Kesan Naringenin Pada Profil MiRNA-mRNA dalam Sel HepaRG

Untuk butiran lanjut, hubungi:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrak: Naringenin, semulajadiflavonoiddidapati secara meluas dalam buah sitrus, telah dilaporkan mempunyai sifat antioksidan, anti-radang, dan hepatoprotektif sebagai suplemen pemakanan semula jadi. Walau bagaimanapun, mekanisme pengawalseliaan naringenin dalam hati manusia masih tidak jelas. Dalam kajian ini, penjujukan RNA messenger (mRNA-seq), penjujukan mikroRNA (miRNA-seq), dan qPCR masa nyata digunakan untuk membezakan perbezaan ekspresi antara kawalan dan sel HepaRG yang dirawat naringenin. Kami memperoleh 1037 mRNA yang dinyatakan secara berbeza dan 234 miRNA. Menurut ramalan sasaran dan analisis integrasi dalam silico, kami mendapati 20 pasangan miRNA-mRNA yang berpotensi terlibat dalamhatimetabolisme. Kajian ini adalah yang pertama memberikan perspektif interaksi miRNA-mRNA dalam pengawalan naringenin melalui analisis bersepadu mRNA-seq dan miRNA-seq dalam sel HepaRG, yang selanjutnya mencirikan nilai nutraseutikal naringenin sebagai bahan tambahan makanan.

Kata kunci: naringenin; mRNA-seq; miRNA-seq; sel HepaRG

klik untuk mendapatkan lebih banyak maklumat produk

1. Pengenalan

Naringenin, flavonoid semulajadi, banyak ditemui dalam buah sitrus dan buah-buahan lain yang boleh dimakan, seperti limau gedang, oren, bergamot, tomato, dan buah ara [1]. Selepas pemberian oral, naringenin diedarkan secara meluas dalam saluran gastrousus dan hati [2,3] dan mempamerkan sifat antioksidan langsung oleh aktiviti penghapusan radikal bebas berdasarkan struktur molekulnya, dan mendorong sistem antioksidan endogen dalam hati [4]. Bukti yang semakin meningkat daripada kajian in vitro dan in vivo telah mengenal pasti pelbagai kapasiti perlindungan naringenin, sepertianti-radang[5], antioksidan [6], anti-fibrosis [Z], dan hepatoprotektif 4,8| aktiviti. Kapasiti ini menunjukkan bahawa naringenin diet boleh digunakan untuk mencegah sindrom metabolik dan penyakit malignan, termasuk hepatitis fulminan, lemak.penyakit hati, fibrosis, dsb. 19,10]. Walau bagaimanapun, terdapat beberapa kajian terperinci mengenai kesan pengawalseliaan naringenin pada keseluruhan gen hati [4].

MicroRNAs (miRNAs) ialah kelas molekul RNA beruntai tunggal tanpa pengekodan dengan panjang 18-26 nukleotida yang dikodkan oleh gen endogen, yang mempamerkan pelbagai fungsi pengawalseliaan biologi dalam filogeni, pembezaan, percambahan dan apoptosis. [11]. miRNA, mengikat RNA messenger (mRNA) dengan pengiktirafan khusus urutan, secara negatif mengawal ekspresi gen pada tahap pasca transkrip melalui degradasi mRNA sasaran [12]. Di bawah rangsangan eksogen, ekspresi miRNA diubah, dan kemudian ekspresi mRNA sasaran dikawal. Akhirnya, fungsi fisiologi yang luas diubah untuk menghadapi cabaran yang disebabkan oleh rangsangan eksogen [13]. Kaedah yang lebih dipercayai untuk meramalkan hubungan sasaran miRNA-mRNA adalah untuk menyepadukan analisis mRNA-seq secara serentak dengan analisis miRNA-seq menggunakan konteks pemprosesan tertentu dalam silico [14].

