Pembaca RNA M6 A YTHDF2 Mengawal Antitumor Sel NK Dan Kekebalan Antiviral Bahagian 3

YTHDF2 diperlukan untuk kemandirian sel NK pengantara IL-15, percambahan dan fungsi efektor

IL-15 ialah salah satu daripada, jika bukan sitokin yang paling penting untuk fungsi pleiotropik sel NK. Kami dan yang lain sebelum ini mendapati bahawaIL-15 memainkan peranan penting dalam mengawal selia homeostasis sel NK, survival dan fungsi efektor (Becknell dan Caligiuri, 2005; Carsonet al., 1997; Carson et al., 1994; Wang et al., 2019b; Yu et al., 2013).

Pleiotropi sel merujuk kepada keupayaan mereka untuk melaksanakan fungsi yang berbeza dalam persekitaran yang berbeza. Pleiotropi sel berkait rapat dengan imuniti kerana banyak sel dalam sistem imun boleh memainkan pelbagai peranan yang berbeza.

Dalam sistem imun, sel T adalah jenis sel yang sangat kritikal. Mereka mengenali dan menyerang patogen, sementara juga mengawal aktiviti sel imun yang lain. Pleiotropi sel T adalah sangat penting kerana apabila sistem imun menghadapi patogen baru, sel T perlu memainkan peranan yang berbeza dalam tempoh yang singkat untuk bertindak balas dengan berkesan. Sebagai contoh, apabila sistem imun menghadapi jangkitan bakteria, sel T perlu memainkan peranan membunuh bakteria, dan apabila sistem imun menghadapi jangkitan virus, sel T perlu memainkan peranan mengawal sel imun yang lain.

Selain itu, dalam sistem imun, kelas sel yang dipanggil makrofaj juga mempunyai kesan pleiotropik. Mereka boleh memfagositosis dan memecahkan patogen asing, dan juga boleh mengaktifkan sel imun lain untuk menyerang patogen. Pleiotropi makrofaj adalah penting kerana mereka perlu memainkan peranan yang berbeza dalam persekitaran yang berbeza. Sebagai contoh, dalam jangkitan virus, makrofaj perlu merembeskan beberapa bahan untuk melawan virus, manakala dalam jangkitan bakteria, makrofaj perlu menelan dan mencerna bakteria untuk membersihkan patogen.

Ringkasnya, terdapat hubungan rapat antara pleiotropi selular dan imuniti. Sel pleiotropik boleh memainkan peranan yang berbeza dalam persekitaran yang dijangkiti oleh patogen yang berbeza, dengan itu meningkatkan keupayaan sistem imun untuk bertindak balas dan meningkatkan imuniti badan terhadap pelbagai patogen. Oleh itu, kita harus memberi perhatian kepada pleiotropi sel dan juga menguatkan penanaman imuniti untuk mengekalkan kesihatan manusia. Ia boleh dilihat bahawa kita perlu meningkatkan ingatan, dan Cistanche deserticola boleh meningkatkan ingatan dengan ketara, kerana Cistanche deserticola juga boleh mengawal keseimbangan neurotransmitter, seperti meningkatkan tahap asetilkolin dan faktor pertumbuhan. Bahan-bahan ini sangat penting untuk ingatan dan pembelajaran. Selain itu, Cistanche deserticola juga boleh meningkatkan aliran darah dan menggalakkan penghantaran oksigen, yang dapat memastikan otak menerima nutrien dan tenaga yang mencukupi, seterusnya meningkatkan daya hidup dan daya tahan otak.

Klik tahu cara untuk meningkatkan ingatan anda

Dalam kajian semasa, kami menunjukkan bahawa IL-15 mengawal selia mRNA dan tahap protein YTHDF2 dalam sel NK (Rajah 6 A; dan Rajah 1, D–F). Oleh itu, kami membuat spekulasi bahawa YTHDF2 diperlukan untuk survival IL-15-pengantara dan fungsi effector sel NK.

