Perencatan Reseptor Hidrokarbon Aryl Mengembalikan Disfungsi Endothelial Pengantaraan Indoxyl Sulfate dalam Cincin Aorta Tikus

Abstrak:Thetoksin uremik indoksil sulfat(IS), dinaikkan dalampenyakit buah pinggang yang kronik(CKD), diketahui menyumbang kepada penyakit kardiovaskular yang progresif. IS mengaktifkan reseptor aril hidrokarbon (AhR) pengantara tekanan oksidatif dandisfungsi endothelialmelalui pengaktifan laluan CYP1A1. Kajian ini mengkaji perencatan AhR dengan antagonis, CH223191, mengenai kemerosotan IS-pengantara fungsi endothelial vaskular dan gangguan keseimbangan redoks. Kesan akut IS pada kelonggaran yang bergantung kepada endothelium dinilai dalam cincin aorta daripada tikus Sprague Dawley yang terdedah kepada keadaan berikut: (1) kawalan; (2) IS (300µM); (3) IS + CH223191 (1µM); (4) IS + CH223191 (10µM). Selepas itu, tisu dinilai untuk perubahan dalam ekspresi penanda redoks. IS mengurangkan tahap maksimum kelonggaran yang bergantung kepada endothelium (Rmax) sebanyak 42% (p < 0.001) compared to control, this was restored in the presence of increasing concentrations of CH223191 (p < 0.05). Rings exposed to IS increased expression of CYP1A1, nitro-tyrosine, NADPH oxidase 4 (NOX4), superoxide, and reduced eNOS expression (p < 0.05). CH223191 (10 µM) memulihkan ekspresi penanda ini kembali ke tahap kawalan (p < 0.05). These findings demonstrate the adverse impact of IS-mediated AhR activation on the vascular endothelium, where oxidative stress may play a critical role in inducing disfungsi endothelialdalam vaskular jantung danbuah pinggang. Perencatan AhRboleh menyediakan terapi novel yang menarik untuk CVD dalamtetapan CKD. 

Kata kunci:reseptor aril hidrokarbon; indoksil sulfat; disfungsi endothelial; penyakit buah pinggang yang kronik; penyakit kardiovaskular; tekanan oksidatif

Sumbangan Utama: Indoxyl sulfate (IS), toksin uremik terikat protein yang paling banyak dikaji dan agonis kuat reseptor aril hidrokarbon (AhR), diketahui memainkan peranan patologi dalamperkembangan CKDdankecederaan berkaitan CKDdalam tisu lain, seperti vaskular. Kajian ini menunjukkan bahawa perencatan AhR ex vivo boleh menghalang disfungsi endothelial akibat IS dan perubahan yang berkaitan dalam keseimbangan redoks, merealisasikan potensi baharu.sasaran untuk terapi CKD

Perkhidmatan Sokongan Wecistanche-Pengeksport cistanche terbesar di China:

E-mel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Beli Untuk Butiran Spesifikasi Lebih Lanjut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

KLIK DI SINI UNTUK MENDAPATKAN EKSTRAK CISTANCHE ORGANIK SEMULAJADI DENGAN 25% ECHINACOSIDE DAN 9% ACTEOSIDE UNTUK JANGKITAN BUAH PINGGANG

1. Pengenalan

CKD menjejaskan 10% daripada populasi global, bukan sahaja memberi kesan kepada sistem kesihatan tetapi juga meletakkan beban ekonomi dan produktiviti yang berat kepada negara-negara di seluruh dunia [1,2]. Risiko penyakit kardiovaskular (CVD) meningkat pada pesakit dengan penyakit buah pinggang kronik (CKD) [3]. Dalam pesakit ini, pengumpulan toksin uremik terikat protein (PBUTS) yang beredar tidak boleh dialisis seperti indoxyl sulfate (IS) bukan sahaja menunjukkan peningkatan kematian CVD [4], tetapi juga meramalkan kejadian kardiovaskular yang buruk pada pesakit dengan kegagalan jantung kronik [4]. 5]. CKD dan tahap IS yang tinggi juga memburukkan lagi komplikasi kardiovaskular seperti hipertrofi miokardium, dislipidemia, keradangan kronik [6], serta disfungsi endothelial, yang dibuktikan oleh dilatasi aliran-mediasi aliran arteri brachial (FMD) yang tidak normal yang dikaitkan dengan tahap IS serum [7,8] . Kajian lain mendapati bahawa penyempitan mikrovaskular pada pesakit dengan CKD dikaitkan dengan penurunan kadar penapisan glomerular yang dianggarkan [9]. Tambahan pula, kajian haiwan telah melaporkan bahawa IS, sama ada meningkat dalam model CKD atau diberikan secara eksogen, menyumbang kepada gangguan vasorelaxasi yang bergantung kepada endothelium [10,11].

