Sel Buah Pinggang Bayi Hamster Adherent Dan Suspensi Mempunyai Repertoir Sitoskeleton Dan Reseptor Permukaan Yang Berbeza

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Veronika Dill¹, Florian Pfaff¹, Aline ZimmerID², Martin Beer¹, Michael EschbaumerID^1*

Abstrak

Kultur sel haiwan, dengan sel tunggal tumbuh dalampenggantungan, idealnya dalam persekitaran yang ditakrifkan secara kimia, adalah tunjang utama pengeluaran biofarmaseutikal. Persekitaran sintetik tidak mempunyai faktor pertumbuhan eksogen dan biasanya memerlukan proses penyesuaian yang memakan masa untuk memilih klon sel yang membiak dalampenggantungankepada bilangan sel yang tinggi. Mekanisme molekul yang memudahkan penyesuaian dan yang berlaku di dalam sel sebahagian besarnya tidak diketahui. Terutamanya untuk talian sel yang digunakan untuk penghasilan antigen virus seperti sel buah pinggang hamster bayi (BHK), sekatan pertumbuhan virus melalui evolusi ciri sel yang tidak diingini adalah sangat tidak diingini. Perbandingan antara sel BHK yang tumbuh secara patuh dan sel penggantungan dengan berbezakerentanankepada virus penyakit kaki dan mulut mendedahkan perbezaan dalam ekspresi reseptor selular seperti integrin dan heparan sulfat dan dalam organisasi sitoskeleton aktin. Analisis dan pertumbuhan transkriptomkinetikmenunjukkan kepelbagaian garisan sel BHK dan mengesahkan kepentingan klon sel ibu bapa yang dicirikan dengan baik dan pemeriksaan penuh perhatian untuk memastikan ciri selular yang penting tidak hilang semasa penyesuaian.

Cistanche tubulosa mencegah penyakit buah pinggang, klik di sini untuk mendapatkan sampel

1. Pengenalan

Teknologi kultur sel haiwan mula-mula digunakan untuk penghasilan antigen virus dalam pengeluaran vaksin, tetapi baru-baru ini platform pengeluaran bakteria atau yis untuk protein rekombinan ditukar kepada sistem sel mamalia juga [1, 2]. Penting dalam kedua-dua konteks ialah sel buah pinggang hamster bayi (BHK), yang diperoleh daripada hamster emas Syria (Mesocricetus auratus). Pada asalnya, sel-sel BHK adalah sel mamalia yang bergantung kepada anchor yang tumbuh secara berterusan dengan corak pertumbuhan fibroblast dalam keadaan kultur sel standard termasuk serum lembu janin (FBS) [3, 4]. Penyesuaian sel BHK yang berpegang kepadapenggantunganpertumbuhan dalam media bebas serum digabungkan dengan keadaan kultur berskala besar adalah kisah kejayaan untuk penghasilan protein rekombinan (cth, faktor VIII) dengan hasil yang tinggi [1, 2]. Tambahan pula, sel BHK mudah terdedah kepada pelbagai jenis virus, termasuk virus penyakit kaki dan mulut (FMD) [5]. Untuk memenuhi permintaan yang semakin meningkat untuk vaksin FMD di banyak bahagian dunia, kuantiti antigen yang besar mesti dihasilkan semurah mungkin, yang boleh dicapai dengan meningkatkan kepadatan sel yang berdaya maju pada bahagian selular dan mengurangkan kos melalui pemudahan pemprosesan atas dan hiliran antigen pada bahagian pengeluaran [6]. Media bebas komponen haiwan (ACFM) mengurangkan risiko pencemaran oleh agen adventif dan juga memudahkan proses apabila tiada serum perlu ditambah [6, 7]. Walau bagaimanapun, penyesuaian sel untuk tumbuh dalam penggantungan tanpa serum dan dalam ACFM adalah proses yang memakan masa dan beransur-ansur [6, 8]. Sel BHK mudah mencapai ketumpatan sel 3.5×106 sel/mL dalam penggantungan tetapi penyesuaian sentiasa membawa risiko sifat sel yang tidak diingini berkembang berbanding populasi permulaan yang boleh mengakibatkan prestasi pertumbuhan yang lemah, hasil khusus sel yang tidak mencukupi atau aset tumorigenik [5, 7]. Sebaliknya, perubahan pada sel boleh membawa kepada varian virus yang tidak dijangka semasa proses penyesuaian budaya. Terutama untuk pengeluaran antigen vaksin, perubahan dalam ciri-ciri virus dan antigenicity adalah sangat tidak diingini. Sel BHK sudah berbeza dalam kerentanan mereka dan kemungkinan mereka untuk menyebarkan strain virus FMDV tertentu [9]. Jelas sekali, perubahan daripada pertumbuhan fibroblastik yang bergantung kepada penambat melalui pengagregatan dan pembentukan spheroid kepada sel yang tumbuh secara bebas dalam penggantungan akan disertai dengan perubahan ketara pada sel itu sendiri [4, 6]. Kehilangan isyarat integrin akibat gangguan hubungan sel matriks ekstraselular membawa kepada perubahan dalam ekspresi protein membran dan dalam organisasi sitoskeleton aktin yang merupakan penerima penting isyarat pengantara integrin [6, 10]. Pada masa yang sama, integrin ini memainkan peranan penting dalam jangkitan FMDV kerana ia adalah reseptor untuk FMDV dalam hos semula jadi dan reseptor utama dalam kultur sel [11].

Pemahaman yang lebih mendalam tentang perbezaan selular antara sel HK yang berkembang secara patuh dan sel dalampenggantunganakan membuka kemungkinan baharu untuk kejuruteraan sel dan memudahkan pemilihan klon sel yang sesuai untuk penghasilan antigen vaksin.

Dalam kajian ini, sel-sel BHK yang semakin meningkat dan disesuaikan dengan ACFMpenggantunganSel BHK telah diperiksa berkenaan dengan ekspresi reseptor selular seperti integrin dan heparan sulfat (HS), keupayaan mereka untuk membentangkan protein pada permukaan sel, dan organisasi rangka aktin selular. Analisis transkrip dan kinetik pertumbuhan memberikan maklumat tentang kepelbagaian garisan sel BHK yang diuji.

cistanche boleh menyuburkan buah pinggang dan meningkatkan fungsi buah pinggang

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1 Garisan sel dan kultur sel

Talian sel utama yang digunakan ialah dua terbitan BHK-21 klon 13 (daripada American Type Culture Collection [ATCC] CCL-10, dipegang sebagai CCLV-RIE 164 dan 179 dalam Koleksi Talian Sel dalam Perubatan Veterinar , Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald, Jerman; ringkasnya: BHK164 atau BHK179) danpenggantungantalian sel BHK21C13-2P (BHK-2P) yang disediakan oleh European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC; 84111301) dan BHK-InVitrus (BHK-InV, juga dirujuk sebagai "line #8" seperti dalam penerbitan awal kami [12]; Sigma-Aldrich, St. Louis, Amerika Syarikat).

