Pemodelan Penyakit Dengan Organoid Buah Pinggang Ⅱ

4. Strategi untuk Meningkatkan Platform Organoid Buah Pinggang

Pameran organoid buah pinggang semasastruktur yang berkaitan dengan buah pinggangtetapi tidak menyerupaibuah pinggang dewasa berfungsi. Oleh itu, protokol yang diterangkan dalam Bahagian2.2 menimbulkan organoid buah pinggang yang kekurangan persekitaran biofizikal seperti in vivo, termasuk aliran bendalir melalui tisu. Kajian terbaru telah meningkatkan persamaan organoid kepada buah pinggang dewasa, menggunakan teknik seperti pemindahan dan menggabungkan jenis organoid yang berbeza untuk mencapai struktur buah pinggang peringkat tinggi. Teknik-teknik ini boleh digabungkan dengan pendekatan bioengineering untuk meneroka dan meningkatkan kematangan organoid. Di bawah, kami akan menyerlahkan strategi tersebut dan membincangkan pertimbangan baharu untuk menjana generasi akan datangsistem organoid buah pinggang. 

KLIK DI SINI UNTUK MENDAPATKAN CISTANCHE UNTUK RAWATAN CKD

4.1. Memperkenalkan Kecerunan

Kita tahu bahawa semasa embriogenesis normal, mesonephros, metanephros, dan UB menghantar isyarat kepada satu sama lain untuk membentuk buah pinggang yang sedang berkembang [6]. Di samping itu, kecerunan biokimia yang ditubuhkan pada embrio awal adalah penting untuk mengarahkan corak dan perkembangan buah pinggang yang betul [47]. Isu penting dalam protokol pembangunan organoid buah pinggang semasa kami ialah pengasingan mereka daripada tisu badan lain semasa pembangunan, dan dengan itu kekurangan kecerunan biokimia yang ditubuhkan melalui interaksi dengan sistem tisu pembangunan bersama embrio yang lain. Oleh itu, adalah berbaloi untuk memasukkan interaksi tersebut dalam pembangunan organoid. Taguchi dan Nishinakamura (2017) dan Tsujimoto et al. (2020) telah mempertimbangkan beberapa interaksi ini untuk memudahkan pematangan organoid [17,24]. Dalam strategi mereka, mereka mula-mula menggunakan faktor khusus PIM dan AIM untuk membangunkan organoid bebas, kemudian memindahkan organoid MM dan UB yang dikultur bersama ke dalam tikus [17,24]. Organoid buah pinggang yang dibangunkan dengan cara ini mempamerkan struktur tertib tinggi tetapi tidak dapat menyusun semula secara meluas dalam percabangan UB seperti vivo. Walaupun kajian ini menekankan kepentingan pengkulturan bersama tisu jiran, mereka menyeru penambahbaikan organoid melalui kecerunan yang telah ditetapkan termasuk dari permulaan perkembangan organoid.

Memandangkan hampir mustahil untuk memasukkan setiap tisu daripada embrio yang sedang berkembang dan mengoptimumkan keadaannya, kami mencadangkan satu simulasi persekitaran, di mana sel mengalami kesan tisu jiran. Ini boleh dicapai dengan mereka bentuk kecerunan biokimia untuk membesarkan sel, di mana kecerunan itu boleh meniru kehadiran tisu jiran. Kecerunan kemudiannya boleh mengarahkan kedua-dua garis keturunan AIM dan PIM dalam penggantungan sel yang sama, dan dengan itu mendorong pembentukan UB dan MM secara serentak. Sebagai contoh, kita boleh mewujudkan kecerunan GDNF dan memajukan cawangan UB dalam MM untuk mendorong pembentukan sistem saluran pengumpul rumit buah pinggang dewasa.