Kami mula-mula cuba mengenal pasti faktor transkripsi yang berpotensi di hiliran isyarat IL-15 yang mengawal selia secara langsung ungkapan YTHDF2. Kami menganalisis Ensiklopedia Elemen DNA menggunakan Universiti California, Santa Cruz, Pangkalan Data Pelayar Genom (https://genome.ucsc.edu), yang menyediakan ramalan tapak pengikatan merentas keseluruhan genom, dalam kombinasi denganJASPAR (http://jaspar.genereg .net).

Kami mendapati bahawa STAT5, yang merupakan faktor hiliran utama IL-15 dalam sel NK, mempunyai empat tapak pengikat dalam 2 kb hulu tapak mula transkripsi (TSS) Ythdf2, menunjukkan bahawa IL-15 mungkin positif mengawal selia transkripsi Ythdf2 dalam sel NK tetikus melalui STAT5.

Dengan menggunakan STAT perencat STAT55-IN-1 (Müller et al., 2008), kami menunjukkan bahawa perencatan STAT5 mengakibatkan penurunan Ythdf2 pada kedua-duamRNA dan tahap protein dalam sel NK murine (Rajah S4, A dan B). Untuk mengesahkan lagi bahawa YTHDF2 ialah faktor hiliran yang dikawal oleh STAT5, kami menggunakan tikus Stat5fl/fl Ncr1-iCre (selepas ini dirujuk sebagai tikus Stat5ΔNK), di mana STAT5 secara khusus memadamkan sel NK tetikus (Wiedemann et al., 2020).

Kami merawat sel splenicNK daripada tikus Stat5WT dan Stat5ΔNK dengan IL-15. Kami mendapati bahawa YTHDF2 berkurangan dengan ketara dalam sel NK daripada tikus Stat5ΔNK berbanding dengan sel NK daripada tikus Stat5WT pada kedua-dua merekaRNA dan tahap protein (Rajah 6, B dan C; dan Rajah S4, C dan D).

Ujian wartawan Luciferase menunjukkan bahawa kedua-dua STAT5a danSTAT5b mengaktifkan transkripsi gen Ythdf2 secara langsung (Rajah 6, D, dan E). Keputusan imunopresipitasi Chromatin (ChIP)–qPCR menunjukkan bahawa STAT5 mempunyai pengayaan yang ketara pada empat tapak di atas kawalan IgG biasa, menunjukkan pengikatan langsung dalam sel NK tetikus (Rajah 6 F). Bersama-sama, keputusan kami menunjukkan bahawa ekspresi YTHDF2 dikawal oleh STAT5 hiliran isyarat IL-15 dalam sel NK.

Kami kemudiannya tertanya-tanya sama ada sel NK kekurangan Ythdf2-cacat dalam tindak balasnya kepada IL-15. Kami mengasingkan sel NK splenik daripada tikus Ythdf2ΔNK dan tikus Ythdf2WT dan mengkulturkan min vitro dengan kehadiran IL-15. Kami mendapati bahawa pertumbuhan sel NK telah menurun dengan ketara dalam tikus Ythdf2ΔNK berbanding tikus Ythdf2WT (Rajah 6 G). Ujian pelabelan CellTrace Violet (CTV) menunjukkan bahawa percambahan sel NK telah terjejas oleh kekurangan Ythdf2 (Rajah 6 H).

 Analisis pengedaran kitaran sel mendedahkan pecahan sel NK meningkat dengan ketara daripada tikus Ythdf2ΔNK dalam fasa G0/G1 tetapi pecahan sel NK menurun dengan ketara daripada tikus Ythdf2ΔNK dalam fasa S (Rajah 6 I), menunjukkan bahawa kekurangan Ythdf2 menyebabkan kekurangan. dalam penangkapan fasa G0/G1 dalam sel NK.

