Protein Rembesan Kaya Cysteine ​​MaCFEM85 Berinteraksi Dengan MsWAK16 Untuk Mengaktifkan Pertahanan Tumbuhan

Abstrak: Metarhizium anisopliaeadalah kulat entomopatogen yang boleh meningkatkan pertumbuhan dan rintangan tumbuhan apabila bertindak sebagai endofit dalam tumbuhan perumah. Walau bagaimanapun, sedikit yang diketahui tentang interaksi protein atau mekanisme pengaktifannya. Lazim dalam protein membran ekstraselular kulat (CFEM) telah dikenal pasti sebagai pengawal selia imun tumbuhan yang menyekat atau mengaktifkan tindak balas rintangan tumbuhan. Di sini, kami mengenal pasti protein yang mengandungi domain CFEM, MaCFEM85, yang kebanyakannya disetempat dalam membran plasma. Yeast two-hybrid (Y2H), glutathione-S-transferase (GST) pull-down, dan ujian pelengkap pendarfluor bimolekul menunjukkan bahawa MaCFEM85 berinteraksi dengan domain ekstraselular suatuMedicago sativaprotein membran (alfalfa), MsWAK16. Analisis ekspresi gen menunjukkan bahawa MaCFEM85 dan MsWAK16 dikawal dengan ketara dalamM. anisopliaedanM. sativa, masing-masing, dari 12 hingga 60 jam selepas inokulasi bersama. Ujian dua-hibrid yis tambahan dan mutasi khusus tapak asid amino menunjukkan bahawa domain CFEM dan sistein ke-52 secara khusus diperlukan untuk interaksi MaCFEM85 dengan MsWAK16. Ujian fungsi pertahanan menunjukkan bahawa JA telah dikawal selia, tetapi saiz lesi Botrytis cinerea dan pembiakan Myzus persicae telah ditindas oleh ekspresi sementara MaCFEM85 dan MsWAK16 dalam kilang hos model Nicotiana benthamiana. Secara kolektif, keputusan ini memberikan pandangan baru tentang mekanisme molekul yang mendasari interaksi M. anisopliae dengan tumbuhan perumah.

faedah tambahan cistanche-meningkatkan imuniti

Kata kunci: kinase berkaitan dinding; CFEM; Metahizium anisopliae; imuniti tumbuhan; Medicago sativa

1. Pengenalan

Interaksi antara tumbuhan dan mikrob meluas dan merupakan hasil daripada evolusi bersama yang lalu dan berterusan. Interaksi ini boleh mempunyai hasil sama ada bermanfaat, neutral, atau buruk untuk setiap peserta [1-3]. Mikrobiota rhizosfera yang bermanfaat boleh meningkatkan pertumbuhan tumbuhan dan meningkatkan kesihatan keseluruhan dengan melindungi daripada penyakit bawaan tanah atau meningkatkan pengambilan nutrien [4,5]. Pelbagai mikrob berfaedah boleh meningkatkan keupayaan tumbuhan seperti pengambilan nutrien, pertumbuhan, dan pertahanan patogen dan serangga [6,7]. Metarhizium Sorok¯ın ialah genus penting kulat entomopatogen dengan keupayaan untuk menjajah tumbuhan [8], tetapi terdapat juga bukti yang menunjukkan bahawa ahli genus boleh meningkatkan rintangan patogen tumbuhan. Sebagai contoh, kajian makmal mendapati 60% perencatan Fusarium solani (Mart.) Sacc. dengan kehadiran Metarhizium robertsii (dahulunya dikenali sebagai M. anisopliae) berbanding dengan kawalan tanpa M. robertsii [9]. Sesetengah strain Metarhizium mempunyai potensi untuk meningkatkan ketahanan tumbuhan terhadap perosak dan penyakit serangga dengan mengubah ekspresi gen pertahanan tumbuhan. Penjajahan endofit dengan M. Roberts mengaktifkan ekspresi kedua-dua jalur pertahanan asid jasmonik (JA) dan asid salisilik (SA) dalam daun jagung; tambahan pula, penjajahan sedemikian dikaitkan dengan menggalakkan pertumbuhan tumbuhan dan penindasan pembangunan larva Agrotis epsilon (Hufnagel) [10]. Metarhizium guizhouense mengaktifkan -1,3-glukanase dan kitinase dalam kulit buah Lansium parasiticum yang mengakibatkan perencatan pertumbuhan Botrytis sp. dan Fusarium sp. pada buah Aglaia dookkoo Griff [11]. Selain itu, apabila M. anisopliae digunakan pada anak benih kacang tanah, pelbagai faktor transkripsi termasuk WRKYs, MYCs, TGAs, dan faktor transkripsi responsif etilena telah diaktifkan, manakala pengangkut nitrat dan unsur-unsur tindak balas dehidrasi yang mengikat protein juga dinyatakan secara berbeza [12] . Ini menunjukkan bahawa M. anisopliae mengawal gen pertahanan tumbuhan semasa ia menjajah tumbuhan. Walau bagaimanapun, agak sedikit diketahui tentang mekanisme yang mendasari tindak balas pertahanan tumbuhan berikutan jangkitan oleh Metarhizium. Efektor adalah cara biasa yang mikroorganisma mengawal rintangan tumbuhan [13]. Pengaktifan rintangan tumbuhan biasanya dicirikan oleh pecah oksidatif dan induksi hormon, metabolit, dan isyarat lain [13]. Hormon tumbuhan SA dan JA memainkan peranan penting dalam mendorong rintangan tumbuhan, mengantara dua laluan isyarat pertahanan yang berasingan [14]. Laluan isyarat SA berfungsi terutamanya dalam tindak balas alahan tumbuhan dan dalam rintangan yang diperoleh sistemik terhadap patogen, tetapi ia juga mungkin terlibat dalam tindak balas pertahanan tumbuhan tidak langsung yang disebabkan oleh pemakanan serangga yang menyengat [15]. Pengumpulan SA dikaitkan dengan peningkatan ekspresi gen yang mengekodkan protein pemindahan lipid (LTP) dan phenylalanine ammonia-lyase (PAL) [16], yang mengantara sintesis dan pengumpulan metabolit khusus hiliran seperti flavonoid dan lignin [17]. Laluan isyarat JA berfungsi dalam tindak balas langsung dan tidak langsung kepada kerosakan mekanikal, patogen kulat, dan perosak serangga. Kajian telah menunjukkan bahawa isyarat JA mempunyai kesan pengawalseliaan ke atas sintesis metabolit khusus seperti terpenoid, fenilpropanoid, dan alkaloid, yang mempunyai pelbagai fungsi biologi [18]. Beberapa metabolit khusus telah ditunjukkan untuk terkumpul dalam sel tumbuhan berikutan rawatan dengan metilJA (MeJA), termasuk paclitaxel dalam spesies Taxus [19,20], terpenoid dalam Centella Asiatica (L.) Urban [21], dan saponin dalam ginseng [22] . Penggunaan SA dan kitosan (CHT) sebagai elisitor menyebabkan pengumpulan lignin dan tindak balas enzim pertahanan dalam tomato, yang mengurangkan kejadian jangkitan Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi [23]. Di samping itu, paras JA dan SA dalam gandum telah terkumpul dengan ketara melalui penggunaan elicitor PeaT, meningkatkan tindak balas pertahanan terhadap aphid oat Sitobion avenae (Fabricius) [24]. Ini menunjukkan bahawa imuniti tumbuhan boleh dikawal oleh pengesan ini melalui hormon dan metabolit tumbuhan.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Lazim dalam protein membran ekstraselular kulat (CFEM) terdapat dalam pelbagai jenis kulat. Mereka mengekod domain yang biasanya 60 asid amino (aa) panjangnya dan mengandungi lapan sistein yang mempunyai jarak yang berciri [25]. Domain CFEM adalah serupa dengan domain seperti faktor pertumbuhan epidermis (EGF), yang berfungsi sebagai reseptor ekstraselular, transduser isyarat, atau molekul lekatan dalam interaksi hos-patogen [26]. Protein yang mengandungi domain CFEM boleh memanipulasi tindak balas rintangan tumbuhan dengan bertindak sebagai efektor. Dalam kulat karat daun gandum Puccinia triticina Erikas, calon pengesan CFEM PTTG_08198 mempercepatkan kemajuan kematian sel dan menggalakkan pengumpulan spesies oksigen reaktif (ROS) [27]. Kulat anthracnose Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils mengandungi lima efektor (CgCFEM6, 7, 8, 9, dan 15) yang telah ditunjukkan untuk menindas kematian sel terprogram akibat BAX dalam Nicotiana benthamiana Domin [28]. Kulat mikoriza phytosymbiotic Laccaria bicolor (Maire) PDOrton dilaporkan merembeskan beberapa protein CFEM, seperti Lac310796, Lac296573, dan Lac296572, dalam tisu simbiotik [29]. Walaupun fungsi kompleks protein ini tidak dikaji lebih lanjut dalam simbiosis mikoriza, keputusan terdahulu menunjukkan bahawa protein CFEM mungkin berfungsi dalam isyarat antara kulat dan tumbuhan. M. anisopliae boleh berfungsi sama ada sebagai kulat entomopatogenik atau endofit dalam tumbuhan perumah [30]. Walau bagaimanapun, peranan protein CFEM belum lagi dilaporkan. Kami sebelum ini mengenal pasti protein yang mengandungi domain CFEM dalam M. anisopliae, MaCFEM85 (ID GenBank: MZ682609) [31]. Di sini, kami melaporkan hubungan antara MaCFEM85 dan kinase yang berkaitan dengan dinding Medicago sativa MsWAK16. Kami menganalisis jujukan MaCFEM85 dan menjalankan eksperimen untuk menentukan residu mana yang kritikal untuk interaksi dengan MsWAK16. Akhirnya, menggunakan N. benthamiana sebagai kilang model kami, kami menilai tindak balas pertahanan tumbuhan terhadap Botrytis cinerea dan aphid Myzus persicae dengan dan tanpa ekspresi sementara MaCFEM85 dan MsWAK16.

