="" and="" ccr2="" expression,="" as="" confirmed="" by="" immunohistochemistry="" and="" immunofluores-="" cence="" (pearson="" r="−" 0.5068,="" p="0.0031;" pearson="" r="−" 0.4705,="" p="0.0313," respectively),="" thus="" suggesting="" a="" protective="" role="" of="" cd73="">kecederaan buah pinggang.Akhirnya, kami mengenal pasti CD73 sebagai penanda diagnostik berpotensi baru podocytopathies manusia, terutamanya MCD yang telah terkenal dengan kekurangan ciri patologi yang dikenali oleh mikroskopi ringan dan imunohisokimia.
Kata kunci:podocyte; penyakit perubahan minimum; CD73; CCR2;kecederaan buah pinggang;Kegagalan buah pinggang
Pengenalan
Peranan penting evolusi adenosine trifosfat (ATP) sebagai sumber tenaga intraselular di mana-mana telah dikemas kini lebih dari tiga dekad yang lalu dengan tanggapan revolusioner bahawa anggota sistem purinergik (ATP, adenosin di- dan trifosfat (ADP dan AMP, masing-masing) mungkin juga menyampaikan isyarat ekstraselular kepada interaksi selular pengantaraan [ 1 , 2 ]. Konsep ini membawa kepada pemahaman bahawa sistem purinergik mengambil bahagian dalam membentuk tindak balas imun melalui modulasi profil ekspresi reseptor, rembesan sitokin, pengeluaran spesies oksigen reaktif (ROS) dan pencernaan patogen intraselular [3-7]. ATP ekstraselular menjalani penukaran/dephosphorylation ke dalam ADP dan AMP melalui CD39 (ecto-nucleosidtriphosphate diphosphohydrolase 1) dan akhirnya, AMP diturunkan kepada adenosin oleh CD73 (ecto-5 0 nukleotidase) [ 8 ]. CD73 mungkin hadir dalam bentuk membran-terikat atau larut. Bentuk membran mempunyai struktur dimer yang terdiri daripada dua subunit 70 kD yang sama yang mengikat membran plasma melalui pautan antara serine C-terminal dan glikosylphosphatidyl inositol (GPI) [ 9 ]. Perlu diberi perhatian, substrat CD39 ATP dan ADP nampaknya menjadi perencat kompetitif CD73 [ 9 - 11 ]. Ungkapan CD73 mewakili laluan kritikal penalaan aras adenosin dalam ruang ekstraselular. CD73 bukan molekul khusus sel atau organ; ungkapannya pada leukosit, endothelium, epitel atau sel mesenchymal pelbagai organ (Buah pinggang, paru-paru, hati, kolon, otak dan jantung) dan sel induk telah didokumentasikan dengan baik [ 12 - 14 ]. Peranan perlindungan adenosin melalui laluan nitrik oksida (NO)-sintesis dalam kecederaan yang disebabkan oleh iskemia hati pertama kali dilaporkan oleh Peralta et al. [ 15 ]. Selaras dengan data ini, tindakannya telah ditunjukkan untuk ameliorate kerosakan paru-paru akut, penolakan saluran udara allograft, penyakit rasuah akut berbanding tuan rumah dan sepsis [4,16-19].
