Penemuan Novel STING Inhibitors Berdasarkan Struktur DMXAA Agonis STING Tetikus
Nov 27, 2023
Abstrak:
Protein stimulator-of-interferon-gen (STING) terlibat dalam imuniti semula jadi. Dadah DMXAA (5,6-dimethylxanthenon-4-asid asetik) terbukti sebagai agonis murine-STING (mSTING) yang kuat tetapi mempunyai sedikit kesan pada manusia-STING (hSTING). Dalam makalah ini, kami menggunakan perbandingan struktur kristal yang berbeza dan analisis hubungan interaksi protein-ligan untuk meneroka hipotesis bahawa reka bentuk ubat varian DMXAA mempunyai potensi untuk menukar agonis STING kepada perencat. Berdasarkan penemuan dua analog DMXAA kami sebelum ini, 3 dan 4 (kedua-duanya boleh mengikat STING), kami masing-masing mengoptimumkannya secara berstruktur dan mensintesiskan derivatif baharu. Dalam ujian pengikatan, kami menemui sebatian 11 dan 27 untuk mewakili pengikat STING yang lebih baik daripada struktur asal dan membincangkan hubungan struktur-aktiviti. Semua sebatian sasaran tidak aktif dalam ujian selular untuk pemeriksaan aktiviti agonis STING. Secara menggembirakan, kami mengenal pasti 11 dan 27 sebagai perencat STING dengan aktiviti mikromolar dalam kedua-dua laluan hSTING dan mSTING. Selain itu, 11 dan 27 menghalang induksi interferon dan sitokin radang yang diaktifkan oleh 20 3 0 -cGAMP tanpa sitotoksisiti yang jelas. Penemuan ini memecahkan pemikiran tegar bahawa DMXAA menyediakan asas struktur khusus untuk agonis STING dan membuka lebih banyak kemungkinan untuk membangunkan agonis atau perencat STING novel.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Kata kunci:
MENENGAT; DMXAA; selektiviti spesies; Agonis STING; perencat STING
1. Pengenalan
Gen perangsang-interferon (STING) ialah molekul isyarat penting untuk imuniti intrinsik, terutamanya mengantarkan tindak balas imun semula jadi yang disebabkan oleh DNA sitoplasma [1]. Apabila reseptor DNA kitaran guanosin-adenosin fosfat sintase (cGAS) mengesan DNA untai dua intraselular, cGAS memangkinkan sintesis 2 0,30 -cGAMP (Rajah 1), dinukleotida kitaran (CDN) yang mampu mengikat secara langsung dan mengaktifkan STING pada retikulum endoplasma [2–4]. Selepas pengaktifan, STING membentuk agregat yang direkrut hiliran ke kinase pengikat TANK 1 (TBK1) dan mengikat faktor pengawalseliaan interferon 3 (IRF3), yang memfosforilasi IRF3, mengaktifkan dimer IRF3 ke dalam nukleus, mendorong ekspresi interferon (IFN) jenis I dan memulakan. tindak balas imun interferon [1]. Banyak kajian telah menunjukkan bahawa STING terlibat dalam patogenesis pelbagai penyakit dan rangsangan STING mendorong tindak balas imun yang berkesan terhadap jangkitan patogen dan kanser; bagaimanapun, kegagalan untuk memodulasi isyarat keradangan kronik membawa kepada penyakit autoimun dan keradangan [5-8]. Disebabkan oleh peranan asas STING dalam pengawalan imuniti semula jadi, sebilangan besar pasukan telah mula membangunkan agonis atau perencat STING.
Rajah 1. Modulator STING wakil
Penyelidikan mengenai agonis STING generasi pertama memberi tumpuan kepada pengubahsuaian struktur analog CDN untuk memintas beberapa batasan CDN endogen, seperti kebolehtelapan membran yang lemah dan kerentanan terhadap hidrolisis oleh fosfatase [9,10]. Molekul kecil STING agonis 5,6-dimethylxanthenon-4-asid asetik (DMXAA), yang telah menunjukkan janji terapeutik terhadap tumor pepejal dalam model tetikus, boleh mengatasi kelemahan derivatif CDN [11]. Walau bagaimanapun, ubat itu gagal dalam ujian klinikal manusia [12]. Ia seterusnya menegaskan bahawa DMXAA secara selektif mengikat kepada STING murine (mSTING) dan bukannya STING manusia (hSTING) [13,14], yang menghalang potensi terapeutik DMXAA pada manusia. 10-Carboxymethyl-9-acridinone (CMA) ialah satu lagi agonis STING khusus murine yang digunakan sebagai inducer IFN jenis I yang kuat untuk terapi antiviral pada awal 1970-an [15]. Oleh itu, selektiviti spesies adalah faktor penting dalam pembangunan agonis STING molekul kecil. Agonis hSTING rangka novel yang besar telah dilihat oleh usaha penyelidik yang tidak kenal lelah, termasuk diABZI, SR717, MSA02, dan lain-lain [16-19].
manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun
Bukti yang semakin meningkat menunjukkan bahawa hiperaktivasi STING dikaitkan dengan penyakit autoradang dan autoimun. Ia adalah perlu untuk mengehadkan pengaktifan berlebihan laluan isyarat STING, yang menyerlahkan nilai potensi perencat STING. Berbeza dengan agonis STING, pembangunan perencat STING masih di peringkat awal, bagaimanapun, dan belum ada calon ubat yang memasuki kajian klinikal. Perencat STING yang diketahui termasuk dua jenis sebatian: antagonis kompetitif (SN-011 dan Merck-18) dan perencat kovalen (H151) [20–22]. Inhibitor STING kovalen yang dikenal pasti lebih awal berinteraksi dengan Cys88/91 atau Cys91 yang terletak dalam domain transmembran N-terminal STING di luar poket pengikat CDN [22]. Baru-baru ini, dua pasukan telah berturut-turut melaporkan dua jenis struktur antagonis STING yang menduduki 20 3 0 -poket pengikat cGAMP untuk menghalang pengaktifan 20 3 0 -cGAMP, mencadangkan kesan bermuka dua dalam poket pengikat CDN [20 ,21].
Di sini, kami menyediakan perspektif baharu. Kami mencadangkan bahawa poket bawah tempat DMXAA dan CMA terletak memudahkan pembangunan perencat STING berdasarkan perlombongan data mendalam kami dan perbandingan maklumat struktur kristal bersama protein STING yang dikenal pasti. Kajian terdahulu kami melaporkan satu siri analog CMA dan DMXAA dan mengenal pasti sebatian 3 dan 4 yang mengikat kepada hSTING tetapi dengan potensi selular yang lemah [23] (Rajah 2).
Rajah 2. Struktur kimia sebatian 3 dan 4 dengan data tentang aktiviti biologinya. Nilai EC50 bagi sebatian 1–4 diukur oleh sel wartawan STING, dan IC50 yang mengikat diukur oleh kit pengikat persaingan STING.
Dalam makalah ini, mengenai reka bentuk perencat STING untuk menemui agen pengikat yang lebih kuat dengan lebih banyak kenalan di dalam poket bawah, kami melakukan pengoptimuman struktur untuk 3 dan 4, masing-masing. Selepas itu, kami menjalankan kajian SAR berdasarkan ujian mengikat persaingan. Dalam penilaian bioaktiviti, sebatian 11 dan 27 bertindak sebagai pengikat spektrum luas dan mempamerkan tahap mikromolar aktiviti perencatan STING dalam pelbagai sel yang dilaporkan. Dari segi struktur dok, dua molekul kompaun 11 memegang hSTING dalam konformasi "terbuka" yang tidak aktif, sekali gus menghalang pengikatan 20 3 0 -cGAMP endogen secara kompetitif, yang serupa dengan struktur kristal Merck-18 dan struktur dok daripada SN-011 [20,21].
2. Keputusan
2.1. Strategi Reka Bentuk Derivatif DMXAA sebagai Perencat STING
2.1.1. Pengenalpastian Tapak Reka Bentuk untuk Perencat STING dengan Membandingkan Struktur Kristal Berbeza
Apo-protein domain pengikat ligan STING (LBD) terhablur sebagai dimer simetri dalam bukan ligan, yang terbukti tidak disebabkan oleh penapisan gel dan analisis ultrasentrifugasi analitik [24-26]. Dimer STING menggunakan konformasi seperti rama-rama dengan tapak pengikat ligan diposisikan pada antara muka antara dua monomer. Pertama, kertas ini mengkaji mekanisme infrastruktur dan pengaktifan protein hSTING dan mSTING, membandingkan perbezaan antara mereka, serta mendedahkan beberapa pandangan yang menarik. Untuk struktur apo, konformasi semula jadi kedua-dua protein menunjukkan bahawa mSTING lebih pekat daripada hSTING (Rajah 3). Shih et al. menggunakan simulasi dinamik molekul (MD) untuk mengkaji perbezaan antara hSTING dan mSTING, menunjukkan bahawa hSTING lebih suka konformasi tidak aktif terbuka, dan mSTING lebih suka konformasi aktif tertutup walaupun tanpa terikat ligan [27].
