Peranan Fosfat Bebas Protein dalam Perkembangan Penyakit Buah Pinggang Kronik
Mar 20, 2022
Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com
Irene Faria Duayer1 et al
Abstrak:Beberapa faktor menyumbang kepadafungsi buah pinggangpenurunan dalam pesakit CKD, dan peranan kandungan fosfat dalam diet masih menjadi perdebatan. Kajian ini bertujuan untuk menganalisis mekanisme yang mana fosfat, bebas daripada protein, dikaitkan dengan perkembangan CKD. Tikus AdultMunich-Wistar telah diserahkan kepada 5/6 nephrectomy (Nx), diberi makan dengan diet rendah protein, dan dibahagikan kepada dua kumpulan. Hanya kandungan fosfat (fosfat rendah, LoP, 0.2 peratus ; fosfat tinggi, HiP,0.95 peratus ) diet yang dibezakan. Selepas enam puluh hari, parameter biokimia danbuah pingganghistologi telah dianalisis. Kumpulan HiP menunjukkan fungsi buah pinggang yang lebih teruk, dengan tahap PTH, FGF-23 dan pecahan fosfat yang lebih tinggi. Dalam analisis histologi tisu buah pinggang, mereka juga menunjukkan peratusan fibrosis interstisial yang lebih tinggi, ekspresi -actin, PCNA, danbuah pinggangpenyusupan oleh makrofaj. Kumpulan LoP membentangkan ekspresi beclin-1 yang lebih tinggi dalam sel tubul renal, penanda efluks autofagik jika dibandingkan dengan kumpulan HiP. Penemuan kami menyerlahkan tindakan fosfat dalam induksibuah pinggangkeradangan interstisial dan fibrosis, menyumbang kepada perkembangan penyakit buah pinggang. Kemungkinan kesan fosfat pada disregulasi mekanisme autophagy sel renal memerlukan penyiasatan lanjut dengan kajian klinikal.
Kata kunci:fosfat;diet; CKDkemajuan;buah pinggangfibrosis; autophagy;apoptosis
Sumbangan Utama:Mekanisme perlindungan buah pinggang, dengan menyekat diet fosfat, masih belum ditentukan. Dalam kajian ini, lebihan fosfat bertindak dalam perkembangan CKD dengan pengaktifan laluan keradangan dan induksibuah pinggangfibrosis celahan. Kesan hiperfosfatemia pada apoptosis sel renal dan rakan autofagik memerlukan siasatan lanjut.
Cistanche tubulosa mencegah penyakit buah pinggang, klik di sini untuk mendapatkan sampel
1. Pengenalan
Kronikbuah pinggangpenyakit (CKD) dianggap sebagai masalah kesihatan awam. Prevalensnya meningkat dengan usia dan berbeza antara 11 dan 13 peratus di seluruh dunia [1]. Walaupun CKD secara amnya merupakan keadaan yang tidak dapat dipulihkan, beberapa pendekatan boleh digunakan untuk melambatkan perkembangan penyakit, seperti kawalan tekanan darah, dislipidemia dan hiperglikemia, penggunaan perencat enzim penukar angiotensin, dan diet rendah protein [2-7] . Antara strategi ini, diet rendah protein adalah cadangan paling tinggi yang boleh dipertikaikan untuk menangguhkanbuah pinggangpenurunan fungsi, disebabkan kebimbangan terhadap pematuhan, keselamatan dan keberkesanannya. Kekurangan konsensus mengenai faedah mengurangkan protein dalam diet bergantung pada peranan kandungan protein dan fosfat yang bertindih dalam diet. Oleh kerana sumber protein kaya dengan fosfat, pengurangan pengambilan protein disyorkan untuk mencapai pengambilan fosfat yang terhad. Adalah mungkin untuk menyekat protein tanpa menyekat fosfat, walaupun sebaliknya adalah sukar.
Dalam kajian eksperimen, kesan diet rendah protein melindungi model CKD daripada kerosakan glomerular dan proteinuria [8], menggalakkan pemeliharaan kadar penapisan glomerular yang lebih besar [9]. Perlu diingatkan bahawa protein diet dan fosfat sangat berkorelasi. Oleh itu, walaupun beberapa kajian eksperimen telah memberi tumpuan kepada menilai kesan terpencil sekatan protein, mereka juga mungkin telah berat sebelah disebabkan oleh sekatan fosfat yang tidak disengajakan. Sebaliknya, sumbangan individu diet kaya fosfat kepada pembangunan CKD telah ditunjukkan dengan jelas [10,11]. Diet tinggi fosfat ditunjukkan untuk mendorong lebih banyak interstisialbuah pinggangfibrosis dan atrofi tiub, dengan glomerulosklerosis minimum, pada tikus uremik. Menariknya, kerosakan telah tumpul selepas sekatan fosfat [12]. Daripada nota, kandungan protein dalam diet tidak disebut dalam kajian ini.
