Penindasan Kerosakan Buah Pinggang Berkaitan Keradangan Selepas Pemindahan Menggunakan PrC-210 Pemusnah Radikal Bebas Baharu dalam Tikus
Mar 18, 2022
Torsten R. Goesch 1, Nancy A. Wilson2, Weifeng Zeng2, Bret M. Verhoven2, Weixiong Zhong2,Maya M. Coumbe Gitter3dan William E. Fahl1,3,*
Abstrak:
Allograftbuah pinggangpemindahan, yang mencetuskan penolakan pengantara selular dan antibodi perumah terhadapbuah pinggang, merupakan penyumbang utama kepada kerosakan buah pinggang semasa pemindahan. Di sini, kami bertanya sama ada PRC-210 akan menyekat kerosakan yang dilihat dalam pemindahan buah pinggang allograf. Buah pinggang tikus Brown Norway (BN) telah disapu in situ (Penyelesaian UW) dengan atau tanpa tambahan 30 mM PrC-210 dan kemudian segera dipindahkan ke tikus Lewis (LEW). 20 jam kemudian, buah pinggang BN yang dipindahkan dan plasma LEWrat telah dianalisis.buah pingganghistologi, dan tahap buah pinggang/serum beberapa sitokin yang berkaitan dengan keradangan, diukur untuk menilai patologi buah pinggang yang berkaitan dengan ketidakpadanan dan keberkesanan perlindungan PrC-210. Dua puluh jam selepas pemindahan allograf: (i) kerosakan tubul buah pinggang histologi yang ketara dan penyusupan sel radang mononuklear dilihat dalam buah pinggang allograf; (ii)buah pinggangmetrik fungsi (kreatinin dan BUN) telah meningkat dengan ketara; (iii) perubahan ketara dalam sitokin utama, iaitu, TIMP-1, TNF-alpha dan MIP-3A/CCL20, dan paras caspase diaktifkan buah pinggang telah dilihat. Dalam PRC-210-buah pinggang yang dirawat dan tikus penerima, (i) kerosakan histologi buah pinggang (Skor Banff) dan penyusupan mononuklear telah dikurangkan kepada tahap latar belakang yang tidak dirawat; (ii) kreatinin dan BUN dikurangkan dengan ketara; dan (iii) perubahan caspase dan sitokin yang diaktifkan telah dikurangkan dengan ketara, beberapa ke latar belakang. Kesimpulannya, keputusan menunjukkan bahawa PrC-210 boleh menyediakan perlindungan organ yang boleh digunakan secara meluas untuk banyak keadaan pemindahan allograf; ia boleh melindungi buah pinggang yang dipindahkan semasa dan selepas semua peringkat proses pemindahan—daripada pendermaan organ, melalui pengangkutan, implantasi semula, dan keradangan selepas pembedahan—untuk meminimumkan penolakan akut dan kronik.
Keywords: buah pinggangallograf; penolakan buah pinggang; iskemia
Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com
maca ginseng cistanche
1. Pengenalan
Kegagalan buah pinggang peringkat akhir menyebabkan lebih daripada 1.2 juta kematian setiap tahun di seluruh dunia [1].buah pinggangpemindahan adalah rawatan pilihan untuk pesakit dengan penyakit buah pinggang peringkat akhir. Lebih 90,000 pemindahan buah pinggang dilakukan setiap tahun di seluruh dunia.
Proses pemindahan itu sendiri menyebabkan kecederaan selular dan organ yang ketara kepadabuah pinggang, yang mengurangkan kemandirian jangka panjang organ. Tiga penghinaan utama kepada buah pinggang semasa pemindahan allograf adalah (i) kerosakan disebabkan oleh oksigen dan nitrogen reaktif (ROS dan RNS) semasa iskemia sejuk ('penyimpanan sejuk) [2], (ii) kerosakan akibat ROS semasa implan ('kecederaan re-perfusi') [3], dan (iii) inflamasi selepas pemindahan allograf, yang mencetuskan tindak balas imun semula jadi dan penolakan pengantaraan antibodi (ABMR) [4].