IS diperoleh daripada metabolisme tryptophan yang secara beransur-ansur terkumpul dalam serum tahap CKD memajukan 2–5; pertalian mengikatnya yang tinggi kepada albumin menghalang pelepasannya walaupun selepas dialisis [4,12]. Kajian terdahulu telah mengenal pasti IS sebagai agonis endogen pada reseptor aril hidrokarbon (AhR), faktor transkripsi yang bergantung kepada ligan sitosolik yang secara konstitutif dinyatakan dan terlibat dalam pelbagai proses biologi seperti tekanan oksidatif, keradangan, pembentukan semula vaskular, dan aterogenesis [13,]. 14]. Pengaktifan AhR pengantara IS mendorong enzim, sitokrom P450 1A1 (CYP1A1) dalam sel endothelial dan ini dikaitkan dengan peningkatan pengeluaran spesies oksigen reaktif (ROS) [14,15]. Tambahan pula, peningkatan ekspresi CYP1A1 dalam darah pesakit dengan CKD telah diperhatikan [16]. Perencatan pengaktifan AhR pengantara IS dengan antagonis terpilih seperti 2-metil-2H-pirazol-3-asid karboksilik (2-metil-4-o-toly- lazo-phenyl)-amide (CH223191) [17] telah dilaporkan untuk membalikkan keradangan yang disebabkan oleh IS dan pengeluaran ROS untuk mengawal tahap dalam sel endothelial [14,15].

AhR diketahui memainkan peranan dalam mengekalkan keseimbangan redoks genom dengan pengaktifan xenobiotik fasa I dan unsur tindak balas anti-oksidatif fasa II (ARE) Pengaktifan AhR mencetuskan sistem detoksifikasi selular, yang dibahagikan kepada enzim fasa I seperti CYP1A1 yang terlibat dalam Pengeluaran ROS. Penjanaan ROS yang berterusan membawa kepada interaksinya dengan faktor transkripsi anti-oksidan faktor nuklear erythroid 2-faktor berkaitan (Nrf2), selain itu, pengaktifan AhR juga merangsang Nrf2 [18,19]. Nrf2 bersama-sama dengan faktor transkripsi proto-onkogen c-Maf mengikat kepada ekspresi ARE-mendorong enzim anti-oksidatif fasa II NAD(P)H: quinone oxidoreductase (NQO1) dan glutathione S-transferase (GSTA1/2). CYP1A1 dan NRF2 memainkan peranan homeostatik dalam mengekalkan keseimbangan antara pro- dan anti-oksida [18,19].

Pilihan rawatan yang mengehadkan kesan merosakkan PBUT seperti IS adalah terhad. AST penjerap oral-120, yang membuang prekursor toksin uremik daripada usus, seperti indole, mengurangkan pembentukan dan tahap pengedaran IS dan PBUT terbitan indole yang lain. AST-120 telah digunakan dalam ujian klinikal kecil dengan sedikit kejayaan [20–22], yang menyaksikan ia diluluskan di beberapa negara Asia. Walau bagaimanapun, ujian klinikal fasa III besar EPPIC-1 dan -2 (Evaluating Prevention of Progression in CKD) menunjukkan bahawa AST-120 tidak mencapai titik akhir utamanya [23]. Ini menimbulkan keperluan untuk strategi alternatif yang boleh menghalang mekanisme tindakan IS. In vitro, AhR telah ditunjukkan sebagai sasaran berkesan yang perencatannya boleh menyekat tindakan hiliran IS dan berpotensi metabolit tryptophan lain [13,14] dan boleh memberikan utiliti terapeutik dalam mengurangkan risiko CVD dalam CKD dan mengurangkan perkembangannya.