Untuk kinetik pertumbuhan, garisan sel berikut digunakan sebagai tambahan: BHK-2P dikekalkan sama ada dalam Medium Penting Minimal (GMEM) Glasgow dengan 10 peratus FBS ("baris #2") atau disesuaikan dengan ACFM Cellvento™ BHK200 ( Merck KGaA, Darmstadt, Jerman) dalam dua proses berbeza (baris #4 dan #5), ditambah empat lagipenggantungangarisan sel: BHK21C13 disesuaikan dengan pertumbuhan dalampenggantungandengan pengeluaran beransur-ansur serum (baris #3), BHK21-C (baris #6), BHK21-Hektor (baris #7) dan pengeluaran BHK (baris #9) [12]. Semua sel ini disediakan oleh Merck KGaA.

Semua sel BHK-21 yang digunakan dalam kajian akhirnya diperoleh daripada barisan sel BHK-21 klon 13 Macpherson dan Stoker [13]. Istilah "garisan sel" digunakan secara longgar; bukan semua sebelas baris BHK-21 yang diterangkan dalam kajian ini adalah garisan sel yang benar-benar berbeza dan bukannya derivatif yang dikultur dalam keadaan yang berbeza. Untuk rujukan yang lebih mudah, penomboran baris disimpan konsisten dengan penomboran dalam penerbitan kami sebelum ini [12].

Talian sel #1 daripada penerbitan sebelumnya tidak disertakan dalam kajian ini dan oleh itu nombor ini tidak digunakan. Sebaliknya, sebarang rujukan kepada sel BHK-2P yang tidak menyebut nombor baris #2, #4 atau #5 adalah kepada prinsipalpenggantungantalian sel BHK21C13-2P (ECACC84111301) diperkenalkan pada permulaan bahagian ini.

Talian sel ovari (CHO) hamster Cina (Cricetulus griseus) yang melekat CHO-K1 (ATCCCCL-61, dipegang sebagai CCLV-RIE 134) dan CHO677 (CRL 2244, dipegang sebagai CCLV-RIE 1524) serta IB-RS -2 sel (Instituto Biolo´gico-Rim Suı´no-2, dipegang sebagai CCLV-RIE 103) dan sel buah pinggang lembu Madin-Darby (pendek kata: MDBK, dipegang sebagai CCLV-RIE261) telah digunakan sebagai kawalan dalam eksperimen sitometri aliran.

Keadaan kultur ialah 37 ˚C, 5 peratus CO2, dan untukpenggantungansel 320 rpm dalam bioreaktor TubeSpin (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland) pada kelembapan relatif 80 peratus. Semua garisan sel yang melekat telah dikultur dalam Minimum Essential Medium Eagle (MEM) yang ditambah dengan garam Hanks' dan Earle's (Sigma-Aldrich) dengan 10 peratus FBS. Semua garisan sel penggantungan telah disesuaikan untuk berkembang dalam medium Cellvento™ BHK200 (Merck KGaA) kecuali talian sel #2, yang telah dikultur seperti yang diterangkan di atas.

Pengukuran ketumpatan sel dan daya maju dilakukan menggunakan biru trypan (Bio-Rad, Hercules, CA, Amerika Syarikat) dan kaunter sel automatik (model TC20, Bio-Rad).

2.2 Analisis lengkung pertumbuhan sel penggantungan

Analisis lengkung pertumbuhan telah dijalankan sebagai percubaan kelompok, dilakukan dalam pendua, dua kali secara individu, dengan ketumpatan pembenihan sebanyak 0.6×106 sel/mL. Ketumpatan sel berdaya maju (VCD) dan daya maju dalam peratus diukur setiap hari sehingga enam hari selepas inokulasi sel.

Pengiraan khusus sel telah dilakukan mengikut persamaan yang diberikan oleh [14]:

X: VCD (setiap mL); t: titik masa pensampelan (jam); n dan n-1: dua titik persampelan berturut-turut.

Nombor Bahagian Sel (cd):

2.3 Sitometri aliran

Analisis sitometri aliran dilakukan menggunakan instrumen sitometri aliran FACScanto II(BD Biosciences, Oxford, UK). Serpihan sel telah berpagar keluar berdasarkan corak serakan ke hadapan dan sisi. Untuk pewarnaan aktin, keamatan pendarfluor median dalam saluran Alexa 488 diukur secara langsung. Untuk semua kesan antibodi, peratusan Alexa 488 atau sel positif PE ditentukan dengan gerbang selang yang sempadan bawahnya ditetapkan berdasarkan kawalan isotype. Semua eksperimen dilakukan tiga kali secara bebas.

2.3.1 Pewarnaan antibodi reseptor permukaan selular.

permukaan. Sel MDBK berfungsi sebagai kawalan positif untuk ekspresi v 3, sel IB-RS-2 berfungsi sebagai kawalan positif untuk ekspresi v 8 dan sel CHO-K1 berfungsi sebagai kawalan positif untuk ekspresi HS . Sel CHO677 tidak menyatakan mana-mana integrin atau HS yang diuji dan oleh itu berfungsi sebagai kawalan negatif dalam semua eksperimen. Antibodi berikut digunakan: untuk v 3, klon konjugasi PE LM609 (pencairan 1:20) (mAb1976H, Merck KGaA); untuk v 8, antibodi primer 11E8, klon 68, tetikus IgG2a (pencairan 1:100) (diberikan oleh Dr. StephenNishimura) dengan antibodi sekunder kambing anti-tikus IgG2a (pencairan 1:1000) berkonjugasi dengan Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific ); untuk HS, klon 10E4, IgM tetikus (pencairan 1:200)(Amsbio, Abingdon, UK) dengan rantaian mu IgM anti-tikus kambing antibodi sekunder (pencairan1:2000) berkonjugasi dengan Alexa Fluor 488 (ab150121, Abcam, Cambridge, UK) . Hanya satu antibodi utama digunakan dalam setiap eksperimen.