Neutrofil dan makrofaj berhijrah ke dalam pemindahan yang rosak dalam masa 6 jam selepas reperfusi dan merangsang sintesis kemokin dalam sel dendritik pemastautin yang kemudiannya mengaktifkan limfosit T dan merekrut sel imun adaptif. Sebaik sahaja sel imun ini menyusup ke dalam sel epitelium tubul proksimal, mereka menghasilkan myeloperoxidase dalam neutrofil dan nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase dalam makrofaj, yang kedua-duanya menyumbang kepada pengeluaran radikal bebas tempatan. Proses keradangan ini membawa kepada pengaktifan laluan pelengkap dan pembentukan semula sel dan lisis selanjutnya dalambuah pinggangallograft [5].ABMR boleh berlaku akibat salah satu, atau kedua-duanya, alloantibody prabentuk terhadap cantuman atau melalui pembangunan de novo antibodi khusus penderma (dnDSA) [5-7]. Akut (min/hari), beralih kepada kronik (hari/minggu), tindak balas keradangan dalam buah pinggang allograf, dengan pengeluaran berterusan ROS dan sitokin radang, boleh mewujudkan tindak balas yang teruk dan berterusan yang menyebabkanbuah pinggangkegagalan organ.
Untuk lebih memahami laluan selular dan molekul yang terlibat dalam patogenesisbuah pinggangallograft keradangan dan penolakan, kami membangunkan dan mencirikan model tikus yang mereplikasi kebanyakan kriteria klinikal tindak balas imun semula jadi, ABMR, dan kehilangan organ buah pinggang [8]. Model ini telah digunakan untuk menilai beberapa strategi pemindahan pasca-allograf yang baru.
Kedua-duanya pada masa ini mengakui pendekatan untuk mengurangkan tindak balas imun akut dan jangka panjang terhadapbuah pinggangallograft adalah: (i) untuk meningkatkan peluang mencari penderma padanan silang, dan (ii) untuk mengeluarkan antibodi yang sedia ada terhadapbuah pinggangallograft menggunakan protokol penyahpekaan [9,10].
Dalam kerja yang diterangkan dalam manuskrip ini, kami bertanya sama ada pendekatan ketiga untuk menyekat keterukan keradangan akut dan jangka panjang akan bermanfaat. Kami mentadbir pemusnah radikal bebas bertindak segera, PRC-210, kedua-duanya kepada allograf yang diimplanbuah pinggangdan kepada tikus penerima, untuk menentukan sama ada kerosakan ROS yang berkaitan dengan keradangan boleh ditindas. Walaupun konsep menindas ROSin yang berkaitan dengan keradanganbuah pinggangpemindahan bukan baharu, penggunaan di sini bagi PRC bertindak segera-210 ROSscavenger baharu adalah. Kedua-dua penghapusan serta-merta dan kronik serta penyahaktifan penjanaan keradangan, dan penjanaan, radikal bebas dalam allograft yang baru dipindahkanbuah pinggangwould significantly enhance the existing strategies to suppress allograft rejection and would provide another pathway to reduce post-transplant kidney cell damage, and with it, suppress Delayed Graft Function to improve survival of the kidney allograft.PRC-210 is a new small-molecule, aminothiol, free radical scavenger [11]; it has no measurable nausea/emesis nor hypotension side effects [12]. Unlike traditional antioxidants that act indirectly over hours to days via NrF-2 to activate the expression of protective genes [13], PRC-210 directly scavenges ROS to confer 100% protection in seconds [11]. PRC- 210 was the most potent of the 13 commonly studied "antioxidants" screened in an assay that scored the ability of molecules to prevent x-ray-induced damage to naked DNA; the majority of the tested "antioxidants" showed no protection [14,15]. In a related essay, the addition of PrC-210 30 s before a 60 s pulse of •OH to naked DNA provided complete protection against the •OH insult that induced >95 peratus kerosakan DNA dalam kawalan tanpa perlindungan [16]. Dalam dua kajian pemindahan buah pinggang tikus sebelumnya [16,17], PRC-210 telah ditunjukkan untuk menyekat kerosakan buah pinggang yang disebabkan oleh ROS yang disebabkan semasa (i) penyimpanan sejuk 30 jam [17] dan (ii) kecederaan reperfusi semasa implan [16 ] ke tahap latar belakang, sekali gus menghilangkan dua sumber besar kecederaan pada buah pinggang yang dipindahkan. Molekul PRC-210 juga telah ditunjukkan untuk menyekat kecederaan yang disebabkan oleh radikal bebas dalam beberapa tetapan organ lain [15,18]. Oleh itu, kami membuat hipotesis bahawa PrC-210 juga sepatutnya dapat melindungi allograf daripada tekanan oksidatif yang dihasilkan oleh KEDUA-DUA (i) proses penolakan pengantaraan selular dan (ii) antibodi yang menghasilkan radikal bebas sebagai hasil sampingan.
