Pembaca RNA M6 A YTHDF2 Mengawal Antitumor Sel NK Dan Kekebalan Antiviral Bahagian 2

YTHDF2 diperlukan untuk fungsi antivirus sel NK

Untuk menentukan sama ada kekurangan Ythdf2 menjejaskan aktiviti antiviral sel NK, kami menyuntik 2.5 × 104 PFU MCMV ke dalam tikus Ythdf2WT dan tikus Ythdf2ΔNK.

Keputusan menunjukkan bahawa tikus Ythdf2ΔNK lebih mudah terdedah kepada jangkitan MCMV, seperti yang digambarkan oleh penurunan berat badan yang ketara dan peningkatan titer virus dalam darah, limpa, dan hati berbanding dengan tikus Ythdf2WT (Rajah 3, A dan B; dan Rajah S2, A dan B) .

Kami juga melihat pengurangan ketara dalam peratusan dan bilangan mutlak jumlah sel NK dalam limpa dan darah tikus Ythdf2ΔNK berbanding dengan tikus Ythdf2WT selepas jangkitan (Rajah 3, C dan D; dan Rajah S2, C dan D). Analisis lanjut menunjukkan bahawa sel NK daripada tikus Ythdf2ΔNK mempunyai ekspresi Ki67 yang jauh lebih rendah daripada tikus Ythdf2WT (Rajah 3, E-G).

Walau bagaimanapun, daya maju sel NK adalah serupa antara tikus Ythdf2WT dan tikus Ythdf2ΔNK, seperti yang ditunjukkan oleh pewarnaan annexin V (Rajah S2 E). Data ini menunjukkan bahawa kekurangan YTHDF2 dalam sel NK mengakibatkan kecacatan dalam percambahan sel dan bukannya survival sel semasa jangkitan virus. NKcells menghalang jangkitan MCMV melalui reseptor mengaktifkanLy49H dan Ly49D, dan proses ini dicirikan oleh tindak balas antivirus perforin atau IFN-mediated (Arase et al., 2002; Lee et al., 2009; Loh et al., 2005; Orr et al., 2010; Sumaria et al., 2009).

Kami mendapati bahawa tikus Ythdf2ΔNK telah mengurangkan sel Ly49H+ dan Ly49D+ NK dengan ketara dalam limpa dan darah berbanding tikus Ythdf2WT selepas jangkitan (Rajah 3, H–J; dan Rajah S2, F–K).

Analisis lanjut menunjukkan bahawa walaupun setiap peratusan, hanya sel Ly49D+Ly49H+ menunjukkan perbezaan dalam tikus Ythdf2ΔNK berbanding tikus Ythdf2WT, nombor sel mutlak sel Ly49D−Ly49H+ NK, Ly49D+Ly49H− NK sel, dan sel NK Ly49D+Ly49H− NK dan limpa dan darah semuanya berkurangan dengan ketara dalam tikus Ythdf2ΔNK berbanding dengan tikus Ythdf2WT selepas jangkitan (Rajah S2, L–W).

Data kami mencadangkan bahawa mengawal jangkitan MCMV oleh YTHDF2 nampaknya dimediasi oleh sel Ly49D+Ly49H+ NK. Pengeluaran granzim B dan IFN oleh sel NK dalam tikus Ythdf2ΔNK adalah setanding dengan tikus Ythdf2WT (Rajah S2, X dan Y).

Kami mendapati pengeluaran perforin dikurangkan dengan ketara oleh tikus Ythdf2ΔNK berbanding tikus Ythdf2WT dalam kedua-dua limpa dan darah 7 hari selepas jangkitan (Rajah 3, K–M), menunjukkan bahawa YTHDF2 terutamanya mempengaruhi aktiviti antivirus pengantara sperforin terhadap MCMV dalam sel NK. Data ini mencadangkan bahawa YTHDF2 adalah penting untuk pengembangan sel NK dan fungsi effector semasa jangkitan MCMV.