Sel penggantungan telah dibasuh dengan garam penampan fosfat (PBS). Sel melekat telah ditanggalkan menggunakan 10 mM EDTA dalam PBS dan kemudian dibasuh dengan PBS. Selepas mencuci, sel ditapis melalui penapis sel (jaring nilon, diameter liang 7{15}} μm, VWR, Radnor, Amerika Syarikat) untuk mengeluarkan gumpalan sel dan dilaraskan kepada 1×106 sel/mL sebelum 1 μL LIVE/ Noda sel mati DEAD FixableViolet (Thermo Fisher Scientific) telah ditambah kepada 1 mL penggantungan sel selama 30 minit. Langkah ini dan semua langkah berikut telah dilakukan dilindungi daripada cahaya dan pada 4 ˚C. Antibodi primer diinkubasi selama 30 minit dan antibodi sekunder diinkubasi selama 20-30 minit. Langkah mencuci dengan penimbal 2 mL FACS (PBS, 0.1 peratus natrium azida, 0.1 peratus BSA) dan sentrifugasi pada 300 × g, 5 min, 4 ˚C dilakukan selepas semua langkah. Akhirnya, sel-sel berwarna telah digantung semula dalam penimbal FACS 300 μL.

2.3.2 Pewarnaan aktin.

Aktin berfilamen telah diwarnakan menggunakan Reagen Phalloidin-iFluor 488(ab176753, Abcam), disediakan mengikut lembaran data. BHK179, BHK-2P dan BHK-InVcells telah ditanggalkan seperti yang diterangkan di atas dan dibetulkan dengan 4 peratus formaldehid selama 20 minit pada suhu bilik (RT). Sel telah dibasuh dua kali dengan PBS dan 1×106 sel tetap telah telap dengan 0.1 peratus Triton X-100 (Sigma-Aldrich) dalam PBS, diikuti dengan pengeraman di RT selama 3 minit. Sel telah dibasuh dua kali dengan PBS (sentrifugasi pada 300 × g, 5 min) sebelum menambah larutan stok phalloidin yang disediakan, dicairkan 1:1000 dalam penimbal FACS, dan diinkubasi selama 20 minit atRT. Akhir sekali, sel telah dibasuh dua kali dengan penimbal FACS dan digantung semula dalam 300 μL FACSbuffer. Sel bernoda dianalisis secara langsung dengan mikroskop pendarfluor dan digunakan untuk analisis FACS.

2.3.3 Eksperimen pemindahan.

Sel BHK164 dan BHK-2P telah ditransfeksi dengan sama ada EGFP-N1, plasmid yang mengekspresikan protein pendarfluor hijau yang dipertingkatkan (EGFP) (Clontech), atau dalam satu lagi siri eksperimen dengan pVSV-G, plasmid yang mengekspresikan protein G vesikular stomatitis Indiana virus (VSV), menggunakan Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) mengikut arahan pengilang. Ringkasnya, 2 ug DNA plasmid dan 1.875 μL atau 3.75 μLof lipofectamine yang dicairkan dalam medium Cellvento™ BHK200 dicampur dan diinkubasi di RT selama 20 minit untuk membolehkan pembentukan kompleks. Selepas itu, campuran ini dipindahkan ke sel dalam12-plat perigi (kira-kira 4×105 sel/mL) dan medium ditambah sehingga 200 μL. Sel-sel telah diinkubasi pada 37 ˚C selama 24 jam.

Untuk analisis FACS, keseluruhan kandungan telaga telah dituai selepas 24 jam. Sel yang ditransfeksi pEGFP telah dibasuh tiga kali dengan PBS dan digantung semula dalam penimbal FACS 300 μL. Satu pendua sel yang ditransfeksi pVSV-G telah diresapkan dengan PBS dengan 0.1 peratus (v/v) TritonX-100 selama 5 minit pada RT sebelum pewarnaan antibodi, manakala satu lagi kekal tidak telap. Pewarnaan antibodi dilakukan seperti yang diterangkan di atas dengan serum arnab poliklonal VSV 274/E(pencairan 1:500, disediakan oleh Dr. Stefan Finke) dan anti-arnab kambing antibodi sekunder (H tambah L) yang digabungkan dengan Alexa Fluor 488 (pencairan 1: 1000; Thermo Fisher Scientific).

2.4 Analisis statistik

Data dianalisis menggunakan GraphPad Prism versi 07.04 untuk Windows (GraphPad Software, La Jolla, USA). Analisis sehala biasa bagi varians dilakukan dengan post-hottest Tukey untuk menilai perbezaan antara kumpulan rawatan. Ambang untuk kepentingan statistik ditetapkan pada nilai p 0.001.

2.5 Analisis transkriptom

2.5.1 Pengekstrakan RNA, penyediaan perpustakaan, dan penjujukan.

Tiga kelompok bebas bagi setiap garisan sel BHK179 yang mematuhi dan garisan sel penggantungan BHK-2P dan BHK-InV telah digunakan untuk analisis transkrip. Secara purata, 8.3×105 sel BHK179, 1.6×107 BHK-2Psel dan 1.4×107 sel BHK-InV telah disaring dalam Reagen TRIzol (Thermo Fisher Scientific). Selepas menambah 0.2 isipadu triklorometana ke dalam lisat sel, pengeraman dan sentrifugasi, fasa akueus dikumpulkan dan dicampur dengan satu isipadu etanol 100 peratus. Daripada ini, jumlah RNA telah diekstrak menggunakan Kit Mini RNeasy (Qiagen, Hilden, Jerman) dengan pencernaan DNase pada lajur dengan Set DNase Tanpa RNase (Qiagen) mengikut arahan pengeluar. ERCC RNA Spike-In Mix 1 (Thermo Fisher Scientific) telah ditambah dan digunakan sebagai kawalan dalaman untuk semua langkah berikut. Seterusnya, mRNA polyadenylated telah diasingkan daripada 1-3 ug jumlah RNA berkualiti tinggi menggunakan kit Dynabeads mRNA DIRECT Micro (ThermoFisher Scientific). MRNA kemudiannya dipecahkan dan digunakan untuk sintesis cDNA dan penyediaan perpustakaan menggunakan Kit Persediaan Sampel mRNA LT TruSeq Stranded (Illumina, San Diego, Amerika Syarikat) mengikut arahan pengilang. Penjujukan telah dilakukan di Heinrich-Pette-Institut, Hamburg, menggunakan peralatan NextSeq 500 (2x75 bp) dan HiSeq 4000 (1x50 bp) (Illumina).

2.5.2 Analisis statistik ekspresi gen pembezaan.

Semakan kualiti bacaan mentah daripada setiap perpustakaan penjujukan telah dilakukan menggunakan FastQC (versi {{0}}.11.9; Institut Babraham, Cambridge, UK) dengan penekanan pada pengedaran panjang bacaan dan pencemaran penyesuai sebelum dan selepas penyesuai pemangkasan menggunakan Trim Galore (versi 0.6.4_dev, Babraham Institute) dan Cutadapt (versi 2.10) [15]. Menggunakan Salmon [16], bacaan mentah yang dipangkas kemudiannya dipetakan separa kepada genom hamster emas Syria.