Untuk meneroka hipotesis ini, kami membangunkan model tikus baharu yang mengelakkan induksi peristiwa iskemia dan reperfusi utama dan mentadbir PrC-210 kedua-dua sebelum dan selepas implantasi. Buah pinggang tikus coklat disiram dengan larutan UW yang mengandungi PrC-210 dan segera dipindahkan ke penerima tikus Lewis syngeneik. Masa iskemia sejuk hampir dihapuskan. Segera implan berikut, dan selama 8 jam berikutbuah pinggangimplan, tikus penerima menerima suntikan PrC{0}} sistemik pada dos yang membolehkan penghapusan radikal bebas secara berterusan dalam pemindahanbuah pinggang. Buah pinggang dan plasma darah yang dipindahkan kemudiannya dituai 20 jam selepas pemindahan untuk membolehkan pengukuran kedua-dua PrC-210-yang diberikan (i) penindasan produk sampingan yang meradang dan (ii)buah pinggangperlindungan.
maca ginseng cistanche
2. Bahan-bahan dan cara-cara
2.1. Haiwan
Tikus Lewis dan BN jantan dewasa (200–250 g) telah dibeli dari Envigo (Indian-napolis, IN, Amerika Syarikat) dan ditempatkan di kemudahan penjagaan haiwan di Universiti Wisconsin di Madison, WI, Amerika Syarikat. Semua prosedur telah dilakukan mengikut Dasar Penjagaan dan Penggunaan Haiwan di Universiti Wisconsin. Penyelenggaraan kesihatan haiwan, termasuk kematian haiwan, suhu bilik, kitaran terang/gelap 12 jam, dan pembersihan sangkar, antara tugas sanitasi lain, dilakukan setiap hari oleh kakitangan penjagaan haiwan. Makanan dan air disediakan secara ad libitum. Penyelidikan ini telah diluluskan secara prospektif oleh Pusat Pengajian Perubatan dan Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Kesihatan Awam di Universiti Wisconsin(Protokol Haiwan #M005204). Semua kumpulan mengandungi 4–6 haiwan.
2.2. Bahan
Sintesis PrC-210 HCl aminothiol, molekul praklinikal, telah diterangkan secara berasingan [19,20]. Hablur PrC-210 HCl (3-(methylamino)-2-(metil monometil)propana-1- tiol) disimpan di bawah atmosfera nitrogen pada −20 ◦C, dan juga dengan rutin pencairan, penggunaan dan penyimpanan semula, kristal PrC-210 adalah stabil sepenuhnya selama lebih daripada 4 tahun melalui analisis spektrometri jisim. Reagen kimia lain diperoleh daripada Sigma Aldrich (St. Louis, MO, Amerika Syarikat). UW Organ Preservation Solution telah dibeli dari Bridge to Life, Columbia, SC, USA.
2.3. Prosedur Pembedahan dan Eksperimen
Prosedur pemindahan yang digunakan dalam eksperimen ini ditunjukkan dalam Rajah 1. Dalam tikus penderma BN, selepas pengikatan berganda aorta, pengikatan arteri dan vena buah pinggang kanan, dan bahagian pembedahan vena renal kiri, tikus kiri.buah pinggangtelah disapu in situ menggunakan 5 mL Larutan UW suhu bilik (dalam tempoh 15 saat). Minyak wangi itu sama ada UW Solution sahaja (untuk kumpulan "0 h" dan "20 h Tiada Rawatan"), atau UW Solution yang PrC berhablur-210, mencapai 30 mM [17], telah ditambah, dilarutkan serta-merta, dan kemudian pH diselaraskan kepada pH Larutan UW permulaan 7.4 dengan menambahkan 0.0619 µL 5N NaOH per µmol garam PrC-210 HCL (FW: 220). Separuh hayat PrC-210 thiol (bentuk aktif) adalah lebih kurang 3.5 jam dalam larutan pH fisiologi seperti UW Solution dan darah manusia [14]. Mengikuti perfusi in situ, meninggalkan BNbuah pinggangtelah dikeluarkan melalui pembedahan dan kemudian dijahit dengan anastomosis tumpul pada saluran dan ureter ke dalam tapak buah pinggang kiri yang dikosongkan tikus penerima LEW. LEW yang betulbuah pinggangtelah diikat dan dikeluarkan serta-merta sebelum ini. Lima minit selepas penutupan pembedahan tikus LEW, tikus menerima dos PrC{{0}} sistemik (121 ug PrC-210 HCl setiap gm berat badan, yang sama dengan 0.24 X Dos Boleh Ditoleransi Maksimum) melalui suntikan intraperitoneal. Seperti yang ditunjukkan dalam skema Rajah 1, tikus juga menerima dos suntikan intraperitoneal PrC-210 (0.24 MTD) pada tambah 4 jam dan tambah 8 jam selepas pemindahan. Tikus telah dieutanasi pada ditambah 20 jam selepas pemindahan, danbuah pinggangdan sampel plasma telah dikumpul untuk analisis. Terdapat sekurang-kurangnya lima ekor tikus dalam setiap kumpulan rawatan.
