Keberkesanan Antioksidan Hasil Sampingan Pemakanan Pada Ekspresi Gen CYP Terinduksi Dan Pengubahan Histologi dalam Hati Babi Dan Buah Pinggang Yang Diberi Aflatoksin B1 Dan Ochratoxin A
Feb 26, 2022
Abstrak:Tujuan kajian ini adalah untuk menyiasat potensi campuran hasil sampingan yang diperoleh daripada industri minyak biji anggur dan buckthorn laut untuk mengurangkan kerosakan berbahaya yang dihasilkan oleh ochratoxin A dan aflatoksin B1 pada hepatik danbuah pinggangtahap dalam anak babi selepas bercerai susu. Empat puluh anak babi hibrid TOPIGS{1}} kacukan selepas dicerai susu telah diperuntukkan kepada tiga kumpulan eksperimen (E1, E2, E3) dan satu kumpulan kawalan (C), dan diberi makan dengan diet percubaan selama 30 hari. Pemakanan asas dihidangkan sebagai kawalan dan mengandungi makanan kompaun biasa untuk babi pemula tanpa mikotoksin. Kumpulan eksperimen diberi makan seperti berikut: E1—diet basal ditambah campuran (1:1) dua produk sampingan (makanan biji anggur dan buckthorn laut); E2—diet asas yang tercemar secara eksperimen dengan mikotoksin (479 ppb OTA dan 62ppb AFB1); dan E3—pemakanan asas yang mengandungi 5 peratus daripada campuran (1:1) biji anggur dan makanan buckthorn laut dan tercemar dengan campuran OTA dan AFB1. Selepas 4 minggu, haiwan itu disembelih, dan sampel tisu diambil dari hati dan buah pinggang untuk melakukan ekspresi gen dan analisis histologi. Analisis ekspresi gen menunjukkan bahawa apabila anak babi yang disapih diberi makan dengan diet yang tercemar, ekspresi kebanyakan gen yang dianalisis telah dikurangkan. Di antara keluarga CYP450, CYP1A2 adalah gen yang mempunyai downregulation tertinggi. Menurut keputusan ini, dalam hati, kami mendapati bahawa mikotoksin menyebabkan perubahan histomorfologi dalam hati danbuah pinggangdan mempunyai kesan ke atas tahap ekspresi CYP1A2, CYP2A19, CYP2E1, dan CYP3A29, tetapi kami tidak mengesan perubahan penting dalam tahap ekspresi gen CY4A24, MRP2 dan GSTA1.
Kata kunci: anak babi; kesan antioksidan; aditif makanan; mikotoksin; ekspresi gen CYPs; buah pinggang; buah pinggang
pengenalan
Mikotoksin ialah metabolit toksik sekunder yang dihasilkan oleh strain tertentu kulat berfilamen. Sebatian berat molekul rendah ini (sehingga 500 Da) boleh mencemari pelbagai bahan mentah dan menyebabkan peningkatan risiko kepada kesihatan manusia dan haiwan [1]. Bilangan mikotoksin yang dicirikan dan dengan kesan yang terkenal adalah agak kecil disebabkan oleh banyak metabolit dengan potensi toksik yang dihasilkan oleh kulat [2-4]. Mereka dikelaskan kepada lima kumpulan, dengan struktur kimia tertentu yang kerap berlaku dalam makanan dan makanan: trichothecenes, zearalenone, ochratoxins, fumonisins, dan aflatoksin. Kulat penghasil mikotoksin yang terdapat dalam makanan dan makanan terbahagi kepada dua kumpulan: mereka yang menyerang sebelum penuaian bijirin, dipanggil kulat lapangan, dan mereka yang tumbuh hanya selepas penuaian, dipanggil kulat penyimpanan [5]. Di peringkat Eropah, terdapat peraturan dan cadangan mengenai tahap maksimum yang diterima untuk enam jenis mikotoksin yang biasa ditemui dalam makanan babi: aflatoksin, fumonisin, ochratoxin, deoxynivalenol, toksin T2, dan zearalenone [6-8]. Di antara spesies haiwan ternakan, babi sangat sensitif terhadap mikotoksin kerana pendedahannya kepada makanan ternakan berasaskan bijirin [9]. Metabolisme babi tidak berkesan dalam menyahtoksik dan mengeluarkan mikotoksin, yang meningkatkan risiko mikotoksikosis. Kecenderungan ini juga berbeza mengikut umur, kepekatan mikotoksin dalam makanan, dan tempoh pendedahan. Hati adalah organ yang paling terjejas oleh pengambilan toksin ini [10]. Tambahan pula, toksin ini meningkatkan kebolehtelapan penghalang epitelium usus dalam babi dan ayam, yang boleh menjana kecenderungan untuk enteritis nekrotik [11] dan penurunan imuniti semula jadi.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI FUNGSI BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
Aflatoksin mewakili mikotoksin yang paling banyak terdapat dalam bahan makanan, biji minyak, bijirin, susu, tanah, haiwan dan manusia. Semua jenis aflatoksin berasal daripada spesies kulat yang tergolong dalam genus Aspergillus dan dianggap antara mikotoksin yang paling berbahaya untuk haiwan dan manusia [4, 10 – 17]. Seperti yang dinyatakan di atas, dalam anak babi yang menyusu dan babi yang sedang membesar, siap dan membiak, kesan biologi utama aflatoksin ialah kekarsinogenan, imunosupresi, mutagenisiti, teratogenisiti, penurunan kecekapan penyusuan dan pertambahan berat badan yang lemah, hati terjejas, dan parameter biokimia serum yang diubah [18, 19] . Kesan yang teruk dalam babi boleh menyebabkan hepatitis akut, pendarahan sistemik, nefrosis, dan kematian [20], serta penurunan daya tahan terhadap tekanan [21]. Sesetengah pengarang juga telah menunjukkan bahawa babi yang diberi makan dengan aflatoksin tahap rendah menunjukkan tanda-tanda edema pulmonari, mengurangkan penggunaan makanan dan penambahan berat badan, dan penurunan dalam aktiviti enzimatik yang terlibat dalam dekarboksilasi oksidatif, serta jumlah protein serum, tekanan darah, dan jumlah kiraan leukosit [18, 22-24]. Dalam konteks ini, menurut Arahan Suruhanjaya Eropah 2003/100/EC, paras maksimum aflatoksin B1 (AFB1) yang diterima untuk babi ditetapkan pada 0.02 mg/kg. Ochratoxins adalah metabolit sekunder yang dihasilkan oleh spesies kulat yang tergolong dalam genus Aspergillus dan Penicillium. Pendapat yang berbeza mengenai mekanisme genotoksik atau nongenotoksik ketoksikan ochratoxins telah diterbitkan [25, 26]. Kajian in vitro dan in vivo mendedahkan bahawa penambahan DNA khusus guanine-OTA berterusan selama lebih daripada 16 hari padabuah pinggangtahap, manakala dalam hati dan limpa, mereka dikeluarkan selepas 5 hari [27]. Disebabkan ini, kesan toksik dan karsinogenik utamanya telah dikenakanbuah pinggang[28].