Dalam senario klinikal, diet rendah protein mengurangkan kepekatan toksin uremik dan mengekalkan fungsi buah pinggang yang tinggal, walaupun dalam peralihan daripada penjagaan konservatif kepada rejimen dialisis tambahan [13].Pemakananproteinsekatan juga telah melambatkan perkembangan CKD dalam meta-analisis baru-baru ini [14]. Walau bagaimanapun, kerana sekatan protein dikaitkan dengan paras fosfat serum yang lebih rendah, kesan berfaedah diet ini boleh dijelaskan sebahagiannya oleh sekatan fosfat. Kajian prospektif terbesar setakat ini, MDRD [15], hanya menunjukkan manfaat kecil diet rendah protein pada pesakit dengan kekurangan buah pinggang sederhana, manakala perkembangan penyakit buah pinggang tidak terjejas pada pesakit dengan kekurangan buah pinggang yang teruk. Walau bagaimanapun, kandungan fosfat dalam diet tidak ditangani dalam percubaan ini dan kesan sumbangan individunya dalam memperlahankanCKDperkembangan masih tidak diketahui.
Telah diketahui bahawa fosfat boleh menurunkan Klotho renal dan peredaran [16], protein antipenuaan yang terlibat dalam cytoprotection dan antifibrosis, dengan kesan antioksidatif dan antiapoptotik [17]. Di samping itu, autophagy yang rosak dalam sel buah pinggang akibat kekurangan Klotho telah ditunjukkan [18]. Autophagy ialah proses katabolik dengan fungsi kritikal dalam mengekalkan homeostasis selular dan memelihara daya maju sel dalam keadaan tekanan. Beberapa bukti mencadangkan hubungan antara autophagy dan perkembangan CKD melalui laluan yang berbeza, termasuk isyarat TGF [19], faktor fibrogenik yang kuat untuk perkembangan fibrosis buah pinggang. TGF- mempengaruhi beberapa proses biologi, mengawal percambahan dan pembezaan sel, apoptosis, dan bertindak dengan mengikat kepada reseptor transmembran tertentu yang mendorong isyarat intraselular yang dimediasi oleh protein SMAD [20]. Apoptosis ialah mekanisme kematian sel terprogram yang berbeza daripada nekrosis. Fosfat telah digambarkan sebagai mediator apoptosis dalam model eksperimen endothelial [21], osteoblastik [22], dan sel mesothelial peritoneal [23]. Terdapat bukti penyertaan kematian sel apoptosis dalam perkembanganbuah pinggangkecederaan [24], tetapi kesan fosfat pada apoptosis sel buah pinggang masih belum dijelaskan.
Memandangkan mekanisme diet fosfat tinggi mempercepatkan perkembangan CKD masih belum dijelaskan sepenuhnya, kami membuat hipotesis bahawa ia mungkin dikaitkan dengan rakan autofagik yang tidak berfungsi. Oleh itu, dalam kajian semasa, kami menilai dua kumpulan tikus Munich-Wistar mengikut kandungan fosfat dalam diet mereka (rendah 0.2 peratus berbanding tinggi0.95 peratus ) dan menguji kesan a diet rendah fosfat padabuah pinggang' perubahan histologi dan imunohistokimia, termasuk penanda autophagy, beclin-1.
2. Keputusan
Parameter hemodinamik, morfologi dan biokimia yang diperoleh daripada kumpulan diet rendah (LoP) dan diet fosfat tinggi (HiP) diberikan dalam Jadual 1. Seperti yang dijangkakan, nefrektomi 5/6- menyebabkan pengurangan pelepasan kreatinin dan peningkatan dalam serum urea dan kreatinin dalam kedua-dua kumpulan. Haiwan dari kumpulan HiP menunjukkan fungsi buah pinggang yang lebih rendah, seperti yang dibuktikan oleh kreatinin yang lebih tinggi dan pelepasan kreatinin yang lebih rendah; mereka juga menunjukkan hematokrit yang lebih rendah dan berat akhir yang lebih rendah. Kumpulan HiP mempersembahkan peningkatan dalam serum dan perkumuhan pecahan fosfat, serta dalam hormon paratiroid (PTH) dan faktor pertumbuhan fibroblas-23 (FGF-23). Nota, tekanan ekor, berat awal, dan perkumuhan albumin kencing adalah serupa antara kumpulan.
Penemuan histologi ditunjukkan dalam Rajah 1–3. Glomerulosclerosis (GS) hampir tidak dijumpai dalam kedua-dua kumpulan. Walau bagaimanapun, peratusan fibrosis interstisial adalah lebih tinggi di kalangan tikus dalam kumpulan HiP. Sehubungan itu, haiwan ini juga mempunyai peratusan yang lebih tinggi - kawasan bernoda aktin otot licin dan penyusupan buah pinggang yang lebih tinggi oleh makrofaj, dinilai dengan ungkapan ED-1, seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 2. Ekspresi SMAD (p-SMAD) Phosphoryated, penanda pengaktifan laluan TGF-beta, tidak berbeza antara kumpulan.
Sel-sel antigen nuklear sel proliferatif (PCNA)-positif adalah utama dalam kumpulan HiP, menunjukkan bahawa kelebihan fosfat menggalakkan percambahan sel buah pinggang yang lebih sengit. Sebaliknya, bilangan sel apoptosis cenderung lebih tinggi dalam kumpulan LoP. Begitu juga, sel beclin 1-positif adalah lebih tinggi dengan ketara dalam lesi tubulointerstitial dalam kumpulan LoP, yang menunjukkan kemungkinan kesan fosfat yang lebih tinggi dalam menghalang proses autofagik regeneratif padabuah pinggangtisu.