Kebaikan cistanche tubulosa-menguatkan sistem imun

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity

【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Keputusan

2.1. MaCFEM85 Berkaitan Paling Erat dengan CFEM Kulat Bukan Patogenik dan Disetempatkan pada Membran Plasma

Pokok filogenetik dibina untuk menganalisis hubungan antara MaCFEM85 dan protein CFEM lain daripada kulat model patogenik dan bukan patogen. Ini termasuk Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum (Schl)., Neurospora crassa Shear & BODodge, dan Beauveria bassiana (Bals.) (lihat Bahagian 4). MaCFEM85 paling rapat berkait dengan protein CFEM dalam B. bassiana, dan oleh itu, secara evolusi lebih dekat kepada bukan patogen daripada kulat patogen (Rajah 1a).

Rajah 1a

2.2. MaCFEM85 Dikawal Selia semasa Interaksi dengan M. sativa

Kinase seperti reseptor yang berkaitan dengan dinding (WAKs) mewakili subkumpulan dalam superfamili kinase protein seperti reseptor (RLKs), dan termasuk domain ekstraselular, heliks transmembran dan domain kinase intraselular. Mereka memainkan peranan penting dalam mengawal pertumbuhan tumbuhan, perkembangan, tindak balas tekanan, dan laluan isyarat rintangan patogen [32]. RNA telah diekstrak daripada M. anisopliae hyphae dan akar M. sativa selepas inkubasi bersama untuk menyiasat corak ekspresi MaCFEM85 dan MsWAK16. Kedua-dua MaCFEM85 dan MsWAK16 dinyatakan pada tahap yang lebih tinggi dengan ketara semasa pengeraman bersama dari 12 hingga 6{13}} h (Rajah 1c,d). Dari 0 hingga 36 jam, ekspresi MaCFEM85 meningkat secara beransur-ansur, memuncak pada 36 jam. Ia adalah × 593 kali lebih tinggi dinyatakan dalam gabungan M. anisopliae dan M. sativa berbanding dengan M. anisopliae yang ditanam sahaja. Walaupun ekspresi MaCFEM85 berkurangan sedikit dalam tempoh 48-60 jam, ia masih dinyatakan pada tahap yang lebih tinggi daripada M. anisopliae yang ditanam sahaja. MsWAK16 juga dikawal dengan ketara, dengan ekspresi memuncak pada 36 jam. Dalam M. sativa yang dijangkiti M. anisopliae, MsWAK16 adalah × 89.06 kali lebih tinggi daripada M. sativa tanpa M. anisopliae. Dari 36 hingga 60 jam, tahap MsWAK16 menurun sedikit, tetapi ekspresinya masih jauh lebih tinggi daripada tumbuhan yang tidak disuntik.

2.3. MaCFEM85 Berinteraksi dengan MsWAK16 In Vitro dan In Vivo

Untuk menyiasat potensi mekanisme fungsi MaCFEM85 sebagai tindak balas kepada rawatan M. anisopliae, skrin ragi dua-hibrid (Y2H) telah dilakukan untuk mengenal pasti terlebih dahulu protein perumah yang berinteraksi dengan MaCFEM85. Interaksi antara domain ekstraselular MsWAK16 (MsWAK16-ED) dan MaCFEM85 telah diperiksa dengan ujian dua-hibrid yis satu-ke-satu menggunakan MaCFEM85 dalam pGBKT7 sebagai vektor BD dan MsWAK16 dalam pGADT7 sebagai vektor AD. Semua yis yang diubah berkembang dengan baik pada medium kekurangan SD-T/L dan kumpulan kawalan positif serta kumpulan eksperimen berjaya berkembang pada medium kekurangan SD-T/L/H/A + X- -gal. Ini menunjukkan bahawa MaCFEM85 boleh berinteraksi dengan MsWAK{19}}ED (Rajah 2a).

Rajah 2. Pengesahan interaksi antara MaCFEM85 dan MsWAK16.

Untuk pengesahan in vitro, glutathione-S-transferase (GST)-teg MsWAK16-ED (pengekodan produk 60 kDa) telah dimasukkan ke dalam pGEX6-P2 dan polyhistidine (His)-tag MaCFEM85 ( pengekodan produk 17 kDa) telah dimasukkan ke dalam pET-21b. Imunoblotting dengan antibodi His dan GST menunjukkan bahawa protein rekombinan MaCFEM85-His berinteraksi dengan mangsa GST-MsWAK16-ED tetapi tidak dengan GST sahaja dan GST-MsWAK16- ED berinteraksi dengan His -MaCFEM85 (Rajah 2b). Untuk mengesahkan lagi interaksi antara MaCFEM85 dan MsWAK16, kami melakukan ujian pelengkap pendarfluor bimolekul (BiFC) dengan binaan MaCFEM85-YFPN dan MsWAK16-YFPC. Ungkapan bersama MaCFEM85-YFPN dan MsWAK16-YFPC dalam daun tembakau menghasilkan isyarat pendarfluor kuning, menunjukkan bahawa MaCFEM85 berinteraksi dengan MsWAK16 (Rajah 2c).

2.4. Tapak Utama untuk Interaksi MaCFEM85 dan MsWAK16

Untuk menentukan kawasan MaCFEM85 yang diperlukan untuk interaksi dengan MsWAK16-ED, domain protein telah diramalkan dengan perisian dalam talian SMART (Rajah 3a). MaCFEM85 mengandungi domain CFEM dalam 19-86 rantau aa. Struktur tertiari juga telah diramalkan (Rajah 3b). Lapan sistein dalam domain ini menghasilkan empat ikatan disulfida (CYS26 dan CYS69, CYS30 dan CYS64, CYS43 dan CYS50, dan CYS52 dan CYS85), mengekalkan kestabilan protein (Rajah 3b). Untuk mengesahkan tapak interaksi putatif dalam MaCFEM85, tujuh versi mutasi protein telah dihasilkan dan dimasukkan ke dalam pGBKT7 sebagai protein umpan. Setiap vektor rekombinan telah ditransfeksi bersama dengan AD-MsWAK{19}}ED dalam strain Y2H Gold. Strain dengan CYS52 bermutasi tidak berkembang pada media terpilih (Rajah 3c, digariskan dalam warna merah), menunjukkan bahawa CYS52 diperlukan untuk interaksi MaCFEM85 dengan MsWAK16-ED.

2.5. Interaksi MaCFEM85 dengan MsWAK16 Mengaktifkan Tindak Balas Kekebalan Tumbuhan

2.5.1. Menilai Peranan MaCFEM85 dan MsWAK16 dalam Ketahanan Penyakit terhadap B. cinerea

Untuk meneroka kemungkinan penglibatan MaCFEM85 dan MsWAK16 dalam tindak balas pertahanan patogen, kami memeriksa sama ada ekspresi berlebihan MaCFEM85, MsWAK16, atau MaCFEM85 dan MsWAK16 boleh memberikan peningkatan rintangan kepada B. cinerea. Kami secara sementara menyatakan vektor ini dalam daun N. benthamiana. Ujian Western blot menunjukkan bahawa MaCFEM85 dan MsWAK16 telah dinyatakan pada tahap yang setanding apabila ia dinyatakan secara bersendirian atau bersama-sama, yang menunjukkan bahawa MaCFEM85 dan MsWAK16 berjaya dinyatakan dalam tembakau (Rajah 4a). Ujian penyakit juga dilakukan menggunakan N. benthamiana yang menyusup dengan MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16 atau kawalan GFP. Lesi adalah lebih kecil dengan ketara (sebanyak ~30% pada 2 hari selepas inokulasi) pada daun yang menyusup dengan MaCFEM85, MsWAK16 atau MaCFEM85+MsWAK16 berbanding dengan tumbuhan kawalan (Rajah 4b). Data ini menunjukkan bahawa ekspresi sementara MaCFEM85 dalam N. benthamiana memberikan peningkatan rintangan kepada B. cinerea dan bahawa MaCFEM85 dan MsWAK16 mengawal selia secara positif tindak balas pertahanan terhadap B. cinerea.