Kebanyakan metabolit ochratoxin daripada detoksifikasi Fasa I dan Fasa II mempunyai ketoksikan yang rendah. Di dalam perut, sebahagian daripada ochratoxin dihidrolisiskan kepada ochratoxin oleh enzim proteolitik. Satu lagi kemungkinan untuk hidrolisis mereka ialah pembukaan cincin lakton di bawah keadaan alkali usus, dengan itu menghasilkan sebatian dengan ketoksikan yang tinggi. Oleh kerana pengikatan yang kuat kepada albumin, penyingkiran ochratoxin melalui penapisan glomerular adalah diabaikan, dengan perkumuhan terutamanya melalui rembesan tiub. Penyerapan tiub dianggap sebahagiannya bertanggungjawab untuk pengumpulan intraselular ochratoxin [29,30]. Secara amnya, dalam haiwan ternakan, ochratoxin cepat diserap selepas pengingesan melalui saluran gastrousus (perut dan bahagian proksimal jejunum) secara pasif, yang disukai oleh pertalian tinggi pengikatan ochratoxin kepada protein plasma, dan dalam bentuk tidak terion. , yang menerangkan kegigihan mereka dalam badan. Dalam serum babi, ochratoxin mengikat lebih khusus kepada protein dengan jisim molekul kurang daripada 20 kDa, membolehkan mereka melalui membran bawah tanah glomerular dan memberikan kesan nefrotoksik. Ochratoxin juga terkumpul dalam hati dan otot. Walau bagaimanapun,buah pinggangadalah tapak utama penyimpanan ochratoxin, dengan penyerapan semula di tubul proksimal dan distal menyumbang kepada kegigihan badan dan peningkatan nefrotoksisiti [27,31]. Sebaliknya, apabila AFB1 diserap pada peringkat usus, ia mencapai hati di mana ia diubah oleh enzim metabolisme Fasa I melalui hidroksilasi, penghidratan, demetilasi dan epoksidasi. Tiga tindak balas pertama menjana metabolit tidak toksik, manakala yang keempat menghasilkan AFB1-8,9 epoksida yang membentuk adduct dengan DNA di tapak N7 guanin [32]. Juga, AFB1 boleh digabungkan dengan glutation terkurang dalam tindak balas yang dimangkinkan oleh glutathione-S-transferases [33] dan asid glukuronik [34]. Perkumuhan AFB1 berlaku terutamanya melalui laluan hempedu, diikuti oleh laluan kencing [35].
Salah satu kesukaran utama yang dihadapi dalam mengawal mikotoksin ialah lebih daripada satu jenis mikotoksin terdapat dalam kumpulan makanan ternakan atau bijirin pada masa yang sama. Oleh itu, memberi makan anak babi dan babi dengan makanan tercemar dengan beberapa jenis mikotoksin, walaupun ia berada dalam kepekatan minimum, boleh menyebabkan banyak akibat negatif kerana kesan sinergistiknya [36-40]. Dalam konteks ini, mengurangkan dan menghapuskan kesan negatif mikotoksin yang terdapat dalam makanan babi boleh mengurangkan kos pengeluaran dan kerugian dalam industri babi. Sehingga kini, banyak strategi telah dibangunkan untuk mencegah, mengurangkan, atau bahkan menghapuskan pencemaran mikotoksin daripada makanan haiwan melalui kaedah detoksifikasi biologi, kimia dan fizikal. Kaedah ini membenarkan degradasi mikotoksin dan metabolitnya yang sepadan dan mengekalkan nilai pemakanan makanan tanpa memasukkan bahan lain yang berpotensi toksik ke dalam sistem biologi [6,14,41]. Dekontaminasi biologi mikotoksin menggunakan perencatan kompetitif oleh strain kulat lain atau penambahan sebatian antioksidan dalam makanan haiwan untuk mengurangkan kesan toksik mikotoksin dan/atau untuk menghalang pertumbuhan spesies kulat penghasil mikotoksin merupakan penyelesaian yang baik. Kaedah yang paling banyak digunakan untuk mengatasi kesan negatif mikotoksin pada haiwan ternakan ialah menambahkan "pengikat mikotoksin" atau "pengubah suai mikotoksin," yang merupakan aluminosilikat dengan struktur berliang yang mampu menjerap dan memerangkap mikotoksin [42-44]. Mereka sangat berkesan untuk aflatoksin dan mempunyai aktiviti terhad terhadap jenis mikotoksin lain. Walau bagaimanapun, sebagai tidak spesifik, mereka juga mengikat vitamin dan unsur surih, menghasilkan kekurangan [45-47]. Menambah beberapa antioksidan yang berasal dari tumbuhan dalam makanan boleh menjadi penyelesaian yang lebih baik [48] untuk mengurangkan kesan buruk mikotoksin pada kesihatan haiwan.
Enzim sitokrom P450, terutamanya terdapat dalam hati, saluran usus, danbuah pinggang,memainkan peranan penting dalam biotransformasi fasa I xenobiotik, terutamanya yang dimiliki oleh keluarga 1 dan 3 [49]. Mikotoksin boleh menjadi substrat, perencat, atau induktor enzim metabolisme ini. Perubahan dalam aktiviti khusus dan kebolehdorongan cytochromes P450 akhirnya akan menentukan perubahan relatif dalam metabolisme xenobiotik. Mikotoksin boleh mengubah ekspresi gen protein ini, membawa kepada penyerapan yang diubah dan biotransformasi nutrien dan ubat substrat lain daripada makanan. Disebabkan ini, tujuan kajian ini adalah untuk menyiasat potensi campuran produk sampingan yang diperoleh daripada industri minyak Vitis vinifera (biji anggur) dan Hippophae rhamnoides (buckthorn laut) untuk mengurangkan kerosakan berbahaya yang dihasilkan oleh kehadiran ochratoxin A (OTA) bersamaan. dan aflatoksin B1 (AFB1) dalam makanan di hepatik danbuah pinggangtahap dalam anak babi selepas bercerai susu.
Keputusan
Komposisi DietKomposisi kimia makanan hasil sampingan menunjukkan bahawa makanan laut buckthorn lebih kaya dengan protein (tambah 38.4 peratus), lemak (tambah 66.6 peratus), dan karbohidrat serta lebih rendah dalam abu daripada tepung biji anggur (Jadual 1).
Analisis kimia juga menunjukkan profil berbeza bagi dua produk sampingan dalam asid lemak, flavonoid, asid fenolik dan mineral. Oleh itu, hidangan laut buckthorn mempunyai kandungan asid lemak tepu (palmitik dan palmitoleik), asid omega-9 (asid cis oleik) dan asid omega-3 (-asid linolenik) yang lebih tinggi daripada makanan biji anggur. . Sebaliknya, makanan biji anggur mempunyai kandungan asid omega-6 (asid linoleik) yang sangat tinggi (67.35 peratus berbanding 18.59 peratus dalam makanan buckthorn laut) (Jadual 2).
Kedua-dua produk sampingan mengandungi flavonoid dan asid fenolik, sebatian bioaktif yang terkenal dengan sifat antioksidan, anti-radang dan imunomodulatornya [50, 51]. Oleh itu, jumlah kepekatan polifenol adalah 74.8 peratus lebih tinggi dalam tepung biji anggur (133.84 mg GAE/L) berbanding buckthorn laut (76.57 mg GAE/L). Mengenai kelas polifenol yang berbeza, tepung biji anggur mengandungi kepekatan katekin dan asid vanillik yang lebih tinggi daripada buckthorn laut, manakala buckthorn laut lebih kaya dengan rutin, kuersitrin, luteolin, asid p-kuumarik, dan asid ferulik (Jadual 3). Mengenai komposisi mineral, makanan buckthorn laut mempunyai kandungan K, Mg, Fe, Mn, dan Zn yang lebih tinggi daripada makanan biji anggur. Sebaliknya, makanan biji anggur mengandungi tembaga dua kali lebih banyak daripada makanan buckthorn laut. Yang perlu diperhatikan ialah kepekatan tinggi zat besi daripada hidangan buckthorn laut (Jadual 4).