Apabila terikat kepada 20,30 -cGAMP, peralihan konformasi hSTING adalah daripada terbuka (apo-protein, jarak sisi ~57 Å) kepada tertutup (protein terikat cGAMP, jarak sisi ~40 Å), manakala sebaliknya adalah benar untuk mSTING (29 Å hingga 40 Å). Struktur apo-hSTING berbeza secara dramatik daripada apo-mSTING, tetapi struktur STING kompleks dengan 20,30 -cGAMP bertindih. DMXAA, CMA, dan cGAMP ialah agonis STING dengan pelbagai perancah struktur, tetapi konformasi pengaktifannya apabila mengikat protein mSTING juga pada asasnya adalah sama (Rajah 3). Senario yang diterangkan di atas membuktikan bahawa mekanisme rangsangan hSTING dan mSTING adalah sangat berbeza; konformasi yang diaktifkan oleh STING, walau bagaimanapun, agak malar, bebas daripada selektiviti spesies dan jenis tulang belakang agonis (sementara terhad kepada agonis STING yang membawa perubahan konformasi). Isipadu poket mengikat kompleks kristal yang berbeza secara amnya menumpu (~ 300 Å3, Jadual S1), yang merupakan bukti lanjut tentang kestabilan konformasi pengaktifan protein STING.
Rajah 3. Perbandingan struktur hablur STING yang terikat apo dan sebatian. Protein mSTING ialah gandum (jarak diuji dengan garis merah), kod PDB:4KC0 (apo), 4LOJ (terikat-cGAMP), 4LOL (terikat-DMXAA) dan 4JC5 (terikat-CMA)
Kedua, berdasarkan penemuan kestabilan konformasi pengaktifan di atas, kami menindih struktur kristal bersama cGAMP, DMXAA, CMA, SR717, dan MSA02, yang merupakan agonis STING konformasi tertutup, untuk meneroka kedudukan agonis struktur yang berbeza dalam Tapak pengikat protein STING. Poket protein boleh dibahagikan kepada dua kawasan: poket bawah dan poket atas, berikutan pengedaran agonis STING dalam poket protein (Rajah 4a). Kecuali untuk agonis mSTING DMXAA dan CMA berada di poket bawah sepenuhnya, agonis lain boleh mengaktifkan laluan hSTING dan terletak di kawasan atas. Kami kemudiannya memetakan interaksi lima agonis STING dengan residu asid amino yang terikat pada protein STING (dalam 5 Å ligan; Rajah S1), menunjukkan bahawa asid amino primer termasuk R238, Y167, R232, S162, T263, dan T267 (nombor jujukan sisa sepadan mSTING tolak satu). Memadankan sisa secara berurutan ke poket menunjukkan bahawa T267, T263, dan S162 terletak di poket bawah; poket atas mengandungi R238, R232, dan Y167 (Rajah 4b). Seperti yang dilaporkan, R238, Y167, dan R232 adalah penting untuk pengikatan agonis kepada STING, terutamanya R238 (protein mSTING sepadan dengan R237), mutasi yang akan mengakibatkan kehilangan penstabilan sepenuhnya (ligan mengikat) [28-30]. Che et al. juga mendedahkan bahawa baki kunci R238 mendominasi pengikatan DMXAA, dan mutasi titik (S162A/E260I) boleh meningkatkan interaksi R238 dengan DMXAA oleh simulasi MD [31].
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity
【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Untuk menduduki poket protein mSTING, DMXAA atau CMA menggunakan mod pengikatan unik di mana dua agonis molekul kecil mengikat satu homodimer mSTING tunggal. DMXAA dipasang dengan kuat pada poket bawah oleh ikatan hidrogen antara kumpulan keto dan rantai sisi T266 (hSTING sepadan dengan 267), manakala kumpulan karboksilat berinteraksi dengan rantai sisi R237 dan T262 (Rajah 5a). Interaksi DMXAA dengan R237 (satu-satunya asid amino utama dalam poket atas) adalah penting untuk aktiviti mSTING. Perincian yang sering diabaikan ialah DMXAA hanya boleh bertindak pada R237 protein monomerik simetri, contohnya, DMXAA (molekul A) yang mempengaruhi R237B (Rajah 5a). Oleh kerana DMXAA terletak di bahagian bawah, jarak antara molekul A dan R237B ialah 3.06 Å, manakala jarak ke R237A adalah lebih besar daripada 5 Å (Rajah 5b). Mendapat manfaat daripada poket protein mSTING yang lebih padat, DMXAA berinteraksi dengan mudah dengan R237 monomer mSTING simetri tetapi tidak ada cara untuk DMXAA mengaitkan dengan mana-mana R238 dalam protein apo-hSTING yang terbuka secara konformasi (Rajah 3). Oleh itu, kedudukan poket DMXAA menjejaskan rangsangan laluan hSTING. Baru-baru ini, Merck, yang diilhamkan oleh nisbah pengikatan 2:1 DMXAA, telah menemui antagonis STING yang mampu menduduki poket pengikat [21]. Kompleks kristal protein Merck 18 dan hSTING menunjukkan bahawa sebatian itu terletak terutamanya di bawah poket protein dan berinteraksi dengan S162, T263, dan T267, yang semuanya sepadan dengan sifat DMXAA (Rajah 5c). Daripada ini, hipotesis dijana: poket atas adalah rongga yang sangat baik untuk mereka bentuk agonis STING; poket bawah adalah sarang yang lebih sesuai untuk perencat, dan struktur DMXAA atau CMA dioptimumkan untuk berpotensi menjadi antagonis STING.
Rajah 4. Pembahagian tapak pengikatan STING dan pengedaran dengan asid amino utama. (a) Lokasi dua kawasan dalam monomer STING. Poket bawah berwarna magenta dan poket atas berwarna hijau. Kod PDB untuk kompleks kristal bertindih adalah seperti berikut: 4LOH (cGAMP, hijau), 6UKV (MSA-02, kuning), 6XNP (SR717, oren), 4LOL (DMXAA, magenta) dan 4JC5 (CMA, ungu). (b) Taburan asid amino utama di kawasan atas dan bawah. Sisa dalam poket bawah ditunjukkan dalam warna magenta, dan yang hijau berada di kawasan atas.
Rajah 5. Kompleks kristal DMXAA dan Merck 18. (a) Sentuhan antara molekul dalam kompleks DMXAA dan mSTING. DMXAA terikat ditunjukkan dalam warna kelabu, dengan subunit STING individu dalam dimer simetri ditunjukkan dalam warna hijau dan ungu. Superskrip A dan B menunjukkan monomer protein atau identiti ligan individu. (b) Jarak antara sisa utama R237A dan R237B, masing-masing, dan DMXAA (molekul A). R237A kepada karboksil DMXAA ialah 6.02 Å, R237B kepada karboksil DMXAA ialah 3.06 Å. (c) Struktur kristal Merck 18 terikat pada protein hSTING (PDB 6MXE) dan butiran hubungan antara molekulnya. Ligan terikat ditunjukkan dalam warna kelabu, dengan subunit STING individu dalam dimer simetri ditunjukkan dalam warna hijau dan ungu. Superskrip A dan B menunjukkan monomer protein atau identiti ligan individu
Rajah 6. Asas penyelidikan dan tempat liputan kami yang dioptimumkan untuk terbitan DMXAA dan CMA. (a) Superposisi struktur DMXAA terikat kepada mSTING (PDB: 4LOL, ditunjukkan sebagai biru tua) dengan struktur DMXAA terikat pada hSTING S162A/G230I/Q266I (PDB: 4QXR, ditunjukkan sebagai oren). (b) Butiran DMXAA yang terikat kepada hSTING bermutasi (PDB: 4QXR). Kotak garis putus-putus mewakili tapak pengubahsuaian yang berpotensi. Sisa amino yang ditunjukkan dalam warna hijau adalah sisa bermutasi (S162A/Q266I).
Kami mendapati bahawa ketidakupayaan DMXAA untuk mengaktifkan laluan pengehosan adalah berkaitan dengan lokasi DMXAA dalam poket bawah (mengikut Bahagian 2.1.1), yang turut memberikan kami idea reka bentuk perencat STING: meningkatkan hubungan derivatif DMXAA dengan kawasan bawah melalui pengubahsuaian struktur untuk memastikan STING dalam konformasi tidak diaktifkan. S162 dan Q266 terletak dengan betul di bahagian bawah tapak pengikatan, jadi DMXAA boleh diletakkan dengan baik dalam hubungan langsung dengan kedua-duanya, memudahkan penerokaan kesan asid amino poket bawah pada ligan. Analisis hubungan struktur-aktiviti (SAR) mendedahkan bahawa bahagian 5,6-dimetil dan metoksi kedudukan7-C adalah penting untuk aktiviti biologi 3 dan 4. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6b, 5 ,6-kumpulan dimetil mencipta interaksi hidrofobik dengan berbilang asid amino dalam poket bawah; disebabkan oleh kedekatan kedudukan C7 DMXAA dengan asid amino Q266, pengubahsuaian metoksi yang sepadan membenarkan 3 dan 4 untuk mengikat pada pengehosan. Oleh itu, penghuraian struktur kami mengandaikan penguncian 5,6-dimetil dan metoksi C7, dan reka bentuk derivatif novel tertumpu pada mengubah suai kumpulan kutub pada kedudukan C1/C2 (mempengaruhi S162) dan menukar kumpulan asid karboksilik ( memperluaskan kepelbagaian struktur). Kami mereka bentuk dan mensintesis satu siri derivatif menggunakan sebatian 3 dan 4 sebagai perancah, dengan itu mengesahkan ramalan perencat kami yang dicadangkan.