Oleh itu, objektif kami adalah untuk mengkaji kesan naringenin pada gen global dan menyerlahkan kemungkinan mekanisme pengawalseliaan pasangan miRNA-mRNA dalam hati. Dalam kajian ini, perubahan ekspresi mRNA dan profil ekspresi miRNA telah disiasat dalam HepaRGcells dengan melakukan mRNA-seq, miRNA-seq, analisis bioinformatik, dan qPCR masa nyata untuk memberikan bukti tentang potensi naringenin sebagai suplemen pemakanan semula jadi.

2. Keputusan

2.1.Analisis Penjujukan Transkriptom dalam Tindak Balas terhadap Naringenin

Untuk mengenal pasti perubahan ekspresi mRNAsel HepaRGsebagai tindak balas kepada naringenin, lapan perpustakaan DNA(cDNA) pelengkap dalam kumpulan kawalan (CK-1, CK-2, CK-3 dan CK-4) dan kumpulan eksperimen (T-1, T-2, T-3 dan T-4) telah dibina dengan jumlah RNA dan tertakluk kepada penjujukan Illumina HiSeq2500(Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou , China). Gambaran keseluruhan hasil penjujukan dan pemasangan untuk kumpulan kawalan dan kumpulan eksperimen ditunjukkan dalam Jadual 1. Perubahan ekspresi gen dianalisis dengan membandingkan kumpulan yang dirawat dan kawalan. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah la, kumpulan terdedah naringenin menyatakan 1037 gen yang dinyatakan secara berbeza (DEG) berbanding dengan kumpulan kawalan. Peta haba sebanyak 1037 DEG menunjukkan analisis kelompok kumpulan kawalan dan kumpulan naringenin (Rajah 1b; 381 gen terkawal ke atas dan 656; Jadual S1, Bahan Tambahan).

Menurut sistem klasifikasi Gene Ontology(GO), 1037 DEG dikelaskan kepada tiga kategori fungsi utama (proses biologi, komponen selular dan fungsi molekul) dan 61 subkategori (Rajah 2). Di antara proses biologi, proses selular (731) adalah yang paling biasa diwakili, diikuti oleh proses organisma tunggal (672) dan peraturan biologi (595). Dalam kategori komponen selular, sebahagian besar kelompok telah diberikan kepada sel(727), bahagian sel (721), dan organel(580). Gen yang terlibat dalam kumpulan mengikat (666) dan aktiviti pemangkin (238) ditunjukkan dalam kategori fungsi molekul.

Klasifikasi Ensiklopedia Gen dan Genom Kyoto (KEGG) ditemui untuk 1037 DEG yang selanjutnya diklasifikasikan ke dalam dua puluh laluan biokimia teratas mengikut nilai q terkecil dan Nombor Gen terbesar dalam anotasi laluan (Rajah 3). Nombor Gen dan nisbah gen beranotasi bagi lima laluan teratas ialah lupus eritematosus sistemik(33,8.4 peratus), alkoholisme (38,9.67 peratus), salah kawal selia transkrip dalam kanser (22, 5.6 peratus), laluan isyarat PI3K-Akt (34, 8.65 peratus ), dan lata pelengkap dan pembekuan (12, 3.05 peratus o). Terdapat lebih daripada 10 gen diperkaya antara lima laluan. Secara keseluruhannya, menjalani rawatan naringenin mempunyai kesan yang signifikan terhadap profil ekspresi gen global sel HepaRG. Keputusan ini menunjukkan bahawa gen yang terlibat dalam laluan ini mungkin memainkan peranan penting dalam peraturan naringenin.

2.2. Analisis Tahap Transkrip miRNA sebagai Tindak Balas kepada Naringenin

Dalam kajian ini, kami bertujuan untuk menentukan sama adanaringeninpendedahan mengubah tahap ekspresi miRNA dalam sel HepaRG. Selepas pendedahan, kami mengumpul RNA kecil dan mengukur kelimpahan relatifnya menggunakan Illumina HiSeq2500 (Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou, China). Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual2, bacaan bersih lapan sampel dijana, masing-masing, selepas mengeluarkan bacaan bahan cemar. Gambaran keseluruhan bacaan untuk penjujukan RNA kecil daripada data mentah kepada kualiti tinggi dan dengan penapisan berkualiti disediakan dalam Jadual 2. Taburan panjang RNA kecil adalah serupa di antara perpustakaan kerana 21-23 RNA nt adalah yang paling banyak (Rajah 4). ).