Persembahan Haiwan
Pendedahan anak babi daripada kumpulan E2 kepada campuran ochratoxin ditambah aflatoksin B1 tidak mempunyai kesan buruk terhadap berat badan, penambahan berat badan, dan pengambilan makanan, kerana perbezaannya tidak ketara berbanding dengan kawalan. Sebaliknya, pemberian diet yang mengandungi campuran produk sampingan sahaja (E1) meningkat dengan ketara berat badan anak babi yang diberi diet ini jika dibandingkan dengan kawalan (32.14 ± 1.63 berbanding 27.09 ± 1.31) dan kepada kumpulan E2, yang diberi makan yang tercemar. diet (32.14 ± 1.63 berbanding 28.72 ± 1.07). Perlu diingatkan bahawa kumpulan anak babi yang menerima makanan tercemar dan campuran produk sampingan mempunyai kecenderungan untuk menambah berat badan berbanding kumpulan anak babi yang mabuk mikotoksin, walaupun perbezaannya tidak ketara. Analisis parameter biokimia, yang mencirikan keadaan umum kesihatan haiwan dan kefungsian hati danbuah pinggang, mencatatkan nilai normal untuk kategori umur dan berat anak babi yang diputuskan susu. Tiada perbezaan yang ketara dikenal pasti antara kumpulan bagi kebanyakan mereka (Jadual 5). Walau bagaimanapun, campuran mikotoksin meningkatkan aktiviti ALP dan gamma GT berbanding kawalan dan penurunan aktiviti dalam tahap kawalan dalam kumpulan E3 yang menerima campuran hasil sampingan.
Histologi Hati dan Buah PinggangAnalisis mikroskopik cahaya hati dari kumpulan E2, diberi makan dengan diet basal yang tercemar dengan campuran OTA dan AFB1, menunjukkan kawasan tumpuan nekrosis, dilatasi sinusoid, dan penyusupan parenkim radang. Kawasan portal mendedahkan penyusupan selular mononuklear dan fibrosis periportal. Septa fibrotik perilobular fibrotik juga diperhatikan (Rajah 1)
Pentadbiran mikotoksin menyebabkan perubahan struktur dalambuah pinggangyang menjejaskan kedua-dua korteks dan medula. Atrofi jumbai glomerular dan perubahan kapsul Bowmann telah diperhatikan (Rajah 2). Tubul menunjukkan nekrosis lapisan sel epitelium dengan penyusupan sel radang di antaranya. Agregat fokus sel-sel radang diperhatikan di antara glomeruli dan tubulus dalam hubungan dengan kawasan tumpuan kesesakan dalam saluran darah, terutamanya di kawasan medulla. Nampaknya, percambahan kolagen terutamanya diperhatikan di kawasan kecederaan tiub. Tambahan pula,buah pinggangbahagian dari kumpulan E3, kumpulan yang diberi makan dengan diet asas yang mengandungi campuran biji anggur dan makanan buckthorn laut dan tercemar dengan campuran OTA dan AFB1, mendedahkan perubahan patomorfologi kecil, hampir serupa dengan kawalan.
Dalam hati, ekspresi gen untuk CYP1A2 masing-masing menurun sebanyak 18 peratus untuk E2 dan 44 peratus untuk E3, berbanding kumpulan E1. Ekspresi gen CYP2A19 tidak diubah suai dalam kumpulan E1 dan E2, manakala dalam kumpulan E3, ia menurun hampir 62 peratus . Peningkatan ketara sebanyak 29 peratus telah diperhatikan dalam ekspresi gen CYP2E1 dalam kumpulan E1 yang diberi makanan asas yang ditambah dengan campuran biji anggur dan makanan buckthorn laut berbanding kumpulan E2. Sebaliknya, pentadbiran diet basal yang diperkaya dengan campuran biji anggur dan makanan buckthorn laut (kumpulan E1) mengurangkan ekspresi gen CYP3A29 sebanyak 24 peratus berbanding tahap kumpulan E2. Satu lagi kontras diperhatikan dalam ekspresi gen CYP4A24, dengan penurunan 33 peratus untuk kumpulan E1 dan penurunan 24 peratus untuk kumpulan E3, dan peningkatan 41 peratus yang ketara dalam kumpulan E2 yang diberi makan dengan diet asas ditambah dengan campuran AFB1 dan OTA, berbanding dengan tahap kawalan. Dalam kes MRP2, corak ekspresi gen adalah serupa dengan gen CYP4A24, dengan penurunan 35 peratus yang tidak ketara untuk kumpulan E1 dan penurunan 24 peratus untuk kumpulan E3, dan peningkatan 28 peratus yang ketara dalam kumpulan E2, berbanding ke tahap kawalan. Begitu juga, kepada ekspresi gen CYP4A24, ekspresi gen GSTA1 menunjukkan peningkatan 14 peratus yang ketara dalam kumpulan E2, peningkatan 9 peratus dalam kumpulan E1, dan penurunan 30 peratus untuk kumpulan E3. Jelas sekali, pentadbiran serentak campuran biji anggur dan hidangan buckthorn laut dan OTA dan AFB1 menghasilkan penurunan semua ekspresi gen yang dianalisis dalam hati berbanding dengan kawalan. Mengenai tahap ekspresi gen ini dalambuah pinggang,berbanding dengan sampel hati, tiada perubahan ketara secara statistik diperhatikan (Rajah 4). Walau bagaimanapun, perubahan dalam peraturan tahap ekspresi gen boleh diperhatikan.
Menganalisis Rajah 4, dapat dilihat bahawa campuran biji anggur dan makanan buckthorn laut merendahkan ekspresi gen CYP1A2 dan mengimbangi ekspresi gen CYP2A19, CYP2E1, CYP3A29, dan CYP4A24 dengan cara yang tidak penting, manakala ekspresi gen MRP2 dan GSTA1 kekal tidak berubah. . Juga, kehadiran OTA dan AFB1 dalam anak babi memberi makan ekspresi gen CYP1A2 dan CYP2A19 yang dikurangkan dengan cara yang tidak penting, manakala MRP2 dan GSTA1 tidak diubah suai. Pentadbiran serentak campuran biji anggur dan hidangan buckthorn laut dan OTA dan AFB1 menentukan pengembalian semua tahap ekspresi gen untuk mengawal tahap dengan pengecualian GSTA1, yang menunjukkan peningkatan penting berbanding kumpulan E1.