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN KEGAGALAN BUAH PINGGANG / BUAH PINGGANG
Seperti yang ditunjukkan dengan meyakinkan dalam beberapa model tetikus, CD73 boleh mengambil bahagian dalam interaksi tubulo-glomerular dalamBuah pinggang. Generasi adenosin CD73 yang dimediasi yang diperolehi oleh CD73 dari ATP asal tiub semasa kerosakan iskemia-reperfusi telah ditunjukkan untuk melemahkan keradangan melalui perencatan fungsi efektor neutrofil [ 20 ]. Selain itu, tikus yang kekurangan CD73 menunjukkan keradangan autoimun yang disertai dengan pengurangan bilangan podosit dan fenestrasi endothelial [ 21 ]. Fenomena ini dikaitkan dengan peningkatan tahap serum sitokin pro-radang seperti faktor nekrosis tumor (TNF)-alpha atau ligan motif C-X-C chemokine 2 (CXCL-2). Dalam suasana manusiapenyakit buah pinggang,ia telah postulated bahawa kerosakan podocyte mungkin mewakili campuran mekanisme penyesuaian dan merosakkan tindak balas selular terhadap rangsangan patologi, tidak semestinya mencerminkan pemerhatian yang diterbitkan dari model in vitro atau haiwan. Etiologi kecederaan podocyte berbeza dari tekanan mekanikal ( hiperfiltrasi glomerular), tekanan oksidatif (seperti dalam nefropati hipertensi atau diabetes, kecederaan toksik, penyusupan sel keradangan atau model haiwan penyakit perubahan minimum) kepada tekanan imunologi (iaitu, kompleks imun dan melengkapkan kerosakan yang dimediasi semasa glomerulonephritis) [ 22 ]. Penetapan keradangan glomerulonephritis boleh merangsang podocytes untuk mensintesis pelbagai sitokin, berpotensi melalui CC chemokine reseptor 2 (CCR2) isyarat pengantaraan. Namun, sedikit yang diketahui mengenai peranan CD73 pada manusiapenyakit buah pinggang, terutamanya dalam keadaan keradangan kronik dan kecederaan podosit.
Dalam kajian ini, kami membuat hipotesis bahawa CD73 memainkan peranan dalam patogenesis penyakit glomerular manusia dan menganalisis ungkapan CD73 podocyte dalam manusiaBuah pinggangbiopsi dari pesakit dengan patologi yang berkaitan dengan podocytopathy. Kami menunjukkan bahawa podocyte surfaceexpression ofCD73adalah penanda yang boleh dipercayaiofpodocytedamage, dengan ituseparticular menyokong nilai diagnostik CD73 dalam penyakit perubahan minimum (MCD). Lebih-lebih lagi, kami melaporkan korelasi negatif antara ungkapan podocyte CCR2 dan CD73, menunjukkan bahawa overexpression CD73 mewakili tindak balas penyesuaian terhadap lesi glomerular.
Keputusan
Data Klinikal dan Pengimejan Ultrastruktur Kerosakan PodocyteJadual 1 menggariskan pembentangan klinikal kes-kes yang termasuk dalam kajian mengenai umur, jantina, kreatinin dan jumlah nilai proteinuria. Semua pesakit FSGS mempunyai borang NOS primer (tidak dinyatakan sebaliknya). Di antara 12 pesakit MGN, 5 adalah reseptor phospholipase A2 (PLA2R)-positif (42%). Dalam kumpulan amyloidosis, 2 pesakit mempunyai AA-amyloidosis (16.7%) dan 10 AL-amyloidosis (83.3%); dalam 2 pesakit dengan rantaian cahaya AL-amyloidosis kappa adalah jelas (20%) dan 8 adalah positif untuk lambda (80% daripada kumpulan AL-amyloidosis). Dalam semua pesakit dengan MCD, FSGS, MGN dan amyloidosis, kerosakan podosit jelas dikesan oleh mikroskopi elektron (Rajah 1).
Rajah 1. Imej ultrastruktur kerosakan podosit primer dan sekunder. ( a ) Penyebaran badan podocyte pada membran bawah tanah glomerular (anak panah) dengan penarikan balik proses kaki dalam kes MCD. ( b ) Proses kaki podocyte yang luas effacement (anak panah) dan vacuolization cytoplasmic (bintang) pada pesakit dengan FSGS primer. ( c ) Effacement proses kaki (anak panah), vacuolization dan organel yang menonjol (anak panah berganda) dengan bahan padat elektron epimembranous yang mendasari (bintang) dalam glomerulonephritis membran utama. ( d ) Pengumpulan subepithelial amyloid-fibrils (anak panah dua kepala) dengan detasmen podosyte berturut-turut (sebagai tanda kerosakan podosyte yang tidak dapat dipulihkan) pada pesakit dengan AL-amyloidosis (lambda). Semua mikrograf elektron dibentangkan pada 4000 × pembesaran. Sisipan—fotomografi mikroskopi cahaya yang sepadan (40 × /0.65 NA; saiz bar skala: 50 μm in (a,c,d) dan 100 μm in (b); Pas-staining).