YTHDF2 mengawal homeostasis sel NK dan pematangan terminal pada keadaan mantap

Penemuan di atas bahawa kekurangan Ythdf2 dalam sel NK meningkatkan metastasis tumor dan kapasiti sel NK terjejas untuk mengawal jangkitan MCMV menggalakkan kami untuk menyiasat sama ada YTHDF2 diperlukan untuk penyelenggaraan sel NK pada keadaan mantap.

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4 A, kekerapan dan bilangan mutlak sel NK berkurangan dengan ketara dalam darah periferi, limpa, hati dan paru-paru tetapi tidak dalam sumsum tulang (BM) tikus Ythdf2ΔNK berbanding tikus Ythdf2WT.

Walau bagaimanapun, tiada perubahan ketara di kalangan progenitor limfoid biasa, progenitor sel pra-NK, dan progenitor sel NK yang ditapis (NKP) dalam BM (Fathman et al., 2011) antara tikus Ythdf2WT dan Ythdf2ΔNK (Rajah S3 A), menunjukkan bahawa YTHDF2 mungkin tidak menjejaskan perkembangan awal sel NK dalam model kami.

Untuk meneroka mekanisme berpotensi yang bertanggungjawab terhadap penurunan sel NK dalam tikus Ythdf2ΔNK, kami menyiasat pembiakan sel, daya maju dan keupayaan pemerdagangan sel NK selepas pemadaman Ythdf2 pada keadaan mantap. Peratusan sel NK yang membiak adalah setanding antara tikus Ythdf2WT dan Ythdf2ΔNK, seperti yang dibuktikan oleh pewarnaan Ki67 (Rajah S3 B).

Daya maju NKcells juga bersamaan antara tikus Ythdf2WT dan Ythdf2ΔNK, seperti yang ditunjukkan oleh pewarnaan lampiran V (Rajah S3 C). Untuk memeriksa sama ada YTHDF2 menjejaskan pengeluaran sel NK dari BM ke pinggir, tikus Ythdf2WT dan Ythdf2ΔNK disuntik iv dengan antibodi antiCD45 untuk menandakan sel imun dan dikorbankan selepas 2 minit, dan sel BM mereka dianalisis.

Ini membolehkan kami mengukur bilangan sel NK dalam kawasan sinusoidal berbanding parenkim BM, penunjuk pemerdagangan sel NK dari BM ke darah periferi di bawah keadaan mantap (Leong et al., 2015). Keputusan menunjukkan pengurangan ketara dalam kekerapan CD45+ sel NK dalam tikus Ythdf2ΔNK berbanding tikus Ythdf2WT dalam sinusoid (Rajah 4 B), menunjukkan bahawa kekurangan Ythdf2 menjejaskan keluarnya sel NK dari BM ke sistem peredaran in vivo .

Sel imun mengalami percambahan homeostatik semasa limfopenia yang disebabkan oleh jangkitan virus tertentu atau disebabkan oleh kemoterapi (Sun et al., 2011). Walaupun kami mendapati bahawa YTHDF2 boleh diketepikan untuk percambahan sel NK pada keadaan mantap, kami melihat penurunan ketara dalam percambahan sel semasa jangkitan MCMV (Rajah 3, E-G). Oleh itu, kami menyiasat peranan YTHDF2 dalam mengawal proliferasi homeostatik sel NK dalam persekitaran limfopenik dalam vivo .

Kami memindahkan bilangan sel NK splenik yang sama daripada CD45.2 Ythdf2ΔNK tikus atau CD45.1 tikus congenik ke dalam tikus Rag2−/−Il2rg−/− yang kekurangan limfosit. Keputusan menunjukkan bahawa sebahagian besar sel NK diperoleh daripada tikus kawalan CD45.1WT berbanding tikus CD45.2 Ythdf2ΔNK pada hari ke-3 selepas pemindahan sel (Rajah S3 D).