Perbincangan
Mikotoksin seperti AFB1 dan OTA adalah toksin semula jadi yang mencemari pelbagai jenis produk tumbuhan. Akibatnya, AFB1, OTA, dan metabolitnya terdapat dalam makanan dan makanan, serta dalam produk asal haiwan [52]. Kebanyakan kajian toksikologi mengenai kesan mikotoksin telah mempertimbangkan pendedahan kepada satu jenis mikotoksin tanpa mengambil kira gabungan dan interaksi antara mereka, masing-masing, kesan sinergistik atau antagonis yang sering berlaku di alam semula jadi. Data mengenai kesan toksik gabungan mikotoksin adalah terhad, jadi risiko pendedahan kepada beberapa jenis toksin masih tidak diketahui. Kejadian mikotoksin seperti AFB1, DON, ZEA, OTA, FB1, dan FB2 dalam bijirin, produk bijirin, dan bahan makanan pelengkap dan lengkap untuk babi [16] adalah berkaitan dengan lokasi geografi dan perubahan iklim, yang meningkatkan risiko yang berkaitan. dengan pencemaran mikotoksin semasa penyimpanan dan pemprosesan produk makanan untuk babi [53]. Pencemaran bersama bijirin dan bahan mentah lain berlaku lebih kerap dalam kehidupan sebenar daripada pencemaran mikotoksin tunggal [7]. Sebagai contoh, kejadian bersama aflatoksin B1 dan ochratoxin A telah ditemui dalam makanan atau bahan makanan yang berbeza, seperti gandum [54], barli [55], tepung bijirin [56], rempah [57], dan lain-lain. antara AFB1 dan OTA dalam suapan didapati kira-kira 1 hingga 6 [37]. Selain itu, kandungan suapan global dalam AFB1 dan OTA berkisar antara tidak ditentukan dan 100 ppb dan tidak ditentukan dan 211 ppb, masing-masing [58]. Dalam konteks ini, untuk meniru keadaan lapangan, kami mengkaji kesan mikotoksin ini bersama-sama dan untuk menilai keberkesanan campuran produk sampingan dalam mengatasi kesan mikotoksin. Bahan tambahan semula jadi (biji anggur dan produk sampingan buckthorn laut) telah dipilih berdasarkan keupayaan mereka untuk memperbaiki mycotoxicosis apabila suplemen pemakanan [59,60].
Dalam kajian ini, pendedahan anak babi (kumpulan E2) kepada campuran mikotoksin tidak mempengaruhi prestasi haiwan (27.83 ± 1.1 berbanding 27.09 ± 1.3 untuk berat badan dan 1.48 ± 0 .9 lwn. 1.40 ± 0.8 untuk pengambilan suapan) dan parameter biokimia jika dibandingkan dengan kawalan. Begitu juga, Balogh et al. [61] melaporkan bahawa anak babi yang diberi makan dengan kira-kira 0.4 mg/kg OTA semasa tempoh pemula (0-28 hari) dan penanam (29-49 hari) tidak mencatatkan perubahan ketara dalam ciri pengeluaran dan tanda klinikal ketoksikan dalam penanam. fasa. Sebaliknya, penurunan berat badan yang ketara diperhatikan semasa tempoh permulaan apabila haiwan lebih sensitif. Dalam kajian ini, kemasukan diet campuran produk sampingan sahaja mempunyai pengaruh yang ketara ke atas prestasi haiwan (kumpulan E1) dan cenderung untuk meningkatkan berat anak babi apabila campuran dikaitkan dengan makanan tercemar (kumpulan E3).
Dari sudut toksikologi, OTA diklasifikasikan oleh IARC (International Agency for Research on Cancer) dalam kumpulan yang sama (2B) bahan karsinogenik untuk manusia, mempunyai ketoksikan yang sama dengan AFB1 [62]. Corak toksikokinetik penyerapan, pengedaran, dan penyingkiran untuk mikotoksin ini, sebahagian besarnya, dijelaskan sepenuhnya. Sebaliknya, walaupun terdapat kemajuan baru-baru ini, pengetahuan kami tentang langkah biotransformasi toksikokinetik tidak dijelaskan secara terperinci. Beberapa kajian telah menunjukkan bahawa AFB1 dan OTA dimetabolismekan oleh mikrosom hati daripada manusia, babi, dan tikus kepada beberapa epimer [63]. Perubahan dalam aktiviti khusus dan kebolehdorongan cytochromes P450 akhirnya menentukan perubahan relatif dalam metabolisme mana-mana xenobiotik.
Telah didapati bahawa pendedahan kepada AFB1 dan OTA mengurangkan ekspresi gen gen CYP1A2, CYP2E1, CYP3A29, dan MRP2 dalam hati babi dan mengakibatkan beberapa perubahan dalam histologi dan ultrastruktur hati, termasuk kawasan tumpuan nekrosis, dilatasi sinusoid, parenkim radang. penyusupan, dan fibrosis periportal. Mengenai tahap ekspresi gen isoform CYP450 dalam babibuah pinggang,tiada data tersedia dalam kesusasteraan saintifik. Gen CYP1A2, CYP2A19, CYP2E1, CYP3A29, CYP4A24, MRP2, dan GSTA1 telah dipilih untuk kajian ini kerana ia menyandikan protein dengan aktiviti enzim atau fungsi pengangkut yang terlibat dalam Fasa I dan Fasa II biotransformasi dan detoksifikasi xenobiotik reaktif untuk membentuk elektrofilik reaktif. metabolit [64]. Menurut keputusan ini, nampaknya pentadbiran produk sampingan menentukan penurunan dalam ekspresi gen CYP1A2 dan peningkatan dalam ekspresi gen GSTA1. Keputusan yang sama telah diperhatikan dalam sel kanser kolon manusia HT{17}} yang dirawat dengan ekstrak Salicornia freitagii, yang terkenal dengan aktiviti antioksidan dan anti-radangnya. Dalam kes ini, disebabkan kandungannya dalam fenol bioaktif, downregulation mRNA CYP1A2 dan upregulation mRNA GSTA1 berlaku [65]. Berbeza dengan keputusan kami, mRNA dan ekspresi protein CYP1A2 telah meningkat dalam hati babi yang diberi makan chicory [66]. Keputusan yang berbeza ini mungkin disebabkan oleh sebatian semula jadi yang berbeza yang terdapat dalam chicory berbanding dengan produk sampingan yang digunakan dalam kajian ini, terutamanya asid klorogenik, kafeik, dan p-kuumarik [67].
Sebaliknya, OTA dan AFB1 mungkin berinteraksi dengan dan mengaktifkan reseptor hidrokarbon aromatik, yang membawa kepada translokasi nuklearnya. Selepas heterodimerisasi, OTA dan AFB1 mungkin berinteraksi dengan translocator nuklear reseptor hidrokarbon, heterodimer, terikat kepada unsur-unsur responsif xenobiotik dan gen tertransaktivasi seperti CYP1A1, CYP1A2, dan GST [68]. Unsur tindak balas xenobiotik ini dikongsi antara gen CYP1A1 dan CYP1A2 [69], dan kedua-dua enzim yang dikodkan olehnya membentangkan kekhususan substrat yang bertindih [70]. Dalam hati babi, hanya terdapat aktiviti CYP1A2, dan jumlah relatifnya daripada jumlah CYP450 yang dikesan ialah 4 peratus [71]. Dalam hati manusia, AFB1 dan OTA adalah induktor untuk CYP1A1, 1A2, 2B6, 2C9, 3A4, dan 3A5 [72]. AFB1, serta pendedahan OTA, menjana disfungsi mitokondria yang dicirikan oleh peningkatan dalam pengeluaran ROS [14] yang boleh meningkatkan ekspresi TGF- 1 atau mengaktifkan TGF terpendam- 1 [ 73 ]. Dengan mengambil kira, bukti terdahulu bahawa TGF- 1 menurunkan ekspresi CYP1 pada manusia dan tikus, ada kemungkinan mekanisme yang sama [74] berlaku di bawah keadaan kami. Kesan pendedahan serentak kepada kedua-dua mikotoksin dan biji anggur dan produk sampingan buckthorn laut mungkin bersifat sinergistik, dan ekspresi CYP1A2 adalah lebih rendah dalam E3 berbanding E1, E2, dan kumpulan kawalan. CYP1A2 dinyatakan dalam tahap yang lebih rendah dalam tisu ekstrahepatik [75].