2.4. Pengukuran BUN dan Kreatinin Serum
BUN dan kreatinin diukur dalam sampel serum menggunakan Catalyst One AnalyzerTechnology (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA).
2.5. Ujian Imunosorben Berkaitan Enzim
Ujian dilakukan seperti yang diterangkan dalam protokol kit ELISA (Tikus TIMP-1, Cat# RTM- 100; Rat MIP3-A, Cat# DY540; Rat TNF-alpha, Cat# RTA{ {5}}; Sistem R&D, Minneapolis, MN, Amerika Syarikat). Secara ringkas, pencairan plasma tikus telah ditambah pada plat pra-bersalut, diinkubasi selama 2 jam pada 37 О C. antibodi biotin-konjugasi khusus untuk protein yang diuji kemudiannya ditambah dan diinkubasi selama 1 jam pada 37 О C, dibasuh, konjugasi avidin. peroksidase lobak pedas telah ditambah, diikuti dengan pencucian dan penambahan substrat TMB. Tindak balas telah diinkubasi selama 10-30 minit, dihentikan dengan asid sulfurik, dan dibaca pada 450 nm.
2.6. Tatasusunan Sitokin Tikus Profiler Proteome
Ujian dilakukan pada asasnya seperti yang diterangkan dalam protokol produk. Secara ringkas, plasma diinkubasi dengan membran nitroselulosa yang dikesan dengan antibodi penangkapan dan kawalan. Selepas pengeraman, membran dibasuh dan diinkubasi dengan streptavidin HRP. Dalam sisihan daripada protokol, kami menggunakan SuperSignal West Femto (ThermoFisher, Madison, WI, USA; Cat# 34094) untuk pengesanan chemiluminescent, kerana ia memberikan isyarat yang lebih kuat. Tompok telah divisualisasikan pada sistem dokumen gel FotoDyne.
2.7. Histologi
Formalin-fixed (10 peratus formalin), parafin-tertanam,buah pinggangtelah dipotong kepada 5 bahagian um. Slaid telah dinyahparafin, dihidratkan semula daripada xilena melalui siri etanol tergred kepada air, dan seterusnya dirawat seperti yang diterangkan di bawah. Slaid telah diimbas menggunakan objektif 20- dalam Pengimbas Slaid Patologi Digital Aperio. Semua slaid H&E telah disemak oleh Dr. Weixiong Zhong, MD, PhD, ahli patologi pemindahan, dan dijaringkan untuk PTC, glomerulitis (g), vaskulitis (v)/arteritis intim, inflamasi interstisial (I), dan pewarnaan C4d, menurut Banff 2009 [21].
Secara berasingan, slaid diberikan nombor buta, dan imej digital tubul renal yang tidak bertindih diambil pada antara muka antara medula dan korteks dari setiap slaid H / E. Penjagaan telah diambil untuk tidak memasukkan lumen kapal besar dan glomeruli. Pengiraan automatik piksel merah dan biru dalam setiap 10-buah pinggangimej dilakukan menggunakan makro tersuai yang ditulis dalam perisian ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html
diakses pada 13 April 2021). Piksel merah memantulkan ketebalan tiub proksimal termasuk sempadan berus. Nukleus dikira dalam saluran biru. Nisbah piksel nuklear biru kepada tubul merah memberikan Skor Infiltrasi Keradangan untuk penyusupan sel darah putih dalam pasca pemindahanbuah pinggang. Markah dipuratakan dan diplot menggunakan Graphpad Prism.
2.8. Aktiviti Enzim Caspase Diaktifkan
Aktiviti caspase 3 dan 7 diaktifkan dalambuah pinggangsupernat homogenat ditentukan menggunakan substrat pendarfluor Apo-ONE (Promega, Madison, WI, Amerika Syarikat) [16]. Secara ringkas, dicairkanbuah pinggangtelah dicampur dengan 8-kali ganda penimbal lisis berlebihan yang mengandungi 50 mM Na HEPES, pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 10 peratus gliserol dan dihomogenkan pada 4 О C selama 30 saat dengan penghomogen tisu Omni . Homogenat buah pinggang telah disentrifugasi pada 4ОC (16,000-} g) dalam mikrofuge Eppendorf selama 20 minit. Supernat segera diuji untuk aktiviti caspase, dan kandungan protein dengan kaedah Bradford menggunakan albumin serum lembu sebagai piawai. Ujian caspase yang diaktifkan telah dilakukan seperti berikut: 5 uL supernate (~ 40 ug protein supernate) telah dicairkan kepada jumlah isipadu 50 uL dengan penimbal lisis di atas, dicampur dengan 50 uL substrat Apo-ONE yang tidak dicairkan dalam telaga daripada plat telaga hitam, legap, 96 untuk memulakan tindak balas 60 minit. Plat digoncang pada 200 RPM pada 37 О C selama 60 minit. Pembelahan peptida substrat caspase DEVD diukur menggunakan pembaca plat pendarfluor BMG Clariostar pada panjang gelombang pengujaan 499 nm dan panjang gelombang pelepasan 521 nm. Piawaian caspase dimasukkan dalam setiap eksperimen.