Ekspresi Permukaan CD73 Dikaitkan dengan Kecederaan Podocyte dalam Penyakit Buah Pinggang Manusia
Untuk meneroka sama ada podocytes express CD73 dalam tetapan fisiologi dan untuk menilai thepatternofCD73indifferentdiseasesettingsberelesaiantopodocytedamage,weperformedim- analisis munohistokimia ungkapan CD73. Analisis ultrastruktur mengesahkan kerosakan podocyte sebagai ketidakteraturan cytoskeletal dengan sekurang-kurangnya effacement proses kaki (Rajah 1). Dalam kumpulan kawalan negatif kami tanpa lesi podocyte, tiada ungkapan podocyte CD73 yang ketara dapat dikesan walaupun positif kawalan dalaman (kapilari peritubular) yang biasanya mengotorkan positif (Rajah 2). Sebaliknya, kumpulan kerosakan podocyte (MCD, FSGS, MGN dan amyloidosis) menunjukkan peningkatan statistik podocyte CD73 (p< 0.0001);="" the="" significant="" increase="" was="" consistent="" also="" when="" comparing="" single="" entities="" with="" negative="" controls="" (p="" at="" least="">< 0.001).="" interestingly,="" the="" extent="" of="" cd73="" upregulation="" tended="" to="" be="" lower="" in="" the="" mcd="" group,="" albeit="" significantly="" lower="" only="" in="" comparison="" with="" mgn="" samples="" (p="0.0043)" (figure="" 2).="" in="" podocyte="" damage="" groups,="" there="" was="" no="" correlation="" between="" semiquantitative="" cd73="" score="" and="" proteinuria="" on="" binary="" (nephrotic/non-nephrotic)="" or="" quantitative="" (g/24="" h)="" level="" (spearman="" r="−" 0.0807,="" p="0.6302" and="" spearman="" r="−" 0.076,="" p="0.6497," respectively;="" figure="" 3a).="" overall,="" there="" was="" no="" correlation="" between="" cd73="" score="" and="" creatinine="" level="" (spearman="" r="0.0722," p="0.6259;" figure="" 3b).="" additionally,="" we="" could="" not="" detectsignificant="" correlation="" between="" cd73="" expression="" and="" hypertension="" (spearman="" r="−" 0.03024,="" p="0.8384)" or="" diabetes="" mellitus="" (spearman="" r="−" 0.1784,="" p="">
Upregulation CD73 podocyte-Derived dalam Penyakit Glomerular Manusia Berkorelasi Negatif dengan Ungkapan Reseptor CCR2 dan Tidak Berkorelasi dengan Ekspresi Nephrin dan PodocinMenghargai data yang diterbitkan mengenai downregulation of macrophage CCR2 ekspresi berikutan ekspresi berlebihan CD73 dalam model sel stem, kami membuat hipotesis bahawa upregulasi CD73 semasa kecederaan podocyte secara songsang berkaitan dengan ungkapan CCR2 pro-radang dan melakukan analisis CCR2 imunosimia. Dalam kumpulan kawalan, tiada atau hanya ungkapan ringan CCR2 boleh dikesan, tanpa percanggahan yang ketara berbanding dengan tandatangan CD73 dalam sampel yang sama. Sebaliknya, kebanyakan peningkatan ketara permukaan CCR2 (belum pelbagai intensiti) dapat dilihat dalam majoriti sampel dari biopsi kerosakan podocyte dan secara amnya dikawal selia berbanding dengan kumpulan kawalan (p = 0.0206; Rajah Tambahan S1). Kumpulan penyakit tidak berbeza antara satu sama lain dalam hal ini.