2.2. Kimia
Penyediaan semua sebatian perantaraan dan sasaran digariskan dalam Skim 1. 1-metoksi-2,3-dimetil-4-nitrobenzena (5) dan 2-asid bromobenzoik ( 7) tersedia secara komersial. Pada mulanya, 1-methoxy-2,3-dimetil-4-nitrobenzene telah ditukar kepada 4-methoxy- 2,3-dimethylaniline (6) melalui pengurangan dengan serbuk besi. Kemudian, 6 dan 7 telah tertakluk kepada tindak balas Ullmann dengan kalium karbonat dengan pemangkinan oleh kuprum dan kuprum (I) oksida dalam N, N-dimetilformamida untuk menyediakan perantaraan 8 yang sepadan. Tindak balas pemeluwapan intramolekul 8 dilakukan dengan reagen Eaton untuk menghasilkan perantaraan. 2-methoxy-3,4-dimethylacridin-9(10H)-satu (9). Penggantian 9 seterusnya dilakukan dengan etil bromoasetat, dan kehilangan 1 equiv HBr menghasilkan etil 2-(2-methoxy-3,4-dimetil-9- oxoacridin-10(9H)- yl)asetat (10). Akhir sekali, etil asetat dalam 10 telah dihidrolisiskan kepada asid karboksilik oleh natrium hidroksida menghasilkan 2-(2-metoxy-3,4- dimetil-9-oxoacridin-10 (9H)- yl)asid asetik (11).
Skim 1. a. EtOH, Fe, NH4Cl; b. DMF, Cu, Cu2O, K2CO3; c. reagen Eaton; d. BrCH2COOC2H5 , NaH; e. NaOH; f. CCl3CH(OH)2 , NH2OH; g. H2SO4; h. EtOH, H2O2, NaOH.
Untuk sintesis seterusnya bagi lebih banyak sebatian sasaran, kita mesti terlebih dahulu mensintesis sebatian 2-amino-5-metoksi-3,4-asid dimetilbenzoik (14). 6 telah bertindak balas dengan kloral hidrat dan hidroksilamin, membentuk asetamida dan hidroksiamino, dengan perantaraan (E)-2-(hydroxylamine)-N-(4-methoxy-2,3-dimetilfenil )acetamide (12). Tindak balas penyusunan semula Beckmann seterusnya bagi hidroksiamino 12 dilakukan dengan asid sulfurik untuk menghasilkan terbitan laktam 13. Akhirnya, perantaraan 13 dihidrolisiskan dengan hidrogen peroksida dan natrium hidroksida dalam larutan etanol yang menghasilkan 14. Menggunakan 14 sebagai bahan permulaan untuk tindak balas, kita seterusnya mensintesis satu siri 8-metoksi-9,10-dimetil-6Hpyrrolo[3,2,1-de]acridine-1,6( Terbitan 2H)-dione dengan substituen pada R1 dan R2. Pada mulanya, 14 dan 15–19 tertakluk kepada tindak balas Ullmann dengan kalium karbonat dengan pemangkinan oleh kuprum dan kuprum(I) oksida dalam N, N-dimetilformamida untuk menyediakan perantaraan yang sepadan 20–24. Tindak balas pemeluwapan intramolekul 20–24 dilakukan dengan reagen Eaton untuk menghasilkan 8-metoksi-9,10-dimetil-6H-pyrrolo[3,2,{{46} }de]acridine-1,6(2H)- terbitan dione (25–29). Begitu juga, menggunakan 14 sebagai bahan permulaan untuk tindak balas, kami selanjutnya mensintesis satu siri 7-metoksi-5,6-dimetil-9-oxo-9,{{ 59}}dihydroacridine-4- derivatif asid karboksilik dengan substituen pada R. Pada mulanya, 14 dan 7 atau 30 telah tertakluk kepada tindak balas Ullmann dengan kalium karbonat dengan pemangkinan oleh kuprum dan kuprum(I) oksida dalam N, N-dimetilformamida untuk menyediakan perantaraan yang sepadan 31 dan 32. Tindak balas pemeluwapan intramolekul 31 dan 32 dilakukan dengan reagen Eaton untuk menghasilkan 7-metoksi-5,6-dimetil-9-oxo-9 ,10-dihydroacridine-4-derivatif asid karboksilik (33,34). Oleh itu, kami mereka bentuk, mensintesis, dan menyaring 16 analog acridone, yang strukturnya diringkaskan dalam Jadual 1.
Jadual 1. Struktur Analog Baru Kajian Masa Kini.
2.3. Keupayaan Mengikat Kompaun Baharu kepada STING dan SARnya
Keupayaan Mengikat Sebatian Baharu kepada STING dan SARnya Untuk mengesahkan secara langsung keberkesanan pengubahsuaian struktur, kami mula-mula menapis semua sebatian yang disintesis oleh ujian anjakan cGAMP. Selain selektiviti spesies, terdapat lima varian STING yang polimorfik pada manusia, R232 (WT, 58% daripada populasi), HAQ (20%), H232 (13%), AQ (7%), dan Q ( 2%) [32]. Oleh itu, kami menggunakan kit ujian persaingan komersial oleh teknologi pendarfluor penyelesaian masa homogen (HTRF) untuk menguji potensi biokimia sebatian baharu pada mSTING dan pelbagai isoform hSTING (WT, H232, dan AQ) dan membandingkannya dengan kawalan. Seperti yang dijangkakan, sebatian kawalan 1–4 semuanya terikat kepada mSTING; dari skrin hSTING, sebatian 3 dan 4 mempunyai nilai IC50 pada tahap mikromolar.
Jadual 2. Keputusan sebatian dengan pelbagai isoform hSTING dan ujian mengikat persaingan mSTING.
Pertama, berdasarkan sebatian 3, atom halogen atau kumpulan metoksi telah diperkenalkan di tapak C1/C2 (Jadual 1). Kompaun 27, sebagai terbitan optimum bagi kompaun 3 (kedudukan C1 digantikan dengan F), mempunyai aktiviti keseluruhan yang lebih baik daripada kompaun 3 (aktiviti mikromolar satu digit dalam semua ujian biokimia, Jadual 2). Kompaun ubah suai R1-25 mempunyai kesan pengikatan spektrum luas tetapi tidak seaktif versi digantikan F atau tidak digantikan. Berbanding dengan sebatian 3, sebatian (26, 28 dan 29) dengan kumpulan yang diperkenalkan tapak C2-semuanya menunjukkan tahap penurunan yang berbeza dalam pertalian mengikat, terutamanya sebatian 29. Kedua, mengekalkan tulang belakang kompaun 4 dan menggantikan atom halogen terhadap tapak C1/C2, kami memperoleh sebatian 35–38 (Jadual 1). Sebatian ini tidak aktif dalam keempat-empat ujian anjakan pada kepekatan sehingga 100 µM, menunjukkan bahawa penggantian dengan atom halogen di tapak C1/C2 tidak diterima. Kemudian, kami menukar kumpulan asetat pada kompaun 4 menjadi kumpulan karboksil (33) dan memperkenalkan metoksi di tapak C2 (34). Malangnya, perubahan ini gagal kerana kedua-dua sebatian kekal tidak aktif. Belajar daripada kegagalan kami, kami meneroka lebih lanjut SAR bagi derivatif kompaun 4 dengan mengalihkan kumpulan asetat ke kedudukan N dan membiarkan kedudukan C1/C2 tidak diubah suai. Kompaun 11 menunjukkan pengikatan kepada pelbagai variasi STING, semuanya dengan IC50 di bawah 20 µM; aktiviti ini lebih tinggi daripada sebatian 4 dan setanding dengan sebatian 27. Selain itu, sebatian 9 (tiada kumpulan karboksil di tapak N) dan sebatian 10 (etil N-asetat) adalah prekursor sintetik bagi sebatian 11 yang tidak boleh mengikat STING, secara tidak langsung menunjukkan kepentingan kumpulan asid karboksilik.
2.4. Penilaian Biologi Selular
2.4.1. Saringan In Vitro Analog Baharu dengan Aktiviti Agonis STING
Kami menapis semua sebatian secara sistematik untuk aktiviti agonis STING menggunakan talian sel wartawan 293T hSTING-WT, 293T-mSTING dan THP1-KO-STING (disediakan oleh Invivo Gen). Menggunakan sel 293T-hSTING-R232 dan sel 293T-mSTING, kami menunjukkan pengaktifan laluan IRF sebagai ukuran tidak langsung bagi induksi IFN jenis I dengan memantau aktiviti secretory embryonic alkaline phosphatase (SEAP), menyumbang kepada kajian kami tentang selektiviti spesies sebatian. THP1-Sel KO-STING telah dijana daripada THP1-Sel dwi dengan kalah mati gen STING yang stabil dan kami menggunakan sel THP1-KO-STING untuk mengesahkan sama ada sebatian itu menunjukkan fungsi induksi sitokin yang bergantung kepada STING. Kami membandingkan aktiviti agonis STING bagi semua derivatif yang disasarkan dengan agonis rujukan untuk murine (DMXAA) dan manusia (20,30 -cGAMP) STING. Yang menghairankan, tiada satu pun sebatian yang disintesis boleh mengaktifkan sama ada laluan hSTING atau mSTING (kepekatan maksimum pada 200 µM), yang secara serius tidak konsisten dengan keputusan ujian pengikatan. Oleh itu, ejen pengikat STING kami yang disaring mungkin mempunyai corak pengikatan yang berpotensi sebagai antagonis STING novel.
