Ungkapan Pembezaan Enzim Metabolisasi Sphingolipid dalam Tikus Hipertensi Spontan: Substrat yang Mungkin Untuk Kerentanan Kepada Kerosakan Otak Dan Buah Pinggang
Feb 24, 2022
Abstrak: Perubahan dalam metabolisme sphingolipids, kelas molekul aktif biologi dalam membran sel dengan kesan langsung pada homeostasis vaskular, semakin diiktiraf sebagai penentu penting dalam gangguan vaskular yang berbeza. Walau bagaimanapun, tidak jelas sama ada sphingolipids terlibat dalam patogenesis serebrovaskular yang berkaitan dengan hipertensi dankerosakan buah pinggang. Dalam kajian ini, kami menilai kewujudan kemungkinan keabnormalan yang berkaitan dengan metabolisme sphingolipid di dalam otak danBuah pinggangdaripada dua strain tikus hipertensi yang disahkan secara spontan, model yang terdedah kepada strok (SHRSP) dan tahan strok (SHRSR), berbanding dengan strain tikus Wistar Kyoto (WKY) yang biasa. Keputusan kami menunjukkan perubahan global dalam metabolisme sphingolipids dalam kedua-dua serebrum danBuah pinggang tisu kedua-dua strain hipertensi berbanding dengan tikus normottensi. Walau bagaimanapun, beberapa kecacatan, seperti pengurangan ungkapan enzim yang terlibat dalam metabolisme / katabolisme sphingosine-1-fosfat dan dalam laluan de novo biosynthetic, secara eksklusif dikesan dalam SHRSP. Walaupun kajian lanjut diperlukan untuk memahami sepenuhnya penandaan penemuan ini, mereka mencadangkan bahawa kecacatan dalam molekul lipid speifific dan / atau laluan metabolik yang berkaitan mungkin menyumbang kepada patogenesis kerosakan organ sasaran hipertensi dan akhirnya boleh berfungsi sebagai sasaran terapeutik masa depan untuk mengurangkan akibat vaskular hipertensi.
Kata kunci:sphingolipids; strok; otak; buah pinggang; SHR; WKY
PengenalanHipertensi mewakili masalah kesihatan utama yang menyebabkan kerosakan organ tertentu dan akibat klinikal yang dramatik, yang membawa kepada peningkatan kadar kematian dan kecacatan dalam masyarakat Barat [1-3]. Untuk mengurangkan beban komplikasi hipertensi, pemahaman yang lebih komprehensif mengenai mekanisme etiopatogenetik yang mendasari diperlukan. Ketersediaan model haiwan yang mungkin meniru patologi manusia dan, pada masa yang sama, memudahkan kerumitan yang wujud dalam kajian populasi manusia, mungkin sangat berguna dalam pertandingan ini. Pada masa ini, tikus hipertensi yang terdedah kepada strok secara spontan (SHRSP), yang memaparkan kecenderungan utama kepada serebrum dankerosakan buah pinggang, terutamanya apabila diberi makan dengan diet tinggi garam / rendah kalium, mewakili model yang ideal. Hipertensi dan faktor pemakanan berkelakuan sebagai faktor risiko yang terdedah kepada kedua-dua tikus dan manusia [4,5]. SHRSP menunjukkan kekerapan strok yang lebih tinggi apabila diberi makan dengan diet gaya Jepun (JD) daripada kawalan ketat yang berkaitan, tahan strok (SHRSR), walaupun tahap tekanan darah yang sama [6]. Daripada nota,kerosakan buah pinggang sentiasa mendahului peristiwa strok [6]. Walaupun mekanisme molekul asas tidak difahami sepenuhnya, bukti menunjukkan bahawa disfungsi vaskular yang terhasil dan lesi struktur yang terhasil memihak kepadakerosakan buah pinggangdan pembangunan strok.