Ringkasnya, rujukan genomik dan transkrip GCF{{0}}.1_MesAur1.0 diperoleh daripada Pusat Maklumat Bioteknologi Kebangsaan (NCBI) dan digabungkan dengan jujukan rujukan lonjakan ERCC- dalam kawalan. Indeks transkriptom yang menyedari umpan [17] telah dibina untuk membolehkan penjajaran terpilih dengan Salmon. Untuk kuantifikasi, sepuluh replika bootstrap telah digunakan dan pampasan untuk pincang khusus jujukan, pincang GC dan pincang kedudukan 5' atau 3' telah didayakan.

Selepas itu, data kuantifikasi untuk kawalan spike-in ERCC dikaitkan dengan kepekatan teori mereka, untuk mengesan masalah semasa penyediaan sampel.

Tambahan pula, data kuantifikasi khusus gen pada mulanya ditapis (hanya gen yang muncul dalam lebih daripada satu replika dengan lebih daripada 15 kiraan), dinormalisasi menggunakan transformasi log teratur (rlog), dan digunakan untuk analisis data penerokaan, contohnya dengan PCA. Gen yang dinyatakan secara berbeza telah dikenalpasti dan kemudiannya digunakan untuk analisis laluan menggunakan DESeq2 [18]. Data ungkapan dianalisis untuk gen yang dinyatakan secara ketara berbeza antara pasangan garis sel BHK-2P dan BHK179, BHK-InV dan BHK-2P dan BHK-InV dan BHK179. Selepas itu, perubahan lipatan logaritma binari (log2) yang terhasil telah diselaraskan menggunakan fungsi "lfcShrink" dan "apglm" dalam DESeq2 untuk mengimbangi kiraan bacaan rendah atau berubah-ubah yang mungkin membawa kepada anggaran terlalu banyak varians [19].

Kriteria untuk gen yang dinyatakan secara ketara berbeza telah ditetapkan kepada nilai pelarasan maksimum {{0}}.05 dan nilai mutlak minimum perubahan lipatan log2 yang menyusut sebanyak 1. Laluan dan Kriteria bagi gen yang dinyatakan secara ketara berbeza telah ditetapkan kepada nilai pelarasan maksimum 0.05 dan nilai mutlak minimum perubahan lipatan log2 yang menyusut sebanyak 1. Analisis laluan dan pengayaan telah dijalankan menggunakan fungsi "memperkaya" dalam profil kluster (versi3.16.0).

cistanche boleh menyuburkan buah pinggang dan meningkatkan fungsi buah pinggang

3. Keputusan

3.1 Kecenderungan garis sel untuk FMDV adalah bebas daripada kadar pertumbuhan individu dan nombor pembahagian selnya

Eksperimen kelompok dengan sembilan garisan sel penggantungan BHK berbeza telah dijalankan dalam tempoh enam hari dan ketumpatan sel berdaya maju (VCD) dan daya maju diukur setiap hari. Berdasarkan pemerhatian sebelum ini bahawa garisan sel berbeza dalam kerentanannya terhadap FMDV serotype Asia{{0}}} [12], ia telah diperiksa sama ada peningkatan metabolisme selular dan kadar pertumbuhan dikaitkan dengan penurunan kerentanan untuk jangkitan dengan ini. virus (Jadual 1). Dua daripada tiga garisan sel penggantungan BHK yang mudah terdedah ialah sel yang tumbuh perlahan-lahan dengan nombor pembahagian sel kecil (cd) 0.60 (#3) dan 0.70 (#9), manakala garisan sel mudah terdedah ketiga (#8) mempunyai kadar pertumbuhan tertinggi dan cd (μ=0.035, cd=1.62) antara semua baris sel yang diuji.

Penarikan serum dan penyesuaian kepada pertumbuhan dalam ACFM tidak mempunyai kesan ke atas kerentanan kepada FMDV dalam set garisan sel yang diperiksa kami. Talian sel #2 ialah pelopor yang bergantung kepada serum yang perlahan-lahan bagi garisan sel BHK-2P, dikekalkan dalam penggantungan dengan GMEMdengan serum lembu janin. Semasa penyesuaian kepada pertumbuhan dalam ACFM, sel telah dipilih untuk VCD tinggi, dikaitkan dengan kadar pertumbuhan dan cd yang tinggi. Seperti garisan sel BHK-2P utama yang digunakan untuk kajian, garisan sel #4 dan #5 juga diperoleh daripada talian sel #2 tetapi berbeza dalam mod penyesuaian kepada ACFM. Semua talian sel BHK-2P yang dikekalkan dalam ACFM menunjukkan profil pertumbuhan yang hampir serupa. Kerentanan untuk serotype FMDV Asia-1 tidak diperolehi oleh mana-mana talian sel ini semasa penyesuaian kepada ACFM, mungkin kerana talian asal #2 telah pun tahan. Begitu juga, tiada perubahan dalam kerentanan dilihat untuk talian sel penggantungan #3. Apabila berkembang secara melekat (rujuk garisan sel #1 dalam [12]), sel telah terdedah kepada FMDV Asia-1 dan mereka mengekalkan ciri ini semasa penyesuaian kepada pertumbuhan dalam penggantungan. Pada masa yang sama, mereka tidak memperoleh profil pertumbuhan pesat sel penggantungan lain.

3.2 Sel suspensi mempunyai lebih sedikit reseptor primer tetapi lebih banyak reseptor sekunder untuk FMDV pada permukaannya berbanding sel BHK yang melekat

Langkah pertama untuk virus berjaya menjangkiti sel ialah pengikatan zarah virus kepada molekul reseptor pada permukaan sel. Untuk menganalisis perbezaan antara sel BHK yang tumbuh secara patuh dan sel BHK dalam penggantungan, antibodi kepada reseptor selular yang terlibat dalam interaksi matriks ekstraselular dan diketahui memainkan peranan penting dalam jangkitan FMDV telah diuji. Integrins v 3 dan v 8 telah diperiksa sebagai reseptor sel perwakilan yang mengiktiraf motif pengikat RGD (Arg-Gly-Asp) dan berinteraksi dengan komponen serum dan matriks ekstraselular tetapi juga digunakan oleh FMDV sebagai reseptor utama semulajadinya. Kedua-dua garisan sel penggantungan yang diuji (BHK-InV dan BHK-2P) tidak menyatakan integrin v 3 atau v 8 pada permukaan sel. Walaupun perbezaan antara BHK pematuhan dan BHK penggantungan tidak ketara untuk integrin v 8 (Rajah 1b), peratusan BHK179 pematuhan yang jauh lebih tinggi menyatakan integrin v 3 berbanding garisan sel penggantungan BHK-InV dan BHK-2P ( Rajah 1a).