Kami seterusnya menganalisis korelasi yang berpotensi antara intensiti ungkapan CD73 dan CCR2. Sesungguhnya, membandingkan skor CD73 dan CCR2 dari kohort biopsi kecederaan podosit, korelasi negatif yang ditandakan dapat diperhatikan (Spearman r = − 0.4821, p = 0.0052), (Rajah 4). Daripada nota, glomeruli dengan podosit positif CD73 cenderung untuk menunjukkan ungkapan CCR2 yang berkurangan bukan sahaja dalam podosit tetapi juga dalam sel-sel sekeliling, seperti sel epitel parietal (Rajah 4). Korelasi songsang telah disahkan oleh penilaian pewarnaan bersama imunfluorescent untuk CD73/CCR2 dalam podosit yang rosak oleh mikroskopi confocal (Spearman r = − 0.4478, p = 0.0282), (Rajah 5). Untuk menangani perkaitan akhirnya antara kepositifan CD73 dan (kehilangan) ekspresi protein khusus podocyte, kami melakukan pewarnaan rescent immunofluo tambahan untuk nephrin dan podocin dan menilai corak ekspresi mereka dalam kawalan, kumpulan MCD dan FSGS (Rajah 6a) serta mengotorkan bersama dengan CD73 dalam sampel dengan lesi podocyte (Rajah 6b–e). Kami tidak dapat mengesan korelasi yang ketara antara min keamatan pendarfluor podocin atau ekspresi nephrin pada satu sisi, dan ungkapan min CD73 pada yang lain (n = 39, Spearman r = 0.212, p = 0.1948 untuk podocin dan n = 60, Spearman r = 0.01906, p = 0.8851 untuk nephrin).
Perbincangan
Kami menerangkan di sini buat kali pertama ungkapan CD73 pada permukaan podosit yang cedera pada manusiaPenyakit buah pinggang. MenganalisisBuah pinggangbiopsi dari pesakit dengan kerosakan podosit yang menonjol seperti dalam MCD, FSGS, MGN dan amyloidosis, kami melaporkan peningkatan ketara ungkapan CD73 podocyte dalam setiap kumpulan ini berbanding dengan kawalanBuah pinggangbebas daripada etiologi kerosakan podocyte. Selain itu, kami melaporkan korelasi songsang antara ungkapan CD73 dan CCR2 oleh podocytes kumpulan kerosakan podocyte. CCR2 khusus podocyte yang digalakkan telah ditunjukkan untuk menjadi pengantara diabeteskecederaan buah pinggangpada tikus [ 23 ]. Di samping itu, sekatan CCR2 dalam model murine yang disebabkan oleh Adriamycin FSGS telah dilaporkan dapat mengurangkan proteinuria dan kecederaan glomerular [ 24 ]. Satu kajian baru-baru ini dari Lee et al.—juga menggunakan model tetikus—menunjukkan bahawa kekurangan CCR2 mungkin ameliorate albuminuria yang disebabkan oleh obesiti melalui sekatan tekanan oksidatif dan pengumpulan lipid [ 25 ]. Sesungguhnya, dalam sistem in vitro yang menggunakan sel stem mesenchymal (MSC) dari tisu pericardial murine, telah ditunjukkan bahawa MSC CD73-overexpressing menentukan proses reparatif melalui aktiviti anti-radang, antara faktor lain juga disebabkan oleh perencatan penyusupan makrophage positif CCR2 [ 13 ]. Oleh itu, berdasarkan keputusan kami dan data yang diterbitkan, adalah menggoda untuk menyatakan bahawa ungkapan CD73 oleh podocytes boleh bertindak perlindungan dalamkecederaan buah pinggang, mungkin melalui laluan yang melemahkan CCR2. Isyarat CCR2 berkait rapat dengan lekatan dan pengaktifan makrophage [ 26 , 27 ]. Oleh kerana makrofaj boleh mempengaruhi patogenesis yang berkaitan dengan podocytopathypenyakit buah pinggang(seperti MGN primer, di mana penyusupan CD68 + , CCR2 + makrofaj telah diiktiraf sebagai penunjuk penting peringkat akhirKegagalan buah pinggang[ 28 ]), kajian lanjut mengenai hubungan antara kandungan monosit / makrophage, asal (menyusup vs penduduk), profil pengaktifan (M1—proinflammatory vs M2—secara alternatif diaktifkan) dan ungkapan CD73 dalam ungkapan manusiapenyakit buah pinggangadalah perlu untuk menyemak mengikut keputusan kami dengan data terdahulu dari model murine.