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUNGSI BUAH PINGGANG / BUAH PINGGANG
Sepanjang tahun-tahun kebelakangan ini, beberapa aspek mekanistik dan penentu serebrovaskular dankerosakan buah pinggangkejadian telah dikenal pasti dalam model SHRSP [7-12]. Walau bagaimanapun, banyak yang masih belum ditemui. Sphingolipids, termasuk Ceramides (Cer), sphingosine dan bentuk fosforilnya Sphingosine-1-fosfat (S1P), mewakili juzuk lipid utama membran biologi dan memodulasi beberapa fungsi penting untuk populasi sel neuron dan bukan neuron [13]. Walau bagaimanapun, tidak kurang pentingnya adalah peranan penting yang mereka mainkan dalam pembentukan dan fungsi vaskular [13-15], serta dalam peraturan integriti penghalang otak darah (BBB) melalui modulasi protein persimpangan yang ketat [16]. Dalam hal ini, bukti menunjukkan bahawa sintesis de novo sphingolipids sangat penting dalam memelihara fungsi sel endothelial [17,18], yang mungkin menyumbang kepada integriti vaskular dan homeostasis. Metabolisme sphingolipid yang rosak telah diterangkan untuk mendasari keadaan kardiovaskular yang berbeza [19,20]. Walau bagaimanapun, tiada bukti langsung peranan penyebab sphingolipids dalam patogenesis kerosakan organ sasaran hipertensi telah disediakan lagi. Walaupun kekurangan butiran mekanistik, laluan S1P, lipid bioaktif, telah terbukti neuroprotektif semasa iskemia [21,22], dan rangsangan reseptornya membawa kepada kesan benefificial dalam model haiwan strok [23]. Oleh itu, adalah difikirkan bahawa interaksi yang ketat antara strok dan sphingolipids wujud. Dalam kajian ini, kami menyiasat serebrum danBuah pinggangungkapan beberapa molekul yang terlibat dalam laluan sphingolipid dalam kedua-dua strain SHRSP dan SHRSR, berkenaan dengan strain WKY normotensive. Penemuan kami menyoroti, untuk pertama kalinya, metabolisme menyimpang dari sphingolipids baik di otak atau di ginjal kedua-dua model haiwan hipertensi. Yang penting, beberapa kecacatan dikesan secara eksklusif dalam ketegangan SHSRP. Bukti ini menunjukkan bahawa perubahan dalam molekul lipid tertentu dan/atau laluan khusus mereka berpotensi menyumbang kepada patogenesis hipertensi dan kerosakan organ sasaran hipertensi.
Keputusan
Tahap Enzim S1P-Metabolizing Diganggu dalam SHRSPUntuk mendedahkan sama ada sebarang gangguan yang berpotensi dalam metabolisme sphingolipid dapat dikesan dalam strain SHRSP dan SHRSR, kami mula-mula menyiasat ungkapan molekul yang terlibat dalam sintesis S1P dan laluan degradasi (dirancang dalam Rajah 1). Untuk tujuan ini, kami menilai tahap SPHK1 dan 2 serta SGPL1 dalam serebrum danBuah pinggangtisu dari kedua-dua tikus hipertensi secara spontan berbanding dengan strain WKY. Seperti yang dilaporkan dalam Rajah 2, tikus SHRSP dicirikan oleh pengurangan ketara SPHK2 serta SGPL1 di dalam otak jika dibandingkan dengan WKY dan SHRSR. Tiada perbezaan dalamBuah pinggangungkapan semua enzim dikesan di antara tiga strain tikus.
Tahap Reseptor S1P Adalah Aberrant dalam Tikus Hipertensi SpontanBukti menunjukkan bahawa modulasi reseptor S1P mungkin menjadi benefificial dalam model iskemik [23]. Di sini, untuk menentukan sama ada apa-apa perubahan dalam ekspresi mereka akhirnya boleh dikaitkan dengan fenotip penyakit, kami menilai tahap protein reseptor yang paling banyak, S1PR1-3 [24], dalam tiga strain tikus. Analisis Immunoblotting mendedahkan variasi dalam ungkapan ketiga-tiga reseptor dengan cara yang bergantung kepada tisu. Menariknya, S1PR1 adalah satu-satunya reseptor yang ekspresinya meningkat dalam otak dan buah pinggang SHRSR (Rajah 3A,3B). Sebaliknya, analisis tisu SHRSP tidak menunjukkan variasi dalam ungkapan semua reseptor, kecuali S1PR3 yang tahapnya meningkat di dalam otak, sama seperti yang dikesan dalam SHRSR (Rajah 3E)
Ungkapan Sinthases Ceramide Rosak dalam Pelbagai Tisu dari Model SHRSP dan SHRSRBukti sebelumnya menunjukkan bahawa tahap ceramide meningkat dalam model pra-klinikal strok dan juga pada pesakit manusia [25-27]. Di sini, untuk menilai sama ada metabolisme ceramide mungkin terjejas pada tikus hipertensi secara spontan, akhirnya mengakibatkan peningkatan tahap ceramide, kami menyiasat ungkapan sinthases ceramide, yang dilaporkan sebagai yang paling banyak di otak (CerS1 dan CerS2) dan diBuah pinggang(CerS2 dan CerS4) [28]. Seperti yang dilaporkan dalam Rajah 4, analisis qPCR mendedahkan gangguan umum dalam ungkapan sintaksis, dengan beberapa perbezaan antara kedua-dua strain hipertensi secara spontan. SHRSP menunjukkan peningkatan tahap CerS1 mRNA di dalam otak jika dibandingkan dengan WKY atau SHRSR (Rajah 4A) dan mengurangkan tahap CerS6 dalamBuah pinggang, sama seperti yang diperhatikan dalam SHRSR (Rajah 4D). Sebaliknya, SHRSR dicirikan oleh ungkapan CerS2 mRNA yang dikurangkan dalam kedua-dua otak dan buah pinggang (Rajah 4B,4C).