Rajah 3. Pengenalpastian tapak interaksi antara MaCFEM5 dan MsWAK16.

Rajah 4. Aruhan rintangan tumbuhan dengan ungkapan sementara MaCFEM85 dan MsWAK16.

2.5.2. Menilai Peranan MaCFEM85 dan MsWAK16 dalam Pertahanan Aphid di N. benthamiana

Untuk menyiasat lebih lanjut peranan MaCFEM85 dan MsWAK16, tumbuhan N. benthamiana secara sementara menyatakan MaCFEM85 dan MsWAK16 telah diserang M. persicae, dan populasi telah dinilai. Untuk eksperimen ini, kawasan yang luas bagi setiap daun N. benthamiana telah disusup secara agro dengan vektor binari rekombinan pYBA1132 yang mengandungi MaCFEM85 dan MsWAK16. GFP digunakan sebagai kawalan. Pada 12 jam selepas penyusupan, 20 M. persicae dewasa dikurung pada setiap daun, mendedahkan kawasan yang menyusup kepada kutu daun. Dalam tiga hari berikutnya, kematian aphid dewasa dan bilangan nimfa direkodkan; nimfa kemudiannya dikeluarkan. Tiada perbezaan ketara dalam risiko kematian di kalangan populasi M. persicae yang memakan tumbuhan yang menyatakan MaCFEM85, MsWAK16 atau MaCFEM85+MsWAK16 (χ2=3.65827, DF=3, p < 0.30081 ) (Rajah 4c). Walau bagaimanapun, pada 24, 48 dan 72 jam, purata bilangan keturunan yang dihasilkan oleh setiap aphid dewasa adalah lebih tinggi dengan ketara pada N. benthamiana yang menyatakan kawalan GFP berbanding dengan yang menyatakan MaCFEM85, MsWAK16 atau MaCFEM85+MsWAK16 (Rajah 4d).

2.5.3. Menilai Peranan MaCFEM85 dan MsWAK16 dalam Pengumpulan Hormon dan Ekspresi Gen Berkaitan Hormon

Untuk menganalisis perbezaan antara tindak balas pertahanan tumbuhan N. benthamiana yang menyatakan eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 dan MaCFEM85+MsWAK16, kami mengukur tahap JA, SA dan jumlah flavonoid serta ekspresi gen yang berkaitan. Keputusan menunjukkan bahawa tahap JA dan SA berbeza antara tumbuhan yang menyatakan eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 dan MaCFEM85+MsWAK16 (Rajah 5a). Berbanding dengan yang menyatakan eGFP, paras JA jauh lebih rendah dalam tumbuhan yang menyatakan MaCFEM85; Tahap SA meningkat sedikit, tetapi perbezaannya tidak ketara. Sebaliknya, tumbuhan yang menyatakan MsWAK16 tidak menunjukkan perbezaan yang signifikan dalam tahap JA berbanding dengan kawalan eGFP, manakala tahap SA adalah jauh lebih rendah daripada dalam kawalan (Rajah 5a). Tahap JA dan SA telah meningkat dan menurun dengan ketara, masing-masing, dalam loji yang menyatakan MaCFEM85+MsWAK16 berbanding dengan eGFP.

Rajah 5. Tahap hormon dan ekspresi gen tindak balas hormon

Jumlah kandungan flavonoid adalah jauh lebih tinggi dalam tumbuhan yang menyatakan MaCFEM85+MsWAK16 berbanding dengan semua kumpulan rawatan lain (Rajah 5a). Tahap ekspresi gen biosintetik adalah serupa dalam tumbuhan yang menyatakan MsWAK16 dan MaCFEM85+MsWAK16. Sebagai contoh, gen yang berkaitan dengan tindak balas JA, iaitu COI1, MYC2, dan PDF1.2, dikawal dengan ketara berbanding dengan tumbuhan yang menyatakan GFP (Rajah 5b). Begitu juga, gen berkaitan SA NPR1, WRKY70 dan PR1 dinyatakan secara ketara secara berbeza dalam tumbuhan yang menyatakan MsWAK16 dan MaCFEM85+MsWAK16; NPR1 dikawal selia, manakala WRKY70 dan PR1 dikurangkan berbanding dengan kawalan (Rajah 5b). Kami juga mengkaji ekspresi gen utama dalam asid Shikimic dan laluan sintesis fenilpropanoid, yang kedua-duanya berkaitan dengan sintesis flavonoid. Secara umum, ungkapan MaCFEM85 sahaja tidak mendorong ekspresi gen ini yang lebih tinggi dalam tembakau. Walau bagaimanapun, gen ini dikawal selia dalam tembakau yang mengekspresikan MsWAK16 atau MsWAK16+MaCFEM85 berbanding dengan kawalan GFP (Rajah 5c).

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

3. Perbincangan

3.1. Motif Protein CFEM Terpelihara Melayani Pelbagai Fungsi dalam Spesies Kulat

Domain CFEM adalah unik kepada kulat dan biasanya berlaku dalam protein membran ekstraselular kulat. Domain ini berasal dari nenek moyang biasa Ascomycota dan Basidiomycota yang paling terkini [33]. Penyelidikan terkini menunjukkan bahawa protein CFEM dalam patogen kulat boleh bertindak sebagai pengawal selia imun tumbuhan, menyebabkan penindasan atau pengaktifan imun tumbuhan tuan rumah bergantung kepada jenis jangkitan [28,34,35]. Terdapat beberapa laporan mengenai protein yang mengandungi domain CFEM dalam M. anisopliae, hanya dalam konteks perbandingan evolusi dengan kulat lain [36]. Dalam kajian ini, kami membandingkan protein M. anisopliae CFEM dengan protein CFEM lain yang diketahui dalam kedua-dua kulat patogen dan bukan patogen. Kami mengesahkan bahawa homolog terdekat MaCFEM85 ialah Cfem5 yang terdapat di Beauveria bassiana, salah satu daripada 12 protein CFEM dalam spesies tersebut (Tambahan Rajah S1). BbCfem5 adalah penting untuk pemerolehan besi [37]. Selain itu, berdasarkan struktur tertiari yang diramalkan, domain CFEM dalam MaCFEM85 sangat serupa dengan Surface Antigen Protein 2 (CSA2) yang terdapat dalam Candida albicans (CPRobin) Berkhout, di mana 65 residu (96% daripada jujukan) telah dimodelkan dengan 99.8 % keyakinan [31]. Candida albicans ialah patogen haiwan; CSA2 memainkan peranan penting dalam pertumbuhan dan patogenik dengan mengekstrak heme daripada hemoglobin dan mengangkut heme dari dinding sel ke plasma [38-40]. Kami membuat hipotesis bahawa MaCFEM85 mungkin terlibat dalam virulensi M. anisopliae bagi perumah serangga. Gabungan fungsi MaCFEM85 dalam jangkitan patogenik haiwan dan pengaktifan imuniti tumbuhan menjadikan protein sebagai tumpuan penyelidikan masa depan yang menarik.

3.2. Ikatan Disulfida Adalah Struktur Penting untuk Fungsi Protein

Integriti konformasi struktur protein secara langsung berkaitan dengan keupayaannya untuk berfungsi. Ikatan disulfida yang dibentuk oleh pasangan sistein menggalakkan lipatan protein dan kestabilan konformasi dan dianggap membentuk tapak utama untuk pengiktirafan dan pengikatan reseptor atau ligan tertentu [41]. Sebagai contoh, mengganggu mana-mana satu daripada tiga ikatan disulfida terpelihara dalam patogen tumbuhan Cladosporium fulvum effector protein AVR4 mengakibatkan kepekaan protease dan mengurangkan keupayaan mengikat kitin [42]. Dalam tiga protein C. fulvum lain (ECP1, ECP2, dan ECP5), penggantian tunggal alanin untuk sistein melembapkan tindak balas hipersensitif tomato, menunjukkan bahawa sistein adalah penting untuk mengekalkan kestabilan dan aktiviti mendorong tindak balas hipersensitif [43]. Lebih-lebih lagi, dalam protein matang MC69 Magnaporthe oryzae, mutagenesis dua sisa sistein yang dipelihara (Cys36 dan Cys46) boleh menjejaskan fungsi MC69 tanpa menjejaskan rembesan, mencadangkan kepentingan ikatan disulfida secara khusus dalam patogenisitas MC69 [44]. Domain CFEM nampaknya serupa dari segi saiz dan dalam corak sisa sistein kepada domain seperti EGF, yang mengandungi tiga atau empat pasang ikatan disulfida. Protein EGF boleh berfungsi sebagai reseptor permukaan sel, transduser isyarat, atau molekul lekatan dalam interaksi hos-patogen [45]. Dalam kajian ini, kami bukan sahaja mendapati bahawa domain CFEM MaCFEM85 mengandungi lapan sistein terpelihara yang membentuk empat pasang ikatan disulfida (Rajah 3b), tetapi kami juga mengesahkan bahawa CFEM adalah domain kritikal untuk interaksi antara MaCFEM85 dan MsWAK16. Tambahan pula, melalui mutasi sisa sistein yang diarahkan tapak kepada alanin, kami mendapati bahawa residu sistein pada kedudukan 52 adalah tapak teras yang diperlukan untuk interaksi (Rajah 3c). Keputusan ini menyediakan asas untuk kajian lanjut tentang fungsi fisiologi interaksi CFEM85-WAK16.