Semua RNA kecil telah diselaraskan dalam pangkalan data GeneBank(Keluaran 209.0) dan pangkalan data Rfam (11.0) untuk mengenal pasti dan mengalih keluar RNA ribosom (rRNA), RNA bersyarat kecil (scRNA), nukleolar kecil (snoRNA), nuklear kecil (snRNA), dan pemindahan RNA (tRNA). Selaras dengan genom rujukan, RNA kecil ini dipetakan kepada exon, intron, dan urutan ulangan juga telah dialih keluar. Penapisan RNA kecil telah dicari terhadap pangkalan data miRBase (Keluaran 21) untuk mengenal pasti miRNA. Peta haba 3373 miRNA menunjukkan analisis kelompok kumpulan kawalan dan kumpulan naringenin dalam Rajah 5a. Pemprofilan Illumina HiSeq2500 daripada 3373 miRNA yang dianalisis dalam pendedahan naringenin berbanding sampel kawalan menunjukkan bahawa sejumlah 234 miRNA yang dinyatakan secara berbeza (DEM, 174 ke atas dan 60 dikawal ke bawah; Jadual S2, Bahan Tambahan) dapat dikesan dalam sel HepaRG (Rajah 5b) .

2.3. Ramalan Sasaran dan Analisis Integrasi mRNA dan Profil Ekspresi miRNA sebagai Tindak Balas kepada Naringenin

Bertindak pada tahap pasca transkrip, miRNA menyenyapkan dan/atau menurunkan ekspresi gen mRNA selular dengan belahan RNA sasaran. Untuk meramalkan gen sasaran 234 DEM, kami melakukan analisis pengiraan menggunakan RNAhybrid(v2.1.2) ditambah skylight (v6). .01), Miranda (v3.3a) dan TargetScan (Versi:7.0). Pemprofilan serentak 234 DEM dan 1037 DEG tahap dalam silico boleh mengenal pasti mRNA sasaran anggapan miRNA. Kami memilih persimpangan DEG dan gen sasaran DEM dan kemudian melakukan analisis bioinformatik pada gen persimpangan ini. Sejumlah 5607 pasangan miRNA-mRNA negatif untuk rawatan naringenin diperoleh, dengan penglibatan 216 DEM dan 681 DEG (Jadual S3, Bahan Tambahan). Selaras dengan sistem pengelasan GO, 681 DEG dikelaskan kepada 58 subkategori (Rajah 6). Tiga subkategori pertama tidak berubah dalam tiga kategori fungsi utama berbanding dengan analisis penjujukan transkrip (Rajah 2 dan 6).

Analisis pengayaan laluan untuk 681 DEG daripada 5607 pasangan miRNA-mRNA negatif mengenal pasti dua puluh laluan teratas mengikut nilai q terkecil dan Nombor Gene terbesar dalam anotasi laluan selepas pendedahan naringenin (Rajah 7): dengan laluan isyarat PI3K-Akt(25,8.96 peratus )menjadi laluan kelapan dan yang kedua paling banyak.

2.4. Pengesahan qPCR Masa Nyata Peraturan Naringenin dalam Metabolisme Hati dan Pasangan MiRNA-mRNA Pengawalseliaan Potensi

Menurut anotasi fungsi gen global, kajian literatur dan potensi hubungannya dengan miRNA responsif naringenin, 19 DEGs(ALOX15, CA9, TH, HKDC1, NDUFA4L2, RRM2, ACSL5, PLA2G4C, LIPT2, UGDH, FTCD, ABAT, AZIN2, HS6ST3 , B4GALT6, GUSB, DCT, ALAS2, dan MAT1A) telah dipilih secara manual sebagai wakil untuk potensi peranan mereka dalam metabolisme hati. Di samping itu, laluan isyarat PI3K-Akt telah diperkaya dengan ketara (keempat dalam KEGG analisis RNA-seq, Rajah 3; kelapan dalam KEGG analisis miRNA-RNA-seq, Rajah 7); oleh itu.11 DEG (PDGFRB. CSF1R. FGFR2, IL2RG, IL7R, ITGB4, GNG4, PCK1, CREB3L3, CREB3L1 dan NFkB1) antara laluan isyarat PI3K-Akt telah disaring keluar.