2.4.2. Saringan In Vitro Pengikat STING dengan Aktiviti Inhibitor STING
Pertama, kami melakukan pra-eksperimen: dengan perencat kovalen 1 µM H151 sebagai rujukan positif, kami meneroka tahap perencatannya dalam barisan sel wartawan mSTING dan hSTING yang dikultur bersama dengan kepekatan 20 3 0 -cGAMP yang berbeza untuk menentukan keadaan optimum untuk menyaring perencat (lihat Bahagian 4.2.3 untuk butiran protokol). Kedua, kami pada mulanya menapis potensi perencatan sebatian baru dengan rawatan dengan kaedah pra-eksperimen pada kepekatan 100 µM. Kami mendapati bahawa sebatian pengikat STING spektrum luas 11 dan 27 mempamerkan perencatan yang sangat baik dalam kedua-dua murine dan sel wartawan STING manusia, dengan sebatian 3 dan 4 dan sebatian lain tidak begitu berkesan. Ketiga, kami menetapkan kecerunan kepekatan untuk sebatian 11 dan 27 untuk menguji kedua-dua nilai IC50 dan membandingkannya dengan H151. Sebatian 11 dan 27 aktif pada kepekatan mikromolar yang menghalang 20 3 0 -ungkapan IFN yang disebabkan oleh cGAMP dalam kedua-dua laluan hSTING dan mSTING.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Dengan nilai IC50, kompaun 11 (hSTING 19.93 µM dan mSTING 15.47 µM) mengatasi kompaun 27 (hSTING 38.75 µM dan mSTING 30.81 µM) (Rajah 7a). Sebagai perbandingan, nilai IC50 H-151 dalam sel 293T-hSTING dan 293T-mSTING ialah 1.04 dan 0.82 µM (Rajah 7a), menunjukkan bahawa perencat kovalen H-151 mempamerkan kesan perencatan yang lebih baik pada STING -isyarat bergantung dalam ujian berasaskan sel. Untuk mengesahkan lagi sifat perencatan sebatian 11 dan 27, kami menggunakan satu lagi THP-1 barisan sel wartawan monosit manusia THP1-Dual-hSTING-R232, yang menggunakan sistem dwi-pelapor untuk melaporkan tentang pengaktifan IRF sebagai ukuran tidak langsung induksi IFN jenis I dan pada pengaktifan NF-κB sebagai ukuran tidak langsung induksi sitokin proinflamasi. Selepas rangsangan talian sel wartawan THP-1 dengan 20,30 -cGAMP, kami menambah perencat STING dengan kepekatan yang sesuai untuk menghalang induksi I IFN dan sitokin proinflamasi. Seperti yang dijangkakan, sebatian 11, 27, dan H151 menghalang pengaktifan laluan IRF dan NF-κB yang dicetuskan STING dengan ketara (Rajah 7b). Di samping itu, untuk mengecualikan kesan sitotoksisiti sebatian pada aktiviti perencatan, kami menggunakan kit CellTiter-Glo untuk menguji aktiviti selular. Yang menggembirakan, sebatian 11 dan 27 tidak menunjukkan bukti sitotoksisiti kepada sel 293T dan THP-1 melalui ujian daya maju sel apabila ditambah pada kepekatan (5 hingga 100 µM) yang menghalang STING, berbeza dengan H151, yang telah menunjukkan sitotoksisiti yang ketara pada 10 µM (Rajah 7c). Kajian ini mengenal pasti sebatian 11 dan 27 sebagai perencat STING sederhana, memecahkan sensitiviti spesies dan menghalang laluan dwi IRF dan NF-κB tanpa sitotoksisiti yang jelas.
2.5. Asas Struktur Aktiviti Kompaun 11 Disiasat Dengan Docking
Mekanisme antagonis STING yang kompetitif adalah untuk menduduki tapak pengikatan dan mengganggu konformasi pengaktifan protein STING [20,21]. Khusus kepada hSTING, antagonis meninggalkan dimer hSTING dalam konformasi "terbuka". Kami menggunakan dok Glide untuk menentukan interaksi antara STING CTD manusia (kod ID PDB 6MXE) dan sebatian aktif terbaik 11. Dalam struktur dok, kedua-dua sebatian 11 sebahagiannya selari antara satu sama lain dan terletak di bahagian bawah celah dimer hSTING (Rajah 8a), mengunci hSTING dalam konformasi terbuka yang tidak aktif (Rajah S2). Kompaun 11 menghasilkan interaksi hidrofobik terutamanya, dengan struktur trisiklik ligan membenarkan lebih banyak sentuhan dengan antara muka dalam poket bawah. Seperti DMXAA atau CMA, kumpulan karboksil membentuk ikatan hidrogen dengan rantai sisi T263, manakala kumpulan keto membentuk ikatan hidrogen dengan rantai sisi T267. Metoksi pada kedudukan C2 berinteraksi rapat dengan S162, menghasilkan persekitaran ligan-ligan antara satu sama lain. Substituen bis-metil bukan sahaja menjana interaksi ligan-ligan tetapi juga terletak dengan mudah di pintu masuk ke poket atas, yang menghalang pengikatan agonis STING semula jadi kepada residu utama (Rajah 8b).
Rajah 7. Pengikat STING spektrum luas 11 dan 27 ialah antagonis STING. (a) Struktur kimia sebatian 11 dan 27, dan aktiviti perencatan perencat STING terhadap kedua-dua laluan m- dan h- STING. Sel 293T (mSTING atau hSTING), prarawatan dengan kepekatan sebatian berbeza telah dirangsang oleh 20,30 -cGAMP; perencatan aktiviti laluan IRF secara tidak langsung diukur dengan nilai ketumpatan optik (OD). Keluk perencatan bergantung dos telah dipasang untuk mengira IC50 sebatian. (b) Sebatian 11 dan 27 boleh menghalang pengaktifan laluan dwi hSTING. Talian sel wartawan THP1-hSTING-R232 telah dirangsang dengan 20,30 -cGAMP, dan dirawat dengan sebatian, menghalang aruhan IFN (menilai aktiviti oleh unit cahaya relatif (RLU) Lucia luciferase ) dan induksi sitokin proinflamasi (memantau aktiviti SEAP yang diukur dengan nilai OD). (c) Analog baru mempamerkan sitotoksisiti yang rendah berbanding dengan perencat kovalen. 293T (atau sel THP-1) telah diinkubasi dengan kepekatan perencat yang ditunjukkan untuk tempoh masa yang dinyatakan. Daya maju sel diukur dengan kit CellTiter-Glo. Data yang ditunjukkan adalah min daripada tiga eksperimen bebas. NS (tiada signifikan) p > 0.05, *** p < 0.001. nilai p dikira dengan ujian-t dua hujung.
Rajah 8. Struktur dok kompaun 11 terikat kepada protein STING. (a) Mod pengikatan sebatian 11. Ligan terikat ditunjukkan dalam warna kelabu, dengan subunit STING individu dalam dimer simetri ditunjukkan dalam warna hijau dan ungu. Dalam poket pengikat monomer STING, bahagian bawah berwarna magenta dan bahagian atas berwarna hijau. (b) Sentuhan antara molekul sebatian 11 terikat kepada STING. Sebatian 11 dan asid amino STING yang tersentuh ditunjukkan sebagai model kayu. Hubungan antara molekul dan ikatan hidrogen ditunjukkan dengan garis putus-putus kuning. Superskrip A dan B menunjukkan monomer protein atau identiti ligan individu.
3. Perbincangan
Berdasarkan laporan meluas mengenai mekanisme dan struktur kristal STING, kami berpeluang untuk menerangkan masalah saintifik mengapa DMXAA tidak mempunyai aktiviti agonistik STING manusia. Dalam kajian ini, dengan membandingkan pelbagai struktur kristal STING, kami memperoleh beberapa penemuan menarik: 1. Konformasi pengaktifan STING adalah stabil; 2. Terdapat mekanisme pengaktifan yang berbeza untuk hSTING dan mSTING; 3. DMXAA dan CMA berada di bahagian bawah tapak pengikat yang membezakannya daripada agonis lain. Memandangkan mekanisme pengaktifan mSTING dan hSTING yang berbeza, agonis mSTING DMXAA atau CMA yang terletak di poket bawah tidak boleh mengaktifkan pengaktifan dalam hSTING kerana apo-hSTING mempunyai rongga pengikat yang lebih besar yang menghalang ligan daripada dikaitkan dengan R238.
Gao et al. melaporkan bahawa mutasi tunggal (G230I, S162A, dan Q266I) memberikan hSTING dengan sensitiviti DMXAA yang sama seperti mSTING [33]. Simulasi MD mendedahkan bahawa rantai sisi mutasi kawasan penutup G230I adalah mencukupi untuk membentuk penghalang sterik untuk menghalang perkumuhan DMXAA, manakala DMXAA mudah keluar dalam hSTING WT [27]. Berdasarkan pengubahsuaian struktur yang sepadan dengan mutasi titik hSTING (S162A/Q266I) di tapak pengikatan, analog DMXAA dan CMA yang banyak telah tersedia tetapi tiada agonis hSTING yang kuat. Sebab di sebalik ini mungkin percanggahan struktur halus antara hSTING "semula jadi" dan "bermutasi" mungkin memainkan peranan penting dalam proses pengecaman. Melalui simulasi MD, Che et al. mendapati bahawa hSTING yang bermutasi secara tidak semulajadi mengganggu pergerakan molekul air yang diselaraskan dan mengubah jumlah air yang dikeluarkan apabila mengikat ligan, yang lebih kondusif untuk memulihkan pengaktifan DMXAA hSTING [31].