3. Perbincangan
Kajian eksperimen ini menyiasat sama ada sekatan diet fosfat adalah langkah yang berkesan untuk memperlahankan perkembangan CKD, tanpa mengira sekatan protein diet bersamaan. Kami meneliti kesan diet dengan kandungan fosfat yang berbeza ({{0}}}.2 vs.0.95 peratus ) dalam model haiwan 5/6-nefrektomi, dengan semua haiwan menerima diet rendah protein (12 peratus ). Penemuan kami menunjukkan bahawa diet tinggi fosfat dikaitkan dengan hiperfosfatemia, walaupun terdapat peningkatan dalam PTH, FGF-23, dan, akibatnya, perkumuhan pecahan fosfat. Di samping itu, HiP menyebabkan kemerosotan fungsi buah pinggang dan peningkatan fibrosis interstisial, yang dikaitkan dengan ekspresi aktin yang lebih tinggi, penyusupan makrofaj, dan percambahan selular, serta perencatan autophagy.
Meta-analisis 12 kajian kohort yang melibatkan 25,546 pesakit bukan dialisis CKD menunjukkan hubungan bebas antara paras fosfat serum,buah pinggangkegagalan, dan kematian [25]. Selain itu, kajian kohort retrospektif dalam 13,772 pesakit kejadian dialisis telah mendedahkan hubungan antara hiperfosfatemia dan keabnormalan lain CKD-mineral dan gangguan tulang dengan penurunan yang lebih curam dari sisa.buah pinggangfungsi [26]. Mekanisme di mana sekatan fosfat melambatkan perkembangan CKD masih belum ditubuhkan. Dalam kajian eksperimen, kami menunjukkan bahawa diet diperkaya fosfat dikaitkan dengan fungsi buah pinggang yang lebih terjejas, jika dibandingkan dengan diet rendah fosfat dalam tikus Wistar yang diserahkan kepada parathyroidectomy dan 5/6-nephrectomy, menggunakan paratiroid tetap. suplemen hormon (PTH) [11]. Kusano et al. [10] menunjukkan bahawa perlindungan fungsi buah pinggang dikaitkan dengan diet rendah fosfat (0.3 peratus), tanpa mengira kandungan protein diet dalam tikus uremik. Tikus dengan diet fosfat (0.5 peratus) biasa, bagaimanapun, memberikan manfaat ini hanya jika diberi diet protein yang sangat rendah (8.4 peratus). Diambil bersama, keputusan ini menunjukkan bahawa peranan fosfat diet mungkin lebih berkuasa daripada protein diet. Walau bagaimanapun, kedua-dua kajian yang disebutkan di atas tidak cuba menyiasat laluan berpotensi yang boleh terlibat dalam kerosakan buah pinggang yang berkaitan dengan fosfat.
Tindakan beban fosfat dalam perkembangan CKD telah menjadi subjek beberapa kajian. Labels et al. mula-mula mencadangkan kemungkinan ini dalam model haiwan, tetapi protein pemakanan [27] tidak dikawal, yang mungkin menutupi kesan terpencil fosfat. Faedah yang sepatutnya daripada sekatan bebas fosfat, dan bukannya sekatan protein dalam senario CKD, adalah sangat menarik kerana risiko mengawal serum fosfat bersama-sama dengan pengambilan protein yang terhad boleh membawa kepada kekurangan zat makanan dan menyebabkan kematian yang lebih tinggi.
Kandungan diet fosfat tidak semestinya menentukan kepekatan fosfat serum dalam pesakit CKD [28], menonjolkan kepentingan sekatan diet bebas daripada kepekatan serum unsur ini. Kesan patologi fosfat pada tulang dan sistem kardiovaskular mendorong campur tangan untuk merawat hiperfosfatemia. Dalam amalan klinikal, intervensi untuk mengurangkan tahap fosfat terdiri daripada sekatan dietetik dan pengikat fosfat. Walaupun faedah pendekatan ini pada titik akhir klinikal dipersoalkan dalam kajian bersaiz sampel kecil [29], dalam menghadapi pengetahuan bahawa lebihan fosfat bertanggungjawab untuk pengeluaran berlebihan PTH dan FGF-23, adalah munasabah untuk mengekalkan tahap fosfat serendah mungkin pada pesakit dengan CKD [30].
Diet rendah protein mendorong bioavailabiliti fosfat yang rendah dan mengurangkan FGF serum-23 [31,32], mediator penyerapan semula fosfat yang bergantung kepada natrium pada sel tubular renal. Ini menunjukkan bahawa mekanisme pengawalseliaan fosfat dalam CKD lanjutan mungkin dipengaruhi oleh pengambilan fosfat secara bebas sepenuhnya kepada kandungan diet protein. Atas sebab ini, kami telah menilai kesan kandungan diet fosfat pada perkembangan CKD, dalam model 5/6-nephrectomy. Kajian eksperimen sebelumnya telah menunjukkan bahawa fosfat boleh mengubah suai tindak balas antiproteinurik kepada diet protein yang sangat rendah (0.3 g/kg), menunjukkan korelasi antara paras fosfat serum dan fosaturia dengan tindak balas antiproteinurik kepada a diet protein terhad, bebas daripada fungsi buah pinggang [33]. Dalam kajian silang yang melibatkan 11 pesakit dengan CKD (eGFR 30-55 mL/min/m2), irama sirkadian fosfat serum telah diubah dengan diet fosfat tinggi, yang tidak dijelaskan oleh perkumuhan fosfat air kencing, PTH, atau FGF. -23 [34]. Keputusan ini mengukuhkan kepentingan sekatan diet fosfat dalam pesakit CKD sebagai sasaran terapeutik bebas.