Walaupun kebanyakan kajian in vitro menilai perencatan AhR menggunakan siRNA atau perencat molekul kecil seperti antagonis AhR tulen CH223191 [17], tiada kajian ex vivo telah dilakukan untuk menilai kesan antagonis ini pada kelonggaran endothelial untuk menentukan 'bukti prinsip'. Matlamat kajian ini adalah untuk menilai kesan perencatan AhR pada tisu aorta terpencil untuk mencegah kemerosotan IS yang disebabkan oleh fungsi vaskular yang bergantung kepada endothelial dengan mengurangkan tekanan oksidatif pengantara IS dan ekspresi gen CYP1A1 yang dikaitkan dengan pengaktifan AhR, dan seterusnya mengkaji kesan ke atas sistem anti-oksidan.

2. Keputusan

2.1. Kesan Perencatan Reseptor Hidrokarbon Aryl pada Relaksasi Bergantung Endothelium yang Terjejas IS

Cincin aorta daripada tikus yang sihat telah terdedah kepada IS (10–300 µM) untuk menentukan dos optimum IS yang menyebabkan kemerosotan kelonggaran endothelial. IS pada 300 µM tetapi bukan 10 µM atau 100 µM dengan ketara mengurangkan kelonggaran bergantung kepada endothelium (Rmax) kepada asetilkolin (ACh) berbanding kawalan sebanyak 32% (p < 0.05; Rajah 1A), dan kepekatan ini ialah digunakan dalam eksperimen selanjutnya. Dalam eksperimen seterusnya dengan kehadiran perencat AhR, CH223191 (1 dan 10 µM), kemerosotan akibat IS Rmax (42%) telah dihalang (p <0.001, Rajah 1B, Jadual 1). Dalam cincin aorta yang dirangsang IS sahaja, potensi ACh (-pEC50) dikurangkan berbanding kawalan (p <0.01) dan dipulihkan dengan kehadiran CH223191 (p <0.05; Jadual 1). Untuk menentukan sama ada perencat AhR sahaja menunjukkan sebarang kesan intrinsik pada kelonggaran yang bergantung kepada endothelium, cincin aorta diinkubasi dengan CH223191 sahaja, dan tidak menunjukkan kesan pada nilai Rmax atau -pEC50 (Jadual 1, juga Rajah Tambahan S1).

Rajah 1. Kesan CH223191 pada kereaktifan vaskular. (A) Pendedahan cincin aorta kepada IS (300 µM) mengurangkan kelonggaran yang bergantung kepada endotelium yang dirangsang ACh (p < 0.05; N=6). (B) Prainkubasi dengan CH223191 (1 µM dan 10 µM) menghalang pengurangan kelonggaran yang bergantung kepada endotelium yang disebabkan oleh IS (p < 0.001; N=10). Titik data dinyatakan sebagai min ± SEM

2.2. Kesan IS pada Endothelium dan Endothelial Nitric Oxide Synthase

Setelah selesai tindak balas kelonggaran berfungsi kepada ACh, bahagian tisu dari cincin aorta ini dianalisis oleh imunohistokimia untuk sel endothelial dan ekspresi endothelial nitric oxide synthase (eNOS). Tiada perubahan dalam sel endothelial seperti yang ditentukan oleh pewarnaan untuk antigen sel endothelial tikus {{0}} (RECA-1) di bawah empat keadaan yang diperiksa (Rajah 2A). Walau bagaimanapun, bahagian cincin aorta yang diwarnai untuk eNOS menunjukkan bahawa pendedahan IS mengurangkan ekspresi eNOS dengan ketara sebanyak 75% daripada permukaan luminal endothelial (p < 0.01), manakala dengan kehadiran CH223191 pengurangan ini telah dihalang dengan kehadiran. daripada 10 µM CH223191 (Rajah 2B–F; p <0.05).

Rajah 2. IS mengurangkan ekspresi eNOS tanpa kehilangan sel endothelial. (A) Pewarnaan sel endothelial RECA-1 dalam cincin aorta yang dirawat IS tanpa kehadiran dan kehadiran CH223191. ( B ) Ekspresi EndothelialNOS yang dikurangkan dengan kehadiran IS telah dihalang dengan CH223191. Imej perwakilan pewarnaan eNOS dalam tisu kawalan (C), (D) dirawat IS, IS dengan kehadiran (E) 1 uM dan (F) 1{{10}} uM CH223191. Anak panah menunjukkan pewarnaan positif. Data dinyatakan sebagai min 土 SEM daripada=10 percubaan. ** p < 0.01 berbanding dengan tisu kawalan, #fp < 0.05 berbanding dengan tisu terdedah ISPembesaran X400.