Walaupun pendekatan berasaskan kecerunan ini belum diterokai untuk membentuk organoid buah pinggang, ia telah digunakan untuk meningkatkan kematangan organoid lain. Contohnya, Ben-Reuven dan Reiner et al. (2020) membenamkan manik pembebas morfogen dalam hidrogel untuk membantu membentuk paksi anterior-posterior organoid otak [48]. Dalam kajian lain, Kamperman et al. (2019) menubuhkan substratum sel dengan morfogen terbiotinilasi [49]. Selain pendekatan statik ini, penyelidik juga telah membangunkan cip mikrobendalir dengan penambahan morfogen yang didorong oleh rakan. Sebagai contoh, Cui et al. (2020) menggunakan ruang dengan ruang chemotaxis untuk pengedaran morfogen dan ruang di mana sel stem boleh dibiakkan dalam hidrogel [50]. Oleh itu, penyelidik boleh menggunakan sistem yang serupa untuk memprogramkan pembangunan organoid buah pinggang menggunakan faktor tertentu yang dikawal secara spatial untuk menengahi kesannya. Ini akan mewujudkan kecerunan dan meniru taburan morfogen yang berlaku secara semula jadi yang berkaitan dengan perkembangan buah pinggang embrio. Contohnya, manik dengan faktor khusus untuk pembezaan AIM dan PIM boleh disemai pada sisi bertentangan hidrogel untuk meniru kecerunan AIM-PIM semula jadi. Sebagai alternatif, untuk mengawal pembezaan hiPSC, sel atau organoid boleh disemai ke dalam peranti mikrofluid, supaya sel/organoid daripada keturunan yang berbeza berada di sisi bertentangan (lihat Rajah 5A). HiPSC yang tertanam dalam hidrogel boleh dibiakkan di antara kedua-dua struktur ini, yang boleh berfungsi sebagai sumber faktor morfogenik. Pendekatan ini boleh digunakan untuk meniru interaksi antara mesonephros dan metanephros, yang kekurangan protokol organoid buah pinggang semasa dalam persediaannya (lihat Rajah 5A). Oleh itu, kerja masa depan harus bertujuan untuk meniru isyarat biokimia daripada pelbagai jenis tisu yang berkaitan dengan perkembangan buah pinggang, termasuk antara UB dan MM, serta antara buah pinggang dan vaskular yang sedang berkembang. Reka bentuk sistem yang berkaitan boleh meneroka pilihan untuk mewujudkan kecerunan untuk meniru interaksi tersebut.

4.2. Perfusi Organoid dengan Mikrobendalir

Aliran bendalir adalah penting untukfisiologi buah pinggangkerana ia memulakan rangkaian peristiwa intrasel sebagai tindak balas kepada penderiaan mekanis dan memudahkan pengangkutan merentasi tisu [51]. Oleh itu, jika kita ingin menjana organoid buah pinggang yang berfungsi dan mengekalkannya untuk jangka masa yang panjang, kita mesti menyepadukan rangkaian vaskular yang stabil dan boleh meresap ke dalam sistem model organoid kita. Aliran cecair telah diperkenalkan kepada organoid buah pinggang dalam dua cara utama, mikrobendalir dan pemindahan. Homan et al. (2019) memasukkan isyarat biofizik dalam cip bio-cetak 3D, di mana organoid dibiakkan dalam ruang dengan aliran bendalir dinamik [52]. Persediaan ini mensimulasikan rakan mikrofluid dan menggalakkan pembentukan rangkaian vaskular, tetapi ia tidak menyusun semula perfusi melalui struktur vaskular dan tubul untuk mereplikasi fisiologi buah pinggang. Namun begitu, kajian ini menekankan kepentingan persekitaran biofizikal dalam pematangan organoid.