Kami di sini menerangkan interaksi antara 30 DEG dan 11 miRNA manusia (hsa-miR-1306-5p, hsa-miR-627-3p, hsa-miR-194-3p, hsa-miR{{9 }}p, hsa-miR-6837-5p, hsa-miR-429, hsa-miR-100-3p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR{{19} }a-3p, hsa-miR-7-5p,dan hsa-miR-200a-5p), termasuk 20 interaksi miRNA-mRNA negatif (Rajah 9). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah9, miRNA tunggal boleh mengawal selia berbilang mRNA sasaran dan sebaliknya (cth, ABAT HS6ST3, B4GALT6, dan DCT mungkin boleh dikawal secara serentak oleh hsa-miR-429; HS6ST3 mungkin dikawal oleh hsa-miR secara serentak -429, hsa-miR-100-3p,hsa-miR-519a-3p, hsa-miR-676-3p, hsa-miR-7-5 p dan hsa-miR-194-5p; sesetengah DEG tidak mempunyai DEM berpasangan). Profil ekspresi 19 DEG yang berkaitan dengan metabolisme hati dan 11 DEG di antara laluan isyarat PI3K-Akt telah disahkan selanjutnya menggunakan qPCR masa nyata (Rajah 9a, b). Tahap ekspresi 11 miRNA manusia (dua ke atas dan sembilan dikawal ke bawah) dinilai selanjutnya untuk perubahan yang disebabkan oleh naringenin oleh qPCR masa nyata yang konsisten dengan hasil penjujukan (Rajah 9c). Walaupun terdapat beberapa perbezaan kuantitatif antara dua platform analisis, persamaan antara data RNA-seq dan PCR masa nyata mencadangkan bahawa data RNA-seq boleh dihasilkan dan boleh dipercayai.

3. Perbincangan dan Kesimpulan

Penemuan yang dibincangkan di sini mendedahkan maklumat terperinci pertama mengenai perubahan ekspresi mRNA dan miRNA selari dalam sel HepaRG sebagai tindak balas kepadanaringenin. Kami melakukan analisis integratif data ini termasuk 234 DEM dan 1037 DEG yang disebabkan oleh naringenin, yang memberikan pandangan global ke dalam interaksi miRNA-mRNA naringenin dalam mekanisme pengawalseliaan. Menurut anotasi fungsi gen dan kajian literatur, 19 DEG yang berkaitan dengan metabolisme telah disaring. Khususnya, laluan isyarat PI3K-Akt diperkaya dengan ketara dalam kedua-dua analisis penjujukan transkrip (yang ketiga paling banyak, dan menduduki tempat keempat) dan analisis integrasi profil ekspresi miRNA-mRNA (yang kedua paling banyak, dan menduduki tempat kelapan) sebagai tindak balas kepada naringenin. Di samping itu, 11 DEG dalam laluan isyarat PI3K-Akt telah disahkan lagi menggunakan analisis qPCR masa nyata. Dalam kerja ini, kami membina rangkaian kawal selia miRNA-mRNA mengikut set data DEM dan DEG dan maklumat penyasaran miRNA. Beberapa kajian telah menunjukkan bahawa rangkaian pengawalseliaan miRNA-mRNA bertindak balas terhadapkerosakan hati, termasuk karsinoma hepatoselular dan tekanan oksidatif [15]. Walaupun beberapa fenomena pengaktifan RNA yang disebabkan oleh miRNA telah dikenalpasti [16], dalam kebanyakan keadaan, korelasi negatif antara miRNA dan mRNA sasaran mereka sering dianggap sebagai sokongan untuk penyasaran miRNA [17]. Akhirnya, 20 pasangan korelasi negatif miRNA-mRNA telah dikenal pasti dengan penglibatan metabolisme hati dan laluan isyarat PI3K-Akt.