2.9. Mitokondria Buah Pinggang Tikus
Pecahan mitokondria yang telah dimurnikan telah disediakan daripada tikus homogenbuah pinggangdengan teknik sentrifugasi piawai [22]. Mitokondria yang telah dimurnikan telah digantung dalam 0.15 M Tris HCl penimbal, pH 7.4.
Untuk menentukan sama ada penambahan PrC eksogen {{0}} menyekat pemecahan DNA mitokondria yang disebabkan oleh ROS [22], dalam isipadu tindak balas 25 uL (dalam tiub PCR), kami menambah: 1{{29} } uL mitokondria tulen, 5 uL PrC-210 pencairan atau air (PrC-210 telah ditambah 10 minit sebelum penjana Fe tambah tambah tambah ADP tambah H2O2 ●OH), dan 10 uL mengandungi FeCl2 (2.5 mM; FW:127), garam natrium adenosin 5'-difosfat (10 mM; FW: 427) dan H2O2 (0.003 peratus kepekatan akhir). Selepas 20 minit pada 37 О C, 10 uL tindak balas dicampur dengan 5 uL 6- pewarna pemuatan gel yang mengandungi 0.3 peratus SDS; tiub duduk di dalam air 60 О C selama 1 minit, 10 ul kemudian dimuatkan ke dalam perigi 1 peratus agarose gel TAE, dan selepas 60 minit pada 60 volt, gel diwarnakan dan difoto. Sekurang-kurangnya tiga ulangan telah dilakukan untuk setiap titik ujian untuk membolehkan perbandingan statistik.
2.10. Analisis statistik
Data dinyatakan sebagai min tambah /一 STD. Ujian-t pelajar digunakan untuk menentukan perbezaan statistik dan nilai p menggunakan perisian GraphPad Prism 7.03. nilai-p kurang daripada 0.05 dianggap penting.
3. Keputusan
3.1. PrC-210 Penindasan Patologi Allograft Buah Pinggang
Pada 20 jam selepas pemindahan, histologi BN yang dipindahkanbuah pinggang(Rajah 2A–D) yang dirawat dengan UW Solution sahaja jelas menunjukkan peningkatan markah Banff untuk tubulitis dan kapilalitis peritubular (anak panah merah dan kuning); skor patologi yang dijumlahkan ditunjukkan dalam panel E. BNbuah pinggangdiserap dengan PrC{{0}}mengandungi UW Solution dan menerima dos sistemik intraperitoneal pasca implan PrC-210 (Rajah 2D) menunjukkan dengan jelas patologi inflamasi yang ditindas pada buah pinggang dan menekan skor Banff untuk tubulitis dan peritubular capillaritis sama dengan markah Banff bagi kumpulan BN kawalan "0 h" (Rajah 2E). Pentadbiran PrC-210 memberikan pengurangan ketara dalam kedua-dua penanda kerosakan buah pinggang creatine (p=0.032) dan BUN (p=0.046).
3.2. Tahap Caspase Diaktifkan dalam Buah Pinggang Selepas Pemindahan
Tahap caspase diaktifkan dalam BNbuah pingganghomogenat telah dikurangkan dengan ketara dalam alograf BNbuah pinggangyang tidak terdedah kepada rawatan PrC{{0}} selama 20 jam selepas pemindahan (Rajah 5). Perfusi buah pinggang BN dengan PrC-210-mengandungi UW Solution dan pemindahan ke tikus Lewis yang menerima dos PrC-210 sistemik menghasilkan aktiviti caspase diaktifkan yang sama seperti yang dilihat dalam buah pinggang kawalan "0 h".