Rajah 5. Cadangan penambahbaikan kepada platform organoid buah pinggang. (A) Pendekatan untuk menjana kecerunan di mana hiPSC boleh dibiakkan untuk berkembang menjadi organoid buah pinggang. Dari kiri ke kanan: gugusan iPSC dalam hidrogel diapit oleh manik pemancar morfogen, gugusan hiPSC dalam hidrogel diapit oleh organoid pemancar morphogen, sistem cip berbilang ruang dengan gugusan hiPSC yang dikultur dalam hidrogel dan terdedah secara dua hala kepada morfogen NP dan keturunan UB yang terkandung dalam cecair. (B) Sistem cip yang dicadangkan untuk mengkultur organoid buah pinggang di sebelah saluran endothelial bercabang, dengan susulan dalam hidrogel (cth, matriks kolagen). (C) Cadangan persediaan perancah, di mana organoid buah pinggang boleh ditanam dan kemudiannya dipindahkan. Dari kiri ke kanan: perancah berliang dengan saluran endothelial bercabang (merah), organoid buah pinggang berbiji, dan manik morfogen berbiji (sfera merah dan biru); perancah berliang dengan organoid NP mengelilingi organoid UB

Kami percaya bahawa seseorang boleh membangunkan organoid dalam platform organ-on-cip mikrofluid yang disalurkan untuk memodelkan buah pinggang manusia, seperti yang telah dilakukan dalam sistem sferoid yang lain. Sebagai contoh, tidak seperti Homan et al. (2019), yang meletakkan organoid dalam ruang sesama bendalir, Nashimoto et al. (2017) kultur spheroid fibroblast paru-paru manusia dalam matriks ekstraselular (ECM) antara dua saluran endothelial [52,53]. Saluran tersebut menimbulkan rangkaian vaskular yang mudah tembus yang terbentuk melalui angiogenesis. Menggunakan pendekatan yang agak serupa dengan Nashimoto et al. (2017), kami mencadangkan meletakkan kluster hiPSC bersebelahan dengan kapal endothelial perfusable yang boleh dibina ke dalam cip, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5B [53]. Dengan penambahan isyarat khusus buah pinggang-organoid yang seterusnya, saluran vaskular boleh diarahkan ke cawangan dan menyerang organoid apabila ia mula membezakan. Konfigurasi ini akan meniru peringkat awal perkembangan buah pinggang [54]. Dengan perfusi berterusan isyarat morfogenetik yang diperlukan untuk pembangunan buah pinggang, organoid buah pinggang sepatutnya dapat meniru proses pembentukan buah pinggang manusia yang lebih baik. Parameter sistem juga penting, seperti tekanan sesama bendalir, komposisi dan konfigurasi ECM, dan peringkat organoid dipertimbangkan dan dioptimumkan dengan teliti. Tambahan pula, sejak Schumacher et al. (2021) telah menunjukkan bahawa hipoksia membawa kepada peningkatan angiogenesis dalam organoid buah pinggang, sistem ex vivo sedemikian boleh dibiakkan dengan kehadiran oksigen yang berkurangan untuk mendorong vascularization dengan lebih cekap [55]. Akhirnya, strategi ini harus memudahkan pematangan organoid, menyusun semula perfusi vaskular dan tiub, dan melaksanakan fungsi fisiologi apabila ia berlaku dalam vivo.

4.3. Memajukan Pematangan Organoid melalui Pemindahan

Kajian telah menunjukkan bahawa pemindahan organoid buah pinggang ke dalam perumah, seperti tikus, telur ayam, atau tikus, boleh memberikan laluan yang berdaya maju untuk vaskularisasi [16,33,56]. Walau bagaimanapun, organoid yang dipindahkan mempamerkan kejayaan terhad sebagai struktur berfungsi. Halangan utama dalam strategi ini ialah menyusun semula cawangan UB yang luas dalam MM organoid yang dipindahkan. Selain itu, segmen nefron dalam organoid tidak mempunyai orientasi yang betul ke arah saluran pengumpul. Ciri-ciri ini penting untuk organoid yang dipindahkan untuk melaksanakan fungsi buah pinggang manusia dewasa. Selain itu, organoid selepas pemindahan berintegrasi dengan perumah, menjadikannya sukar untuk membezakan sempadan tisu organoid berbanding perumah, dan dengan itu mengehadkan analisis khusus organoid.