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI KEGAGALAN BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
Thebuah pinggangadalah anorgant yang menerima kira-kira 25 peratus daripada cardiacoutput dan membersihkan sisa metabolik dan xenobiotik daripada sistem peredaran darah. Semasa proses pelepasan ini, bahan toksik tertumpu di dalambuah pinggang[ 76 ]. Dalam anak babibuah pinggang, variasi ekspresi gen CYP1A2 adalah serupa dengan tahap ekspresi dalam hati untuk E1 dan E2. Menariknya, dalam kumpulan E3, ekspresi gen ini berada pada tahap yang lebih tinggi daripada kumpulan kawalan. Ini mungkin disebabkan oleh pengaktifan laluan isyarat bukan kanonikal untuk transkripsi AhR dalambuah pinggangsel [77]. Dalam hati babi, jumlah relatif CYP2A19 dan CYP2E1 mewakili 31 peratus masing-masing 13 peratus daripada jumlah CYP450 [71]. Gen babi CYP2A19 dan CYP2E1 bertanggungjawab untuk biotransformasi untuk sebatian endogen (skatole, hormon seks) serta sebatian exoge-nous (komponen makanan). Kedua-dua jenis sebatian sangat dinyatakan dalam hati dan kurang dalambuah pinggangdan tisu adiposa. Transkripsi CYP2A19 dikawal oleh faktor transkripsi CAR [78]. Ortolog manusianya, CYP2A6 dikawal oleh CAR, PXR, reseptor glukokortikoid (GR), reseptor estrogen, HNF 4 dan PGC-1 [79]. Selain itu, ekspresi hepatik konstitutif CYP2A6 dalam tikus dikawal oleh interaksi antara HNF 4 , protein pengikat CCAAT-box/enhancer (C/EBP , C/EBP ) dan faktor transkripsi oktamer-1 (Okt{{13} }) [ 80 ]. Sebelum ini, korelasi positif antara tahap mRNA dan protein untuk gen CYP2A19 telah diperhatikan [81]. Tidak seperti gen CYP 450 yang lain, CYP2A19 memainkan peranan yang kurang penting dalam metabolisme xenobiotik tetapi terlibat dalam tindak balas sel terhadap tekanan, Nrf-2, yang turut terlibat dalam transkripsi CYP2A19 [ 82 ]. Gen CYP2A19 mungkin sangat polimorfik berbanding dengan gen CYP2A6 [83], dan variasi antara individu yang meluas bagi produknya boleh berlaku. Kajian terdahulu mendedahkan bahawa ortolog P450 itik mamalia CYP2A6 dan CYP3A4 terlibat dalam bioaktivasi AFB1 ke dalam bentuk epoksidanya [84]. Tidak seperti keputusan ini, dalam kajian ini, tiada perubahan ketara ekspresi gen CYP2A19 telah diperhatikan dalam kumpulan E1 dan E2, mungkin disebabkan oleh tahap tinggi ekspresi gen ini dalam hati babi. Buat masa ini, sukar untuk menjelaskan mengapa pendedahan bersama kedua-dua mikotoksin dan campuran biji anggur dan hidangan buckthorn laut mengurangkan ekspresi CYP2A19. Walau bagaimanapun, penurunan ekspresi ini mengurangkan risiko penjanaan metabolit toksik.
Dalam babibuah pinggang,ungkapan CYP2A19 adalah lebih rendah berbanding dengan yang terdapat dalam hati [79]. Mungkin disebabkan ungkapan yang lebih rendah ini, pendedahan haiwan kepada campuran biji anggur dan makanan buckthorn laut menghasilkan penyelarasan ekspresi gen CYP2A19 yang disebabkan oleh Nrf-2 disebabkan oleh kandungan luteolin [85] dan asid ferulik [86] . Sebaliknya, terdapat bukti bahawa hanya dua faktor transkripsi, iaitu faktor transkripsi promoter hulu ovalbumin ayam (COUP-TF1) dan faktor nuklear hepatosit (HNF-1), terlibat dalam pengawalseliaan transkripsi CYP2E1 dalam babi. [87]. CYP2E1, seperti P450 yang memetabolismekan xenobiotik yang lain, terletak terutamanya dalam membran retikulum endoplasma (ER) dan boleh diinduksi di bawah pelbagai keadaan metabolik atau pemakanan. Tekanan ER boleh disebabkan oleh tekanan metabolik, yang disebabkan oleh kelebihan biosintesis protein/lipid, dan tekanan oksidatif, yang boleh mencetuskan laluan isyarat homeostatik kompleks yang dipelihara secara evolusi yang dikenali sebagai tindak balas protein terungkap (UPR) [88].
Berkemungkinan tahap mRNA CYP2E1 adalah lebih kurang sama dalam kumpulan E1 dan kawalan disebabkan oleh tindakan antagonis asid palmitik [89], asid linoleik dan -linolenik [90] yang meningkatkan transkripsi gen ini dan tindakan vanillic dan asid p-kuumarik yang mengurangkannya [65]. Baru-baru ini, telah terbukti bahawa makanan yang mengandungi OTA mengubah mikrobiota usus dalam itik, menjejaskan kepelbagaian dan komposisi mikrobiota cecum serta halangan usus. Akibatnya, lipopolisakarida yang berasal dari bakteria Gram-negatif memasuki darah dan hati, menyebabkan keradangan hati [91]. Dalam kes kecederaan hati pengantara imun, ekspresi CYP2E1 dikurangkan [92]. Keadaan ini boleh berlaku dalam kumpulan E2. Berkemungkinan kesan kumulatif dua mikotoksin dan produk sampingan pemakanan mengurangkan ekspresi CYP2E1 dalam hati kumpulan E3. Di dalambuah pinggang,asid lemak bebas, seperti palmitat, oleat, dan linoleat, disimpan dalam nefron [93], dan asid ini mungkin meningkatkan ekspresi gen CYP2E1 dalambuah pinggangkumpulan E1 berbanding dengan tahap kawalan. Menurut Pfohl-Leszkowicz dan Manderville [25], OTA membentuk tambah dengan DNA, menjanabuah pingganggenotoksisiti dan karsinogenesis. Berkemungkinan tahap tinggi OTA merangsang ekspresi gen CYP2E1 dalambuah pinggangkumpulan E2 berbanding dengan tahap kawalan. Dalam kumpulan E3, nampaknya penggunaan bersama kedua-dua mikotoksin dan produk sampingan pemakanan mempunyai kesan antagonis, dengan ekspresi gen CYP2E1 kembali ke tahap kawalan. Selain itu, penilaian histologi untuk kumpulan E3 menunjukkan bahawa campuran hasil sampingan yang diperoleh daripada biji anggur dan minyak buckthorn laut mengurangkan kerosakan berbahaya yang dihasilkan oleh aflatoxin B1 dan ochratoxin A pada hepatik danbuah pinggangtahap dalam anak babi selepas bercerai susu. CYP2E1, seperti P450 yang memetabolismekan xenobiotik lain, terutamanya terletak dalam membran ER dan boleh diinduksi di bawah pelbagai keadaan metabolik atau pemakanan [89]. Peraturan gen CYP2E1 dalam kumpulan E1 mungkin disebabkan oleh hidroksilasi sebatian terbitan coumarin yang dimangkinkan oleh enzim CYP2A, yang dianggap sebagai penunjuk khusus untuk kehadiran enzim CYP2 [94], dengan p-kuumarik. asid yang terdapat dalam biji anggur dan hasil sampingan buckthorn laut.