Berkenaan dengan gen global, kami menangani persoalan penyelidikan khusus kami menggunakan analisis laluan laluan untuk menyerlahkan 19 DEG yang berkaitan dengan kluster berfungsi: metabolisme, termasuk metabolisme Lipid (ALOX15, ACSL5, PLA2G4C, dan B4GALT6), Metabolisme tenaga (CA9 dan NDUFA4L2) , Metabolisme kofaktor dan vitamin (TH, LIPT2, dan FTCD), metabolisme asid amino(RRM2, AZIN2, DCT, ALAS2, dan MAT1A), biosintesis dan metabolisme Glycan (HS6ST3 dan GUSB), dan metabolisme karbohidrat"(HKDC1, PCK1, UGDH, dan ABAT). 19 DEG yang diperkaya untuk metabolisme ini terlibat terutamanya dalam kepekaan insulin, pengumpulan lipid, penyimpanan glikogen, dan perbelanjaan tenaga. Kajian terdahulu melaporkan bahawa pengawalan ke bawah ALOX15 dalam kerosakan hati tikus akibat alkohol[18], CA9 dalam tikus BALB/C [19], penyakit hati berlemak bukan alkohol (NAFLD) [20], HKDC1[21], dan pengawalseliaan UGDH [22] dengan ketara boleh melegakan tekanan oksidatif, pengumpulan lipid dan kerosakan hati. Penghancuran NDUFA4L2 menindas akumula ROS tion dan apoptosis dalam sel karsinoma hepatoselular (HCC) [23]. Penyenyapan RRM2 menghalang percambahan sel NCI-H929 [24], dan overexpression FTCD menyekat percambahan sel dengan menggalakkan kerosakan DNA dan mendorong apoptosis sel dalam sel HCC [25]. Ablasi ACSL5 meningkatkan sensitiviti insulin meningkatkan perbelanjaan tenaga, dan melambatkan penyerapan trigliserida pada tikus [26]. Suplemen DCT meningkatkan steatosis dan keradangan hati yang berkaitan dengan usia [27]. Pembentukan titisan lipid apabila asid lemak dan rangsangan virus hepatitis C dalam sel knockdown PLA2G4C telah terjejas [28]. Peraturan turun LIPT2 menghalang sintesis asid lemak [29]. Pengawalseliaan ABAT [30], AZIN2 [31], B4GALT6 [32], HS6ST3 [33], dan GUSB [34] boleh menggalakkan dekomposisi asid lemak dan glikogen. Ekspresi berlebihan ALAS2 boleh meningkatkan kapasiti hematopoietik hati [35l, dan MAT1A yang dinyatakan dalam hepatosit mengekalkan keadaan dibezakan sel-sel ini [36]. Selaras dengan penemuan yang diterangkan di atas, peraturan gen metabolik ini dalam keputusan kami mungkin menguntungkan untuk meningkatkan metabolisme sebagai tindak balas kepada naringenin.