Dalam mikromilieu keradangan yang dapat dilihat dalam hipoksia, iskemia-reperfusi atau tisu autoimun merosakkan pelbagai sel melepaskan anggota sistem isyarat purinergik, kebanyakannya dalam bentuk ATP pro-radang atau ADP [ 29 , 30 ]. Dalam tetapan ini, ecto-nucleotidaseCD73anditsproductadenosineareimportantfactorsinimmune peraturan tindak balas dan silencing. Dalam model haiwan, CD73 telah terbukti melindungiBuah pinggangkecederaan reperfusi iskemia dan kekurangannya menyebabkan disfungsi podocyte, yang membawa kepada keradangan autoimun danpenyakit buah pinggang[ 21 , 31 ]. Tetikus lain dalam eksperimen vivo menggunakan kecederaan reperfusi iskemia mendedahkan pengaruh anti-radang penting CD73 yang dinyatakan oleh sel epitel tiub proksimal dan tindakan pentingnya dalamBuah pinggangperlindungan semasa nefropati diabetes melalui reseptor adenosine-endothelial Adora2b memberi isyarat [20,32]. Podocytopathies adalah kumpulan lesi glomerular yang paling kerap membawa kepada protein- uria. MCD, prototaip 'primary' podocytopathy, adalah penyebab proteinuria nefrotik yang paling biasa pada kanak-kanak > berumur 1 tahun [ 33 , 34 ]. Hipotesis semasa mengenai patogenesis MCD mencadangkan peranan penting sitokin dan pengantara imun lain dalam gangguan integriti membran bawah tanah podocyte-glomerular [ 35 - 38 ]. Perbezaan antara ketiadaan perubahan yang kelihatan dalam mikroskopi cahaya dan proteinuria yang teruk adalah ciri khas MCD; bukti ultrastructural kerosakan podocyte oleh mikroskopi elektron adalah oleh itu conditio sine qua bukan untuk diagnosis MCD setakat ini. Algoritma diagnostik ini menekankan kepentingan alat diagnostik baris pertama dalam hal ini. Pemeriksaan ungkapan CD73, terutamanya dalam penetapan ketersediaan mikroskopi elektron yang terhad, mungkin dapat membantu membezakan antara sumber proteinuria glomerular (iaitu, podocytopathic) dan extraglomerular (contohnya, tiub atau paraproteinemik). Perbandingan antara imunohistokimia dan imunofluorescence dalam kajian kami akan bercakap memihak kepada yang terakhir.