Jumlah HS yang tinggi dibentangkan pada permukaan kedua-dua garisan sel penggantungan. Ekspresi HS adalah sangat berbeza antara budaya replika sel BHK179 yang mematuhi. Berbanding dengan garisan sel penggantungan, lebih sedikit sel dalam kultur BHK179 adalah HS-positif, walaupun perbezaannya tidak ketara pada tahap kepentingan yang telah ditetapkan (Rajah 2).

Analisis pewarnaan dan mikroskopik mendedahkan perbezaan yang besar dalam susunan sitoskeleton aktin antara sel yang melekat dan penggantungan (Rajah 3). Filamen aktin dalam sel BHK179 yang melekat diedarkan secara seragam ke seluruh sel dalam corak retikular halus (Rajah 3a), manakala sel yang tumbuh dalam ampaian mempunyai pewarnaan aktin yang meresap (Rajah 3b). Menariknya, kuantiti aktin berfilamen adalah berbeza antara garisan sel penggantungan BHK-InV dan BHK-2P. Keamatan pendarfluor median (MFI) selepas pewarnaan phalloidin adalah lebih tinggi dengan ketara dalam sel BHK-InV berbanding BHK-2P, yang menunjukkan kandungan aktin filamen yang lebih tinggi dalam sel ini (Rajah 3c).

3.3 Sel penggantungan berbeza dalam kecekapan pemindahan tetapi tidak dalam keupayaan mereka untuk memaparkan protein permukaan

Oleh kerana perbezaan dalam konformasi aktin antara sel yang melekat dan penggantungan, sel telah diperiksa berkenaan dengan kebolehpindahannya dan keupayaan untuk membentangkan protein pada permukaannya. Secara umum, keberkesanan transfeksi, diukur dengan ungkapan EGFP, dikurangkan dalam sel penggantungan (Rajah 4a). Apabila menggunakan dos rendah reagen transfeksi, peratusan sel yang lebih tinggi dengan ketara menyatakan EGFP berbanding dengan sel penggantungan. Apabila dos reagen pemindahan yang tinggi digunakan, peratusan sel penggantungan yang lebih tinggi berjaya ditransfeksi, walaupun perbezaan antara dos tinggi dan rendah tidak ketara. Untuk menjawab persoalan sama ada sel penggantungan masih dapat membentangkan protein seperti reseptor selular pada permukaannya, sel telah ditransfeksi dengan pengekodan plasmid untuk protein VSV G (Rajah 4b). Satu siri sel telah telap sebelum pewarnaan untuk mengambil kira kemungkinan bahawa protein G dinyatakan tetapi tidak dipaparkan pada permukaan selular. Tiada perbezaan yang ketara dalam keupayaan untuk mengekspresikan dan membentangkan protein VSV G antara sel yang melekat dan penggantungan, tidak juga apabila menggunakan reagen transfeksi dos rendah atau tinggi.

3.4 Analisis transkriptom mendedahkan perbezaan dalam ekspresi gen yang berkaitan dengan matriks ekstraselular antara sel penggantungan

Analisis transkriptom telah dilakukan untuk menyiasat lebih lanjut perbezaan antara sel BHK yang tumbuh dengan patuh dan sel BHK dalam penggantungan dan untuk menjelaskan mengapa sel penggantungan berbeza dalam kerentanan mereka untuk FMDV. Talian sel BHK melekat (BHK179) yang dikultur dalam MEM ditambah dengan FBS serta talian sel mudah terdedah FMDV (BHK-InV) yang berkembang pesat dan talian sel tahan cepat berkembang (BHK-2P), kedua-duanya disesuaikan dengan ACFM, telah dipilih untuk analisis.

Analisis komponen utama (PCA) menyerlahkan hubungan rapat antara replika biologi garisan sel individu (Rajah 5a). Semua replika barisan sel yang sama terletak berdekatan dalam plot dengan sedikit petunjuk kesan kelompok ke kelompok. Komponen utama pertama (mengambil kira 81 peratus varians dalam dataset ternormal) ditafsirkan sebagai perbezaan transkrip antara sel yang tumbuh dalam penggantungan dan sel yang tumbuh dalam pematuhan, manakala komponen utama kedua (15 peratus varians) mewakili perbezaan antara talian sel penggantungan BHK-2P dan BHK-InV, mungkin dikaitkan dengan kerentanan kepada jangkitan FMDV. Bersama-sama, dua komponen utama pertama dapat menjelaskan 96 peratus varians yang terdapat dalam dataset, yang menunjukkan bahawa analisis transkriptom mengenal pasti perbezaan yang relevan antara tiga baris sel.

Bilangan terkecil gen yang dizahirkan secara berbeza ditemui apabila membandingkan BHK-InV dengan BHK-2P (590 dikawal ke atas; 304 dikawal ke bawah). Nombor yang sama dilihat dalam perbandingan sama ada BHK-2P atau BHK-InV secara individu dengan BHK179 (1527 dan 1519 dikawal ke atas; 1308 dan 943 dikawal ke bawah, masing-masing) (Rajah 5b). Apabila dua garisan sel penggantungan (BHK-InV dan BHK{17}}P) digabungkan dan dibandingkan dengan garisan sel BHK179 yang mematuhi, 1814 gen dinyatakan secara berbeza. Walaupun 411 gen dinyatakan secara eksklusif secara berbeza apabila membandingkan BHK179 dengan BHK-InV, hampir dua kali lebih banyak (701 gen) dinyatakan secara eksklusif secara berbeza antara BHK179 dan BHK-2P. Di antara dua garisan sel penggantungan, hanya 104 gen yang dinyatakan secara eksklusif secara berbeza.

Apabila membandingkan set gen yang dinyatakan secara berbeza bagi garisan sel mudah terdedah FMDV BHK179 dan BHK-InV dengan garisan sel tahan FMDV BHK-2P, subset 553 gen didapati dinyatakan secara berbeza dalam kedua-dua perbandingan ( Rajah 5c). Oleh kerana gen ini mungkin terlibat dalam kerentanan FMDV, analisis pengayaan istilah GO telah dijalankan dan mendedahkan bahawa banyak gen ini berkaitan dengan komponen selular matriks ekstraselular (ECM), membran sel, dan persimpangan sel sel (Rajah 5d) .