Laluan isyarat PI3K-Akt mungkin menawarkan petunjuk untuk mekanisme molekul yang terlibat dalam metabolisme, keradangan, dan tekanan oksidatif [37], yang memainkan peranan penting dalam tindak balas terhadap naringenin. Laluan isyarat PI3K-Akt mempunyai kesan hiliran yang pelbagai pada metabolisme selular melalui sama ada pengawalan langsung pengangkut nutrien dan enzim metabolik atau kawalan faktor transkripsi yang mengawal ekspresi komponen utama laluan metabolik [38,39], termasuk metabolisme glukosa, biosintesis makromolekul, dan mengekalkan keseimbangan redoks. Telah dilaporkan bahawa pembungkaman PDGFRB menghalang pengaktifan dan percambahan sel stellate hepatik dan memperbaiki fibrosis hati [40]. Perencatan kolaboratif CSF1R dan FGFR2 dijangka meningkatkan kesan antitumor dengan mensasarkan pengelakan imun dan angiogenesis dalam persekitaran mikro tumor [41]. Mengetuk ITGB4 menindas glikolisis dalam fibroblas yang berkaitan dengan kanser [42]. Kejatuhan genetik PCK1 menghalang kenaikan yang disebabkan oleh asid lemak dalam fluks oksidatif, tekanan oksidatif, dan keradangan [43], yang juga dikaitkan dengan laluan isyarat yang dikawal oleh insulin [44]. Telah ditunjukkan bahawa overexpression CREB3L3 nuklear menyebabkan lipolisis sistemik, ketogenesis hepatik, dan sensitiviti insulin dengan peningkatan perbelanjaan tenaga [45]. Perencatan CREB3L1 dilaporkan menyekat pencerobohan kanser dan metastasis [46]. NFkB ialah pengawal selia utama pembangunan imun, tindak balas imun, keradangan, dan kanser [47]. Telah terbukti bahawa penindasan NFkB trans-menghasilkan isyarat anti-radang dan mengurangkan keradangan [48]. Dalam laluan isyarat PI3K-Akt, keputusan kami menunjukkan bahawa naringenin merendahkan secara ketara ekspresi mRNA PDGFRB, PCK1, CREB3L1 dan NFkB1 dengan miRNA yang berkaitan (has-miR-1306-5p dan hsa-miR{{40} }p) dikawal dengan ketara. Oleh itu, data kami mencadangkan bahawa naringenin boleh memainkan peranan yang bermanfaat dalam tekanan anti-radang, anti-oksidatif, dan metabolisme amelioratif melalui perencatan laluan isyarat PI3K-Akt.

Kajian ini adalah yang pertama untuk mengintegrasikan analisis mRNA-seq dan miRNA-seq dalam hati sebagai tindak balas kepada naringenin dan memberikan perspektif metabolisme dalam peraturan naringenin. Dari segi metabolisme dan laluan isyarat PI3K-Akt, pasangan 11 DEM, 30 DEG dan 20 miRNA-mRNA memerlukan lebih banyak penyelidikan untuk aktiviti naringenin. Terdapat beberapa batasan kajian ini; contohnya, kesan naringenin yang bergantung kepada dos dan bergantung kepada masa dalam interaksi miRNA-mRNA masih tidak jelas. Walaupun diberi miRNA yang dianalisis dalam silico mencadangkan kapasiti pengawalseliaan, fungsinya perlu diperakui lagi dalam konteks tertentu dalam sistem hidup. Ringkasnya, kami menyediakan penyelidikan awal yang menganalisis mRNA dan ekspresi miRNA dan pemprofilan metabolisme. Mekanisme pengawalseliaan pasangan miRNA-mRNA boleh menjadi bukti tambahan yang mungkin untuk menganotasi nilai nutraseutikal naringenin.

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Bahan Kimia dan Reagen

Talian sel HepaRG pada asalnya dibeli daripada Biopredic International (Rennes, Perancis). Penyelesaian sederhana RPMI-1640 dan penicillin-streptomycin-glutamin diperoleh daripada Gibco (Gaithersburg, MD, USA). Fetal bovine serum (FBS) dibeli dari Corning (Auckland, New Zealand). Naringenin dan dimetil sulfoksida (DMSO) adalah daripada Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA). Reagen TRIzolTM dibekalkan oleh Thermo Fisher (Carlsbad, CA, USA). Air ultratulen telah disucikan oleh sistem penulenan air akademik Milli-O (Millipore, Bedford, MA, USA). Semua reagen lain adalah produk yang dikomersialkan dengan gred analisis tertinggi yang ada.

4.2. Kultur Sel HepaRG

Sel HepaRG telah disemai pada 5× 10*sel/cm- dalam plat enam perigi dan ditanam dalam medium RPMI-1640, dikultur dengan atau tanpa 100 uM naringenin selama 48 jam, dan ditambah dengan 10 peratus FBS dan 1 peratus antibiotik (100 U/mL penisilin dan 100 ug/mLstrepto-mycin) pada 37 darjah dalam 5 peratus CO yang dilembapkan, inkubator. CK-1, CK-2, CK-3 dan CK-4 merujuk kepada kumpulan semakan kawalan; T-1, T-2, T-3 dan T-4 merujuk kepada kumpulan rawatan naringenin 100 μM. Nombor 1, 2, 3, dan 4 mewakili sampel daripada empat eksperimen berulang bebas.