Dalam kes babi, sangat sedikit yang diketahui tentang kehadiran enzim CYP3As dalamtisu buah pinggang,dan tiada apa yang diketahui tentang kebolehdorongan mereka [95]. Beberapa gen telah dikenal pasti dalam subfamili CYP3A mamalia (contohnya, lima pada tikus dan empat pada manusia), tetapi ekspresi gen ini dalamtisu buah pinggangtelah kurang disiasat [96]. Dari segi ekspresi gen, Ayed-Boussema et al. (2012) [63] dan Gonzalez-Arias et al. [97] menerangkan peningkatan tahap ekspresi dalam semua sitokrom yang diuji (CYP3A4, 2B6, 3A5, dan 2C9) dalam budaya hepatosit manusia primer. Kajian terdahulu telah melaporkan pelbagai keputusan mengenai kesan AFB1 dan OTA dalam hepatosit manusia kultur primer di mana peningkatan kepekatan mikotoksin ini jelas menyebabkan tahap mRNA CYP3A4 dan CYP2B6 dalam cara yang bergantung kepada dos [63]. Sebaliknya, didapati bahawa dengan kehadiran OTA dan AFB1 dalam hati (Rajah 3, kumpulanE2), tahap ekspresi CYP3A29 menurun berbanding dengan tahap kawalan, mungkin disebabkan oleh pengaktifan AhR [98]. Data ini berbeza daripada data Zepnik et al. [ 99 ], yang melaporkan peningkatan hidrolisis OTA oleh enzim mikrosomal daripada hati tikus, khusus untuk P450 3A1/2 dan 3A4, menunjukkan bahawa ekspresi gen ini dimodulasi dalam cara yang bergantung kepada spesies. Dalam sesetengah kes, perencatan enzim P450 oleh polifenol mungkin mempunyai kesan kemopreventif disebabkan oleh potensi pengaktifan karsinogen oleh enzim P450 dalam perjalanan aktiviti metabolik semulajadinya. Perencatan enzim Fasa I yang memetabolismekan xenobiotik boleh menjadi salah satu sasaran kesan kemo-pencegahan polifenol cincin yang berlaku secara semula jadi. Peningkatan CYP4A24 yang diperhatikan dalam hati boleh menjadi tindak balas fisiologi dalam konteks luar biasa pengumpulan lipid menyimpang dan ketiadaan aktiviti CYP2E1, disebabkan fakta bahawa CYP2E1 dan CYP4A adalah sitokrom mikrosomal hepatik yang boleh diinduksi P-450 yang terlibat dalam hidroksilasi lemak. asid, dan kedua-duanya boleh memulakan proses auto-propagatif peroksidasi lipid. Mereka mungkin saling melengkapi, yang membawa kepada interaksi dalam pengawalan enzim individu [100]. Oleh itu, jelas bahawa protein CYP4A adalah perantara utama dalam tindak balas penyesuaian terhadap gangguan metabolisme lipid hepatik [101]. Tahap CYP4A24 menurun dalambuah pinggangmungkin membawa kepada kesan toksik yang dihasilkan dalam hati disebabkan oleh diet tercemar mikotoksin, yang bermaksud bahawa CYP4A24 mengawal tekanan ER hepatik [102,103].
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI SAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG
Dalam kajian ini, penambahan campuran biji anggur dan produk sampingan makanan buckthorn laut meningkatkan tahap ekspresi dalambuah pinggang,yang dijangka akan memihak kepada proses penghapusan dan penyelenggaraan keseimbangan bahan intraselular [104]. Selain itu, OTA telah diserap dalam usus di mana protein rintangan multidrug 2 (gen MRP2) memainkan peranan penting, bertindak sebagai pengangkut keluar xenobiotik untuk mengurangkan bioavailabiliti oral dan beban toksin ke organ dan, dengan itu, ketoksikan OTA. Sebaik sahaja OTA mencapai aliran darah, ia boleh mencapai organ lain seperti hati, dan pengangkut MRP2 sekali lagi merupakan pengangkut aktif utama utama yang terlibat dalam konjugat anionik dan penyemperitan xenobiotik ke dalam ruang ekstraselular yang menyumbang kepada pembentukan hempedu dan penyingkiran toksin berikutnya [ 97 , 105 ]. Juga, pengangkut MRP2 terdapat dalam membran apikal enterosit,buah pinggang-tubul proksimal, dan sel lain [105]. Ketoksikan OTA telah dikaitkan dengan bahagian isocoumarinnya, dan diketahui umum bahawa OTA dinyahaktifkan atau bioaktif oleh enzim cytochrome P450 [29]. Sebelum ini, kehadiran OTA dalam makanan dikaitkan dengan perkembangan nefrotoksisiti, yang, pada tikus, telah dikaitkan denganbuah pinggangadenoma danbuah pinggangtumor [97]. Dalam kajian ini, penurunan ekspresi MRP2 dalam hati didapati, menunjukkan kemerosotan rembesan mikotoksin dalam kumpulan E2.
Dalam tikus, OTA diperhatikan dikumuhkan 15 peratus kurang dalam tubul proksimalbuah pinggang,manakala pengangkutan tubular proksimal asid amino tidak terjejas [97, 106]. Oleh itu, penurunan MRP2 dalam hati yang ditemui dalam kajian ini boleh menjadi mekanisme di mana mikotoksin mencapai peratusan bioavailabiliti yang tinggi dalam vivo . Dengan cara ini, pendedahan AFB1 dan OTA pada anak babi akan diperbesarkan, menyumbang kepada hepatotoksisiti. Memandangkan potensi nefrotoksik OTA dan AFB1, penurunan produk gen MRP2 juga mungkin memberi kesan besar pada tubul proksimal, yang membawa kepada penurunan kapasiti untuk menghapuskan OTA [97]. Walau bagaimanapun, kajian lanjut diperlukan mengenai mekanisme pengangkut AFB1 dan OTA untuk menyokong hipotesis ini. Dalam Fasa II detoksifikasi metabolik, sebatian xenobiotik asal atau metabolit perantaraan yang diubah suai semasa Fasa I dikonjugasikan supaya sesuai untuk perkumuhan. Pemindahan Glutathione S (GST) dan UDP glycurosyltranferases (UGT) menyumbang kepada pemprosesan Fasa II [107].
Dengan kehadiran campuran biji anggur dan produk sampingan makanan buckthorn laut dalam makanan babi, tahap ekspresi GSTA1 dalam hati meningkat dengan ketara, mungkin oleh unsur tindak balas antioksidan (ARE) dan unsur tindak balas -NF ( -NF-RE), masing-masing, yang, dengan kehadiran antioksidan fenolik, mengaktifkan isoform GST tanpa memerlukan reseptor aril hidrokarbon (Ah) [108]. Anehnya, dalam kajian Ghadiri et al. (2019) [ 109 ], pengantaraan AFB1-menurun regulasi mRNA GSTA1 telah diperhatikan dalam hati lembu dengan kehadiran antioksidan. Kajian terdahulu [110] menunjukkan bahawa OTA dan AFB1 bersaing untuk enzim CYP450 yang sama yang mewakili laluan bioaktivasi AFB1, dengan kurang AFB1-aduk DNA dihasilkan. Disebabkan oleh persaingan ini, AFB1 mungkin boleh digabungkan dengan glutation yang dikurangkan dalam tindak balas yang dimangkin oleh enzim GST, dengan gen pengekodannya dikawal selia. AFB1 boleh terlibat dalam jenis tindak balas Fasa II yang lain, iaitu, glukuronidasi dan sulfatasi, manakala OTA terutamanya terkonjugasi dengan glutation terkurang [72]. Selain itu, sebagai tindak balas kepada pentadbiran serentak dalam babi, makanan dua mikotoksin (AFB1 dan OTA) meningkatkan penjanaan biomarker tekanan oksidatif. Oleh itu, mekanisme pertahanan diaktifkan, menggalakkan penyesuaian dan kelangsungan hidup sebagai tindak balas kepada tekanan oksidatif [111]. Sebagai contoh, ROS dan oksidan boleh mengaktifkan transkripsi isoform GST melalui ARE [108], seperti yang diperhatikan dalam kedua-dua hati danbuah pinggangmelalui peningkatan tahap ekspresi gen GSTA1.