Ungkapan SPTLC1 Dikurangkan dalam Tisu SHRSPKajian baru-baru ini telah menunjukkan potensi penglibatan biossintesis de novo sphingolipids dalam hipertensi dan penyakit vaskular [29,30]. Untuk menyiasat sebarang kemungkinan hubungan antara laluan de novo sphingolipid dan strok, kami menilai profifiles ungkapan protein SPTLC1 dan 2, dua subunit SPT, enzim yang mengehadkan kadar dalam biossintesis de novo sphingolipids [13], dalam kedua-dua serebrum danBuah pinggangTisu. Seperti yang dilaporkan dalam Rajah 5A,B, tikus SHRSP dicirikan oleh pengurangan ketara SPTLC1 dalam kedua-dua otak danBuah pinggang.Menariknya, SPTCL2 juga dikurangkan dalam otak SHRSP berbanding SHRSR (Rajah 5C).
Ungkapan 3-Keto-Dihydrosphingosine Reductase Dikurangkan dalam Kedua-dua Tikus Hipertensi Secara SpontanPerubahan dalam de novo biosynthesis sphingolipids telah disahkan lagi oleh analisis enzim 3-keto dihydrosphingosine reductase (KDSR) dan ceramide desaturase (DES), biasanya terlibat dalam de novo sintesis sphingolipids [13]. Analisis qPCR menunjukkan pengurangan ketara tahap ungkapan mRNA KDSR dalamBuah pinggangkedua-dua SHRSP dan SHRSR (Rajah 6B). Tiada perubahan lanjut yang diperhatikan.
Rajah 2. Ungkapan enzim metabolisasi S1P rosak dalam tisu otak dari SHRSP. Wakil imunblottings dan analisis densitometrik SPHK1 (sphingosine kinase 1) (A,B), SPHK2 (sphingosine kinase 2) (C,D) dan SGPL1 (S1P-Lyase) (E,F) dalam tisu otak dan buah pinggang dari WKY, SHRSP dan SHRSR. Dalam setiap imunisasi, semua sampel dijalankan pada gel yang sama. Sampel bukan bersebelahan dipisahkan oleh garis hitam. Data diwakili sebagai purata ± SD, n = 6/7 untuk setiap kumpulan tikus. * p< 0.05;="" **="" p="">< 0.01;="" ***="" p="">< 0.001="" (one-way="" anova,="" tukey="" post-test).="" the="" raw="" date="" for="" generating="" the="" fifigure="" are="" reported="" in="" the="" supplementary="" material="" table="">
Perbincangan
Walaupun usaha penyelidikan yang luar biasa oleh saintis asas dan klinikal, komplikasi hipertensi seperti strok danBuah pinggangpenyakit masih merupakan penyebab utama kematian di seluruh dunia [1-3]. Oleh itu, pengetahuan tentang laluan patogen alternatif dan sasaran ubat baru diperlukan untuk mengekalkan kesihatan serebrovaskular dan buah pinggang. Meneroka metabolisme sphingolipids, kelas molekul aktif biologi dalam membran sel yang memainkan peranan penting dalam homeostasis vaskular, boleh membuka jalan ke arah ufuk pemahaman baru. Walaupun bukti yang muncul menunjukkan bahawa perubahan dalam metabolisme sphingolipids, seperti S1P dan ceramides, mungkin mempunyai peranan dalam gangguan vaskular dan hipertensi [31], sama ada ia terlibat dalam patogenesis kerosakan organ hipertensi masih tidak jelas. Dalam kajian ini, kami cuba untuk mendapatkan beberapa pandangan mengenai metabolisme sphingolipids dalam strain tikus SHRSP dan SHRSR, dua model pra-klinikal hipertensi secara spontan dengan kerentanan yang berbeza kepadaBuah pinggangdan pembangunan kerosakan serebrovaskular. Khususnya, kami melakukan kajian pada tikus berusia 8 minggu, pada usia ketika mereka menjadi hipertensi tetapi masih bebas dari kerosakan organ sasaran. Melalui pendekatan ini, kami bertujuan untuk mengenal pasti sebarang tandatangan "sphingobiological" yang berpotensi terlibat dalam hasil yang berbeza dari penyakit hipertensi dalam kedua-dua model tikus. Terikan tikus normotensive berfungsi sebagai kawalan yang sesuai. Penemuan kami menunjukkan buat kali pertama bahawa kedua-dua model tikus hipertensi dicirikan oleh gangguan global metabolisme sphingolipid, tetapi beberapa perubahan adalah spesifik kepada sama ada SHRSP atau ketegangan SHRSR. Khususnya, ungkapan kedua-dua SPHK2 dan SGPL1 dikurangkan dengan ketara hanya di otak SHRSP. Pengurangan tahap SPHK2 mungkin mempunyai kesan yang sangat merosakkan di dalam otak, di mana ia sangat banyak terdapat dalam sel endothelial mikrovaskular dan memberikan peranan perlindungan terhadap iskemia yang disebabkan oleh prasyarat hipoksik [32]. Sebaliknya, pengurangan SGPL1 mungkin berpotensi toksik untuk fungsi sel neuron [33].