Digalakkan oleh penemuan kajian perencat STING di tapak pengikatan bawah [21], kami berusaha untuk membayangkan bahawa DMXAA, yang terletak di rantau yang sama, mempunyai potensi untuk diubah menjadi perencat STING yang baru. Dalam kajian terdahulu, kami menggabungkan struktur DMXAA dan CMA dengan pengubahsuaian struktur halus dan berjaya menemui 3 dan 4 yang boleh mengikat hSTING, tetapi aktiviti agonistik STING yang lemah tidak sepadan dengan potensi mengikatnya. Dalam kertas kerja ini, idea reka bentuk adalah untuk meningkatkan lagi hubungan analog DMXAA dengan poket bawah untuk menentang pengikatan 20,30 -cGAMP secara kompetitif, jadi kami mereka bentuk dan mensintesis struktur sebatian 3 dan 4 yang dioptimumkan.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Langkah saringan pertama adalah untuk menguji aktiviti biokimia menggunakan kit pengikat pelbagai variasi STING untuk mencirikan potensi pengikatan terbitan novel. Keputusan ujian pengikatan membuktikan keteguhan arah reka bentuk kami; kami mengenal pasti 11 dan 27 sebagai pengikat STING spektrum luas (lebih tinggi daripada 3 dan 4) dan membincangkan SAR. Untuk analog bagi sebatian 3, pengubahsuaian pada kedudukan C1 telah meningkatkan pengikatan kepada pelbagai variasi STING dengan ketara, manakala sebatian diubah suai C2-tidak mempunyai kesan. Walau bagaimanapun, kompaun 4 tidak diterima dengan baik untuk pengubahsuaian struktur dalam C1/C2. Selepas menempatkan semula kedudukan asid karboksilik (C4 kepada N), kami mendapati pengikat STING 11 yang lebih baik dan menentukan bahawa kumpulan asid karboksilik adalah penting untuk aktiviti. Seterusnya, kami menyaring semua sebatian untuk aktiviti peringkat selular menggunakan tiga baris sel wartawan, dan tiada sebatian sasaran yang aktif. Kami kemudiannya menubuhkan kaedah pemeriksaan untuk perencat STING dan menapis semula semua analog baharu. Ejen pengikat STING 11 dan 27 mempamerkan aktiviti perencatan mikromolar, dengan data yang setanding dengan ujian pengikatan kompetitif. Inhibitor kovalen H151 menunjukkan aktiviti perencatan STING yang lebih baik sedikit daripada 11 dan 27 in vitro. Selain itu, kami selanjutnya mengesahkan bahawa 11 dan 27 boleh menghalang 20,30 -pengaktifan cGAMP bagi laluan dwi STING. Paling mengagumkan, 11 dan 27 mengekalkan tahap daya maju sel yang tinggi pada kepekatan tinggi, yang tidak mungkin dengan H151. Sitotoksisiti adalah masalah biasa dengan perencat kovalen dan mengehadkan penggunaan H151.
Dengan analisis dok, kami telah memperoleh cerapan tentang asas struktur aktiviti kompaun aktif 11 terbaik. Kompaun 11 menduduki poket bawah dengan sempurna, memegang hSTING dalam konformasi terbuka yang tidak aktif dan dengan itu menghalang pengikatan 20,30 -cGAMP secara kompetitif. Struktur cincin trisiklik acridine adalah kunci untuk menghasilkan interaksi hidrofobik, dengan kumpulan asid karboksilik dan bahagian keton menambat sebatian di bahagian bawah poket. Kami membuat spekulasi bahawa metoksi menghasilkan perkaitan intim dengan S162, menarik konformasi protein ditutup sedikit tetapi tidak mencukupi untuk mengubahnya menjadi konformasi agonis. Struktur bis-metil mencipta penyekatan tapak spatial yang meningkatkan interaksi ligan-ligan dan menghalang kemasukan agonis ke dalam poket atas. Pada masa ini, tiada struktur bersama kristal bagi antagonis mSTING dan STING yang dilaporkan, jadi kami tidak dapat menerangkan mekanisme tindakan kompaun 11 dengan mSTING menggunakan pendekatan dok. Walau bagaimanapun, kami menjangkakan bahawa terdapat dua kemungkinan: satu ialah prinsip lakonan adalah sama dengan hSTING; yang satu lagi ialah kompaun 11 mengekalkan mSTING dalam konformasi apo yang lebih terkumpul dan 20,30 -cGAMP tidak boleh masuk ke dalam poket untuk memberikan kesan agonistik. Ringkasnya, pengoptimuman struktur halus kami terhadap agonis STING yang lebih lemah telah berjaya membalikkan fungsi biologi untuk menemui perencat STING. Penemuan ini menggambarkan kerumitan poket pengikat STING dan memberikan pandangan penyelidikan baharu untuk pembangunan ubat agonis atau perencat STING.
4. Bahan dan Kaedah
4.1. Kimia
Pelarut dan reagen yang digunakan dalam sintesis diperoleh daripada Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Beijing, China). Struktur produk telah dikenal pasti oleh spektroskopi 1H dan 13C-NMR (JNM-ECA-400, Jepun). Berat molekul produk diukur dengan spektrometri jisim resolusi tinggi (HRMS) dengan pengionan elektrospray (ESI) sebagai mod pengionan (Agilent 1260-G6230A, Jerman). NMR dan spektrum jisim sebatian disediakan dalam Bahan Tambahan. Sebatian 35–38 telah disintesis dan dikenal pasti oleh kami; sila rujuk artikel yang dilaporkan sebelum ini untuk butiran [23].
Etil {{0}}(2-metoxy-3,4-dimetil-9-oxoacridin-10 (9H)-yl)asetat (1{ {25}}): Kepada larutan 4-metoksi{{10}},3-dimethylaniline (6) (0.97 g, 6.4 mmol) dan 2-asid bromo-benzoik (7) (1.29 g, 6.4 mmol) dalam DMF (6 mL) pada suhu bilik, kami kemudiannya menambah serbuk Cu (0.05 g), Cu2O ({{6{0}}.05 g) dan K2CO3 ({{186}}}.71 g, 5.1 mmol). Campuran tindak balas dipanaskan pada 11{195}} ◦C selama 12 jam. Selepas penyingkiran pelarut di bawah vakum, sisa telah dibubarkan dalam larutan 1 N NaOH (25 mL). Produk mentah diperoleh melalui pemendakan apabila pengasidan turasan dengan conc. HCl. Selepas pengeringan, produk mentah ditambah kepada reagen Eaton (5 mL) pada suhu bilik, kemudian campuran dipanaskan hingga 90 ◦C selama 1 jam. Campuran tindak balas yang disejukkan dijatuhkan ke dalam larutan NaHCO3 berair tepu. Mendakan itu ditapis untuk mengumpul produk kasar. Penulenan sisa dengan kromatografi lajur gel silika disediakan 9, pepejal kuning pucat (0.61 g, hasil 37.7%). Larutan NaH (1.43 mmol) dan 9 (0.33 g, 1.3 mmol) dalam DMF (5 mL) pada suhu bilik dikacau selama 1 jam dan kemudian disejukkan kepada 5–7 ◦C. Etil bromoasetat (0.43 g, 2.6 mmol) telah ditambah kepada campuran yang terhasil dan terus dikacau pada suhu bilik selama 20 jam. Selepas selesai tindak balas (TLC), campuran tindak balas dituangkan ke dalam air ais (15 mL). Mendakan yang terhasil ditapis, dikeringkan, dan kemudian diekstrak dengan kloroform. Penyejatan pelarut memberikan ester mentah yang ditulenkan dengan penghabluran semula untuk memberikan 10, pepejal kuning (0.33 g, hasil 76%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 8.30 (d, J=8.4 Hz, 1H), 8.08 (d, J=8.6 Hz, 1H), 7.75–7.67 (m , 1H), 7.57–7.50 (m, 1H), 7.48 (s, 1H), 5.02 (s, 2H), 4.22 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.96 (s, 3H) , 2.77 (s, 3H), 2.34 (s, 3H), 1.21 (t, J=7.1 Hz, 3H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ (ppm): 169.25, 157.87, 155.96, 147.46, 146.72, 135.46, 132.15, 130.17, 129.51, 129.51, 129.51 19.46, 95.26, 72.06, 61.28, 56.06, 14.59 , 14.34, 13.77. HRMS (ESI) m/z [M+H]+ dikira untuk C20H21NO4: 339.3910 ditemui: 340.1546. 2-(2-metoxy-3,4-dimetil-9-oxoacridin-10(9H)-yl)asid asetik (11): Larutan 10 (0.37 g, 1.1 mmol) dan NaOH (0.05 g, 1.3 mmol) dalam etanol (20 mL) dan air (2 mL) dipanaskan hingga 60 ◦C selama 1 jam. Selepas penyingkiran pelarut, sisa yang terhasil dilarutkan dalam air dan ditapis. Selepas peneutralan turasan dengan conc. HCl, campuran itu ditapis untuk mendapatkan pepejal mentah, kemudian dihablurkan semula oleh metanol untuk memberikan 11, serbuk kuning pucat (0.29 g, hasil 85.7%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 10.51 (s, 1H), 8.33 (d, J=6.9 Hz, 1H), 8.04 (d, J=8.5 Hz, 1H ), 7.69 (s, 1H), 7.67–7.62 (m, 1H), 7.45 (t, J=6.8 Hz, 1H), 4.52 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 2.75 (s, 3H), 2.31 (s, 3H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ (ppm): 159.04, 155.63, 147.47, 146.64, 134.86, 131.52, 129.56, 128.98, 125.98, 125.25, 125.15, 125.25, 125.15 01.77, 96.02, 74.81, 55.69, 14.42, 13.33 . HRMS (ESI) m/z [M+H]+ dikira untuk C18H17NO4: 311.3370 ditemui: 312.1229.