3.3. Interaksi MaCFEM85 dengan MsWAK16 Activated Plant Defenses

Dalam interaksi mikrob-tumbuhan, tindak balas pertahanan tumbuhan secara amnya diaktifkan oleh protein efektor mikrob. Pertahanan teraruh menjadi alat penting dalam kawalan perosak biologi untuk menggalakkan rintangan. Protein CFEM telah dikenal pasti sebagai efektor yang terlibat dalam pengawalan pengaktifan atau perencatan imun tumbuhan [28,46]. Walau bagaimanapun, terdapat kekurangan penyelidikan yang diterbitkan yang menghubungkan peraturan faktor imun ini kepada peranan khusus mereka dalam penyakit tumbuhan dan rintangan serangga. Dalam kajian ini, kami menggunakan kulat entomopatogenik dan endofit, M. anisopliae, untuk mengenal pasti interaksi antara MaCFEM85 dan kinase yang berkaitan dengan dinding sel, MsWAK16, dalam M. sativa. Keputusan menunjukkan bahawa interaksi ini mengurangkan nisbah lesi selepas inokulasi dengan B. cinerea (Rajah 4b) dan menurunkan kadar pertumbuhan populasi M. persicae (Rajah 4d), menunjukkan interaksi antara MaCFEM85 dan MsWAK16 meningkatkan ketahanan M. sativa terhadap aphids. Perubahan dalam tahap JA, SA, dan etilena (ET) boleh digunakan sebagai penanda untuk menilai induksi rintangan tumbuhan [47,48]. Di sini, kami menunjukkan bahawa MaCFEM85 berinteraksi dengan MsWAK16 untuk mempengaruhi rintangan tumbuhan melalui peraturan hormon dan untuk menghalang kadar pembiakan M. persicae (Rajah 4d). Kajian serupa telah dilaporkan sebelum ini. Sebagai contoh, protein Brevibacillus laterosporus effector PeBL1 telah ditunjukkan untuk mendorong pengumpulan JA dan SA dalam tomato dan mengurangkan kadar pertumbuhan populasi generasi kedua dan ketiga M. persicae yang diberi makan pada tumbuhan tersebut. Selain itu, tumbuhan tomato yang disembur dengan efektor mempunyai kesan penghalau pada M. persicae [49]. Penggunaan protein elicitor PeBC1 pada kacang biasa (Phaseolus vulgaris L.) membawa kepada kesan sub-maut yang ketara dan ketara pada aphid pic hijau. Tumbuhan yang dirawat dengan PeBC1 menunjukkan peningkatan ketara gen yang berkaitan dengan JA dan SA [50]. Elicitor Beauveria bassiana PeBb1 mengurangkan kesuburan M. persicae pada tembakau dan mendorong ekspresi gen berkaitan JA dan ET [51]. Dalam kajian ini, ekspresi sementara MaCFEM85 dan MsWAK16 dalam tembakau secara signifikan mengimbangi gen berkaitan tindak balas JA COI1, MYC2, dan PDF1.2 (Rajah 5b) dan peningkatan JA dan jumlah kandungan flavonoid (Rajah 5a), yang setanding dengan keputusan. dalam literatur seperti yang diterangkan di atas. Walau bagaimanapun, kami tidak mengesan tahap SA yang tinggi dalam tembakau 12 jam selepas penyusupan, dan tumbuhan yang secara sementara menyatakan MsWAK16 atau MaCFEM85+MsWAK16 menunjukkan tahap SA yang berkurangan dengan ketara dan regulasi rendah gen yang terlibat dalam tindak balas SA (Rajah 5a,b) . Ini menunjukkan bahawa rangsangan hormon tumbuhan yang berbeza boleh membawa bukan sahaja kepada aktiviti sinergi tetapi juga kepada crosstalk dan maklum balas, membolehkan tumbuhan bertindak balas dengan sewajarnya kepada rangsangan yang berbeza. Peningkatan tahap JA tetapi tahap SA yang rendah telah dilaporkan sebelum ini dalam tumbuhan. Sebagai contoh, dalam A. thaliana yang rosak untuk pengumpulan SA, tahap JA adalah 25-kali ganda lebih tinggi daripada jenis liar A. thaliana, dan gen responsif JA telah diaktifkan [52]. Ia juga telah dilaporkan bahawa sesetengah bakteria boleh meningkatkan tahap JA dalam tumbuhan untuk menghalang pengumpulan SA, mengelakkan bahaya yang disebabkan oleh SA. Sebagai contoh, Pseudomonas syringae menyasarkan reseptor COI1 melalui toksin, koronatin, yang secara negatif mengawal laluan JA [53]. Ini menggalakkan MYC2-meningkatkan kawal selia faktor transkripsi ANAC019, ANAC055 dan ANAC072 [54], menghalang transkripsi ICS1 (gen utama untuk sintesis SA) dan dengan itu menurunkan kawal selia pengeluaran SA dan transduksi isyarat. Dalam kajian ini, interaksi antara MaCFEM85 dan MsWAK16 membawa kepada peningkatan pengumpulan JA dan pengawalseliaan gen responsif JA tetapi perencatan pengumpulan SA dan transkripsi gen berkaitan SA. Ini menunjukkan bahawa interaksi antara MaCFEM85 dan MsWAK16 mendorong JA, dengan itu meningkatkan ketahanan tumbuhan terhadap kutu daun.

Dalam N. benthamiana secara sementara menyatakan MaCFEM85 dan MsWAK16, tahap JA meningkat dan saiz lesi B. cinerea berkurangan (Rajah 4b), selaras dengan kajian terdahulu. JA terlibat dalam rintangan tumbuhan terhadap serangga dan patogen nekrotropik [52,55]. Sebagai patogen nekrotropik, B. cinerea telah dihalang oleh pengumpulan JA dan ET [56]. Dalam mutan ein kekurangan A. thaliana ET2-1 dan coi mutan tindak balas JA1-1, tahap gen pertahanan hiliran, PDF1.2 telah dikurangkan dengan ketara dan sensitiviti kepada B. cinerea telah dipertingkatkan [ 57]. Kami mendapati di sini bahawa pengumpulan JA dan transkripsi gen berkaitan JA telah meningkat dengan ketara dalam N. benthamiana secara sementara menyatakan MaCFEM85 dan MsWAK16, manakala pengumpulan SA dan transkripsi gen berkaitan SA telah dihalang. Ekspresi MaCFEM85 dan MsWAK16 juga menunjukkan kesan perencatan pada B. cinerea. Ini menunjukkan bahawa JA telah diaktifkan oleh MaCFEM85 dan MsWAK16 dan memainkan peranan utama dalam rintangan tumbuhan terhadap B. cinerea.

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Strain Kulat, Bahan Tumbuhan, dan Kaedah Pengkulturan

Strain pencilan Metarhizium anisopliae Ma 9 telah dibiakkan pada medium kentang-gula-agar (PSA) (200 g ekstrak kentang kupas direbus dalam air, 20 g sukrosa dan 15 g agar/L). Serbuk sporangium segar dikumpul selepas 10 hari. Tumbuhan Nicotiana benthamiana ditanam dalam ruang iklim buatan dengan kitaran cahaya/gelap 14/10 jam (27/25 ◦C). Untuk ekspresi gen sementara melalui transformasi Agrobacterium-mediated, Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 telah dibiakkan dalam medium Luria Broth (LB) (10 g tryptone, 5 g ekstrak yis, dan 10 g NaCl/L). Strain yis Gold (OE Biotech Co., Ltd., Shanghai, China) telah dikultur pada medium ekstrak yis peptone dextrose (YPDA) (10 g ekstrak yis, 20 g peptone, 20 g glukosa dan 0.03 g adenine hemisulfate/L). Untuk setiap vektor dan strain, antibiotik yang sesuai digunakan, iaitu rifampin, kanamycin, atau ampicillin (masing-masing 25, 50, atau 50 µg/mL). Strain dan plasmid yang digunakan dalam kajian ini disenaraikan dalam Jadual Tambahan S1. Biji Medicago sativa disterilkan di permukaan dengan 75% etanol selama 1 minit, diikuti dengan 50% NaClO (5.5%) selama 15 minit. Biji benih dicampur dengan teliti dan kemudian dibasuh dalam air steril tiga kali selama 5 minit setiap satu. Biji benih telah diinkubasi pada suhu 4 ◦C dalam gelap selama lebih 24 jam, kemudian bercambah pada plat agar air 1% pada suhu bilik semalaman. Tiga hari selepas percambahan, anak benih yang sedang berkembang dipindahkan ke kertas turas pada 9-sm cawan petri steril, dengan 20 anak benih setiap hidangan. Rawatan dan kawalan telah diperuntukkan kepada 15 hidangan setiap satu. Anak benih kemudiannya diairi dengan 10 mL suspensi spora M. anisopliae yang mengandungi 107/mL, dan kawalan disiram dengan 10 mL air steril. Pada 0, 12, 24, 48, dan 60 jam, pemilihan anak benih secara rawak diambil daripada tiga cawan petri untuk setiap selang masa. Sampel dibekukan dalam nitrogen cecair dan disimpan pada suhu -80 ◦C.