Strategi kejuruteraan tisu menyediakan pelbagai alat untukmeningkatkan perkembangan organoid buah pinggangdari segi kematangan dan integrasi fungsi. Biasanya, pendekatan kejuruteraan tisu menggunakan perancah (cth, perancah fibroin sutera) dalam pelbagai konfigurasi, seperti filem, tikar, hidrogel, dan span, untuk menyokong susunan sel dan untuk menyusun semula isyarat biofizikal yang berbeza bagi isu yang dikehendaki. Sebagai contoh, dalam satu kajian, Gupta et al. (2019) menggunakan perancah sutera berliang untuk menanam organoid, diikuti dengan pemindahan [31]. Dalam pendekatan ini, biomaterial dan konfigurasi perancah menyediakan rangka kerja untuk menyokong pembangunan organoid dan memberikan kestabilan semasa pemindahan. Walau bagaimanapun, sistem ini tidak mempunyai petunjuk berfungsi untuk menyokong kematangan organoid, seperti pembangunan bersama vasculature dengan rakan yang berdekatan dengan struktur membangun yang lain.

Kajian masa depan boleh membangunkan strategi yang serupa dan memasukkan isyarat berfungsi untuk menyokong kematangan organoid. Sebagai contoh, seperti yang digariskan dalam Rajah 5C, perancah berliang boleh dikonfigurasikan dengan saluran perfusable dan dimuatkan dengan faktor morfogenik untuk membangunkan sistem pembangunan organoid yang berkaitan melalui pemindahan. Pra-pembenihan dengan sel endothelial boleh menyokong pembangunan kapal terarah, manakala struktur berliang terbuka boleh disemai dengan hiPSC dan diprogramkan melalui faktor morfogenetik untuk pembangunan organoid. Sebagai alternatif, matriks ekstraselular (ECM) yang dirembeskan daripada tisu buah pinggang boleh, dengan sendirinya, berfungsi sebagai bahan perancah untuk kejuruteraan tisu organoid buah pinggang. Sebagai contoh, buah pinggang deselular telah digunakan untuk menyokong kematangan organoid. Matriks tersebut boleh digunakan untuk mengkultur dan memindahkan organoid atau untuk memperoleh perancah kejuruteraan tisu daripada biobahan tersebut.

Tambahan pula, perancah memberikan peluang yang belum diterokai untuk membenamkan berbilang keturunan organoid bersama-sama dalam kedudukan yang dipilih. Sebagai contoh, Taguchi dan Nishinakamura (2017) dan Tsujimoto et al. (2020) memindahkan kedua-dua organoid UB dan NP, membolehkan mereka memvaskularisasi [17,24]; bagaimanapun, mereka tidak mempunyai perancah ekstraselular untuk mengorientasikan organoid berbilang keturunan mereka. Dengan menggunakan perancah, kita boleh meniru penjanaan nefron di sekeliling struktur pengumpulan tunggal dengan mengorientasikan organoid UB di tengah dan bawah perancah. Pada masa yang sama, kita boleh menyemai organoid NP di sepanjang bahagian luar (lihat Rajah 5C). Pendekatan kejuruteraan tisu yang serupa boleh dibangunkan untuk memajukan kematangan organoid. Namun begitu, apabila mereka bentuk pendekatan berasaskan kejuruteraan tisu untuk pemindahan organoid, parameter seperti konfigurasi dan keserasian biobahan harus dipilih dengan teliti, mengikut keperluan buah pinggang.