Status hemodinamik nampaknya tidak terlibat dalam kemerosotan fungsi buah pinggang dalam kumpulan HiP, kerana tekanan arteri adalah serupa dalam kedua-dua kumpulan. Selain itu, kami tidak menemui kerosakan glomerular yang ketara dalam model kami, yang boleh dijelaskan oleh sekatan protein. Walau bagaimanapun, kami mendapati lebih banyak fibrosis interstisial dalam kumpulan diet HiP.
Fibrosis interstisial berkorelasi baik dengan kehilangan fungsi buah pinggang pada manusia dan tikus.
Kajian terdahulu telah mengaitkan perkembangan fibrosis buah pinggang yang disebabkan oleh diet fosfat tinggi melalui peptidyl-prolyl isomerase Pin 1 [35], manakala kertas lain telah menunjukkan peranan berbahaya kekurangan aKlotho padabuah pinggangfibrosis tisu [36,37]. Penghapusan genetik Klotho, dalam model eksperimen, menyebabkan penuaan, terencat pertumbuhan, dan kalsifikasi [38]. FGF23-Isyarat Klotho menghalang penyerapan semula fosfat buah pinggang. Dalam tetapan CKD, ekspresi Klotho dikurangkan dalam tubul renal [39]. Selain itu, diet kaya fosfat telah memburukkan lagi kekurangan Klotho dalam model kecederaan buah pinggang akut reperfusi iskemia dan seterusnya meningkatkan peningkatanbuah pinggangfibrosis tisu, mempercepatkan perkembangan CKD [18]. Pengaruh diet fosfat pada ekspresi buah pinggang Klotho telah ditunjukkan dalam model murine [40]. Mungkin, antara laluan lain, kelebihan fosfat memburukkan fungsi buah pinggang dengan memodulasi ekspresi Klotho pada sel tiub; ia perlu disiasat lebih lanjut dalam kajian akan datang.
Apoptosis dan fibrosis dimediasi oleh sitokin, seperti TGF- [41,42]. Kami telah menerangkan persatuan hiperparatiroidisme sekunder dan akibat ekspresi TGF yang lebih tinggi pada proses pembentukan semula jantung [43]. Kononnya, terdapat perkaitan antara pengaktifan PTH dan isyarat TGF yang merangsang percambahan fibroblas, sintesis kolagen, dan fibrosis. Malah terdapat bukti eksperimen tindakan bersepadu reseptor TGF- dan PTH pada sel tulang, mengawal isyarat pembentukan semula tulang [44]. Peranan TGF- /Smad memberi isyarat masukbuah pinggangpenyakit telah pun diterangkan. TGF- mengikat reseptor transmembran, mencetuskan fosforilasi protein Smads, dan menggalakkan translokasi mereka ke nukleus untuk kesan transkrip. Oleh itu, ia adalah penting untuk transduksi isyarat ahli keluarga TGF-. Malah, ekspresi berlebihan protein Smad2 dan Smad3 dalam buah pinggang fibrotik dalam model haiwan dengan CKD telah ditunjukkan [45]. Menariknya, terdapat bukti pengaktifan Smads oleh mediator lain yang bebas daripada TGF-, seperti produk akhir glikasi lanjutan [46] dan angiotensin II [47]. Oleh kerana kesan hiperfosfatemia pada perkembangan CKD tidak dipengaruhi oleh penggantian PTH dalam model eksperimen [11], kami tertanya-tanya sama ada fosfat akan mempunyai peranan langsung dalam isyarat Smad buah pinggang. Dalam model kami, tidak ada pengaruh hiperfosfatemia pada ekspresi p-Smad dalam sel tiub buah pinggang.
Walau bagaimanapun, ini tidak menolak kemungkinan pengaktifan laluan TGF bebas daripada fosforilasi Smads. Kajian lanjut diperlukan untuk menyiasat laluan alternatif ini.
Dalam penilaian tisu tulang, kelebihan fosfat telah menyebabkan apoptosis sel seperti osteoblast [22]. Rojas et al. menunjukkan dalam biopsi tulang pesakit yang dipindahkan bahawa bilangan sel apoptosis lebih tinggi pada mereka yang mempunyai fosfat rendah dan PTH akan mempunyai kesan dalam meningkatkan osteoblas dan mencegah apoptosis [48]. Kesan perencatan PTH pada apoptosis sel tulang telah ditunjukkan sebelum ini [49]. Selain kesan pada tisu tulang, laluan apoptosis juga berkaitan dengan kegagalan buah pinggang akut [48] dan boleh menjadi pengantara yang mungkin pada perkembangan CKD. Dalam model kami, kami melihat bahagian unggul sel yang menjalani apoptosis dalam kumpulan LoP, tanpa kaitan statistik. Pertimbangan ini mencadangkan mekanisme apoptosis terjejas yang disebabkan oleh hiperfosfatemia. Walau bagaimanapun, kita mesti ingat bahawa tidak mungkin untuk menilai kesan eksklusif fosfat padabuah pinggangapoptosis tisu apabila haiwan juga telah membangunkan ketinggian PTH dan FGF-23.