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN PENYAKIT BUAH PINGGANG / BUAH PINGGANG
Beberapa penerbitan telah mendokumentasikan pengedaran yang menyimpang dan kehilangan protein khusus podocyte dalam pelbagaipenyakit buah pinggangtetapan yang merangkumi kecederaan podocyte dan proteinuria, seperti yang dikaji baru-baru ini [ 39 ]. Dalam kajian kami, dalam kumpulan kerosakan podocyte, kami tidak dapat mengesan korelasi yang ketara antara intensiti pendarfluor podocin/nephrin dan keamatan ungkapan CD73. Walau bagaimanapun, batasan tertentu menghalang tafsiran patofisiologi podocin/nephrin vs data statistik CD73. Pertama, untuk penilaian keamatan pendarfluor kami memilih podocytes menggunakan pembesaran teknikal dan kapasiti resolusi mikroskopi confocal. Walaupun keadaan ini dengan mudah membolehkan pengesanan badan podocyte, proses utama dan terutamanya proses kaki kekal tidak jelas, oleh itu mungkin tidak ditandakan / dianalisis. Kedua, korelasi antara ungkapan CD73 dan protein khusus podocyte dalam keseluruhan glomeruli tidak boleh dibenarkan: walaupun penilaian podocin dan nephrin pada tahap ini akan menjadi sah (kerana ia adalah munasabah untuk menganggap bahawa tiada sel glomerular lain menyatakan protein ini) ini tidak boleh dituntut untuk CD73 yang sebahagiannya dinyatakan sekurang-kurangnya oleh sel endothelial. Ketiga, penilaian intensiti pendarfluor min sahaja sebagai penanda bebas kecederaan podocyte boleh dipersoalkan, kerana ia tidak meliputi corak pengedaran patologi, berbutir podocin dan nephrin dalam glomerulus, yang dapat kita perhatikan dengan jelas dalam Rajah 6. Oleh itu, kami enggan mengaitkan ketiadaan korelasi CD73-podocin dan CD73-nephrin dalam analisis kami kepada laluan molekul yang berbeza penanda ini. Kajian in vitro dan haiwan podocyte selanjutnya diperlukan untuk meneroka gangguan akhirnya antara lata isyarat ini.
Diambil bersama-sama, mengiktiraf saiz sampel kecil sebagai batasan utama kajian kami, kami menunjukkan di sini aconsistent CD73 overexpression oleh podocytes yang cedera dan mencadangkanCD73 sebagai penanda diagnostik baru podocytopathy. Dalam penyakit perubahan minimum, keputusan kami boleh membantu mengenal pasti podosit yang rosak dan mengakibatkan proses diagnostik yang kurang memakan masa dan kos. Di samping itu, keputusan kami sejajar dengan data yang diterbitkan daripada pendekatan eksperimen murine dan mencadangkan interaksi perlindungan antara CD73 dan CCR2 pada manusiapenyakit buah pinggang. Kajian multicenter selanjutnya dengan kohort pesakit yang lebih besar diperlukan untuk menangani mekanisme isyarat CD73 pada manusiaBuah pinggangpenyakit dan nilai prognostiknya. Begitu juga, nombor kohort yang lebih besar diperlukan untuk mewujudkan korelasi yang berpotensi antara keterukan penyakit dan ungkapan CD73.
Bahan dan Kaedah
Kohort KajianSebanyak 49 biopsi yang dimasukkan dalam kajian ini dari 49 pesakit yang berbeza didiagnosis antara 1 Januari 2018 dan 31 Disember 2019 di Hospital Universiti Mannheim, Universiti Heidelberg. Kriteria pemilihan selanjutnya adalah biopsi wakil dengan kemungkinan untuk melakukan tiga diagnostik dengan imunosimia dan EM, maklumat klinikal yang mencukupi, diagnosis yang jelas dan bahan yang mencukupi untuk kajian ini. Semua pesakit adalah orang dewasa dan kaukasia. Penyiasatan ini merangkumi 39 biopsi dari pesakit dengan kecederaan podosit yang berbeza-beza etiologi (7 biopsi dari pesakit dengan glomerulosklerosis segmen fokus utama - FSGS; 8 dari penyakit perubahan minimum - MCD; 12 dari pesakit dengan glomerulonephritis membran -MGN; 12 dari pesakit dengan amyloidosis). Kawalan negatif adalahBuah pinggangbiopsi dari 10 