Memandangkan ini, adalah difikirkan bahawa ketidakseimbangan enzim S1P-metabolizing, dengan bioavailabiliti S1P yang rosak, boleh mengakibatkan peningkatan kerosakan vaskular. Kemungkinan penglibatan S1P dalam peraturan mekanisme molekul yang berpotensi dikaitkan dengan strok berasal dari bukti bahawa tahap S1PR1, yang baru-baru ini dikenal pasti sebagai gen calon kedudukan untuk kepekaan garam dalam SHRSP [22], meningkat dalam tisu SHRSR. Keputusan ini mencadangkan kemungkinan peranan berganda S1P dalam penentuan kerosakan vaskular dan peristiwa strok yang terhasil. Malah, pengurangan bioavailabiliti S1P dan/atau peraturan yang rosak bagi laluan yang berkaitan boleh meningkatkan kerentanan terhadap strok dalam SHRSP. Sebaliknya, peningkatan ekspresi S1PR1, yang pengaktifannya dilaporkan baik dalam model eksperimen iskemia serebrum [34-36], akhirnya dapat mewakili faktor pelindung dalam SHRSR. Penemuan kami mendedahkan satu lagi perbezaan menarik antara kedua-dua strain tikus hipertensi secara spontan. Peningkatan ekspresi CerS1, yang dikesan hanya dalam SHRSP, mungkin menunjukkan bioavailabiliti tinggi ceramide serebrum yang mungkin mendedahkan toksik dan berpotensi dikaitkan dengan peningkatan kerentanan terhadap strok. Ini disokong oleh beberapa kajian yang melaporkan hubungan antara peningkatan kandungan ceramide, penyakit iskemia kapal kecil dan hiper-intensiti bahan putih [37,38].
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUNGSI BUAH PINGGANG / BUAH PINGGANG
Satu lagi pemerhatian penting yang diperolehi daripada kajian kami adalah pengurangan penting kedua-dua SPTLC1 dan 2 dalam SHRSP berbanding shRSR, di mana tiada variasi dikesan. Walaupun kedua-dua strain hipertensi berkongsi beberapa kecacatan dalam ekspresi gen lain yang terlibat dalam sintesis de novo sphingolipid, pengurangan SPTLCs jelas mencadangkan peranan utama laluan metabolik ini dalam patogenesis penyakit serebrovaskular. Dalam konteks ini, bukti baru-baru ini menunjukkan bahawa endothelial de novo sintesis sphingolipids mengawal tekanan darah dan homeostasis endothelial [30], menonjolkan peranan kritikal de novo synthetized sphingolipids dalam penyakit vaskular. Data semasa mungkin menunjukkan bahawa sintesis de novo sphingolipids boleh terganggu dalam SHRSP. Kajian kami adalah yang pertama menangani aspek spesifik metabolisme sphingolipid berkenaan dengan strok. Walaupun kami tidak melakukan sebarang analisis kuantitatif sphingolipids dalam tisu tikus, fifinding kami mencadangkan perubahan yang berpotensi dalam bioavailabiliti sphingolipids yang berbeza seperti S1P dan ceramide dalam SHRSP. Oleh kerana S1P merangsang percambahan sel dan laluan kelangsungan hidup manakala ceramides biasanya memberikan kesan anti-proliferatif dan apoptotik [39], ketidakseimbangan di antara mereka boleh menjejaskan homeostasis otak dalam SHRSP dan berpotensi menyumbang kepada patogenesis strok. Memandangkan sifat korelatif kajian kami, siasatan lanjut adalah perlu untuk memahami sepenuhnya potensi peranan penting perubahan sphingolipid dalam patogenesis kerosakan organ hipertensi untuk membangunkan strategi terapeutik "berasaskan sphingolipid" yang lebih berkesan. Memandangkan beberapa ubat, yang sasaran molekulnya tergolong dalam laluan sphingolipid, sudah tersedia untuk rawatan penyakit lain [40], kami percaya bahawa penemuan kami mungkin menawarkan sokongan untuk meneroka potensi terapeutik mereka dalam otak hipertensi danBuah pingganggangguan vaskular.