{{0}}chloro-8-metoxy-9,10-dimetil-6H-pyrrolo [3,2,1-de]acridine{ {9}},6(2H)-dione (25): Kepada larutan 6-karboksi-4-metoksi-2,3-dimetilbenzenaminium (14) (1.3 g, 6.4 mmol) dan 2-(2-bromo-4-chlorophenyl)asid asetik (15) (1.6 g, 6.4 mmol) dalam DMF (6 mL) pada suhu bilik, kami kemudiannya menambah serbuk Cu (0.05 g), Cu2O (0.05 g) dan K2CO3 (0.71 g, 5.1 mmol). Campuran tindak balas dipanaskan pada 110 ◦C selama 12 jam. Selepas penyingkiran pelarut di bawah vakum, sisa telah dibubarkan dalam larutan 1 N NaOH (25 mL). Produk mentah diperoleh melalui pemendakan apabila pengasidan turasan dengan conc. HCl. Selepas pengeringan, produk mentah ditambah kepada reagen Eaton (5 mL) pada suhu bilik, kemudian campuran dipanaskan hingga 90 ◦C selama 1 jam. Campuran tindak balas yang disejukkan dijatuhkan ke dalam larutan NaHCO3 berair tepu. Mendakan itu ditapis untuk mengumpul produk kasar. Penulenan sisa dengan kromatografi lajur gel silika disediakan 25, pepejal kuning (0.80 g, hasil 38.6%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 8.17 (d, J =8.1, 1.5 Hz, 1H), 7.86 (d, J=6.9 Hz, 1H), 7.51 (s, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.78 (s, 2H), 2.49 (s, 3H), 2.27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ dikira untuk C18H14ClNO3: 327.7640 ditemui: 328.0734. 4-chloro-8-methoxy-9,10-dimetil-6H-pyrrolo[3,2,1-de]acridine-1 ,6(2H)-dione (26): Sintesis sebatian ini adalah serupa dengan 25. 15 telah digantikan dengan 2-(2-bromo-5-chlorophenyl)asid asetik (16). Kami memperoleh 0.82 g 26 sebagai pepejal kuning pucat dengan hasil 38.7%. 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 7.73 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.64 (s,2H), 2.36 (s, 3H), 2.13 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ dikira untuk C18H14ClNO3: 327.7640 ditemui: 328.0734.
{{0}}fluoro-8-metoksi-9,10-dimetil-6H-pyrrolo[3,2,1-de]acridine{ {9}},6(2H)-dione (27): Sintesis sebatian ini adalah serupa dengan 25. 15 telah digantikan dengan 2-(2-bromo-4-fluorophenyl)asid asetik (17). Kami memperoleh pepejal kuning pekat 27 dengan 0.84 g (42.1% hasil). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 8.21 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.23 (d, J {{39} }.5 Hz, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.81 (s, 2H), 2.53 (s, 3H), 2.30 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ dikira untuk C18H14FNO3: 311.3124 ditemui: 312.1030. 4-fluoro-8-methoxy-9,10-dimetil-6H-pyrrolo[3,2,1-de]acridine-1 ,6(2H)-dione (28): Sintesis sebatian ini adalah serupa dengan 25. 15 telah digantikan dengan 2-(2-bromo-5-fluorophenyl)asid asetik (18). 0.81 g pepejal kuning dalam diperolehi (40.5% hasil). 1H NMR (400 MHz, DMSOD6) δ 7.86 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.77 (s, 2H), 2.49 (s, 3H), 2.26 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ dikira untuk C18H14FNO3: 311.3124 ditemui: 312.1030.
4,8-dimetoksi-9,10-dimetil-6H-pyrrolo[3,2,1-de]acridine-1,6(2H )-dione (29): Sintesis sebatian ini adalah serupa dengan 25. 15 telah digantikan dengan 2-(2-bromo-5-methoxyphenyl)asid asetik (19). {{20}}.73 g pepejal kuning disediakan dengan hasil 35.2%. 1H NMR (400 MHz, DMSO D6) δ 7.93 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.81 ( s, 3H), 3.67 (s, 2H), 2.44 (s, 3H), 2.28 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ dikira untuk C19H17NO4: 323.3480 ditemui: 324.1230. 7-methoxy-5,6-dimetil-9-oxo-9,10-dihydroacridine-4-asid karboksilik (33): Kepada larutan daripada 6-karboksi-4-metoksi-2,3-dimetilbenzenaminium (14) (1.30 g, 6.4 mmol) dan 2-asid bromo-benzoik (7) (1.29 g, 6.4 mmol) dalam DMF (6 mL) pada suhu bilik, kami kemudiannya menambah serbuk Cu (0.05 g), Cu2O (0.05 g) dan K2CO3 (0.71 g, 5.1 mmol). Campuran tindak balas dipanaskan pada 110 ◦C selama 12 jam. Selepas penyingkiran pelarut di bawah vakum, sisa telah dibubarkan dalam larutan 1 N NaOH (25 mL). Produk mentah diperoleh melalui pemendakan apabila pengasidan turasan dengan conc. HCl. Selepas pengeringan, produk mentah ditambah kepada reagen Eaton (5 mL) pada suhu bilik, kemudian campuran dipanaskan hingga 90 ◦C selama 1 jam. Campuran tindak balas yang disejukkan dijatuhkan ke dalam larutan NaHCO3 berair tepu. Mendakan itu ditapis untuk mengumpul produk kasar. Pembersihan sisa menggunakan kromatografi lajur gel silika disediakan 33, pepejal kuning pucat (1.00 g, hasil 52.7%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 13.00 (s, 1H), 10.28 (s, 1H), 8.01 (d, J=9.7 Hz, 1H), 7.69 (d , J=8.5 Hz, 1H), 7.48 (t, J=9.0 Hz, 1H), 7.34 (s, 1H), 3.67 (s, 3H), 2.32 (s, 3H) ), 2.10 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ dikira untuk C17H15NO4: 297.3100 ditemui: 298.1073. 2,7-dimetoksi-5,6-dimetil-9-oxo-9,10-dihydroacridine-4-asid karboksilik (34): sintesis sebatian ini adalah serupa dengan 33. 7 telah digantikan dengan 2-bromo-5- asid metoksibenzoik (30). Pepejal kuning memberikan 1.05 g dengan hasil 50.2%. 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 12.96 (s, 1H), 10.45 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.50 (s, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 2.48 (s, 3H), 2.27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ dikira untuk C18H17NO5: 327.3360 ditemui: 328.1179.
4.2. Ujian Biologi
Kit pengikat STING tetikus, kit pengikat STING WT manusia, kit pengikat AQ STING manusia dan kit pengikat H232 STING manusia telah dibeli daripada Cisbio. 293T mSTING (ISG/KI-IFNb) sel, 293T hSTING-R232 (ISG/KI-IFNb) sel, THP1-KI-hSTING-R232 sel, THP1-KO-STING sel telah dibeli daripada Invivogen. Sel 293T mSTING dan sel 293T hSTING-R232 telah dibiakkan menggunakan DMEM (Gibco, Waltham, MA, USA), 2 mM L-glutamin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Syarikat), 4.5 g/L glukosa (Sigma- Aldrich), 10% FBS (Gibco), Pen-Strep (100 U/mL-100 µM) (Gibco), 100 µM normocin (Invivogen, San Diego, CA, USA) dan ditambah dengan antibiotik terpilih (Invivogen ) blasticidin (10 µM), hygromycin (100 µM) dan zeocin (100 µM). THP1-Sel KO-STING dan sel THP1-KI-hSTING-R232 telah dikultur menggunakan RPMI-1640 (Gibco), 2 mM L-glutamin (Sigma-Aldrich), 25 mM HEPES (Sigma-Aldrich), 10% FBS yang tidak diaktifkan haba (Gibco), PenStrep (100 U/mL-100 µM) (Gibco), 100 µM normocin (Invivogen), dan ditambah dengan antibiotik terpilih (Invivogen) blasticidin ( 10 µM) dan zeosin (100 µM). Penyelesaian QUANTI-Blue, QUANTI-Luc, 20,30 -cGAMP telah dibeli daripada Invivogen. H151 diperoleh daripada Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Beijing, China). Kit ujian daya maju sel luminescent CellTiter-Glo diperoleh daripada Promega.