3.3. Tahap Sitokin Radang Berikutan Allograft Buah Pinggang BN
Dalam eksperimen saringan,buah pinggangsupernat homogenat daripada kawalan 0 h dan 20 jam Tiada Rawatanbuah pinggangtelah disaring dengan tatasusunan sitokin Proteome Profiler 29 untuk mengesan tahap ekspresi sitokin dan kemokin yang diubah, berkaitan dengan keradangan dan kemokin 20 jam selepas pemindahan. Seperti yang ditunjukkan dalam dua sisipan mikroarray Rajah 6, perubahan dilihat dalam TIMP-1, TNF-alpha dan MIP-3a/CCL20. Plat ELISA individu kemudiannya digunakan untuk mengukur perubahan dalam homogenat dan sera buah pinggang ini, kini termasuk tikus yang dirawat dengan PrC-210 juga. Kedua-dua tahap TIMP-1 dan TNF-alpha dinaikkan 20 jam selepas pemindahan, dan dalam kedua-dua kes, tahapnya telah menurun dengan kehadiran PrC-210 (Rajah 6A–C). Tahap MIP-3a/CCL20 telah dinaikkan pada 20 jam, tetapi ia meningkat dengan ketara lebih tinggi dalam tikus yang dirawat-210-PrC (Rajah 6D).
3.4. PrC-210 Perlindungan Mitokondria Buah Pinggang Tikus
Fungsi mitokondria yang berterusan semasa dan selepasbuah pinggangpemindahan diperlukan untuk kemandirian organ yang dipindahkan. ROS yang dihasilkan semasa iskemia berkaitan pemindahan, reperfusi iskemia, dan keradangan selepas implan semuanya boleh menjejaskan prestasi mitokondria buah pinggang dan kelangsungan hidup. Kerana peranan mitokondria yang penting, kami mengasingkan mitokondria daripada buah pinggang tikus dan menentukan sama ada PrC-210 pada kepekatan farmakologi yang boleh dicapai boleh melindungi organel ini daripada penghinaan ROS.
Dalam Rajah 7, tikus yang telah disucikanbuah pinggangmitokondria telah diinkubasi dengan penjana ●OH [23]. Berikutan tindak balas ringkas, kami melihat pemecahan ROS yang ketara bagi DNA mitokondria buah pinggang tikus. Berikutan penghinaan ROS, aliquot mitokondria telah dilarutkan dalam penimbal pemuatan gel yang mengandungi SDS, dan DNA mitokondria dipisahkan dan "bersaiz" menggunakan kromatografi gel agarose (Rajah 7). Penghinaan ROS jelas mengurangkan saiz min DNA mitokondria buah pinggang tikus (jalur b), dan penambahan PrC-210 kepada mitokondria menghalang pemecahan DNA (jalur c–g) dalam PrC-210 cara yang bergantung kepada tumpuan.
maca ginseng cistanche
4. Perbincangan
Allograftbuah pinggangpemindahan, yang mencetuskan penolakan sel-sel dan antibodi-pengantara perumah semula jadi terhadap buah pinggang, merupakan penyumbang utama kepada jangka pendek dan jangka panjang.buah pinggangkerosakan semasa pemindahan, dan Fungsi Cangkok Tertunda yang berkaitan dilihat pada sehingga 50 peratus buah pinggang yang dipindahkan. Kami menjalankan kajian ini untuk menentukan sama ada PrC-210 berkesan dalam menyekat keterukan kerosakan yang disebabkan berikutan pemindahan buah pinggang allograf dalam model tikus yang sebahagian besarnya menghapuskan masa iskemia pemindahan dan tekanan oksidatif yang berkaitan. Andaian kami ialah pendekatan ini sepatutnya membolehkan kami melihat kesan PrC-210 pada penghinaan keradangan selepas pemindahan dengan gangguan iskemia yang minimum.
Peningkatan dalam TNF-alpha dan penyusupan mononuklear yang ketara menunjukkan bahawa pemindahan buah pinggang allograf menyebabkan keradangan akut yang ketara dalam 20 jam selepas pemindahan, dan ini dikaitkan dengan kerosakan sel tubular buah pinggang yang dilihat dalambuah pingganghistologi (Skor Banff). TNF-alpha terutamanya dihasilkan oleh makrofaj yang diaktifkan dan merupakan protein isyarat sel yang terlibat dalam inflamasi akut. Ia berkait rapat dengan patogenesis penolakan allograf akut dan kronik [24].
Berbeza dengan penemuan di atas dalam BN yang tidak dirawatbuah pinggang, PrC-210 yang diberikan sebagai sebahagian daripada Penyelesaian UW dan ditadbir secara sistemik dalam tikus selepas pemindahan telah mengurangkan kedua-dua tahap TNF-alfa dan penyusupan buah pinggang oleh sel mononuklear, yang kedua-duanya merupakan tanda pengurangan inflamasi akut. PrC-210 mengurangkan kerosakan buah pinggang seperti yang dilihat dalam skor kecederaan buah pinggang histologi (Skor Banff) kepada tahap latar belakang yang tidak dirawat dan menurunkan tahap kedua-dua skor fungsi patologi buah pinggang, kreatinin dan BUN.