4.3. Jumlah Pengekstrakan RNA

Sel HepaRG telah dibasuh dua kali dengan garam penimbal fosfat ais sejuk (PBS) dan dituai dengan reagen TRIzolTM seperti yang disyorkan oleh pengilang. Thermo Scientific NanoDropTM2000 c Spectrophotometers (Wilmington, DE, USA) digunakan untuk mengukur kualiti dan kuantiti RNA setiap sampel mengikut protokol pengeluar.

4.4.Penjujukan RNA

MRNA diperkaya oleh manik Oligo(dT), kemudian mRNA yang diperkaya dipecah-pecah dan ditranskrip terbalik ke dalam cDNA dengan primer rawak oleh kit pengekstrakan PCR OiaOuick (Qiagen, Venlo, Belanda). Molekul RNA dalam julat saiz 18-30 nt telah diperkaya oleh elektroforesis gel poliakrilamida. Penyesuai 3'dan 5' telah ditambah, kemudian RNA yang diperkaya telah ditranskrip terbalik oleh kit pengekstrakan PCR QiaQuick, mengikut arahan pengeluar (Qiagen, Venlo, Belanda). Produk pengikatan telah dipilih saiz oleh elektroforesis gel agarose. Terdapat empat sampel dalam kumpulan naringenin dan empat sampel dalam kumpulan kawalan. Setiap sampel menghasilkan dua perpustakaan cDNA: satu untuk mRNA-seq dan satu lagi untuk miRNA-seg. Produk yang dikuatkan PCR telah diperkaya untuk masing-masing menjana 16 perpustakaan cDNA dan disusun menggunakan Ⅲlumina HiSeq2500 oleh Genedenovo Biotechnology Co. (Guangzhou, China). Data penjujukan RNA dan RNA kecil telah disimpan dalam Arkib Bacaan Urutan NCBI (nombor penyertaan dari SRR13675952 hingga SRR13675963).

4.5. qPCR Masa Nyata

Transkripsi mRNA ke dalam cDNA telah dijalankan dengan Sistem Transkripsi Terbalik GoScriptTM (Promega, Madison, WI, USA) daripada 3 ugs jumlah RNA, mengikut arahan pengeluar. Untuk analisis miRNA, sintesis cDNA dilakukan dengan Sintesis cDNA First Strand miRNA (Tailing Reaction, Sangon Biotech, Shanghai, China) daripada 2 ugs jumlah RNA.

dengan GoTaq® qPCR Master Mix（Promega, Madison, WI, USA) pada LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Jerman), seperti yang disyorkan oleh pengilang. Prosedur kitaran haba bermula dengan denaturasi awal pada 95C selama 10 minit. Ini diikuti oleh 45 kitaran denaturasi selama 10s pada 95 darjah, pengikatan primer selama 20 saat pada 60 darjah, dan pemanjangan selama 20 sat 72 darjah. Prosedur ini berakhir dengan penguatan akhir pada 95 darjah selama 5s, 65 darjah C selama 1 minit, penambahan langkah lengkung disosiasi, dan langkah penyejukan. Primer dibeli daripada Sangon Biotech (Shanghai, China). Urutan pasangan primer yang digunakan untuk pengesahan tandatangan diterangkan dalam Jadual 3 dan4. Ct-nilai dikira merujuk kepada -actin atau U6.

4.6.Analisis dan Statistik Bioinformatik

DEG dan DEM telah dikenal pasti menggunakan pakej perisian berasaskan R. Nilai ambang untuk pemilihan DEG dan DEM ialah nilai q (nilai p terlaras) Kurang daripada atau sama dengan 0.0Perubahan 5 dan lipatan (FC) Lebih besar daripada atau sama dengan 2 atau Kurang daripada atau sama dengan 0.5. Klasifikasi KEGG dan GO termasuk fungsi molekul, proses biologi, dan komponen selular digunakan untuk menganalisis DEG dan DEM.