Bahan dan Kaedah
Model HaiwanSemua eksperimen dilakukan menggunakan strain tikus yang terdedah kepada strok lelaki berusia dua bulan secara spontan (SHRSP), tahan strok secara spontan hipertensi (SHRSR), dan membandingkannya dengan strain tikus normotensive yang sepadan dengan usia dan jantina, WistarKyoto (WKY). SHRSP dan SHRSR adalah model haiwan yang paling biasa digunakan dalam kajian praklinikal hipertensi dan strok yang berkaitan [5,6]. Mereka disimpan di kemudahan haiwan IRCCS Neuromed, dikekalkan pada suhu bilik yang berterusan dan 12 jam kitaran siang / malam, dan diberi makan dengan chow tikus biasa dan libitum iklan air. Semua kajian haiwan dilakukan mengikut protokol yang diluluskan oleh Lembaga Kajian Penjagaan Haiwan Neuromed IRCCS dan oleh "Istituto Superiore di Sanità" (nombor permit ISS: 1086/2020) dan dijalankan mengikut Arahan EU 2010/63 / EU untuk eksperimen haiwan.
ImmunoblottingsTikus telah dikucilkan oleh decapitation dan tisu (otak danBuah pinggang) telah dibekukan dalam cecair N2 dan pulverized dalam mortar dengan alu. Tisu pulverized homogenisasi dalam penimbal lysis yang mengandungi 20 mM Tris, pH 7,4, 1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 20 mM NaF, 2 mM Na3VO4 dan 1:1000 campuran perencat protease (Sigma-Aldrich) dan sonicated dengan denyutan 2 * 10 s. Untuk imunisasi, 20 μg jumlah lysate protein telah mengalami imunologi dengan antibodi berikut: anti-SPHK1 (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, Amerika Syarikat), anti-SPHK2 (1:1000) (Abcam, Cambridge, UK), anti-SGPL1 (1:1000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Syarikat), anti-S1PR1 (1:1000) (Immunological Sciences), anti-S1PR2 (1:1000)(Santa Cruz Biotechnology), anti-S1PR3 (1:1000) (Sains Imunologi), anti SPTLC1 (1:1000) (Abcam) dan anti-SPTLC2 (1:1000) (Abcam). Untuk normalisasi protein, anti-actin (1:2000) (Sains Imunologi, Rom, Itali) digunakan. Jalur protein dikesan oleh ECL Prime (GE Healthcare) dan diukur dengan Perisian Kuantiti Satu (Makmal Bio-Rad, Hercules, CA, Amerika Syarikat).
Pengekstrakan RNA dan qPCR.
Jumlah RNA diekstrak menggunakan kit Rneasy (Qiagen) mengikut arahan pengeluar. 1000 ng daripada jumlah RNA telah disintesis menggunakan transkripase terbalik Super Script III (Invitrogen) dan cDNA yang terhasil telah dikuatkan menggunakan Power SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad) mengikut arahan pengeluar. Analisis qPCR kuantitatif dilakukan menggunakan primer spekifififik: Kdsr FW: 50-TAAAGCAGGCAGGCAGGAGAAG-30; Kdsr RV: 50-GCCTGAGAGGACACAAACA -30; Des FW: 50-AGAGGAGTTCGAATGGGTCTA-30; Des RV: 50- GATAGCCAGAGTCATGGAATGG-30; CerS1 FW: 50- CCTGGAAGCTTCTGTTCTACTT-30; CerS1 RV: 50- CATGTACACGGTGGCATAGA-30; CerS2 FW: 50- CATGGCTGTCACTGTGGATAA-30; CerS2 RV: 50- GAGAAGCAGAGGAGAATGATGG-30; CerS6 FW: 50- CAGGAGTGGACAAAGCAAGA-30; CerS6 RV: 50- TGGTTTGGCTATGAATCTCTCG-30; Gapdh FW: 50- AACGACCCCTTCATTGACCTC-30; Gapdh RV: 50- CCTTGACTGTGCCGTTGAACT-30.
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUNGSI BUAH PINGGANG / BUAH PINGGANG