Keradangan pada buah pinggang BN yang tidak dirawat dikaitkan dengan peningkatan dalam kedua-dua TIMP-1 dan MIP-3A/CCL20. Sebagai perbandingan, kami melihat bahawa rawatan PrC-210 telah mengurangkan tahap TIMP-1 dengan ketara dan meningkatkan tahap MIP-3A/CCL20 dengan ketara.
Perencat tisu metalloproteinase-1 (TIMP-1) ialah pengawal selia penting sintesis dan degradasi matriks ekstraselular (ECM). Pengumpulan ECM yang berlebihan adalah mekanisme patologi utama perkembangan fibrosis semasa dan selepas kecederaan buah pinggang akut. Pada asasnya tiada ungkapan TIMP-1 secara normalbuah pinggangtisu [25], pemerhatian yang disokong dalam Rajah 6A, B kami, tetapi TIMP-1 diketahui dinyatakan dalam buah pinggang yang cedera, terutamanya dalam sel epitelium tubular renal, membran bawah tanah tiub renal dan sitoplasma interstisial sel. Ekspresi TIMP-1 yang meningkat berkorelasi secara positif dengan kemerosotan fungsi buah pinggang secara serentak [26]. Tikus yang dirawat dengan PrC-210 menunjukkan pengurangan ketara dalam tahap TIMP-1 (p=0.001), kedua-duanya dalam homogenat buah pinggang dan plasma; ini menunjukkan bahawa PrC-210 memberikan kesan perlindungan yang kuat terhadap penyusunan semula yang disebabkan oleh pemindahan matriks ekstraselular buah pinggang.
Kemokin MIP-3a/CCL20 mengaktifkan reseptor CCR6, yang dinyatakan terutamanya pada sel-T kawal selia (Tregs). CCL20 diekspresikan oleh sel endothelial dan interstisial tiub dan juga dikawal dalam buah pinggang dengan kecederaan buah pinggang akut. Laluan CCL20– CCR6 memainkan peranan penting dalam pengambilan sel T-pengantara Treg ke buah pinggang, dan Treg telah digambarkan mempunyai peranan positif dalambuah pinggangpembaikan, toleransi pemindahan, dan kelangsungan hidup buah pinggang. Kedua-dua penyekatan antibodi pada laluan CCL20–CCR6, serta penggunaan tikus6-kekurangan CCR dalam keadaan akutbuah pinggangeksperimen kecederaan, ditunjukkan untuk meningkatkan keterukan kegagalan buah pinggang dan kematian [27]. Ini menunjukkan, secara klinikal, peningkatan laluan CCL20-CCR6 dan pengaktifan Treg mungkin merupakan laluan terapeutik yang mungkin untuk mengehadkan akut dan kronik.buah pinggangkecederaan [28]. Dalam kajian kami (Rajah 6D), paras MIP-3a/CCL20 adalah lebih tinggi dengan ketara dalam PrC-210-tikus yang dirawat berbanding tikus yang tidak dirawat. Kami membuat spekulasi bahawa ini adalah salah satu sebab untuk kedua-dua (i) pengambilan sel mononuklear yang ketara lebih rendah kepada buah pinggang (Rajah 3C) dan (ii) kerosakan buah pinggang yang berkurangan dengan ketara (Rajah 2) dalam tikus yang dirawat PrC-210- .
Fungsi mitokondria buah pinggang yang normal, dan yang penting, penghinaan terhadapnya semasa penyimpanan buah pinggang, implan, dan langkah-langkah keradangan selepas implan adalah penentu penting kecederaan ROS dan kegagalan buah pinggang semasa pemindahan. Oleh itu, adalah penting bahawa PrC-210 ditunjukkan untuk memberikan penindasan lengkap pemecahan DNA mitokondria (Rajah7) pada kepekatan (2-4 mM) yang telah dicapai dalam plasma kedua-dua tikus dan tikus yang diberikan sama ada intraperitoneal atau sistemik oral 0.5 dos MTD PrC-210 yang diterima tanpa ketoksikan yang boleh dikesan [29].