Analisis lanjut menunjukkan bahawa pengurangan sel NK daripada tikus Ythdf2ΔNK adalah disebabkan oleh percambahan sel terjejas (Rajah S3 E) tetapi bukan apoptosis sel (Rajah S3 F), menunjukkan bahawa YTHDF2 memacu percambahan homeostatik sel NK dalam vivo di bawah keadaan limfopenik.

Pembezaan lanjut sel NK murine boleh dikelaskan kepada peringkat tidak matang (CD11b−CD27+), matang pertengahan (CD11b+CD27+), dan peringkat matang terminal (CD11b+CD27−) berdasarkan tahap CD11b dan CD27 ( Chiossone et al., 2009; Geiger dan Sun, 2016).

Kami mendapati bahawa ungkapan Ythdf2 meningkat dengan kematangan dan bahawa CD11b−CD27+, CD11b+CD27+, CD11b+CD27− memaparkan tahap ekspresi terendah, pertengahan dan tertinggi Ythdf2, masing-masing (Rajah S3 G), menunjukkan bahawa YTHDF2 mungkin terlibat dalam pematangan sel NK. Oleh itu, kami menyiasat peranan YTHDF2 dalam pematangan sel NK yang ditakrifkan oleh penanda permukaan sel CD11b dan CD27.

Kami mendapati bahawa kehilangan Ythdf2 dalam sel NK mengakibatkan penurunan ketara dalam kekerapan sel NK matang terminal dan/atau peningkatan dalam sel NK matang yang tidak matang dan pertengahan dalam limpa, hati, paru-paru dan darah tetapi tidak dalam BM (Rajah 4 C dan Rajah S3 H), menunjukkan bahawa YTHDF2 secara positif mengawal pematangan sel NK terminal. Selaras dengan data ini, tahap KLRG1, yang merupakan penanda kematangan sel NK terminal, telah menurunkan dengan ketara dalam tikus Ythdf2ΔNK dalam limpa, hati dan paru-paru tetapi tidak BM berbanding dengan tikus Ythdf2WT dalam organ atau petak tisu yang sepadan (Rajah 4 D).

Untuk menentukan sama ada bilangan sel NK matang yang berkurangan oleh kekurangan Ythdf2 adalah intrinsik sel, kami mencipta chimera dalam tikus Rag2−/−Il2rg−/− dengan menyuntik sel BM daripada CD45.1 WT dan CD45.2 Ythdf2ΔNK tikus, dicampur pada 1:1. nisbah. Seperti yang ditunjukkan oleh sitometri aliran pada 8 minggu selepas pemindahan, bahagian sel NK matang terminal yang berkurangan diperoleh daripada sel BM CD45.2 Ythdf2ΔNK berbanding sel kawalan CD45.1 WT (Rajah 4 E), menunjukkan bahawa kematangan terminal sel NK dikawal oleh YTHDF2 adalah intrinsik sel.

Faktor transkripsi kotak T Eomes dan Tbet adalah kritikal untuk kematangan NKcell (Daussy et al., 2014; Gordon et al., 2012). Pewarnaan intraselular mendedahkan pengurangan ketara dalam tahap protein Eomes dalam sel NK daripada tikus Ythdf2ΔNK berbanding dengan tikus Ythdf2WT (Rajah S3 I). Di samping itu, kami mendapati bahawa pengurangan tahap protein dan mRNA Eomes secara khusus berlaku dalam sel NK matang terminal (CD11b+CD27−) (Rajah S3, J–L).

Walau bagaimanapun, berbeza dengan Eomes, ungkapan Tbet adalah setara dalam sel NK antara tikus Ythdf2ΔNK dan Ythdf2WT (Rajah S3, I dan K), menunjukkan bahawa YTHDF2 mungkin mengawal kematangan terminal NKcell dengan menyasarkan Eomes.