4.2. qRT-PCR dan Pembinaan Plasmid

Jumlah RNA telah diekstrak daripada M. anisopliae (hyphae) dan M. sativa (akar) dengan reagen TRIzol (Invitrogen, CA, USA) mengikut arahan pengilang. Kualiti dan kelimpahan RNA yang terhasil diukur dengan NanoPhotometer® (Implen, Münich, Jerman). Sintesis cDNA untaian pertama (sehingga 2ug RNA) dilakukan menggunakan 5× Campuran Induk RT All-In-One (Bahan Biologi Gunaan Inc., Vancouver, BC, Kanada) mengikut arahan pengilang. qRT-PCR telah dilakukan menggunakan 2×SYBR Green qPCR Master Mix daripada US EVER BRIGHT ® INC. dan sistem ABI QuantStudio 5 mengikut arahan pengilang. Primer yang digunakan untuk setiap gen disenaraikan dalam Jadual Tambahan S2. Maury [58], Msactin [59] dan Nbactin [60] telah digunakan sebagai gen rujukan dalaman untuk menormalkan data ungkapan. Tindak balas dilakukan di bawah keadaan berikut: 5 min pada 95 ◦C, diikuti dengan 40 kitaran pada 95 ◦C selama 15 s dan pada 60 ◦C selama 40 s. Terdapat tiga replika teknikal untuk setiap sampel. Ungkapan relatif dikira menggunakan kaedah 2−∆∆Ct [61]. Kepentingan statistik ditentukan menggunakan analisis varians sehala (ANOVA) dan ujian julat berbilang Duncan dalam SPSS v20.0 (SPSS).

4.3. Ekspresi Sementara Protein dalam N. benthamiana

Urutan pengekodan MaCFEM85 (CDS) telah dikuatkan dengan polimerase DNA ultra-fidelity menggunakan cDNA sebagai templat. Untuk ujian penyetempatan subselular, produk PCR yang mengandungi CDS untuk MaCFEM85 telah diklonkan ke pYBA1132-eGFP (dicerna dengan EcoRI dan SalI) dan pcambia1300-ceri (EcoRI dan SacI), masing-masing. Semua binaan telah disahkan dengan penjujukan (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Beijing, China). Primer yang digunakan dalam kajian ini disenaraikan dalam Jadual Tambahan S2. Untuk ungkapan sementara MaCFEM85-eGFP dan MaCFEM85-mCherry dalam N. benthamiana, A. tumefaciens strain GV3101 telah diubah dengan setiap plasmid dan disahkan dengan PCR. Agrobacterium dibiakkan semalaman pada suhu 28 ◦C dengan digoncang. Sel-sel telah dikumpulkan melalui sentrifugasi 5 min 5000 rpm pada suhu bilik, dibasuh tiga kali dengan air suling dua kali steril, dan digantung semula dalam penimbal 10 mM MgCl2 (mengandungi 10 mM MES dan 10 mM acetosyringone, pH 5.7). Suspensi sel telah dilaraskan kepada OD600 sebanyak 0.5, kemudian menyusup ke bahagian bawah 4- hingga 5-daun N. benthamiana berumur seminggu dengan picagari 1-mL. Setiap daun disusup dengan 50 µL A. tumefaciens; tiga helai daun dirawat setiap tumbuhan dan tiga tumbuhan berada dalam setiap kumpulan rawatan. Daun yang dirawat dikumpulkan selepas 30 jam dan divisualisasikan dengan mikroskop confocal Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Jerman) untuk menentukan penyetempatan sub-selular.

manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun

4.4. Analisis Filogenetik

Sebatang pokok filogenetik telah dibina menggunakan kaedah penyambung jiran dalam MEGA X. 1000 replika bootstrap menggunakan model jarak P. Urutan asid amino yang digunakan untuk menjana pokok diperolehi dengan carian BLASTP terhadap pangkalan data NCBI kulat berkaitan (cth, Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus fumigatus, Lasiodiplodia the , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana dan Paecilomyces lilacinus) menggunakan MaCFEM85 sebagai pertanyaan.

4.5. Ujian Ragi Dua Hibrid

Sistem Dua Hibrid Ragi Emas Matchmaker (Clontech Laboratories, Inc.; kini Takara Bio USA, Inc.) telah digunakan untuk mengesahkan interaksi antara MaCFEM85 dan MsWAK16. MaCFEM85 tanpa isyarat peptida telah dimasukkan ke dalam pGBKT7 sebagai umpan dan domain ekstraselular MsWAK16 (MsWAK16-ED) telah dimasukkan ke dalam pGADT7 sebagai mangsa. Penyediaan dan transformasi sel kompeten yis telah dilakukan menggunakan Kit Transformasi Yeast II Frozen-EZ (ZYMO Research, CA, USA) mengikut arahan pengilang. Umpan dan plasmid mangsa telah bertukar bersama menjadi strain yis Emas. Interaksi protein-protein dianalisis berdasarkan pertumbuhan pada medium keciciran SD berganda (DDO, SD/-Trp-Leu) dan plat keciciran SD empat kali ganda (QDO, SD/-Trp-Leu-His-Ade).

4.6. Ujian BiFC

Untuk menjana binaan BiFC, vektor pUC-SPYNE dan pUC-SPYCE telah dilinearkan oleh pencernaan dengan BamHI. CDS panjang penuh MaCFEM85 dan MsWAK16 masing-masing diklon dan dimasukkan ke dalam plasmid linear menggunakan enzim rekombinan untuk mendapatkan binaan MaCFEM85-YFPN dan MsWAK16-YFPC. Plasmid yang mengandungi MaCFEM85 dan MsWAK16 telah ditukarkan bersama dengan vektor kosong sebagai kawalan negatif (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE dan pUC-SPYNE + pUC-SPYCE) . Semua vektor telah dimasukkan ke dalam N. benthamiana melalui transformasi pengantaraan Agrobacterium seperti yang diterangkan di atas. Isyarat pendarfluor diperhatikan dalam sel epidermis daun menggunakan mikroskop confocal Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Jerman). Primer yang digunakan untuk pembinaan vektor disenaraikan dalam Jadual Tambahan S2.

4.7. Ujian Pull-Down GST

Untuk ujian tarik turun GST, MsWAK16-ED telah dimasukkan ke dalam vektor pGEX-6P-2 dan MaCFEM85 telah dimasukkan ke dalam pET-21b. Protein gabungan tulen (GST- MsWAK16- ED) dan pGEX-6P-2 protein tanpa beban (GST) telah digunakan sebagai protein umpan dan pET yang telah dimurnikan-21 Protein gabungan b-MaCFEM85 (His-MaCFEM85) digunakan sebagai mangsa. Ujian tarik turun GST telah dilakukan dengan sistem penulenan protein Mag-Beads GST Fusion (Sangon Biotech, Shanghai, China) mengikut arahan pengilang. Secara ringkas, Mag-Beads telah dibasuh lima kali dengan 1× garam penimbal fosfat (PBS, pH 7.4) untuk melepaskan pelindung alkohol dan 10 mL GST atau GST-MsWAK16-ED kemudiannya ditambah. Manik dicampur dengan penyongsangan pada suhu bilik selama 30 minit. Selepas mengeluarkan supernatan, Mag-Beads dibasuh lima kali dengan 1 × PBS. His-MaCFEM85 telah ditambahkan pada Mag-Beads yang sudah terikat dengan GST, dan campuran itu diinkubasi semalaman pada suhu 4 ◦C dengan putaran. Manik-manik itu kemudiannya dibasuh lima kali dengan 1 × PBS untuk mengeluarkan protein yang tidak terikat. Selepas itu, protein yang tidak bergerak pada manik dipisahkan oleh SDS-PAGE, dipindahkan ke membran nitroselulosa (100 V, 1 jam), dan dianalisis melalui Western blot. Membran dibasuh tiga kali selama 10 minit setiap satu dengan PBS + Tween (PBST). Membran telah disekat selama 2 jam pada suhu bilik dengan susu skim 5%, kemudian diinkubasi dengan antibodi monoklonal tetikus anti-His ProteinFind (TransGen Biotech, Beijing, China) (dicairkan 1:3000) atau antibodi monoklonal tetikus anti-GST ProteinFind selama 2 h pada 4 ◦C. Membran kemudian direndam dalam antibodi IgG(H+L) (HRP) anti-arnab ProteinFind (TransGen Biotech, Beijing, China) (dicairkan 1:5000) selama 1 jam pada suhu bilik. Membran telah divisualisasikan dengan EasySee® Western Blot Kit (TransGen Biotech, Beijing, China) mengikut arahan pengilang.