2.3. Kesan IS dan CH223191 pada Pro- dan Anti-Oksidatif

Ekspresi Gen Pengaktifan AhR yang disebabkan oleh IS diketahui meningkatkan CYP1A1. Kami mendapati IS (3{{10}}0 µM) meningkatkan ekspresi CYP1A1 dengan ketara dalam gelang aorta selepas 1 dan 4 jam dengan hampir sembilan dan tujuh kali ganda, masing-masing, berbanding keadaan kawalan (p < 0.05, Rajah 3). CH223191 pada 1 dan 10 µM mengurangkan ekspresi gen CYP1A1 yang dimediasi IS selepas rangsangan IS 1 jam ke tahap yang sama diperhatikan dalam cincin terdedah kawalan, manakala selepas rangsangan IS 4 jam, hanya 10 µM CH223191 dapat mengurangkan tahap CYP1A1 dengan ketara (p <0. , Rajah 3). Semasa memeriksa laluan anti-oksidatif, IS dalam ketiadaan dan kehadiran CH223191 gagal mendorong perubahan dalam ekspresi gen Nrf2, NQO1 dan GSTA1/2 (Lihat Rajah Tambahan S2)

2.4. Kesan IS dan CH223191 pada Penanda Tekanan Oksidatif dan Keradangan

Untuk mengkaji lebih lanjut perubahan dalam keseimbangan redoks, tisu daripada eksperimen berfungsi telah dianalisis untuk memeriksa perubahan dalam penanda tegasan oksidatif, iaitu nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase 4 (NOX4), ekspresi superoksida dan nitro-tyrosine. Tisu yang terdedah kepada IS menunjukkan peningkatan 180% dalam ungkapan NOX4 (Rajah 4; p < 0.001). Dengan kehadiran CH223191 (1 dan 10 µM), ungkapan NOX 4 dikurangkan dengan ketara berbanding IS (Rajah 4; p < 0.001). Pendedahan IS meningkatkan tahap ekspresi nitro-tirosin, penanda kerosakan sel dan pewarnaan keradangan sebanyak 90% berbanding kawalan (Rajah 5; p <0.05), manakala dengan kehadiran CH223191 (10 µM), ekspresi nitro-tirosin dikurangkan kembali ke tahap kawalan (Rajah 5; p <0.05). Ekspresi molekul spesies oksigen reaktif, superoksida, ditentukan oleh pewarnaan dihydroethidium (DHE). Pendedahan IS meningkatkan pewarnaan DHE sebanyak 430% berbanding kawalan (Rajah 6; p <0.001), manakala dengan kehadiran CH223191 pada kedua-dua dos, ekspresi superoksida dikurangkan kembali ke tahap kawalan, seperti ditunjukkan dalam Rajah 6; (p < 0.001

Ekspresi gen penanda keradangan juga diperiksa dalam aorta yang dirangsang dengan ketiadaan dan kehadiran sama ada CH223191. IS menghasilkan peningkatan tidak ketara sebanyak 111 dan 55% dalam ekspresi gen faktor nekrosis tumor a (TNFa) dan molekul pelekatan sel vaskular -1VCAM-1), pada 4 jam. Dengan kehadiran CH223191, tahap ekspresi kedua-dua gen telah dikurangkan dengan ketara, seperti ditunjukkan dalam Rajah 7 (p < 0.05).

Rajah 6. CH223191 menghalang ekspresi superoksida yang disebabkan oleh IS. (A) Kuantiti pewarnaan DHE dalam cincin aorta yang dirawat S tanpa kehadiran dan kehadiran CH223191. Imej perwakilan ungkapan superoksida dalam (B) tisu kawalan, (C) dirawat IS, IS dengan kehadiran (D) 1 uM dan (E) 1{{10}} M CH223191Data dinyatakan sebagai min SEM daripada N=10 percubaan. *** p < 0.001 berbanding tisu kawalan#### p < 0.001 berbanding tisu terdedah IS. Pembesaran x200.

Rajah 7. Kesan perencatan IS dan Ahk pada ekspresi gen keradangan. Pendedahan cincin aorta kepada ekspresi gen IS tidak dinaikkan secara ketara (A) TNFa dan (B) VCAM-1 pada 4 jam. Dengan kehadiran CH223191, ungkapan TNFx dan VCAM-1 telah dihalang. Data dinyatakan sebagai min 土 SEM daripada=6 percubaan. # p < 0.05 berbanding tisu terdedah IS.