Selain itu, terdapat peningkatan dua hingga tiga kali ganda dalam sel NK apoptosis(annexin V+Sytox-Blue+/−) daripada tikus Ythdf2ΔNK berbanding dengan tikus Ythdf2WT (Rajah 6 J), menunjukkan kemandirian sel NK yang rosak selepas kehilangan Ythdf2. Keputusan ini menunjukkan bahawa YTHDF2 mengawal tindak balas NKcells kepada IL-15 in vitro. Memandangkan IL-15 diterjemahkan dengan buruk dan dirembeskan dalam vivo pada keadaan mantap (Corbel et al., 1996; Fehniger et al.,2001), untuk meneroka sama ada sel NK kekurangan Ythdf2-defisit dalam tindak balasnya kepada IL-15 in vivo, kami merawat tikus dengan IL-15.

Kami mendapati bahawa kekurangan Ythdf2-berbanding sel WT NK menunjukkan percambahan sel berkurangan dengan ketara dan peningkatan apoptosis sel apabila tikus dirawat dengan IL-15 (Rajah 6 K; dan Rajah S4, E–J). Data ini mencadangkan bahawa YTHDF2 mengawal selia tindak balas sel NK kepada IL-15, terutamanya dalam beberapa keadaan dengan IL tahap tinggi-15. Kami juga mendapati bahawa tahap mRNA dan protein IFN-, granzyme B dan perforin telah dikurangkan dengan ketara dalam sel NK Ythdf2ΔNK berbanding dengan sel NK Ythdf2WT sebagai tindak balas kepada IL-15 (Rajah 6, L–N), menunjukkan bahawa YTHDF2 turut menyumbang kepada IL{13}}–fungsi efektor sel NK pengantara secara in vitro.

Secara kolektif, data kami menunjukkan bahawa YTHDF2 diperlukan untuk survival sel NK pengantara IL-15, percambahan dan fungsi efektor. Seterusnya, kami menyiasat mekanisme hiliran yang mana YTHDF2 mengawal kelangsungan hidup, percambahan dan fungsi efektor IL-15-pengantara. Kami mendapati bahawa sel NK daripada tikus Ythdf2ΔNK dan tikus Ythdf2WT mempunyai tahap yang sama bagi reseptor IL-15CD122 (IL-15R ) dan CD132 (IL-15R c; Rajah S4 K). Isyarat IL{12}} dimediasi oleh sekurang-kurangnya tiga laluan isyarat hiliran dalam selNK: Ras–Raf–MEK–ERK, PI3K–AKT–mTOR dan JAK1/3–STAT3/5 (Mishra et al., 2014).

Untuk menyiasat laluan isyarat yang dikawal oleh YTHDF2 dalam sel NK, kami telah memeriksa tahap fosforilasi ERK, AKT, S6, STAT3 dan STAT5 dalam sel inNK daripada tikus Ythdf2ΔNK atau tikus Ythdf2WT selepas rangsangan dengan IL-15.

Keputusan menunjukkan bahawa kekurangan Ythdf2 tidak menjejaskan fosforilasi ERK, AKT, S6 dan STAT3 apabila rangsangan IL-15(Rajah S4, L dan M) tetapi menghalang pengaktifan STAT5 dengan ketara, seperti yang dibuktikan oleh pengurangan tahap fosforilasi STAT5 dalam Ythdf{{ 7}}kekurangan sel NK daripada sel NK daripada tikus Ythdf2WT (Rajah 6 O), menunjukkan bahawa YTHDF2 diperlukan untuk isyarat IL6/STAT5 yang optimum dalam sel NK yang diaktifkan.

Oleh kerana kami menunjukkan bahawa STAT5 terfosforilasi hiliran IL-15mengikat kepada penganjur Ythdf2 (Rajah 6, D–F), dan di sini kami menunjukkan bahawa YTHDF2 diperlukan untuk STAT5fosforilasi optimum, data kami mencadangkan gelung maklum balas positif STAT5–YTHDF2 hiliran IL-15 yang mungkin mengawal kelangsungan hidup sel NK, percambahan dan fungsi efektor.