Oleh kerana kita memerhatikan perbezaan antara garisan sel yang berkaitan dengan interaksi ECM, transkrip dianalisis semula dengan tumpuan pada ekspresi integrin v 1, v 3, v 6, v 8, serta aktin, semuanya berpotensi relevan untuk kerentanan kepada jangkitan FMDV. (Rajah 5e). Dengan pengecualian ACTA2, tidak terdapat perbezaan yang ketara dalam ekspresi gen berkaitan aktin antara sel BHK-InV dan BHK-2P pada tahap mRNA. Kiraan gen yang dinormalisasi untuk semua gen yang berkaitan dengan aktin yang diperiksa adalah jauh lebih tinggi dalam garisan sel yang melekat BHK179 daripada dalam garisan sel penggantungan (S1 Rajah).

Ketiga-tiga garisan sel menyatakan kuantiti transkrip ITGAV yang sama, pengekodan untuk subunit integrin v tetapi menunjukkan ungkapan pembezaan untuk subunit integrin. Secara terperinci, garisan sel penggantungan BHK-2P dan BHK-InV menyatakan kurang ketara ITGB1, ITGB3 dan ITGB6 berbanding dengan garisan sel yang melekat BHK179. ITGB3 dan ITGB8 dinyatakan secara ketara berbeza antara talian sel penggantungan BHK-2P dan BHK-InV. Menariknya, ITGB8 ialah satu-satunya gen pengekodan subunit integrin yang sangat tertekan dalam kedua-dua talian sel mudah terdedah FMDV BHK179 dan BHK-InV jika dibandingkan dengan talian sel tahan FMDV BHK-2P (Rajah 5e).

cistanche boleh menyuburkan buah pinggang dan meningkatkan fungsi buah pinggang

4. Perbincangan

Penyesuaian sel untuk tumbuh dalam penggantungan dan dalam media bebas serum adalah proses yang memakan masa dan beransur-ansur tetapi perlu dalam bioteknologi untuk menghasilkan garisan sel yang menghasilkan tinggi yang digunakan untuk menghasilkan antibodi, antigen vaksin, atau protein lain [1, 8]. ]. Sesungguhnya, proses ini sentiasa penuh dengan risiko bahawa sel memperoleh sifat yang tidak diingini berbanding dengan bahan sel asal [7]. Dalam kes pengeluaran antigen vaksin, kerentanan garis sel untuk virus sasaran adalah sangat penting. Untuk virus penyakit kaki dan mulut (FMDV), ia adalah fenomena yang terkenal bahawa garisan sel BHK tertentu tahan terhadap jangkitan atau kehilangan kerentanannya semasa subkultur berulang [20-22]. Di samping itu, sifat antigen virus boleh berubah-ubah bergantung kepada sel perumah [9].

Sel penggantungan tumbuh secara bebas dari permukaan dan diselubungi oleh media nutrien yang kaya dengan oksigen, membolehkan mereka berkembang dengan cepat. Pendaraban sel yang cepat adalah ciri yang diperlukan untuk meningkatkan kultur kepada jumlah yang besar dengan mudah dan dalam masa yang singkat. Penyingkiran serum daripada medium adalah perlu untuk mengurangkan kos, risiko pencemaran dan untuk memudahkan proses skala bawah [23, 24].

Analisis pertumbuhan kelompok bagi garisan sel penggantungan BHK yang berbeza bertujuan untuk menentukan sama ada pemilihan ke arah populasi sel yang berkembang pesat dalam keadaan bebas serum memudaratkan pembiakan FMDV. Malah, dua daripada tiga garisan sel yang mudah terdedah memang tumbuh dengan perlahan tetapi kerentanan mereka kepada FMDV didapati bebas daripada metabolisme pertumbuhan mereka. Berkemungkinan besar bahawa kerentanan FMDV sudah hilang (atau dikekalkan) semasa penyesuaian awal kepada pertumbuhan dalam penggantungan. Detasmen sel dari permukaan dan penarikan serum dalam langkah penyesuaian berikut kepada pertumbuhan ampaian membawa kepada perubahan dalam tahap ekspresi protein permukaan dan protein yang terlibat dalam sitoskeleton [7].

Integrin adalah keluarga penting reseptor permukaan sel yang disepadukan ke dalam membran sel dan mengantara isyarat sel-ke-sel serta hubungan yang kuat antara sel dan permukaan melalui pengikatan komponen matriks ekstraselular (ECM) [10, 25]. ]. Peraturan kitaran sel, organisasi sitoskeleton, dan translokasi molekul reseptor yang baru lahir ke membran sel bergantung pada integrin [25]. Bagi kebanyakan integrin, pengikatan ECM, serta pengikatan ligan yang disediakan kepada sel melalui penambahan serum ke medium kultur, dimediasi oleh motif RGD [6, 25] dan ia mungkin berubah apabila sel bertukar daripada melekat kepada pertumbuhan ampaian. Pengiktirafan motif RGD oleh integrin juga digunakan oleh FMDV untuk memulakan endositosis pengantara reseptor zarah virus [26]. Motif RGD dalam VP1 FMDV sangat terpelihara [27], dan integrin v 1, v 3, v 6, dan v 8 dikenali sebagai reseptor yang digunakan oleh FMDV secara in vivo dan in vitro [28–31]. Oleh kerana perbezaan yang disyaki dalam proteom permukaan sel antara sel yang melekat dan penggantungan mungkin juga penting untuk perbezaan kerentanan kepada jangkitan FMDV, antibodi yang mengikat kepada integrin v 3 dan v 8 digunakan untuk mengotorkan garisan sel BHK yang melekat serta talian sel BHK suspensi yang mudah terdedah dan tahan. Tiada pewarnaan v 6 dilakukan kerana sebelum ini telah ditunjukkan bahawa integrin ini tidak dinyatakan pada permukaan sel BHK [32], walaupun mRNA ITGB6 dapat dikesan. Begitu juga, walaupun tahap tinggi ekspresi mRNA ITGB8 yang dikesan dalam sel BHK179 dan BHK-InV, integrin v 8 tidak kelihatan dibentangkan pada permukaan sel BHK secara umum. Integrin v 3 ditemui pada tahap kecil pada garis sel yang melekat, tetapi tidak pada garis sel penggantungan.