4.2.1. Ujian Persaingan Mengikat HTRF STING
Menurut arahan kit pengikat STING, penyelesaian berikut telah ditambahkan berturut-turut pada setiap telaga dalam 384-plat perigi: 5 µL sebatian pengesanan atau 2 0,30 -cGAMP (kawalan positif ) dengan kepekatan atau pencair yang berbeza (kawalan negatif); 5 µL manusia STING 6Protein yang ditag-Nya (perigi kawalan negatif telah ditambahkan pada penimbal pengesanan); 10 µL larutan kerja pracampuran STING ligan d2 dan Anti 6His-Tb{11}}. Selepas menyegel plat dan pengeraman pada suhu bilik selama 3 jam, nilai pendarfluor pada 665 nm dan 620 nm dibaca. Nisbah dua keamatan pendarfluor (665 nm/620 nm) digunakan untuk menganggarkan potensi mengikat sebatian. Nilai IC50 (50% kepekatan perencatan) dikira menggunakan perisian GraphPad Prism.
4.2.2. Ujian Selular untuk Penyaringan Kompaun untuk Aktiviti Agonistik
Jumlah 180 µL sel mSTING 293T, sel hSTING-R232 293T dan penggantungan sel THP1-KOSTING telah diedarkan dalam 96-plat bawah rata dengan ketumpatan ~50,000 sel /well (293T) atau ~100,000 sel/well (THP1). Sejumlah 20 µL sama ada larutan masin atau larutan masin bagi sebatian ujian, atau 20,30 -cGAMP sebagai rujukan positif telah ditambah dan sel-sel tersebut diinkubasi pada suhu 37 ◦C dengan 5% CO2 selama 48 jam. Selepas itu, sejumlah 20 µL supernatan telah ditambahkan ke dalam 96-plat bawah rata telaga, diikuti dengan 180 µL larutan QUANTI-Blue untuk setiap telaga. Plat diinkubasi pada 37 ◦C selama 3 jam, dan tahap SEAP (aktiviti laluan IRF) ditentukan menggunakan spektrofotometer pada 620-655 nm.
4.2.3. Ujian Selular untuk Penyaringan Sebatian untuk Aktiviti Perencatan
Pra-percubaan: 180 µL 293T mSTING sel, 293T hSTING-R232 sel (~50,000 sel/perigi) telah dirangsang selama 48 jam pada suhu 37 ◦C dalam Inkubator CO2 5% dengan 10 µL 20,30 -cGAMP (3.125 µM, 6.25 µM) dan 10 µL H151 (1.0 µM ). Selepas itu, sejumlah 20 µL supernatan telah ditambahkan ke dalam 96-plat bawah rata telaga, diikuti dengan 180 µL larutan QUANTI-Blue untuk setiap telaga. Plat diinkubasi pada 37 ◦C selama 3 jam, dan tahap SEAP (aktiviti laluan IRF) ditentukan menggunakan spektrofotometer pada 620-655 nm. 180 µL sel 293T mSTING, penggantungan sel 293T hSTING-R232 telah diedarkan dalam 96-plat bawah rata telaga dengan ketumpatan ~50,000 sel/telaga. Jumlah 10 µL 2 0,30 -cGAMP (3.125 µM) dan kompaun 11 atau kompaun 27 (0.78 µM, 1.56 µM, 3.13 µM, 6.25 µM, 12.5 µM, 12.5 µM, 12.5 µM, 12.5 µM, 12.5 µM µM) atau H151 (0.08 µM, 0.16 µM, 0.31 µM, 0.63 µM, 1.25 µM, 2.5 µM, 5 µM) telah ditambah, dan sel-sel telah diinkubasi pada 37 ◦ 2 jam CO2 untuk 4% Selepas itu, sejumlah 20 µL supernatan telah ditambah ke dalam 96-plat bawah rata telaga, diikuti dengan 180 µL larutan QUANTI-Blue untuk setiap telaga. Plat diinkubasi pada 37 ◦C selama 3 jam, dan tahap SEAP (aktiviti laluan IRF) ditentukan menggunakan spektrofotometer pada 620-655 nm. Nilai IC50 dikira oleh perisian GraphPad.
4.2.4. Ujian Selular untuk Perencatan Dwi Laluan STING
180 µL THP1-Penggantungan sel KI-hSTING-R232 telah diedarkan dalam 96-plat bawah rata telaga dengan ketumpatan ~100,000 sel/telaga. Sejumlah 10 µL 20,30 -cGAMP dan 10 µL sebatian 11 (20 µM) atau sebatian 27 (33 µM) atau H151 (2 µM) telah ditambah dan sel-sel tersebut diinkubasi pada suhu 37 ◦C dengan 5% CO2 selama 24 jam. Selepas itu, sejumlah supernatan ditambah ke dalam 96-plat putih telaga (legap), diikuti dengan larutan QUANTI-Luc atau QUANTI-Blue untuk setiap telaga, dan paras pendaran atau paras SEAP dibaca mengikut arahan pengilang. Ini membolehkan kajian serentak laluan faktor pengawalseliaan IFN (IRF), dengan menilai aktiviti Lucia luciferase dan laluan NF-κB, dengan memantau aktiviti SEAP.
4.2.5. Ujian Daya Tahan Sel Bercahaya CellTiter-Glo
Daya maju sel diukur oleh kit ujian daya maju sel bercahaya CellTiter-Glo mengikut arahan pengilang. Secara ringkas, sel diinkubasi dengan tiga kepekatan berbeza (5 µM, 10 µM, 100 µM) sebatian 11 sebatian 27, atau H-151 selama 48 jam. 100 µL CellTiter-Glo reagen telah ditambahkan ke dalam 96-plat assay well selama 10 minit, kemudian luminescence direkodkan.
4.3. Docking Molekul Sebatian 11
Struktur kristal kompleks STING (PDB ID: 6MXE) telah diambil daripada entri Protein Data Bank dan digunakan sebagai titik permulaan. Protein disediakan menggunakan penyediaan Protein Maestro dan berpecah kepada rantai A dan rantai B. Kami menghasilkan tapak pengikatan dalam LBD monomer STING berdasarkan ligan asal (Merck-18) menggunakan Penjanaan Grid Reseptor. Kami menggunakan ketepatan SP dok Glide untuk bahagian dok molekul, membenarkan kompaun 11 menghasilkan paling banyak 20 pose. Kami akhirnya menghasilkan 16 konformasi terikat (semuanya dalam poket bawah) dan menguji tenaga bebas mengikat kompleks menggunakan modul Prime MM-GBSA dalam perisian Schrödinger. Tambahan pula, berdasarkan skor dok, skor model luncuran dan skor MMGBSA dG Bind, kami memilih konformasi optimum yang mendapat markah pertama dalam dua dan menduduki tempat ketiga dalam satu (lihat dalam Jadual S2). Akhirnya, kami menggabungkan konformasi terbaik bagi rantai A dan B untuk mendapatkan struktur dok yang lengkap.