Analisis seluruh transkriptom mengenal pasti Tardbp sebagai sasaran YTHDF2 dalam sel NK

Untuk menangani mekanisme molekul yang mana YTHDF2 mengawal sel NK, kami mula-mula melakukan penjujukan RNA (seq) dalam sel-sel NK Ythdf2WT dan Ythdf2ΔNK-IL-2–yang diperluaskan dahulu. Pemadaman Ythdf2 dalam sel NK menghasilkan 617 gen yang dinyatakan secara berbeza, termasuk 252 gen terkawal dan 365 gen terkawal (Rajah S5 A).

Analisis ontologi gen (GO) menunjukkan bahawa gen yang dinyatakan secara berbeza diperkaya dengan ketara dalam kitaran sel, pembahagian sel, dan proses berkaitan pembahagian sel, termasuk mitoticcytokinesis, pengasingan kromosom, gelendong, nukleosom, badan tengah dan kromosom (Rajah 7). A).

Analisis pengayaan set gen (GSEA) menunjukkan pengayaan ketara bagi sasaran E2F, G2/Mcheckpoint, dan set gen tanda gelendong mitosis dalam sel Ythdf2ΔNKNK (Rajah S5 B). Gen berkaitan kitaran sel dan pembahagian sel, termasuk Aurka, Aurkb, Cdc20, Cdc25b, Cdc25c, Cdk1, E2f2, dan Plk1 (Bertoli et al., 2013), telah menurun dengan ketara dalam sel NK daripada tikus Ythdf2ΔNK (Rajah 7 B). ).

Gen pengasingan gelendong dan kromosom seperti Anln, Aspm, Birc5, Bublb, Cenpe, Esco2, Ska1, Ska3, dan Tpx2 (Gorbsky, 2015) juga dikurangkan dengan ketara dalam sel NK daripada tikus Ythdf2ΔNK berbanding dengan sel NK daripada Ythdf2WT.mice (Fig.mice).

Di samping itu, gen kemandirian sel, termasuk Birc5 (Niu et al., 2010), Septin4 (Larisch et al., 2000), dan Rffl (Yanget al., 2007), telah berkurangan dengan ketara dalam sel NK dari tikus Ythdf2ΔNK (Rajah 1). 7 D). Gen fungsi efektor sel NK, termasuk Klrk1, Ncr1, CD226, dan Gzma (Bezman et al., 2012), juga dikurangkan dengan ketara dalam sel NK daripada tikus Ythdf2ΔNK (Rajah 7 D).

Data ini menyokong peranan YTHDF2 yang dicirikan kami dalam mengawal selia percambahan sel NK, kemandirian dan fungsi efektor. Kami kemudian melakukan m6A-seq dalam IL-2–sel NK yang dikembangkan daripada tikus Ythdf2WT dan Ythdf2ΔNK. Analisis komponen utama menunjukkan bahawa tiga replika biologi setiap genotip berkumpul bersama (data tidak ditunjukkan), mencadangkan kebolehulangan yang baik bagi sampel m6A-seq.

Pengoptimuman hipergeometrik analisis pengayaan motif (HOMER) mengenal pasti motif konsensus m6A(GGAC), menunjukkan kejayaan pengayaan transkrip diubahsuai m6A (Rajah 7 E). Pengubahsuaian m6A kebanyakannya ditempatkan dalam transkrip pengekodan protein, dan puncaknya diperkaya dalam 59 kawasan tidak diterjemahkan (UTR) dan 39UTR, terutamanya di sekitar kodon mula dan henti (Rajah 7 F dan Rajah S5 C).

Analisis pengayaan gen dengan puncak m6A mendedahkan bahawa kebanyakan transkrip bertanda m6A dalam sel NK telah diperkaya dalam laluan yang terlibat dalam kitaran sel dan percambahan sel (Rajah S5 D).

For more information:1950477648nn@gmail.com