Selain daripada integrin, pengikatan ligan, peristiwa internalisasi, dan isyarat intraselular boleh dimediasi oleh proteoglycans heparan sulfat (HS) [33] dan pemerolehan HS sebagai reseptor sekunder sering diperhatikan selepas penghantaran berulang FMDV dalam kultur [34]. Pewarnaan antibodi spesifik mendedahkan HS yang banyak pada kedua-dua garisan sel penggantungan dan pada tahap yang lebih rendah juga pada sel BHK yang melekat. Mutasi dalam genom FMDV, yang membawa kepada perubahan dalam protein kapsid virus untuk membenarkan penggunaan HS sebagai reseptor, diketahui melemahkan virus dalam perumah semula jadi [35]. Oleh itu, ketersediaan HS mungkin menjadi faktor penting untuk mengubah antigenikiti kebebasan FMDV pada garis sel yang telah disesuaikan dengan virus.

Oleh kerana detasmen selular dikaitkan dengan perubahan dalam mekanisme kontraktil aktin-myosin [7] dan pengkulturan sel dalam ampaian membawa keperluan yang berbeza untuk kemandirian, contohnya rintangan kepada tegasan ricih yang tinggi akibat pergolakan cecair kultur [6], rangka aktin telah kepentingan utama dalam kajian ini. Analisis mikroskopik mendedahkan penyusunan semula konformasi sitoskeleton daripada taburan retikular dalam sel-sel tumbuh yang melekat kepada struktur sfera padat dalam keadaan ampaian. Ini mungkin merupakan mekanisme pelarasan kepada tegasan ricih tinggi yang disebutkan di atas dan juga diketahui berlaku dalam sel CHO dalam keadaan yang sama [6]. Tetapi perlu diperhatikan juga bahawa walaupun tiada perbezaan ketara dalam ekspresi kebanyakan gen aktin antara sel BHK-InV dan BHK-2P pada tahap mRNA, lebih banyak protein aktin berfilamen telah dikesan dalam BHK yang mudah terdedah kepada FMDV. -InV berbanding BHK tahan FMDV-2P. Ini mungkin dikaitkan dengan kadar pempolimeran berbeza aktin globular menjadi aktin berfilamen.

Sekurang-kurangnya dalam sel yang melekat, kemasukan FMDV bergantung kepada dinamik aktin. Kemasukan virus mendorong aktin ruffles dan gangguan rangkaian filamen aktin melalui penukaran aktin filamen kepada aktin globular telah diterangkan pada peringkat awal jangkitan [36-38]. Berdasarkan kesan sitopatik (CPE) yang dilihat dalam sel BHK yang melekat apabila dijangkiti FMDV, sitoskeleton melalui penyusunan semula intensif dalam kebanyakan komponennya [38]. CPE sedemikian tidak kelihatan dalam sel penggantungan kerana bentuknya yang sudah sfera tetapi kandungan aktin yang tinggi mungkin memberi sedikit kelebihan kepada virus. Oleh kerana perbezaan dalam sitoskeleton aktin, eksperimen transfeksi telah dijalankan untuk membandingkan kecekapan transfeksi antara ampaian dan BHK yang mematuhi dan untuk menentukan sama ada sitoskeleton padat sel ampaian menghalang pembentangan protein pada permukaan selular. Umum mengetahui bahawa garisan sel penggantungan sangat sukar untuk ditransfeksi, yang disebabkan oleh pengurangan perlekatan kompleks pemindahan ke membran sel dan seterusnya mengurangkan pengambilan muatan DNA [39]. Ini juga disahkan oleh eksperimen kami. Tetapi walaupun kecekapan pemindahan telah dikurangkan dalam sel BHK-2P berbanding garis sel BHK yang mematuhi, tiada perbezaan dalam keupayaan untuk memaparkan protein VSV G yang ditransfeksi pada permukaan selular. Perbezaan dalam peratusan sel bernoda diperhatikan antara plasmid ekspresi pEGFP-N1 dan pVSV-G dalam sel BHK-2P. Ini tidak disiasat lebih lanjut, tetapi ia mungkin disebabkan oleh had pengesanan yang berbeza antara pewarnaan imunofluoresen yang digunakan untuk memvisualisasikan VSV-G dan pendarfluor semula jadi EGFP.

Akhir sekali, analisis transkriptom dilakukan untuk memberikan lebih banyak maklumat tentang perbezaan transkrip antara sel BHK yang melekat dan penggantungan di satu pihak dan antara garisan sel BHK yang mudah terdedah dan FMDV di sisi lain. Keputusan kami adalah sejajar dengan kajian lain tentang perubahan transkriptom dalam sel CHO, MDCK, atau HEK semasa pertukaran daripada pematuhan kepada pertumbuhan penggantungan. Secara umum, kebanyakan perubahan berkaitan dengan struktur sitoskeletal, metabolisme selular, dan interaksi komponen ECM dan dikawal selia untuk sel penggantungan [7, 40, 41]. Yang menghairankan, sel penggantungan BHK-2P yang tahan FMDV menunjukkan penurunan kawal selia set gen ini, yang mungkin juga menerangkan tahap pengurangan aktin dalam BHK-2P berbanding dengan sel BHK-InV. Analisis khusus bagi ekspresi subunit integrin mendedahkan tahap transkrip subunit V integrin yang sama dalam ketiga-tiga garisan sel. Ekspresi tertinggi dalam semua garisan sel ditemui untuk subunit integrin 1. Adalah penting untuk diperhatikan bahawa integrin 1 boleh membentuk heterodimer dengan sepuluh rantai yang berbeza dan secara konstitutif dinyatakan oleh kebanyakan sel mamalia [6, 42]. Begitu juga, subunit V mampu membentuk heterodimer dengan lima rantai yang berbeza, tetapi 6 dan 8 hanya dibentangkan pada permukaan sel dalam kombinasi dengan V [42]. Ini dicerminkan dengan tepat oleh banyaknya transkrip subunit integrin tunggal yang diperhatikan. Transkripsi tinggi 3 dalam sel yang melekat juga berkorelasi baik dengan isyarat yang lebih tinggi untuk integrin v 3 dalam eksperimen pewarnaan antibodi. Sebaliknya, perbezaan yang diperhatikan dalam tahap mRNA ITGB3 dan ITGB8 antara BHK-2P dan BHK-InV tidak ditunjukkan dalam pewarnaan permukaan. Kami tidak dapat menyelesaikan sama ada ini hanya disebabkan oleh sensitiviti yang berbeza antara kaedah kuantifikasi mRNA dan protein atau menunjukkan blok pasca transkrip ekspresi protein atau persembahan permukaan [43]. Secara keseluruhannya, garisan sel penggantungan BHK-2P dan BHK-InV menyatakan kurang ketara mRNA ITGB1, ITGB3 dan ITGB6 berbanding dengan garisan sel yang melekat.