pesakit tanpa lesi podocyte dan tanpa proteinuria (6 pesakit dengan nefrosklerosis ringan, 2 pesakit dengan nefritisisme interstisial dan 2 pesakit tanpa perubahan patologi). Semua biopsi yang disebutkan di atas dimasukkan ke dalam analisis ungkapan CD73 podocyte; untuk CCR2, selepas pengecualian bahagian parafin dengan bilangan glomeruli bukan sklerotik yang tidak mencukupi (<5), we="" performed="" analysis="" of="" surface="" expression="" and="" of="" correlation="" with="" cd73="" signature="" in="" 6="" samples="" from="" fsgs,="" 8="" from="" mcd,="" 10="" from="" mgn="" and="" 8="" from="" the="" amyloidosis="" group.="" in="" the="" ccr2="" analysis,="" the="" control="" group="" consisted="" of="" 6="" biopsies.="" relevant="" clinical="" data="" were="" collected="" from="" electronic="" medical="" records="" (table="" 1).="" informed="" consent="" was="" waived="" because="" of="" the="" retrospective="" nature="" of="" the="" study,="" because="" of="" the="" fact="" that="" anonymous="" clinical="" data="" were="" used="" for="" analysis="" and="" because="" the="" study="" was="" performed="" on="" already="" existing="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" after="" completing="" the="" diagnostic="" process,="" as="" approved="" by="" the="" ethic="" committee="" of="" the="" university="" medical="" centre="" mannheim,="" university="" of="" heidelberg="" (reference="" number:="">
Histologi, Imunokimia, Immunofluorescence dan Mikroskopi ElektronBahagian siri 1 μ m dilakukan pada parafin-embeddedBuah pinggangbiopsi dan diwarnai dengan hematoxylin / eosin (H / E), asid berkala-Schiff (PAS), pewarnaan trikrom Masson serta imunosokimia rutin standard untuk tujuan diagnostik. Immunohisto- kimia dan immunofluorescent pewarnaan biopsi tertanam parafin formalin-tetap untuk dilakukan secara manual menggunakan antibodi monoklonal anti-manusia CD73 arnab (klon D7F9A, Isyarat Sel, Frankfurt am Main, Jerman) dan antibodi CCR2 anti-manusia monoklonal tetikus (klon 7A7; Abcam, Cambridge, UK), antibodi anti-manusia poliklonal arnab kepada nephrin (Abcam, Cambridge, UK) dan antibodi podocin anti-manusia arnab (Sigma, Saint Louis, MO, Amerika Syarikat), mengikut protokol pengeluar. Semua biopsi dimasukkan ke dalam analisis ungkapan CD73 podocyte oleh imunohistokimia; untuk CCR2, bahagian parafin dengan bilangan glomeruli bukan sklerotik yang tidak mencukupi (<5) were="" excluded.="" to="" minimize="" the="" noise,="" antibody="" optimization="" for="" immunohistochemistry="" was="" performed="" using="" control="" (tonsil)="" tissue.="" the="" tissue="" sections="" were="" stained="" with="" dako="" real="" detection="" system="" alkaline="" phosphatase/red="" rabbit/mouse="" kit="" (agilent,="" santa="" clara,="" ca,="" usa)="" and="" avidin/biotin="" blocking="" kit="" (vector="" laboratories,="" burlingame,="" ca,="" usa).="" antigen="" retrieval="" was="" performed="" for="" 20="" min="" using="" dako="" target="" retrieval="" solution="" (equivalent="" citrate="" buffer,="" ph="" 6.0).="" primary="" antibodies="" were="" incubated="" for="" 60="" min="" in="" dako="" antibody="" diluent="" with="" 2%="" dry="" milk="" at="" 37="" ◦="" c="" and="" detected="" using="" the="" dako="" real="" link,="" biotinylated="" secondary="" antibodies="" (included="" in="" the="" kit),="" and="" dako="" real="" streptavidin="" alkaline="" phosphatase="" (ap).="" the="" reaction="" was="" visualized="" by="" a="" red="" chromogen="" (included="" in="" the="" kit).="" the="" slides="" were="" counterstained="" with="" hematoxylin,="" dehydrated,="" mounted="" using="" aquatex="" (merck,="" darmstadt,="" germany)="" and="" cover-slipped.