5. Kesimpulan

Perkembangan yangorganoid buah pinggangadalah satu kejayaan besar secara in vitropemodelan penyakit buah pinggang. Organoid buah pinggangmembenarkan kajian individu tentangpenyakit buah pinggang genetikdan pemeriksaan dadah dalam platform yang dihasilkan oleh manusia. Walaupun mereka memegang janji yang besar, organoid buah pinggang tidak matang dan terpencil dalam bentuk semasanya. Untuk benar-benar memodelkanbuah pinggang manusiadan penyakit yang berkaitan, kita perlu mematangkannya dengan menyusun semula interaksi buah pinggang yang sedang berkembang. Khususnya, kita perlu memajukan interaksi antara UB dan MM secara in vitro dan memperkenalkan vaskular yang berasal dari manusia kepada organoid buah pinggang. Kita juga mesti mempertimbangkan pendekatan morfogen berasaskan kecerunan untuk selari dalam perkembangan embrio manusia vivo. Organoid buah pinggang mempunyai potensi besar untuk kajian genetik orang dewasa danpenyakit buah pinggang janindan pemeriksaan dadah. Kemajuan mereka boleh membawa kepada pembangunan menyelamatkan nyawapenyakit buah pinggangrawatan dengan cara yang lebih cepat dan lebih tepat berbanding sebelum ini.

Rujukan

1. Bannier-Hélaouët, M.; Pos, Y.; Korving, J.; Trani Bustos, M.; Gehart, H.; Begthel, H.; Bar-Efraim, YE; van der Vaart, J.; Kalmann, R.; Imhoff, SM; et al. Meneroka Kelenjar Lakrimal Manusia Menggunakan Organoid dan Penjujukan Sel Tunggal.Sel Stem Sel2021, 28, 1221–1232.e7. [CrossRef] [PubMed]

2. Lee, J.; Rabbani, CC; Gao, H.; Steinhart, MR; Woodruff, BM; Pflflum, ZE; Kim, A.; Heller, S.; Liu, Y.; Peniaga kapal, TZ; et al. Kulit manusia yang mempunyai rambut terhasil sepenuhnya daripada sel stem pluripotent.alam semula jadi2020, 582, 399–404. [CrossRef] [PubMed]

3. Takahashi, K.; Yamanaka, S. Induksi sel stem pluripoten daripada embrio tetikus dan kultur fibroblas dewasa oleh faktor yang ditentukan.sel2006, 126, 663–676. [CrossRef] [PubMed] 

4. Fakta Global: Mengenai Penyakit Buah Pinggang. Tersedia dalam talian:https://www.kidney.org/kidneydisease/global-facts-about-kidney disease#:~{}:text=10%25%20of%20the%20population%20worldwide,have%20access%20to%20affordable %20rawatan(diakses pada 6 Julai 2022).

5. Rehman, S.; Ahmad, D.Embriologi, Buah Pinggang, Pundi kencing, dan Ureter; StatPearls: Treasure Island, FL, Amerika Syarikat, 2022.

6. Reidy, KJ; Rosenblum, Sel ND dan biologi molekul pembangunan buah pinggang.Semin. Nephrol.2009, 29, 321–337. [CrossRef] [PubMed] 

7. Ryan, D.; Sutherland, M.; Flores, TJ; Kent, AL; Dahlstrom, J.; Puelles, V.; Bertram, J.; McMahon, AP; Little, MH; Moore, L.; et al. Perkembangan buah pinggang janin manusia dari pertengahan hingga akhir kehamilan pada bayi lelaki dan perempuan.eBioPerubatan2017, 27, 275–283. [CrossRef] 

8. Al-Awqati, Q.; Oliver, JA Stem sel dalam buah pinggang.Buah Pinggang Int.2002, 61, 387–395. [CrossRef] 

9. Tran, F.; Klein, C.; Arlt, A.; Imm, S.; Knappe, E.; Simmons, A.; Rosenstiel, P.; Seibler, P. Sel stem dan teknologi organoid dalam perubatan ketepatan dalam keradangan: Adakah kita sudah sampai?Depan. Immunol.2020, 11, 573562. [CrossRef]

10. Drost, J.; Clevers, H. Aplikasi translasi organoid yang berasal dari sel stem dewasa.Pembangunan2017, 144, 968–975. [CrossRef] 

11. Hishikawa, K.; Takase, O.; Yoshikawa, M.; Tsujimura, T.; Nangaku, M.; Takato, T. Sel dewasa seperti batang dalam buah pinggang.Sel Stem J. Dunia2015, 7, 490–494. [CrossRef]