4.8. Pengenalpastian Tapak Utama dalam MaCFEM85

Untuk menentukan saiz yang diperlukan untuk interaksi MaCFEM85 dengan MsWAK16, penguatan PCR telah dilakukan untuk menghasilkan pelbagai bentuk terpotong MaCFEM85. Domain CFEM (MaCFEM85-CFEM; residu aa 19–86) dan terminal C tanpa domain CFEM (MaCFEM85-C, residu aa 87–170) telah dimasukkan ke dalam vektor pGBKT7 sebagai protein umpan (Jadual Tambahan S1). Lima lagi varian telah dibina menggunakan sintesis polipeptida untuk mengubah sistein kepada alanin pada kedudukan 26, 30, 43, 52, dan 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8530, ∆3, CFEM8 CFEM8552, dan ∆CFEM858 semuanya, masing-masing). Varian ini digunakan untuk melakukan percubaan Y2H dengan MsWAK16-ED. Sel yis yang diubah telah diuji untuk pertumbuhan pada plat SD/- Trp-Leu tercicir sintetik dan plat SD/-Trp-Leu-His-Ade yang mengandungi X- -Galactosidase (X- -Gal).

4.9. Ujian Rintangan Tumbuhan

Myzus persicae diperoleh daripada Henan Quanying Biological Co., Ltd. Seminggu sebelum permulaan bioassay, 150 kutu daun dewasa diletakkan pada tiga pokok N. benthamiana (50 kutu daun setiap tumbuhan). Selepas 72 jam, semua orang dewasa dikeluarkan dengan berus artis lembut, dan nimfa dibenarkan makan selama empat hari tambahan sebelum dipindahkan ke N. benthamiana untuk ujian prestasi aphid.

4.10. Ujian Prestasi Aphid

Nicotiana benthamiana Domin. (Solanales: Solanaceae) digunakan untuk menilai prestasi M. persicae, rintangan penyakit tumbuhan terhadap B. cinerea, dan ekspresi gen berkaitan hormon. Agrobacterium yang membawa sama ada pYBA-eGFP, pYBA-MaCFEM85, pYBA-MsWAK16 atau pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16 telah ditanam dalam LB ditambah dengan antibiotik yang sesuai selama 36 jam pada suhu 28 ◦C. Sel-sel telah dibasuh tiga kali, kemudian digantung semula dalam penimbal penyusupan (10 mM MgCl2, 10 mM MES dan 100 µM acetosyringone, pH 5.6) kepada OD600 0.6. Untuk jangkitan bersama, bakteria yang membawa MaCFEM85 dan MsWAK16 dilaraskan kepada OD600 sebanyak 1.2, dan kemudian dicampur dalam jumlah yang sama. Daun yang mengembang sepenuhnya telah diserap dengan bakteria menggunakan 1-mL picagari tanpa jarum. Tiga daun telah disusup pada setiap tumbuhan dan setiap rawatan digunakan pada tiga tumbuhan untuk sejumlah 12 tumbuhan setiap eksperimen.

Untuk ujian prestasi aphid, 20 aphids dewasa telah digunakan pada kawasan penyusupan setiap daun 12 jam selepas Agrobacterium digunakan. Kutu daun telah dikurung menggunakan sangkar klip diameter 5 mm. Setiap rawatan diulang lima kali. Kematian aphid dewasa dan bilangan nimfa yang baru bertelur direkodkan setiap hari selama tiga hari. B. cinerea dikultur selama lima hari pada PDAY. Pada 12 jam selepas penyusupan Agrobacterium, B. cinerea yang baru ditanam ditumbuk ke dalam kek kulat 5-mm, dan permukaan pertumbuhan miselium dilekatkan pada kawasan penyusupan pada permukaan daun. Untuk memudahkan perkembangan penyakit, tumbuhan dikekalkan lembap dengan menutupnya dengan filem plastik dalam dulang pada suhu 22 ◦C untuk memudahkan perkembangan penyakit. Selepas 48 jam, kemajuan penyakit dianggarkan dalam daun yang diinokulasi dengan mengukur saiz lesi. Untuk mengukur ekspresi relatif gen yang berkaitan, tiga daun yang menyusup dikumpulkan dari setiap tumbuhan 12 jam selepas penyusupan, kemudian dibekukan dalam nitrogen cecair dan disimpan pada -80 darjah . Jumlah pengekstrakan RNA, sintesis cDNA, dan qRT-PCR telah dijalankan seperti yang diterangkan dalam Bahagian 3.2. Asid salisilik (SA), asid jasmonic (JA), dan paras flavonoid diukur dalam 15 daun N. benthamiana yang ditapis dalam setiap rawatan. Daun dikumpulkan, dibekukan dalam nitrogen cecair, kemudian disimpan pada suhu -80 darjah . Hormon tumbuhan dikira menggunakan Kit ELISA Asid Salisiklik Tumbuhan dan Asid Jasmonic Tumbuhan (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.), dan flavonoid dikira menggunakan Kit Ujian Flavonoid Tumbuhan Mikro (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) berikutan arahan pengeluar.

4.11. Analisis statistik

Data telah dianalisis dalam SPSS v20.0. Perbezaan ketara dalam tahap ekspresi MaCFEM85 dan MsWAK16 ditentukan menggunakan ujian-t Pelajar. Perbezaan ketara dalam tahap SA, JA, dan flavonoid ditentukan menggunakan ANOVA sehala dan ujian pelbagai julat Duncan dengan ambang p <0.05.

5. Kesimpulan

Dalam kajian ini, kami mengenal pasti dan mencirikan protein yang dirembeskan novel, MaCFEM85, dalam M. anisopliae. Ia didapati sebagai efektor terpelihara yang boleh berinteraksi dengan MsWAK16 dan mengaktifkan tindak balas pertahanan N. benthamiana. Kami menunjukkan bahawa domain CFEM dan residu sistein pada kedudukan 52 dalam MaCFEM85 adalah kritikal untuk interaksi. Interaksi ini boleh mengaktifkan tindak balas imun yang berkaitan dengan JA dan mekanisme tahan penyakit dan tahan serangga dalam tumbuhan.

Rujukan

1. Paulucci, NS; Anta, GG; Gallarato, LA; Vicario, JC; Cesari, AB; Reguera, YB; Kilmurray, C.; Bueno, MA; Garcia, MB; Dardanelli, MS Perkongsian Tumbuhan-mikrob: Implikasi untuk pertumbuhan dan kesihatan tumbuhan. Dalam Simbiosis Mikrob Tumbuhan: Asas dan Kemajuan; Springer: Berlin/Heidelberg, Jerman, 2013; ms 105–117. [CrossRef]

2. Schenk, PM; Carvalhais, LC; Kazan, K. Membongkar interaksi tumbuhan-mikrob: Bolehkah transkriptomi berbilang spesies membantu? Trend Bioteknol. 2012, 30, 177–184. [CrossRef]

3. Sasse, J.; Martinoia, E.; Northen, T. Makan Rakan Anda: Adakah Eksudat Tumbuhan Membentuk Mikrobiom Akar? Trends Plant Sci. 2018, 23, 25–41. [CrossRef]

4. Lugtenberg, B.; Kamilova, F. Rhizobakteria penggalak pertumbuhan tumbuhan. Annu. Mikrobiol Rev. 2009, 63, 541–556. [CrossRef]

5. Shoresh, M.; Harman, GE; Mastouri, F. Terinduksi rintangan sistemik dan tindak balas tumbuhan kepada agen biokawalan kulat. Annu. Rev. Phytopathol. 2010, 48, 21–43. [CrossRef]

6. van de Mortel, JE; de Vos, RC; Dekkers, E.; Pineda, A.; Guillod, L.; Bouwmeester, KJ; van Loon, J.; Dicke, M.; Raaijmakers, JM Metabolik dan perubahan transkriptik yang disebabkan dalam Arabidopsis oleh rhizobacterium Pseudomonas fluorescens SS101. Fisiol Tumbuhan. 2012, 160, 2173–2188. [CrossRef]