Dalam kajian semasa, kami menangani satu lagi mekanisme kerosakan buah pinggang yang mungkin melalui diet fosfat tinggi, disfungsi autophagy, dengan mengukur protein beclin-1, protein pengawalseliaan yang diperlukan untuk nukleasi membran autophagosomal [50]. Autophagy adalah laluan katabolik yang melibatkan degradasi komponen selular melalui lisosom [51,52]. Fosforilasi Beclin-1 telah dianggap sebagai isyarat khusus autophagy untuk pengaktifan kompleks fosfatidillinositol-3-fosfat kinase dan pengambilan ke tapak membran biogenesis autophagosome [53]. Ketukan beclin-1 menyekat autophagy [54] dan reperfusi iskemia meningkatkan tahapnya [55]. Pengurangan dalam beclin- 1 dan penyelarasan serentak mTOR mengurangkan pertumbuhan sel malignan, menonjolkan kesan pro-survival autophagy [52].
Kesan antifibrotik Klotho juga dikaitkan dengan proses autophagy terkawal, laluan di mana kecederaan iskemia telah dilemahkan dalam model AKI dan terjejas oleh tahap fosfat tinggi [18]. Kajian eksperimen telah menunjukkan bahawa fluks autofagik mengurangkan penyusupan makrofaj dan fibrosis buah pinggang yang disebabkan oleh fosfat. Di samping itu, persekitaran yang kaya dengan fosfat mendorong mitophagy dalam sel tiub secara in vitro [56]. Data kami menunjukkan bahawa kandungan fosfat dalam diet juga memodulasi ekspresi beclin-1 dalam tubul renal in vivo. Diet HiP juga dikaitkan dengan lebih banyak percambahan selular dan trend ke arah kadar apoptosis yang lebih rendah, seperti yang digambarkan oleh analisis PCNA dan TUNEL. Walau bagaimanapun, dalam model kami, adalah tidak mungkin untuk mengenal pasti sama ada ini berlaku sebagai kesan langsung daripada lebihan fosfat atau kerana keabnormalan dalam tahap PTH dan FGF-23, yang disebabkan oleh hiperfosfatemia. Penemuan ini perlu disahkan dalam senario klinikal.
Kelebihan utama kajian ini adalah untuk menilai kesan sekatan fosfat dalam diet rendah protein terhadap perkembangan CKD, yang termasuk penyiasatan pengaruhnya terhadap corak histologi dan fenotip molekulbuah pinggangtisu. Setakat yang kami tahu, ini ialah kajian pertama yang menunjukkan modulasi ekspresi beclin-1, penanda autophagy pada sel tubular renal, oleh diet fosfat dalam vivo. Had utama ialah kemustahilan untuk merungkai kesan hiperfosfatemia daripada keabnormalan berkaitan CKD-MBD yang lain, seperti ketinggian PTH dan FGF-23. Kami juga tidak dapat menilai diet dengan kandungan fosfat perantaraan atau ekspresi Klotho buah pinggang. Walau bagaimanapun, model kami menghasilkan semula keadaan kehidupan sebenar, di mana diet HiP biasanya dikaitkan dengan hiperparatiroidisme dan tahap FGF yang tinggi-23.
4. Kesimpulan
Ringkasnya, kajian ini memberikan bukti bahawa diet fosfat memainkan peranan dalam perkembangan CKD, mungkin meningkatkan fibrosis interstisial. Tambahan pula, diet kaya fosfat mungkin mengubah suaibuah pinggangproses autophagy. Pengenalpastian laluan bebas protein di mana fosfat memburukkan fungsi buah pinggang boleh membuka jalan penting untuk pembangunan pendekatan baru yang bertujuan untuk mencegah atau mengurangkan perkembangan CKD dalam keadaan klinikal.
5. Bahan dan Kaedah
Tikus Munich-Wistar jantan dewasa yang diperoleh daripada kemudahan tempatan telah dimasukkan dalam kajian ini. Tikus dikekalkan pada 23 ± 1 ◦C, dengan kelembapan udara pada 60 ± 5 peratus , di bawah kitaran gelap terang-gelap 12:12-h. Semua haiwan mempunyai akses percuma kepada air paip dan diberi makan diet rendah protein (12 peratus protein). Haiwan dikorbankan dua bulan kemudian apabila darah, air kencing, dan tisu buah pinggang dianalisis. Tekanan ekor-cuff, pelepasan kreatinin, dan perkumuhan albumin kencing setiap hari ditentukan dalam semua tikus. Reka bentuk eksperimen ditunjukkan dalam Lampiran A (Rajah A1).