="" for="" immunofluorescence,="" ccr2/cd73="" co-expression="" was="" evaluated="" in="" total="" of="" 22="" podocytes="" from="" all="" podocyte="" lesion="" groups.="" cd73="" was="" stained="" with="" alexa="" flour="" tm="" 488="" tyramide="" superboost="" tm="" kit,="" streptavidin="" (invitrogen,="" thermo="" fisher,="" waltham,="" ma,="" usa)="" using="" secondary="" biotinylated="" anti-mouse="" antibody="" (biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" secondary="" antibodies="" for="" the="" immunofluorescence="" were="" donkey="" anti-mouse="" cf="" 594="" and="" donkey="" anti-rabbit="" cf="" 594="" (both="" from="" biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" for="" electron="" microscopy,="" biopsies="" were="" post-fixed="" with="" 1%="" osmium="" tetroxide="" (roth,="" karlsruhe,="" germany),="" embedded="" in="" agar="" 100="" resin="" (agar="" scientific,="" stansted,="" uk),="" cut="" at90nm="" thickness="" andstained="" with1%="" uranylacetate(serva,="" heidelberg,="" germany).="" micro-graphs="" were="" taken="" on="" transmission="" electron="" microscope="" jem-1400="" (joel,="" freising,="">
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUCTION BUAH PINGGANG / BUAH PINGGANG
Analisis Mikroskopi Ringan dan MorphometrikPemerolehan dan analisis imej dilakukan menggunakan mikroskop pengimbasan PreciPoint M8 dengan Olympus PlanCN 40 × /0.65 objektif dan perisian MicroPoint (v.5 Mei 2016; PreciPoint, Freising, Jerman). Penilaian semiquantitatif ungkapan permukaan podocyte CD73 dalam pewarnaan imunokimia dinilai menggunakan skala pemarkahan 0-3 (0—tiada ungkapan; 1—kepositifan segmen fokus (<50% podocytes="" positive="" in=""><50% glomeruli);="" 2—focal="" global="" (="">50% podocytes positif dalam<50% glomeruli);="" 3—diffuse="" (any="" percentage="" of="" podocytes="" positive="" in="">50% glomeruli). Podocytes positif dan negatif CD73 dianalisis untuk ekspresi bersama CCR2 menggunakan sistem pemarkahan semiquantitatif berasaskan intensiti (0—tiada ekspresi, 1—ekspresi lemah, 2—ekspresi sederhana dan 3—ungkapan kuat, menurut kawalan positif CCR2 biopsik-dalaman—endothelium dan menyusup sel imun). Penilaian dilakukan secara bebas oleh dua ahli patologi (SP dan ZP) dengan cara yang buta.
Mikroskopi ConfocalImej CD73 (Alexa Fluor 488), CCR2 (Alexa Fluor 594) dan nukleus (DAPI) podocytes diperolehi secara berurutan dengan mikroskop confocal bermotor Olympus FV1000 yang dilengkapi dengan HeNe 594 nm, Argon 488 nm dan diod UV 405 nmlaser dan tiub photomultiplier (PMT) dikawal oleh perisian FluoView, menggunakan objektif UPlanSApo 60 × /1.35. Imej 12-bit dengan bingkai 512 × 512 piksel dan saiz piksel 0.41 μ m untuk gambaran keseluruhan dan 0.10 μ m untuk resolusi tinggi diperolehi dengan mengekalkan semua tetapan pada pemalar mikroskop. Imej-imej tersebut diproses secara separa automatik dan dianalisis menggunakan makro ImageJ yang dibangunkan secara dalaman (tarikh diakses: 15 Disember 2020). Tidak lama kemudian, imej dibahagikan untuk podosit individu, ambang digunakan, dan intensiti min diukur, dianalisis secara statistik dan diplotkan. Semua imej telah diproses dengan tetapan malar dan dipaparkan dengan pseudo-warna yang sama sama-sama diselaraskan secara linear untuk saluran individu pada imej yang digabungkan
Analisis StatistikStatisticalanalyseswereperformedusingGraphPadPrismv. 8.4.3software(Perisian GraphPad, Inc., La Jolla, CA, Amerika Syarikat). Semua data dilaporkan sebagai min ± SEM. Perbezaan statistik dikira menggunakan ujian t berpasangan atau tidak berpasangan serta analisis korelasi Pearson, seperti yang ditunjukkan.