7. Lareen, A.; Burton, F.; Schafer, P. Komunikasi akar-mikrob tumbuhan dalam membentuk mikrobiom akar. Tumbuhan Mol. biol. 2016, 90, 575–587. [CrossRef]

8. Sasan, RK; Bidochka, MJ Kulat serangga-patogenik Metarhizium Roberts (Clavicipitaceae) juga merupakan endofit yang merangsang perkembangan akar tumbuhan. Am. J. Bot. 2012, 99, 101–107. [CrossRef]

9. Sasan, RK; Bidochka, MJ Antagonisme kulat patogen serangga endofit Metarhizium robertsii terhadap patogen tumbuhan kacang Fusarium solanif. sp. faseoli. boleh. J. Tumbuhan Pathol. 2013, 35, 288–293. [CrossRef]

10. Ahmad, I.; Jiménez-Gasco, MdM; Luthe, DS; Shakeel, SN; Barbercheck, ME Endophytic Metarhizium robertsii menggalakkan pertumbuhan jagung, menyekat pertumbuhan serangga dan mengubah ekspresi gen pertahanan tumbuhan. biol. Kawalan 2020, 144, 104167. [CrossRef]

11. Chairin, T.; Petcharat, V. Induksi tindak balas pertahanan dalam buah Hongkong (Aglaia dookkoo Griff.) terhadap kulat reput buah oleh Metarhizium guizhouense. biol. Kawalan 2017, 111, 40–44. [CrossRef]

12. Hao, K.; Wang, F.; Nong, X.; McNeill, MR; Liu, S.; Wang, G.; Cao, G.; Zhang, Z. Tindak balas akar kacang Arachis hypogaea terhadap kehadiran kulat yang bermanfaat dan patogenik oleh analisis transkriptom. Sci. Rep. 2017, 7, 964. [CrossRef] [PubMed]

13. Patel, ZM; Mahapatra, R.; Jampala, SSM Bab 11—Peranan elicitor kulat dalam mekanisme pertahanan tumbuhan. Dalam Aspek Molekul Mikrob Berfaedah Tumbuhan dalam Pertanian; Sharma, V., Salwan, R., Al-Ani, L., Eds.; Akhbar Akademik: Cambridge, MA, Amerika Syarikat, 2020; ms 143–158. [CrossRef]

14. Dong, X.; Sa, JA Ethylene, dan rintangan penyakit dalam tumbuhan. Curr. Pendapat. Biol Tumbuhan. 1998, 1, 316–323. [CrossRef] [PubMed]

15. Thomma, BP; Eggermont, K.; Penninckx, IA; Mauch-Mani, B.; Vogelsang, R.; Cammue, BP; Broekaert, WF Laluan tindak balas pertahanan yang bergantung kepada jasmonate dan salisilat yang berasingan dalam Arabidopsis adalah penting untuk penentangan terhadap patogen mikrob yang berbeza. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 15107–15111. [CrossRef] [PubMed]

16. Pant, SR; Irigoyen, S.; Liu, J.; Bedre, R.; Christensen, SA; Schmelz, EA; Sedbrook, JC; Scholthof, K.-BG; Mandadi, KK Brachypodium Phenylalanine ammonia lyase (PAL) Menggalakkan pertahanan antivirus terhadap virus Panicum mozek dan satelitnya. mBio 2021, 12, e03518-20. [CrossRef]

17. Liu, R.; Xu, S.; Li, J.; Hu, Y.; Lin, Z. Profil ekspresi gen PAL daripada Astragalus membranaceus var. Mongholicus dan peranan pentingnya dalam fluks ke biosintesis flavonoid. Rep Sel Tumbuhan 2006, 25, 705–710. [CrossRef]

18. De Geyter, N.; Gholami, A.; Goorachtig, S.; Goossens, A. Jentera transkripsi dalam metabolisme sekunder tumbuhan yang ditimbulkan jasmonate. Trends Plant Sci. 2012, 17, 349–359. [CrossRef]

19. Mirjalili, N.; Linden, JC Kesan komposisi fasa Gas pada budaya penggantungan Taxus cuspidata. Bioteknol. Bioeng. 1995, 48, 123–132. [CrossRef]

20. Li, ST; Zhang, P.; Zhang, M.; Fu, CH; Zhao, CF; Dong, YS; Guo, AY; Yu, LJ Profil transkrip sel taxus chinensis sebagai tindak balas kepada metil jasmonate. BMC Genom. 2012, 13, 295. [CrossRef]

21. Tugizimana, F.; Ncube, EN; Steenkamp, ​​PA; Dubery, IA Metabolomics memperoleh pandangan tentang manipulasi sintesis terpenoid dalam sel Centella asiatica oleh metil jasmonate. Bioteknol Tumbuhan. Rep. 2015, 9, 125–136. [CrossRef]

22. Lu, M.; Wong, H.; Teng, W. Kesan elisitasi terhadap penghasilan saponin dalam kultur sel Panax ginseng. Rep Sel Tumbuhan 2001, 20, 674–677. [CrossRef]

23. Mandal, S.; Kar, I.; Mukherjee, AK; Acharya, P. Tindak balas pertahanan yang disebabkan oleh Elicitor dalam Solanum lycopersicum terhadap Ralstonia solanacearum. Sci. World J. 2013, 25, 561056. [CrossRef]

24. Li, L.; Wang, S.; Yang, X.; Francis, F.; Qiu, D. Protein elicitor PeaT1 meningkatkan ketahanan terhadap aphid (Sitobion avenae) dalam gandum. Pest Manag. Sci. 2020, 76, 236–243. [CrossRef] [PubMed]

25. Bujalowski, W. Meluaskan peranan fisiologi helikase DnaB heksamerik. Trend Biochem. Sci. 2003, 28, 116–118. [CrossRef]

26. Vaknin, Y.; Shadkchan, Y.; Levdansky, E.; Morozov, M.; Romano, J.; Osherov, N. Tiga protein berlabuh GPI domain Aspergillus fumigatus CFEM (CfmA-C) menjejaskan kestabilan dinding sel tetapi tidak memainkan peranan dalam virulensi kulat. kulat. Genet. biol. 2014, 63, 55–64. [CrossRef]

27. Zhao, S.; Shang, X.; Bi, W.; Yu, X.; Liu, D.; Kang, Z.; Wang, X.; Wang, X. Genome-Wide Pengenalpastian calon effector dengan motif terpelihara daripada kulat karat daun gandum Puccinia triticina. Depan. mikrobiol. 2020, 11, 1188. [CrossRef]

28. Gong, A.; Jing, Z.; Zhang, K.; Tan, Q.; Wang, G.; Liu, W. Analisis bioinformatik dan pencirian fungsi protein CFEM dalam kulat antraknosa jagung Colletotrichum graminicola. J. Integr. Agric. 2020, 19, 541–550. [CrossRef]

29. Martin, F.; Aerts, A.; Ahren, D.; Brun, A.; Danchin, EG; Duchaussoy, F.; Gibon, J.; Kohler, A.; Lindquist, E.; Pereda, V.; et al. Genom Laccaria bicolor memberikan pandangan tentang simbiosis mikoriza. Alam 2008, 452, 88–92. [CrossRef]

30. Stefan, V.; Lara, RJ Kulat entomopatogen sebagai endofit: Interaksi tumbuhan-endofit-herbivor dan prospek untuk digunakan dalam kawalan biologi. Curr. Sci. 2015, 109, 46–54.

31. Cai, N.; Liu, R.; Yan, D.; Zhang, N.; Zhu, K.; Zhang, D.; Nong, X.; Tu, X.; Zhang, Z.; Wang, G. Analisis bioinformatik dan pencirian fungsi protein CFEM Metarhizium anisopliae. J. Kulat. 2022, 8, 661. [CrossRef]

32. Stephens, C.; Hammond-Kosack, KE; dan Kanyuka, K. WAKsing keimunan tumbuhan, penyakit yang semakin berkurangan. J. Exp. Bot 2022, 73, 22–37. [CrossRef]

33. Zhang, ZN; Wu, QY; Zhang, GZ; Zhu, YY; Murphy, RW; Liu, Z.; Zou, CG Analisis sistematik mendedahkan keunikan dan asal usul domain CFEM dalam kulat. Sci. Rep. 2015, 5, 13032. [CrossRef] [PubMed]

34. Fang, A.; Gao, H.; Zhang, N.; Zheng, X.; Qiu, S.; Li, Y.; Zhou, S.; Cui, F.; Sun, W. Gen efektor novel SCRE2 menyumbang kepada virulensi penuh Ustilaginoidea virens kepada beras. Depan. mikrobiol. 2019, 10, 845. [CrossRef] [PubMed]