5.1. Teknik Analitik
Enam puluh hari selepas Nx, haiwan telah dibius dengan natrium thiopental (50 mg/kg BW), dan sampel darah telah dikumpulkan. Kepekatan kreatinin serum dinilai dengan kaedah kolorimetrik. Albumin serum, fosfat, urea, kalsium, dan hematokrit diukur dengan kaedah standard. PTH diukur oleh ELISA (Immutopics, San Clemente, CA, USA). FGF-23 diukur menggunakan kit ELISA (KAINOS, Jepun) mengikut protokol pengeluar. Kami mengira penapisan glomerular dengan kelegaan kreatinin berdasarkan paras serum dan kreatinin air kencing dan dinyatakan dalam ml/min, dikira dengan formula: kreatinin air kencing (mg/dL) × sesama air kencing (mL/min)/kreatinin serum (mg/dL). Albumin kencing ditentukan oleh immunodiffusion radial.
-pertiga kiribuah pinggangdengan penutupan dua atau tiga cabang arteri renal kiri. Tikus yang dikendalikan sham menjalani bius dan manipulasi pedikel buah pinggang tanpa pengurangan jisim buah pinggang. Selepas pulih daripada bius, haiwan tersebut dikembalikan ke sangkar asalnya, yang dipanaskan selama 24 jam berikutnya.
Perkumuhan pecahan fosfat (FEP) diperoleh melalui air kencing dan serum fosfat (mg/dL), air kencing dan kreatinin serum (mg/dL), dan dinyatakan dalam peratus , dengan formula berikut: (urin/serum fosfat)/ (urin/serum kreatinin) × 100.
5.2. Kumpulan Eksperimen
Haiwan dibahagikan kepada dua kumpulan mengikut kandungan fosfat pada diet, yang dinyatakan di bawah: Diet Rendah Fosfat (LoP): n=20; haiwan menerima TD-90016, 12 peratus diet protein,diubah suai untuk 0.2 peratus kepekatan fosfat. Diet Tinggi Fosfat (HiP): n=19; haiwan menerima TD-90016, diet protein 12 peratus, diubah suai untuk 0.95 peratus kepekatan fosfat.
5.3. Teknik Histologi
Yang tinggalbuah pinggangtelah diserap in situ pada MAP yang diperhatikan dengan larutan garam dan kemudian dengan larutan Duboscq-Brasil untuk penetapan. Selepas ditimbang, dua hirisan buah pinggang midcoronal telah dicantumkan dalam formaldehid 4 peratus yang ditimbal. Tisu buah pinggang kemudiannya dibenamkan dalam parafin dan disediakan untuk histomorphometry, dan imunohistokimia seperti yang diterangkan sebelum ini [57].
Semua penilaian morfometrik dilakukan dalam bahagian setebal 4-µm oleh seorang pemerhati yang buta kepada kumpulan. Bagi setiap tikus, keterukan glomerulosklerosis (GS) dianggarkan, dalam bahagian yang diwarnai dengan asid berkala Schiff (PAS), dengan memberikan kepada setiap glomerulus (sekurang-kurangnya 120 setiap tikus diperiksa) skor untuk menganggarkan pecahan sclerosed kawasan jumbai. , dan memperoleh indeks GS (GSI) untuk setiap tikus seperti yang diterangkan sebelum ini [58]. Untuk menilai tahap pengembangan interstisial, peratusan kawasan kortikal buah pinggang yang diduduki oleh fibrosis interstisial ( peratus JIKA) dianggarkan dalam bahagian yang diwarnai Masson dengan teknik pengiraan titik [59].
5.4. Imunohistokimia
Empat µm-tebal, bahagian buah pinggang tertanam parafin telah dipasang pada slaid kaca yang disalut dengan 6 peratus silan. Bahagian telah dinyahparafin, dihidratkan semula, dan kemudian dipanaskan dalam penimbal sitrat untuk meningkatkan pengambilan antigen. Mereka telah diinkubasi dengan 5 peratus arnab biasa (untuk ED-1) atau serum kuda (untuk -actin) dalam larutan Tris-buffered saline (TBS) atau larutan Blok Protein berasaskan kasein (Blok Protein; DAKO Corporation, Santa Clara, CA, USA (untuk PCNA, pSmad, danBeclin)), untuk mengelakkan pengikatan tidak spesifik. Pengeraman dengan antibodi primer dilakukan semalaman pada suhu 4◦C. Kawalan negatif dilakukan dengan menghilangkan antibodi utama.
Antibodi utama berikut telah digunakan: antibodi ED{1}} tikus monoklonal anti-tikus (Serotec, Oxford, UK), untuk pengesanan makrofaj; tetikus monoklonal anti-alfa licin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, Amerika Syarikat), untuk pengesanan -aktin; antibodi anti-Beclin 1 poliklonal (Boster, Pleasanton, CA, Amerika Syarikat), untuk analisis autophagy. Selepas dibasuh, bahagian diinkubasi dengan IgG anti-tikus terbiotinilasi (H tambah L), (Vektor, Burlingame, CA, Amerika Syarikat) selama 45 minit, diikuti oleh VECTASTAIN® ABC-AP Kit, Vector® Red (Vector, Burlingame, CA , Amerika Syarikat) selama 30 min. Bahagian kemudiannya dibangunkan dengan larutan pewarna merah cepat.