Kesimpulan
Data kami mendedahkan kewujudan perbezaan antara anak babibuah pinggangdan hati mengenai tindak balas terhadap kedua-dua mikotoksin dan produk sampingan yang digunakan dalam kajian ini. Secara amnya, produk sampingan dengan tindakan antioksidan mengurangkan ekspresi mRNA CYP yang dianalisis dalam hati dan meningkatkannya dalambuah pinggang. Juga, dalam kedua-dua organ, pendedahan bersama anak babi kepada OTA dan AFB1 menghasilkan peningkatan atau penurunan ekspresi gen bergantung kepada jenis gen. Kemasukan biji anggur dan makanan buckthorn laut dalam diet babi mabuk OTA dan AFB1-menurunkan ekspresi gen CYP P450, mencadangkan pengurangan bioaktivasi mikotoksin ini, mungkin mengakibatkan ketoksikan yang berkurangan dalam kedua-dua organ, sebagai kajian histologi telah mendedahkan. Penemuan ini mencadangkan bahawa biji anggur dan sisa makanan buckthorn laut mewakili sumber yang menjanjikan dalam mengatasi kesan berbahaya ochratoxin A dan aflatoxin B1. Walaupun kerja tambahan diperlukan untuk membongkar mekanisme yang mana produk sampingan biji anggur dan buckthorn laut menjejaskan biotransformasi AFB1 dan OTA, dan oleh itu penjanaan metabolit toksik, kesan perlindungan nampaknya sekurang-kurangnya sebahagiannya dimediasi oleh peningkatan pertahanan antioksidan di hati. danbuah pinggangtahap.
Bahan dan Kaedah
Reka Bentuk Eksperimen dan Koleksi SampelEmpat puluh anak babi kacukan TOPIGS-40 kacukan ( ♀ Putih Besar × Hibrid (Putih Besar × Pietrain) ×♂ Bakat, terutamanya Duroc) anak babi selepas bercerai susu dengan purata berat badan 9.11 ± 0.{{16 }}3 kg telah diperuntukkan kepada tiga kumpulan eksperimen (E1, E2, E3) dan satu kumpulan kawalan (C), ditempatkan dalam kandang (dua replika lima ekor babi setiap kandang setiap rawatan) dan diberi makan dengan diet eksperimen untuk 3{{19} } hari. Makanan dan air ditawarkan secara ad libitum semasa eksperimen. Diet asas dihidangkan sebagai kawalan dan mengandungi makanan kompaun biasa untuk babi pemula tanpa mikotoksin (jagung 68.46 peratus, tepung soya 19 peratus, gluten jagung 4 peratus, pengganti susu 5 peratus, L-lisin 0.3 peratus, DL-metionin 0.1 peratus , batu kapur 1.57 peratus , monokalsium fosfat 0.35 peratus , garam 0.1 peratus , pracampuran kolin 0.1 peratus dan 1 peratus pracampuran vitamin-mineral). Kumpulan eksperimen diberi makan seperti berikut: E1—pemakanan asas ditambah campuran (1:1) dua produk sampingan (biji anggur dan hidangan buckthorn laut) dalam peratusan 5 peratus dengan menggantikan tepung jagung dan kacang soya; E2—pemakanan asas yang tercemar secara buatan dengan mikotoksin (campuran 62 ppb aflatoksin B1- AFB1 dan 479 ppb ochratoxin A-OTA); dan E3—pemakanan asas yang mengandungi 5 peratus daripada campuran (1:1) biji anggur dan makanan buckthorn laut dan tercemar dengan campuran AFB1 dan OTA. Campuran mikotoksin OTA dan AFB1 telah disediakan oleh Dr. Boudra dan Dr. Morgavi dari INR A, Pusat Clermont Ferrand, dan dihasilkan melalui penanaman Aspergillus flavus dan Aspergillus ochraceous pada gandum seperti yang telah diterangkan oleh Boudra et al. [ 112 ]. Bahan tercemar yang diperoleh telah dimasukkan ke dalam diet untuk kumpulan E2 dan E3, menghasilkan kepekatan akhir 479 ppb OTA dan 62 ppb AFB1. Haiwan daripada semua kumpulan eksperimen mempunyai akses percuma kepada suapan rawatan dan air setiap hari dalam tempoh percubaan (30 hari). Hidangan biji anggur dan hidangan buckthorn laut disediakan oleh dua iklan tempatan, SC OLEOMET-SRL dan BIOCATINA, Bucharest, Romania. Selepas 4 minggu, haiwan tersebut disembelih dengan kelulusan Jawatankuasa Etika Institut Penyelidikan-Pembangunan Kebangsaan bagi Pemakanan dan Biologi Haiwan, Balote s , ti, Romania (Jawatankuasa Etika no. 118/02.12.2019) dan mengikut Undang-undang Romania 206/2004 dan Arahan Majlis EU 98/58/EC untuk pengendalian dan perlindungan haiwan yang digunakan untuk tujuan eksperimen. Pada akhir tempoh percubaan kajian ini, parameter produktif, berat, dan penggunaan makanan telah diukur. Hati danbuah pinggangsampel dikumpul daripada empat haiwan setiap kumpulan dan disapu dengan larutan garam ais untuk mengeluarkan darah. Serpihan ~50 mg dari lobus hati kanan danbuah pinggangkorteks (tiga daripada setiap satu) dikumpulkan dalam Reagen Penstabilan RNAlater (Qiagen, Germantown, Maryland) dan kemudian disimpan pada − 80 ◦ C sehingga langkah pengasingan RNA. Disebabkan oleh sebab-sebab etika, memaksimumkan penggunaan setiap haiwan, meminimumkan kehilangan haiwan, dan analisis statistik, bilangan individu telah dikurangkan sebanyak mungkin secara saintifik. Sains yang baik dan reka bentuk eksperimen yang baik membantu mengurangkan bilangan haiwan yang digunakan dalam mana-mana kajian penyelidikan, membolehkan saintis mengumpul data menggunakan bilangan minimum haiwan yang diperlukan [113].
Pencirian SuapanPemakanan makanan dianalisis untuk komposisi kimia basal (bahan kering, protein kasar, lemak mentah, gentian mentah dan abu) mengikut kaedah Pertubuhan Piawaian Antarabangsa (SR ISO 6496/2001, Buletin Standard (2010).http://www. asro.ro (diakses pada 13 Februari 2021)). Sebatian bioaktif daripada makanan sampingan, seperti polifenol, asid lemak tak tepu (PUFA), dan mineral, ditentukan oleh tindak balas Folin-Ciocalteu, HPLC-UV-Vis, dan kromatografi gas seperti yang diterangkan oleh pengarang [113, 114]. Aktiviti antioksidan ditentukan oleh kaedah DPPH seperti yang diterangkan sebelum ini oleh pengarang [115].