5. KesimpulanDalam

Kesimpulannya, adalah amat penting dalam penyediaan sel penggantungan untuk menggunakan klon sel ibu bapa dengan ciri yang terkenal dan untuk menyaring populasi sel yang terhasil dengan berhati-hati semasa proses penyesuaian untuk memastikan garisan sel mengekalkan ciri penting, dalam kes ini. , kerentanan kepada FMDV. Di samping itu, kaedah moden seperti analisis FACS dan transkriptomi harus digunakan untuk pencirian lanjut barisan sel pengeluaran.

cistanche boleh menyuburkan buah pinggang dan meningkatkan fungsi buah pinggang

Ucapan terima kasih

Kami berterima kasih kepada Patrick Zitzow atas sokongan teknikalnya yang sangat baik.

Sumbangan Pengarang

Pengkonsepan:Veronika Dill, Michael Eschbaumer.

Analisis formal:Veronika Dill, Florian Pfaff.

Pemerolehan pembiayaan:Aline Zimmer, Martin Beer.

Penyiasatan:Veronika Dill.

Metodologi:Veronika Dill, Florian Pfaff, Michael Eschbaumer.

Pentadbiran projek:Martin Beer.Sumber: Aline Zimmer.

Penyeliaan:Michael Eschbaumer.

Visualisasi:Veronika Dill, Florian Pfaff, Michael Eschbaumer.

Penulisan – draf asal:Veronika Dill.

Penulisan – semak & suntingan:Veronika Dill, Florian Pfaff, Aline Zimmer, Martin Beer, MichaelEschbaumer.

Rujukan

1. Merten OW. Kemajuan dalam budaya sel: pergantungan penambat. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.2015; 370(1661):20140040.

2. Dingermann T. Protein terapeutik rekombinan: platform pengeluaran dan cabaran. Bioteknol J.2008; 3(1):90–7.

3. Hernandez R, Brown DT. Pertumbuhan dan penyelenggaraan sel buah pinggang hamster bayi (BHK). Curr ProtocMicrobiol. 2010; Bab 4:Lampiran 4H. mca04hs17 PMID: 20440683

4. Cruz HJ, Moreira JL, Stacey G, Dias EM, Hayes K, Looby D, et al. Adaptasi sel BHK yang menghasilkan protein rekombinan kepada media bebas serum dan medium bebas protein. Sitoteknologi. 1998; 26(1):59– 64.

5. Guskey LE, Jenkin HM. Penyesuaian sel BHK-21 kepada pertumbuhan dalam budaya shaker dan cabaran seterusnya oleh virus Japanese encephalitis. Appl Microbiol. 1975; 30(3):433–8. https://doi.org/10.1128/am. 30.3.433-438.1975 PMID: 1237269

6. Walther CG, Whitfield R, James DC. Kepentingan Interaksi antara Integrin dan Actin Cytoskeleton dalam Adaptasi Suspensi sel CHO. Appl Biochem Biotechnol. 2016; 178(7):1286–302.

7. Kluge S, Benndorf D, Genzel Y, Scharfenberg K, Rapp E, Reichl U. Memantau perubahan dalam proteom semasa penyesuaian langkah demi langkah garisan sel MDCK daripada pematuhan kepada pertumbuhan dalam penggantungan. Vaksin. 2015; 33(35):4269–80.

8. Costa AR, Withers J, Rodrigues ME, McLoughlin N, Henriques M, Oliveira R, et al. Kesan penyesuaian sel kepada keadaan bebas serum pada profil glikosilasi antibodi monoklonal yang dihasilkan oleh sel ovari hamster Cina. N Bioteknol. 2013; 30(5):563–72. https://doi.org/10.1016/j.nbt.2012.12. 002 PMID:23247406

9. Bolwell C, Brown AL, Barnett PV, Campbell RO, Clarke BE, Parry NR, et al. Pemilihan sel hos bagi varian antigen virus penyakit kaki dan mulut. J Jen Virol. 1989; 70 (Pt 1):45–57.

10. Wiesner S, Legate KR, Fassler R. Interaksi Integrin-aktin. Sel Mol Life Sci. 2005; 62(10):1081–99.

11. O'Donnell V, Pacheco JM, Gregg D, Baxt B. Analisis ekspresi reseptor integrin virus penyakit kaki dan mulut dalam tisu daripada lembu yang naif dan dijangkiti. J Comp Pathol. 2009; 141(2–3):98–112. PMID: 19515380

12. Dill V, Hoffmann B, Zimmer A, Beer M, Eschbaumer M. Penyesuaian FMDV Asia-1 kepada Budaya Suspensi: Rintangan Sel Diatasi oleh Pengubahan Kapsid Virus. Virus. 2017; 9(8). https://doi.org/10. 3390/v9080231 PMID:28820470

13. Macpherson I, Stoker M. Polyoma transformasi klon sel hamster-penyiasatan faktor genetik yang mempengaruhi kecekapan sel. Virologi. 1962; 16:147–51.

14. Rourou S, van der Ark A, van der Velden T, Kallel H. Proses kultur sel pembawa mikro untuk menyebarkan virus rabies dalam sel Vero yang ditanam dalam bioreaktor kacau di bawah keadaan bebas komponen haiwan sepenuhnya. Vaksin. 2007; 25(19):3879–89.

15. Martin M. Cutadapt mengalih keluar jujukan penyesuai daripada bacaan jujukan throughput tinggi. EMBnetjournal. 2011; 17:10–2.

16. Patro R, Duggal G, Love MI, Irizarry RA, Kingsford C. Salmon menyediakan kuantifikasi transkrip yang cepat dan sedar berat sebelah. Kaedah Nat. 2017; 14(4):417–9.

17. Srivastava A, Malik L, Sarkar H, Zakeri M, Almodaresi F, Soneson C, et al. Metodologi penjajaran dan pemetaan mempengaruhi anggaran kelimpahan transkrip. Biol Genom. 2020; 21(1):239.

18. Love MI, Huber W, Anders S. Anggaran sederhana perubahan lipatan dan serakan untuk data RNA-seq dengan DESeq2. Biol Genom. 2014; 15(12):550.

19. Zhu A, Ibrahim JG, Love MI. Pengagihan terdahulu yang berat untuk data kiraan jujukan: mengeluarkan bunyi dan mengekalkan perbezaan yang besar. Bioinformatik. 2019; 35(12):2084–92.

20. Clarke JB, Spier RE. Variasi dalam kerentanan populasi BHK dan garisan sel klon kepada tiga jenis virus penyakit kaki dan mulut. Arch Virol. 1980; 63(1):1–9.