Untuk antigen nuklear sel anti-proliferasi tikus monoklonal (Dako, Denmark) dan antibodi fosfor-smad2 (Ser465/467) (Isyarat Sel, Danvers, MA, Amerika Syarikat), perencatan peroksidase endogen telah dilakukan dengan 3 peratus larutan hidrogen peroksida dan metanol selama 30 min. Bahagian-bahagian itu kemudiannya diinkubasi semalaman dengan antibodi utama dalam ruang yang dilembapkan pada suhu 4 ◦C. Keesokan harinya bahagian tersebut diinkubasi dengan IgG anti-tikus terbiotinilasi (H tambah L) atau IgG anti-tikus terbiotinilasi (H tambah L) (Vektor, Burlingame, CA, Amerika Syarikat) selama 45 minit, diikuti dengan pengeraman dengan VECTASTAIN® ABC- Kit HRP (Vektor, Burlingame, CA, Amerika Syarikat) selama 30 minit. Bahagian kemudiannya dibangunkan menggunakan 3-amino-9-etil carbazole substrate chromogen (AEC) (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Semua bahagian dibilas dalam air suling, diwarnakan balas dengan larutan Mayer's Hemalum (Merck, Darmstadt, Jerman) ditutup dengan gliserin-gelatin Kaiser (Merck, Darmstadt, Jerman).
Untuk anggaran ketumpatan buah pinggang interstisial ED-1, p-Smad, Beclin dan PCNA, bilangan sel positif/mm2 dinilai secara buta pada pembesaran 400×. Untuk menilai -aktin, kami menggunakan teknik kiraan mata, menggunakan mikroskop dengan 100-mata mata yang disambungkan ke monitor video. Kami menganalisis 25 medan di bawah pembesaran 3200. Keputusan dinyatakan dalam peratusan dengan mengambil kira jumlah kawasan.
5.5. Apoptosis
Apoptosis ditentukan dalam sel tubular renal oleh teknik TUNEL (pelabelan akhir X-dUTP Nick yang dimediasi TdT) menggunakan arahan yang disediakan oleh Apoptag plusPeroxidase dalam Kit Pengesanan Apoptosis Situ (S7101, Millipore Sigma, MA, Amerika Syarikat). Sel apoptosis dianalisis dalam 25 medan, dengan pembesaran 1000 ×, untuk mendapatkan nilai akhir yang dinyatakan dalam sel/mm2.
5.6. Analisis statistik
Perbezaan antara kumpulan LoP dan HiP telah diuji menggunakan ujian Pelajar bebas atau ujian Mann-Whitney dengan sewajarnya. Hubungan antara pembolehubah telah diperiksa oleh pekali korelasi Spearman. Data dibentangkan sebagai min ± SE melainkan dinyatakan sebaliknya. Nilai-p daripada<0.05 was="" considered="" significant.="" analyses="" were="" performed="" using="" ibm="" spss="" statistics,="" version="" 20.0.1="" (ibm="" corp.,="" armonk,="" ny,="" usa)="" and="" graphpad="" prism9.1.2="" statistical="" software="" (graphpad,="" san="" diego,="" ca,="">
Pembiayaan:Kajian ini disokong oleh Yayasan Penyelidikan Sáo Paulo (FAPESP—Grant #. 2010/05409-6). Moyses, Jorgetti, Zatz dan Elias disokong oleh CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnol6gico), tetapi sokongan kewangan ini tidak mempunyai peranan dalam menulis kertas ini.
Penyata Lembaga Semakan Institusi:Kajian ini telah dijalankan mengikut saranan lembaga semakan etika tempatan. Protokol telah diluluskan oleh Comite detica em Pesquisa do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina da USP (CEUA, proses #090/10 dan tarikh kelulusan 10 Ogos 2010). Semua prosedur eksperimen mengikut piawaian antarabangsa yang ketat untuk manipulasi dan penjagaan haiwan makmal.
Penyata Ketersediaan Data:Data yang dibentangkan dalam kajian ini tersedia atas permintaan daripada pengarang yang berkaitan.
Penghargaan:Penulis mengucapkan terima kasih kepada Wagner Dominguez atas bantuan teknikal pakarnya. Konflik Kepentingan: Pengarang mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.
Rujukan
1. Bukit, NR; Fatoba, ST; Ok, JL; Hirst, JA; O'Callaghan, CA; Lasserson, DS; Hobbs, FD Kelaziman global penyakit kronikbuah pinggangpenyakit-Semakan sistematik dan meta-analisis. PLoS ONE 2016, 11, e0158765.
2. Wen, CP; Chang, CH; Tsai, MK; Lee, JH; Lu, PJ; Tsai, SP; Wen, C.; Chen, CH; Kao, CW; Tsao, CK; et al. Diabetes dengan awalbuah pinggangpenglibatan boleh memendekkan jangka hayat sebanyak 16 tahun. Buah Pinggang Int. 2017, 92, 388–396.
3. Kakinuma, Y.; Kawamura, T.; Bil, T.; Yoshioka, T.; Ichikawa, I.; Fogo, A. Kesan bebas tekanan darah perencatan angiotensin pada lesi vaskular kegagalan buah pinggang kronik.buah pinggangInt. 1992, 42, 46–55.
4. Goreng, LF; Orchard, TJ; Kasiske, BL Kesan pengurangan lipid pada perkembangan penyakit buah pinggang: Meta-analisis.buah pinggangInt. 2001, 59, 260–269.