Analisis Biomarker PlasmaPada hari ke-30, sampel darah dikumpulkan secara aseptik daripada anak babi yang berpuasa. Penanda yang mencerminkan fungsi hati (aspartate transaminase-AST, alanine transaminase-ALT, gamma glutamyl transferase-GGT, jumlah protein, alkali fosfatase-AKL), dan buah pinggang (albumin, kreatinin) ditentukan selepas pengemparan darah menggunakan bangku Kimia Klinikal. penganalisis Horiba Medical—ABX Pentra 400, (Irvine, CA, USA).
Pemeriksaan Mikroskopi CahayaHati danbuah pinggangbiopsi telah ditetapkan dalam 4 peratus larutan formaldehid penampan fosfat, dehidrasi, dijelaskan, dan dimasukkan ke dalam blok parafin. Bahagian 5 µ m telah diproses secara rutin untuk pewarnaan hematoxylin-eosin dan Gomori trichrome (Leica Biosystems, 38016SS1, Nussloch, Jerman), mengikut protokol Leica. Bahagian mikroskopik dianalisis dengan mikroskop Olympus BX43 yang dilengkapi dengan kamera digital Olympus XC30. Perubahan histopatologi hati danbuah pinggangtelah digredkan oleh keterukan lesi sebagai kepunyaan gred 1-4, seperti yang diterangkan sebelum ini [116]. Untuk hati, gred 1: Aspek normal; gred 2: Hepatosit normal, sinusoid diluaskan sedikit dan kesesakan; gred 3: Hepatosit yang dikosongkan, sinusoid diluaskan dan kesesakan; percambahan kolagen sederhana; gred 4: Nekrosis, infiltrat radang, percambahan kolagen. Untuk buah pinggang, gred 1: Aspek normal; gred 2: Kecederaan kecil tiub/glomerular, keradangan, dan percambahan kolagen; gred 3: Kecederaan tubular/glomerular ringan, keradangan, dan percambahan kolagen; gred 4: Kecederaan tubular/glomerular yang ketara, keradangan, dan percambahan kolagen. "Nilai penilaian min" (MAV) telah dikira sebagai min semua data bagi setiap kumpulan eksperimen.
Pengasingan RNAPengasingan jumlah RNA dilakukan daripada 10 mg tisu menggunakan Kit Mini Universal RNeasy Plus (Qiagen) mengikut protokol pengeluar. Selain itu, ia termasuk langkah pencernaan DNase Pada lajur. Selepas pengasingan RNA, aliquot dibuat untuk mengelakkan degradasi yang disebabkan oleh kitaran pencairan beku. Kepekatan dan ketulenan jumlah RNA ditentukan menggunakan spektrofotometer NanoDrop 8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).
Nombor Integriti RNA (RIN)Nilai RIN sampel RNA ditentukan menggunakan Agilent RNA 6000 NanoKit (Agilent, Santa Clara, CA, Amerika Syarikat) dan Agilent 2100 Bioanalyzer menggunakan protokol pengeluar. Sampel dengan nilai RIN lebih kecil daripada 8 tidak dimasukkan dalam analisis lanjut, dan langkah pengasingan diulang.
Transkripsi SongsangUntuk sintesis cDNA, 1000 ng jumlah RNA tertakluk kepada transkripsi terbalik menggunakan kit sintesis cDNA iScript (Bio-Rad, Hercules, CA, Amerika Syarikat). Campuran tindak balas 4 µ L dan 1 µ L transkripase terbalik dicampur dengan 1 µ L sampel RNA dan dilengkapkan dengan air bebas RNase kepada jumlah isipadu 20 µ L. Kepekatan akhir RNA ialah 1000 ng setiap tindak balas. Tindak balas dilakukan menggunakan Veriti 96-Well thermal cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) dengan program berikut: Satu kitaran 25◦ C selama 5 minit, satu kitaran 42◦ C selama 30 minit dan satu kitaran 85 ◦ C selama 5 min. Kepekatan dan ketulenan sampel cDNA ditentukan menggunakan spektrofotometer NanoDrop 8000 (Thermo Scientific).
Reka Bentuk PrimerOleh kerana kekurangan data mengenai gen yang terlibat dalam hepato-nefrotoksisiti dalam pendedahan mikotoksin babi yang dicerai susu, urutan primer (Jadual 7) telah direka bentuk dalam siliko menggunakan Primer3Plus [59] dan disahkan oleh program BLAST [117]. Mereka yang mempunyai kekhususan tertinggi untuk jujukan sasaran telah dipilih untuk menguatkan gen CYP1A2, CYP2A19, CYP2E1, CYP3A29, CYP4A24, MRP2 dan GSTA1 serta tiga pengekodan gen rujukan untuk protein pengikat kotak TATA, protein ribosom L4 dan beta{ {19}}mikroglobulin dalam Sus scrofa. Suhu penyepuhlindapan primer ditentukan oleh PCR kecerunan suhu.
PCR Masa NyataTindak balas PCR Masa Nyata telah dijalankan pada Sistem Pengesanan PCR Masa Nyata iCycler iQ (Bio-Rad) menggunakan iQ SYBR Green SuperMix (Bio-Rad). Dalam 96-plat perigi, 1 µ L daripada 1{{10}}0 ng/ µ L cDNA, 12.5 µ L iQ SYBR Green SuperMix (Bio-Rad), 0.5 µ L daripada 20 pmol/ µ L primer hadapan, 0.5 µ L daripada 20 pmol/ µ L primer terbalik, dan 10.5 µ L air MilliQ telah ditambah. Jumlah isipadu ialah 25 µ L. Program penguatan terdiri daripada 1 kitaran 95 ◦ C selama 5 minit, 45 kitaran 95 ◦ C selama 30 s 55/56 ◦ C selama 30 s, 72 ◦ C selama 45 s, dan 85 kitaran 55 ◦ C, dengan peningkatan suhu titik set sebanyak 0.5 ◦ C setiap kitaran selama 10 saat. Sampel dijalankan, dan nilai kitaran ambang (Ct) telah direkodkan. Lengkung lebur juga dilakukan.
Analisis dataNilai Ct telah diproses seperti yang dinyatakan dalam "Garis Panduan MIQE: Maklumat Minimum untuk Penerbitan Eksperimen PCR Masa Nyata Kuantitatif" [ 118 ] menggunakan OpenOffice Calc mengikut kaedah 2- ∆∆ Ct yang diterangkan oleh Livak dan Schmittgen (2001). ) [ 119 ]. Gen rujukan (TBP, RPL4, dan B2M) telah dipilih untuk dinyatakan secara stabil merentasi jenis tisu dan rawatan yang berbeza pada spesimen babi [120, 121]. Nilai ungkapan relatif (2 − ∆∆Ct ) diperoleh melalui normalisasi, menolak min aritmetik gen rujukan daripada setiap gen yang diminati. Replika teknikal dipuratakan sebelum analisis statistik. Data digambarkan sebagai nilai purata kumpulan (n=4) ± sisihan ralat piawai bagi min (STDEV). Semua data dianalisis secara statistik menggunakan kaedah ANOVA sehala yang dilakukan dengan perisian GraphPad Prism 3.03 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Perbandingan post-hoc antara semua kumpulan dijalankan menggunakan ujian Bonferroni. Kepentingan statistik (nilai p) dibentangkan untuk semua kumpulan berbeza dengan kumpulan Kawalan (C).