Keputusan ujian biologi dibentangkan dalam bentuk min ± SD berdasarkan empat eksperimen bebas dalam GraphPad Prism 8.

Bahan Tambahan: Perkara berikut boleh didapati dalam talian di https://www.mdpi.com/1422-0 067/22/5/2292/s1: Jadual S1, Pengenalpastian 1037 mRNA yang dinyatakan secara berbeza sebagai tindak balas kepada naringenin; Jadual S2, Pengenalpastian 234 miRNA yang dinyatakan secara berbeza sebagai tindak balas kepada naringenin; Jadual S3, Pengenalpastian 5607 pasangan miRNA-mRNA negatif sebagai tindak balas kepada naringenin, dengan penglibatan 216 DEM dan 681 DEG secara keseluruhan

Rujukan

1. Salehi, B.; Fokou, PVT Potensi Terapeutik Naringenin: Tinjauan Percubaan Klinikal. Farmaseutikal 2019, 12, 11. [CrossRef] [PubMed]

2. Bai, Y.; Peng, W.; Yang, C.; Zou, W.; Liu, M.; Wu, H.; Kipas, L.; Bibir.; Zeng, X.; Su, W. Farmakokinetik dan Metabolisme Naringin dan Metabolit Aktif Naringenin dalam Tikus, Anjing, Manusia dan Perbezaan Antara Spesies. Depan. Pharmacol. 2020, 11, 364. [CrossRef]

3. Joshi, R.; Kulkarni, YA; Wairkar, S. Aspek farmakokinetik, farmakodinamik dan formulasi Naringenin: Kemas kini. Life Sci. 2018, 215, 43–56. [CrossRef]

4. Hernández-Aquino, E.; Muriel, P. Kesan berfaedah naringenin dalam penyakit hati: Mekanisme molekul. Dunia J. Gastroenterol. 2018, 24, 1679–1707. [CrossRef]

5. Wang, Q.; Ou, Y.; Peluk.; Wen, C.; Yue, S.; Chen, C.; Xu, L.; Xie, J.; Dai, H.; Xiao, H.; et al. Naringenin melemahkan penyakit hati berlemak bukan alkohol dengan mengawal selia laluan NLRP3/NF-κB pada tikus. Br. J. Pharmacol. 2020, 177, 1806–1821. [CrossRef]

6. Khan, TH; Ganaie, MA Naringenin menghalang ketoksikan yang disebabkan oleh doxorubicin dalam tisu buah pinggang dengan mengawal penghinaan oksidatif dan keradangan dalam tikus Wistar. Gerbang. Fisiol. Biokim. 2020, 126, 300–307. [CrossRef]

7. Wang, J.; Ding, Y.; Zhou, W. Albumin liposom yang diubah suai sendiri untuk terapi fibrosis hepatik melalui laluan yang bergantung kepada SPARC. Int. J. Pharm. 2020, 574, 118940. [CrossRef]

8. Kometsi, L.; Govender, K.; Mofo Mato, EP; Hurchund, R.; Owira, PMO Dengan mengurangkan tekanan oksidatif, naringenin mengurangkan regulasi yang disebabkan oleh hiperglikemia bagi protein faktor 2 berkaitan erythroid 2-hepatik nuklear. J. Pharm. Pharmacol. 2020, 72, 1394–1404. [CrossRef] [PubMed]

9. Rossino, MG; Casini, G. Nutraseutikal untuk Rawatan Retinopati Diabetik. Nutrien 2019, 11, 771. [CrossRef] [PubMed]

10. Hernández-Aquino, E.; Quezada-Ramírez, MA; Silva-Olivares, A.; Casas-Grajales, S.; Ramos-Tovar, E.; Flores-Beltrán, RE; Segovia, J.; Shibayama, M.; Muriel, P. Naringenin melemahkan perkembangan fifibrosis hati melalui penyahaktifan sel stellate hepatik dan laluan profifibrogenik. Eur. J. Pharmacol. 2019, 865, 172730. [CrossRef] [PubMed]