5. Ishidoya, S.; Morrissey, J.; McCracken, R.; Reyes, A.; Klahr, S. Antagonis reseptor Angiotensin II memperbaiki fibrosis tubulointerstitial renal yang disebabkan oleh halangan ureter unilateral.buah pinggangInt. 1995, 47, 1285–1294.
6. Audigier, JC; Kanjanbuch, T.; Ma, LJ; Brown, NJ; Fogo, AB Regresi glomerulosklerosis sedia ada dengan perencatan aldosteron. J. Am. Soc. Nephrol. 2005, 16, 3306–3314.
7. Nath, KA; Kren, SM; Hostetter, TH Sekatan protein diet dalam kecederaan buah pinggang yang ditubuhkan pada tikus. Peranan terpilih tekanan kapilari glomerular dalam disfungsi glomerular progresif. J. Clin. Menyiasat. 1986, 78, 1199–1205.
8. Brenner, BM; Meyer, TW; Hostetter, TH Pengambilan protein diet dan sifat progresifbuah pinggangpenyakit: Peranan kecederaan glomerular pengantara hemodinamik dalam patogenesis sklerosis glomerular progresif dalam penuaan, ablasi buah pinggang, dan penyakit buah pinggang intrinsik. N. Inggeris. J. Med. 1982, 307, 652–659.
9. Bellizzi, V. Diet rendah protein atau terapi pemakanan dalam kronikbuah pinggangpenyakit? Pemurni Darah. 2013, 36, 41–46.
10. Kusano, K.; Segawa, H.; Ohnishi, R.; Fukushima, N.; Miyamoto, K. Peranan protein rendah dan diet rendah fosforus dalam perkembangan kronikbuah pinggangpenyakit pada tikus uremik. J. Nutr. Sci. Vitam. 2008, 54, 237–243.
11. Neves, KR; Graciolli, FG; dos Reis, LM; Pasqualucci, CA; Moyses, RM; Jorgetti, V. Kesan buruk hiperfosfatemia pada hipertrofi miokardium, fungsi buah pinggang, dan tulang pada tikus dengan kegagalan buah pinggang.buah pinggangInt. 2004, 66, 2237–2244. [CrossRef] [PubMed]
12. Finch, JL; Lee, DH; Liapis, H.; Ritter, C.; Zhang, S.; Suarez, E.; Ferder, L.; Slatopolsky, E. Sekatan fosfat dengan ketara mengurangkan kematian pada tikus uremik dengan kalsifikasi vaskular yang mantap. Buah Pinggang Int. 2013, 84, 1145–1153.
13. Cupisti, A.; Blasco, P.; D'Alessandro, C.; Giannese, D.; Sabatino, A.; Fiaccadori, E. Perlindungan fungsi buah pinggang sisa dan rawatan pemakanan: Strategi langkah pertama untuk pengurangan toksin uremik dalam pesakit penyakit buah pinggang peringkat akhir. Toksin 2021, 13, 289.
14. Yan, B.; Su, X.; Xu, B.; Qiao, X.; Wang, L. Kesan sekatan protein diet terhadap perkembangan kronikbuah pinggangpenyakit: Kajian sistematik dan meta-analisis. PLoS ONE 2018, 13, e0206134. [CrossRef] [PubMed]
15. Klahr, S.; Levey, AS; Beck, GJ; Caggiula, AW; Hunsicker, L.; Kusek, JW; Striker, G. Kesan sekatan protein diet dan kawalan tekanan darah terhadap perkembangan penyakit buah pinggang kronik. Pengubahsuaian diet dalam kumpulan kajian penyakit buah pinggang. N. Inggeris.
J. Med. 1994, 330, 877–884. [CrossRef]
16. Hu, MC; Shi, M.; Cho, HJ; Adams-Huet, B.; Paek, J.; Bukit, K.; Shelton, J.; Amaral, AP; Faul, C.; Taniguchi, M.; et al. Klotho dan fosfat adalah modulator pembentukan semula jantung uremik patologi. J. Am. Soc. Nephrol. 2015, 26, 1290–1302.
17. Hu, MC; Shi, M.; Cho, HJ; Zhang, J.; Pavlenco, A.; Liu, S.; Sidhu, S.; Huang, LJ; Moe, OW Reseptor erythropoietin ialah pengesan hiliran cytoprotection yang disebabkan oleh Klotho. Buah Pinggang Int. 2013, 84, 468–481.
18. Shi, M.; Flores, B.; Gillings, N.; Bian, A.; Cho, HJ; Yan, S.; Liu, Y.; Levine, B.; Moe, OW; Hu, MC alphaKlotho mengurangkan perkembangan AKI kepada CKD melalui pengaktifan autophagy. J. Am. Soc. Nephrol. 2016, 27, 2331–2345.
19. Ding, Y.; Kim, S.; Lee, SY; Koo, JK; Wang, Z.; Choi, ME Autophagy mengawal ekspresi TGF-beta dan menindasbuah pinggangfibrosis yang disebabkan oleh halangan ureter unilateral. J. Am. Soc. Nephrol. 2014, 25, 2835–2846.
20. Moustakas, A.; Souchelnytskyi, S.; Heldin, peraturan CH Smad dalam transduksi isyarat TGF-beta. J. Sel Sci. 2001, 114, 4359–4369.