Rujukan
1. Abe, T.; Harashima, A.; Xia, T.; Konno, H.; Konno, K.; Morales, A.; Ahn, J.; Gutman, D.; Barber, GN STING Pengiktirafan DNA Sitoplasma Menghasut Pertahanan Selular. Mol. Sel 2013, 50, 5–15. [CrossRef]
2. Wu, J.; Matahari, L.; Chen, X.; Du, F.; Shi, H.; Chen, C.; Chen, ZJ Cyclic GMP-AMP Merupakan Pengutus Kedua Endogen dalam Isyarat Imun Semula Jadi oleh DNA Sitosolik. Sains 2013, 339, 826–830. [CrossRef]
3. Abe, T.; Barber, GN Cytosolic-DNA-Mediated, Induksi Gen Proinflamasi Bergantung STING Memerlukan Pengaktifan NF-κB Canonical melalui TBK1. J. Virol. 2014, 88, 5328–5341. [CrossRef]
4. Cai, X.; Chiu, Y.-H.; Chen, ZJ Laluan cGAS-cGAMP-STING Penderiaan dan Isyarat DNA Sitosol. Mol. Sel 2014, 54, 289–296. [CrossRef] [PubMed]
5. Gao, D.; Li, T.; Li, X.-D.; Chen, X.; Li, Q.-Z.; Wight-Carter, M.; Chen, ZJ Pengaktifan sintase GMP-AMP kitaran oleh DNA diri menyebabkan penyakit autoimun. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, E5699–E5705. [CrossRef] [PubMed]
6. Li, TJ; Cheng, H.; Yuan, H.; Xu, QM; Shu, C.; Zhang, YF; Xu, P.; Tan, J.; Rui, Y.; Li, Aktiviti Antitumor PJSR cGAMP melalui Rangsangan cGAS-cGAMP-STING-IRF3 Tindak Balas Imun Semula Jadi. Sci. Rep. 2016, 6, 19049. [CrossRef] [PubMed]
7. Motwani, M.; Pesiridis, S.; Fitzgerald, KA penderiaan DNA oleh laluan cGAS-STING dalam kesihatan dan penyakit. Nat. Rev. Genet. 2019, 20, 657–674. [CrossRef]
8. Zhang, H.; Awak, QD; Xu, XL Menyasarkan Perangsang Gen Interferon (STING): Perspektif Kimia Perubatan. J. Med. Kimia. 2020, 63, 3785–3816. [CrossRef]
9. Gao, J.; Tao, J.; Liang, W.; Zhao, M.; Du, X.; Cui, S.; Duan, H.; Kan, B.; Su, X.; Jiang, Z. Pengenalpastian dan pencirian fosfodiesterase yang secara khusus merendahkan 30 3 0 -GMP-AMP kitaran. Sel Re. 2015, 25, 539–550. [CrossRef] [PubMed]
10. Corrales, L.; McWhirter, SM; Dubensky, TW; Gajewski, TF Laluan STING hos di antara muka kanser dan imuniti. J. Clin. Menyiasat. 2016, 126, 2404–2411. [CrossRef] [PubMed]
11. Baguley, BC; Ching, LM DMXAA: Ejen antivaskular dengan pelbagai tindak balas perumah. Int. J. Radiat. Oncol. biol. Fizik. 2002, 54, 1503–1511. [CrossRef]
12. Lara, PN; Douillard, J.-Y.; Nakagawa, K.; von Pawel, J.; McKeage, MJ; Albert, I.; Losonczy, G.; Reck, M.; Heo, D.-S.; Kipas, X.; et al. Percubaan Terkawal Plasebo Fasa III Rawak Carboplatin dan Paclitaxel Dengan atau Tanpa Ejen Pengganggu Vaskular Vadimezan (ASA404) dalam Kanser Paru-Paru Bukan Sel Kecil Lanjutan. J. Clin. Oncol. 2011, 29, 2965–2971. [CrossRef]
13. Conlon, J.; Burdette, DL; Sharma, S.; Bhat, N.; Thompson, M.; Jiang, Z.; Rathinam, VAK; sami, B.; Jin, T.; Xiao, TS; et al. Tetikus, tetapi bukan STING Manusia, Mengikat dan Isyarat sebagai Tindak Balas kepada Agen Pengganggu Vaskular 5,6-Dimetilxantenon-4-Asid Asetik. J. Immunol. 2013, 190, 5216–5225. [CrossRef] [PubMed]
14. Kim, S.; Li, L.; Maliga, Z.; Yin, Q.; Wu, H.; Mitchison, Flavonoid Antikanser TJ Adalah Agonis STING Pilihan Tetikus. ACS Chem. biol. 2013, 8, 1396–1401. [CrossRef] [PubMed]
15. Cavlar, T.; Deimling, T.; Ablasser, A.; Hopfner, K.-P.; Hornung, V. Pengesanan khusus spesies bagi sebatian molekul kecil antivirus CMA oleh STING. EMBO J. 2013, 32, 1440–1450. [CrossRef]
16. Ranjulu, JM; Pesiridis, GS; Yang, J.; Concha, N.; Singhaus, R.; Zhang, S.-Y.; Tran, J.-L.; Moore, P.; Lehmann, S.; Eberl, HC; et al. Reka bentuk agonis reseptor STING amido benzimidazole dengan aktiviti sistemik. Alam 2018, 564, 439–443. [CrossRef] [PubMed]
17. Chin, EN; Yu, C.; Vartabedian, VF; Jia, Y.; Kumar, M.; Gamo, AM; Vernier, W.; Ali, SH; Kissai, M.; Lazar, DC; et al. Aktiviti antitumor mimetik cGAMP bukan nukleotida STING sistemik. Sains 2020, 369, 993–999.
18. Kuali, BS; Perera, SA; Piesvaux, JA; Presland, JP; Schroeder, GK; Cumming, JN; Trotter, BW; Altman, MD; Buevich, AV; Tunai, B.; et al. Agonis STING bukan nukleotida yang tersedia secara lisan dengan aktiviti antitumor. Sains 2020, 369, eaba6098. [CrossRef] [PubMed]
19. Sali, TM; Pryke, KM; Jinu, A.; Andrew, L.; Iris, A.; Rebecca, B.; Staverosky, JA; Smith, JL; Ahmad, AS; Lisi, AJPP Pencirian Agonis STING Khusus Manusia Novel yang Menimbulkan Aktiviti Antiviral Menentang Alphavirus Muncul. Pathog PloS. 2015, 11, e1005324. [CrossRef] [PubMed]
20. Hong, Z.; Mei, J.; Li, C.; Bai, G.; Maimaiti, M.; Hu, H.; Yu, W.; Matahari, L.; Zhang, L.; Cheng, D.; et al. Inhibitor STING menyasarkan poket pengikat dinukleotida kitaran. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2021, 118, e2105465118. [CrossRef] [PubMed]
21. Siu, T.; Altman, MD; Baltus, GA; Childers, M.; Ellis, JM; Gunaydin, H.; Hatch, H.; Ho, T.; Jewell, J.; Lacey, BM; et al. Penemuan Ligan Kompetitif cGAMP Novel Bentuk STING Tidak Aktif. ACS Med. Kimia. Lett. 2019, 10, 92–97. [CrossRef] [PubMed]
22. Haag, SM; Gulen, MF; Reymond, L.; Gibelin, A.; Abrami, L.; Decout, A.; Heymann, M.; van der Goot, FG; Turcatti, G.; Behrendt, R.; et al. Menyasarkan STING dengan perencat molekul kecil kovalen. Alam 2018, 559, 269–273. [CrossRef]
23. Hou, S.; Lan, X.-J.; Li, W.; Yan, X.-L.; Chang, J.-J.; Yang, X.-H.; Matahari, W.; Xiao, J.-H.; Li, S. Reka bentuk, sintesis dan penilaian biologi analog acridone sebagai agonis reseptor STING novel. Bioorg. Kimia. 2020, 95, 103556. [CrossRef] [PubMed]
24. Ouyang, S.; Lagu, X.; Wang, Y.; Ru, H.; Shaw, N.; Jiang, Y.; Niu, F.; Zhu, Y.; Qiu, W.; Parvatiyar, K.; et al. Analisis Struktur Protein Penyesuai STING Mendedahkan Antara Muka Dimer Hidrofobik dan Mod Pengikatan di-GMP Kitaran. Kekebalan 2012, 36, 1073–1086. [CrossRef] [PubMed]
25. Shu, C.; Yi, G.; Watts, T.; Kao, CC; Li, P. Struktur STING yang terikat kepada di-GMP kitaran mendedahkan mekanisme pengecaman dinukleotida kitaran oleh sistem imun. Nat. Struktur. Mol. biol. 2012, 19, 722–724. [CrossRef]
26. Huang, Y.-H.; Liu, X.-Y.; Du, X.-X.; Jiang, Z.-F.; Su, X.-D. Asas struktur untuk penderiaan dan pengikatan kitaran di-GMP oleh STING. Nat. Struktur. Mol. biol. 2012, 19, 728–730. [CrossRef]
27. Shih, AY; Damm-Ganamet, KL; Mirzadegan, T. Perbezaan Struktur Dinamik antara STING Manusia dan Tetikus Membawa kepada Kepekaan Berbeza kepada DMXAA. Biophys. J. 2018, 114, 32–39. [CrossRef]
28. Gao, P.; Ascano, M.; Zillinger, T.; Wang, W.; Dai, P.; Serganov, AA; Gaffney, BL; Shuman, S.; Jones, RA; Deng, L.; et al. Analisis struktur-fungsi pengaktifan STING oleh c[G(20,50 )pA(30,50 )p] dan penyasaran oleh DMXAA antivirus. Sel 2013, 154, 748–762. [CrossRef] [PubMed]
29. Zhang, C.; Shang, G.; Gui, X.; Zhang, X.; Bai, X.; Chen, ZJN Asas struktur pengikatan STING dengan dan fosforilasi oleh TBK1. Alam Semula Jadi 2019, 567, 394–398. [CrossRef]
30. Vavˇrina, Z.; Gutten, O.; Smola, M.; Zavˇrel, M.; Aliakbar Tehrani, Z.; Charvát, V.; Kožíšek, M.; Boura, E.; Birkuš, G.; Rulíšek, L. Interaksi Protein–Ligan dalam Tapak Pengikat STING Disiasat oleh Mutasi Titik Tunggal Rekaan Rasional: Eksperimen dan Teori. Biokimia 2021, 60, 607–620. [CrossRef] [PubMed]
31. Che, X.; Du, X.-X.; Cai, X.; Zhang, J.; Xie, WJ; Panjang, ZR; Ye, Z.-Y.; Zhang, H.; Yang, L.; Su, X.-D.; et al. Mutasi Tunggal Membentuk Semula Rangkaian Korelasi Struktur Kompleks DMXAA-Human STING. J. Fizik. Kimia. B 2017, 121, 2073–2082. [CrossRef] [PubMed]
32. Restoran, EJ; Burdette, DL; Wilson, SC; Monroe, KM; Kellenberger, CA; Hyodo, M.; Hayakawa, Y.; Hammond, MC; Vance, RE Penderia DNA Kekebalan Innate cGAS Menghasilkan Dinukleotida Kitaran Bukan Kanonik yang Mengaktifkan STING Manusia. Sel Rep. 2013, 3, 1355–1361. [CrossRef] [PubMed]
33. Gao, P.; Zillinger, T.; Wang, W.; Ascano, M.; Dai, P.; Hartmann, G.; Tuschl, T.; Deng, L.; Barchet, W.; Penggantian Patel, DJ Binding-Pocket dan Lid-Region Menjadikan STING Manusia Sensitif terhadap Dadah Spesifik DMXAA. Sel Rep. 2014, 8, 1668–1676. [CrossRef] [PubMed]
34. Hwang, J.; Kang, T.; Lee, J.; Choi, B.-S.; Han, S. Reka bentuk, sintesis dan penilaian biologi C7-terbitan DMXAA berfungsi sebagai agonis STING manusia yang berpotensi. Org. Biomol. Kimia. 2019, 17, 1869–1874. [CrossRef] [PubMed]