35. Zhu, W.; Wei, W.; Wu, Y.; Zhou, Y.; Peng, F.; Zhang, S.; Chen, P.; Xu, X. BcCFEM1, protein yang mengandungi domain CFEM dengan tapak berlabuh GPI yang diduga, terlibat dalam patogenik, pengeluaran konid dan toleransi tekanan dalam Botrytis cinerea. Depan. mikrobiol. 2017, 8, 1807. [CrossRef]

36. Xu, X.; Li, G.; Li, L.; Su, Z.; Chen, C. Analisis perbandingan seluruh genom bagi reseptor bergandingan protein G yang diduga Pth11-dalam kulat kepunyaan Pezizomycotina. Mikrobiol BMC. 2017, 17, 166. [CrossRef] [PubMed]

37. Peng, YJ; Hou, J.; Zhang, H.; Lei, JH; Lin, HY; Ding, JL; Feng, MG; Ying, SH Sumbangan sistematik domain CFEM yang mengandungi protein kepada pemerolehan besi adalah penting untuk interaksi interspesies kulat patogen berfilamen Beauveria bassiana. alam sekitar. mikrobiol. 2022, 24, 3693–3704. [CrossRef] [PubMed]

38. Roy, U.; Kornitzer, D. Heme-iron pemerolehan dalam kulat. Curr. Pendapat. mikrobiol. 2019, 52, 77–83. [CrossRef] [PubMed]

39. Okamoto-Shibayama, K.; Kikuchi, Y.; Kokubu, E.; Sato, Y.; Ishihara, K. Csa2, ahli keluarga protein Rbt5, terlibat dalam penggunaan besi daripada hemoglobin manusia semasa pertumbuhan hifa Candida albicans. FEMS Yis Res. 2014, 14, 674–677. [CrossRef]

40. Perez, A.; Pedros, B.; Murgui, A.; Casanova, M.; Lopez-Ribot, JL; Martinez, JP Biofilm pembentukan oleh mutan Candida albicans untuk gen pengekodan protein kulat yang mempamerkan domain CFEM yang mengandungi lapan sistein. FEMS Yis Res. 2006, 6, 1074–1084. [CrossRef]

41. Hogg, PJ Ikatan disulfida sebagai suis untuk fungsi protein. Trend Biochem. Sci. 2003, 28, 210–214. [CrossRef]

42. van den Burg, HA; Westerink, N.; Francoijs, KJ; Roth, R.; Woestenek, E.; Boeren, S.; de Wit, PJ; Joosten, MH; Vervoort, J. Mutan tergendala ikatan disulfida semula jadi AVR4 patogen tomato Cladosporium fulvum adalah sensitif kepada proteolisis, memintas rintangan pengantara Cf-4-, tetapi mengekalkan keupayaan mengikat kitinnya. J. Biol. Kimia. 2003, 278, 27340–27346. [CrossRef] 43. Hu, K.; Cao, J.; Zhang, J.; Xia, F.; Ke, Y.; Zhang, H.; Xie, W.; Liu, H.; Cui, Y.; Cao, Y.; et al. Penambahbaikan pelbagai sifat agronomik oleh gen rintangan penyakit melalui pengukuhan dinding sel. Nat. Tumbuhan 2017, 3, 17009. [CrossRef] [PubMed]

44. Saitoh, H.; Fujisawa, S.; Mitsuoka, C.; Ito, A.; Hirabuchi, A.; Ikeda, K.; Irieda, H.; Yoshino, K.; Yoshida, K.; Matsumura, H.; et al. Gangguan gen berskala besar dalam Magnaporthe oryzae mengenal pasti MC69, protein yang dirembeskan yang diperlukan untuk jangkitan oleh patogen kulat monokot dan dikotil. Pathog PLoS. 2012, 8, e1002711. [CrossRef] [PubMed]

45. Kulkarni, RD; Kelkar, HS; Dean, R. Domain CFEM yang mengandungi lapan sistein yang unik kepada sekumpulan protein membran kulat. Trend Biochem. Sci. 2013, 28, 118–121. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Peng, J.; Wu, L.; Zhang, W.; Zhang, Q.; Xing, Q.; Wang, X.; Li, X.; Yan, J. Pengenalan sistemik dan pencirian fungsi yang biasa dalam protein membran ekstraselular kulat dalam Lasiodiplodia theobromae. Depan. Sci tumbuhan. 2021, 12, 804696. [CrossRef]

47. Bari, R.; Jones, JD Peranan hormon tumbuhan dalam tindak balas pertahanan tumbuhan. Tumbuhan Mol. biol. 2009, 69, 473–488. [CrossRef]

48. Verma, V.; Ravindran, P.; Kumar, PP Peraturan pengantara hormon tumbuhan bagi tindak balas tekanan. BMC Plant Biol. 2016, 16, 86. [CrossRef]

49. Javed, K.; Qiu, D. Protein elicitor PeBL1 dari Brevibacillus laterosporus meningkatkan daya tahan terhadap Myzus persicae dalam Tomato. Patogen 2020, 9, 57. [CrossRef]

50. Basit, A.; Hanan, A.; Nazir, T.; Majeed, MZ; Qiu, D. Pencirian molekul dan fungsi elicitor PeBC1 yang diekstrak daripada Botrytis cinerea yang terlibat dalam induksi rintangan terhadap aphid pic hijau (Myzus persicae) dalam kacang biasa (Phaseolus vulgaris L.). Serangga 2019, 10, 35. [CrossRef]

51. Nazir, T.; Hanan, A.; Basit, A.; Majeed, MZ; Anwar, T.; Nawaz, I.; Qiu, D. Peranan penyingkiran penyingkir protein yang belum dicirikan PeBb1 Diperoleh daripada Beauveria bassiana ARSEF 2860 Terikan terhadap Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) dalam Brassica rapa ssp. pekinensis. Patogen 2020, 9, 111. [CrossRef]

52. Spoel, SH; Koornneef, A.; Claessens, SM; Korzelius, JP; Van Pelt, JA; Mueller, MJ; Buchala, AJ; Metraux, JP; Brown, R.; Kazan, K.; et al. NPR1 memodulasi perbincangan silang antara laluan pertahanan yang bergantung kepada salisilat dan jasmonate melalui fungsi baru dalam sitosol. Sel Tumbuhan 2003, 15, 760–770. [CrossRef]

53. Xin, XF; Beliau, SY Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: Patogen model untuk menyiasat kerentanan penyakit dan isyarat hormon dalam tumbuhan. Annu. Rev. Phytopathol. 2013, 51, 473–498. [CrossRef] [PubMed]

54. Zhang, X.; Wang, C.; Zhang, Y.; Matahari, Y.; Mou, Z. Subunit kompleks mediator Arabidopsis16 mengawal selia secara positif rintangan sistemik pengantaraan salisilat dan laluan pertahanan yang disebabkan oleh jasmonate/etilena. Sel Tumbuhan 2012, 24, 4294–4309. [CrossRef] [PubMed]

55. Doares, SH; Narvaez-Vasquez, J.; Conconi, A.; Ryan, CA Asid salisilik menghalang sintesis perencat proteinase dalam daun tomato yang disebabkan oleh sistemin dan asid jasmonic. Fisiol Tumbuhan. 1995, 108, 1741–1746. [CrossRef] [PubMed]

56. Pieterse, CM; Leon-Reyes, A.; Van der Ent, S.; Van Wees, SC Rangkaian oleh hormon molekul kecil dalam imuniti tumbuhan. Nat. Kimia. biol. 2009, 5, 308–316. [CrossRef]

57. Penninckx, IA; Thomma, BP; Buchala, A.; Métraux, JP; Broekaert, WF Pengaktifan serentak laluan tindak balas jasmonate dan etilena diperlukan untuk induksi gen defensin tumbuhan dalam Arabidopsis. Sel Tumbuhan 1998, 10, 2103–2113. [CrossRef]

58. Fang, W.; Bidochka, MJ Ekspresi gen yang terlibat dalam percambahan, konidiogenesis dan patogenesis dalam Metarhizium anisopliae menggunakan RT-PCR masa nyata kuantitatif. Mycol. Res. 2006, 110, 1165–1171. [CrossRef]

59. Guerriero, G.; Legay, S.; Hausman, JF Alfalfa Selulosa sintase ekspresi gen di bawah tekanan abiotik: Panduan Hitchhiker untuk normalisasi RT-qPCR. PLoS ONE 2014, 9, e103808. [CrossRef]

60. Yang, Y.; Zhang, Y.; Li, B.; Yang, X.; Dong, Y.; Qiu, D. A Verticillium dahliae pectate lyase mendorong tindak balas imun tumbuhan dan menyumbang kepada virulensi. Depan. Sci tumbuhan. 2018, 9, 1271. [CrossRef]

61. Livak, KJ; Schmittgen, TD Analisis data ekspresi gen relatif menggunakan PCR kuantitatif masa nyata dan Kaedah 2(-Delta Delta C(T)). Kaedah 2001, 25, 402–408. [CrossRef]