Dalam kajian berkaitan pemindahan buah pinggang kami yang terdahulu [16,17], kami melihat peningkatan yang ketara dalam caspase diaktifkan dalam buah pinggang yang terdedah kepada kecederaan "iskemia sejuk" dan "iskemia-reperfusion". Penghinaan yang disebabkan oleh iskemia pada buah pinggang ini telah dikurangkan ke latar belakang dengan rawatan dengan PrC-210 (Rajah8). Dalam kajian manuskrip ini (Rajah 5), di mana iskemia sejuk dan reperfusi iskemia pada dasarnya dihapuskan dengan pemindahan segera, tiada peningkatan dalam caspase diaktifkan dalam buah pinggang yang dipindahkan. Sebaliknya, caspase yang diaktifkan telah dikurangkan dengan ketara pada tambah 20 jam dalam kawalan "Tiada Rawatan Dadah", dan rawatan PrC-210 menghapuskan sepenuhnya pengurangan caspase ini dalam tambah 20 jam tikus dan memastikan tahap caspase stabil. Tafsiran kami tentang keputusan yang menarik ini ialah tiada sebarang penghinaan radikal bebas yang disebabkan oleh iskemia yang ketara melalui ROS dan RNS kepada pasca pemindahan.buah pinggang, tiada kematian sel yang berkaitan dan penanda apoptosis seperti caspases diaktifkan. Sebaliknya, dalam pemindahan buah pinggang allograf ini, isyarat keradangan daripada sito- dan kemokin yang baru dinyatakan kini mengawal metabolisme sel, yang termasuk mempengaruhi laluan apoptosis. Literatur menerangkan bahawa ekspresi berlebihan TIMP-1 membawa kepada penindasan apoptosis [26]. Keputusan caspase kami (Rajah 5) menyokong kesan TIMP-1 yang diterangkan ini dan ia membayangkan bahawa TIMP-1 adalah penting dalam mengawal selia patofisiologi kerosakan sel selepas pemindahan allograft buah pinggang. Sebagai menyokong penindasan PrC-210 yang terdahulu bagi ungkapan TIMP-1 (Rajah 6A, B), rawatan PrC-210 benar-benar mengurangkan perubahan caspase, mengekalkan tahap caspase pada tahap yang sama yang dilihat dalam kawalan "0 h" buah pinggang. Kerana tahap PrC-210 serum TIMP-1 yang dikurangkan pada tambah 20 jam (Rajah 6B) dengan tepat mencerminkan penindasan alograf yang ketara: (i) apoptosis (Rajah 5), (ii) patologi histologi (Rajah 2 dan 3) dan (iii) penyusupan sel radang (Rajah 3), kami menjangkakan pemantauan tahap TIMP{19}} serum dalam penerima allograf buah pinggang manusia akan menjadi cara logik untuk memantau keberkesanan klinikal PrC-210 dalam ujian klinikal akan datang .
Dalam kerja kami sehingga kini [16,17], kami telah menunjukkan bahawa PrC-210 mampu melindungi buah pinggang yang dipindahkan daripada kedua-dua iskemia sejuk dan penghinaan reperfusi iskemia. Dalam kajian ini, kini kita melihat bahawa PrC-210 juga melindungi buah pinggang allograf daripada penghinaan keradangan bukan iskemia yang berlaku selepas implan buah pinggang. PrC-210 secara ketara mengurangkan tahap sitokin inflamasi akut, seperti TNF-alpha, dan menyekat ekspresi kemokin TIMP-1. Kedua-dua peristiwa ini, dan berpotensi, disokong lagi oleh ekspresi CCL20 tambahan, dijangka akan: (i) mengurangkan kerosakan buah pinggang allograf, (ii) menyekat pengambilan sel T ke buah pinggang, dan (iii) menyekat pengaktifan semula jadi dan sistem imun adaptif. Dalam Rajah 8, kami meringkaskan penemuan ini untuk menyokong peranan yang kami rasa PrC- 210 boleh mainkan dalam pemindahan buah pinggang manusia; ia menindas: (i) iskemia sejuk spesies oksigen reaktif (ROS) dan spesies nitrogen reaktif (RNS) kerosakan pada latar belakang [17],
(ii) kerosakan ROS iskemia-reperfusi pada latar belakang [16], dan (iii) kerosakan inflamasi allograf dengan ketara, dalam beberapa kes, ke latar belakang. Memandangkan mekanisme tindakan PrC-210 utama untuk PrC-210 adalah menghilangkan radikal bebas oksigen dan nitrogen, ini membayangkan bahawa radikal bebas ini merupakan penyumbang penting kepada kerosakan buah pinggang yang dilihat dalam keadaan bukan iskemia, iaitu, inflamasi berkaitan alograf yang dikaji dalam manuskrip ini.
Ringkasnya, ini menunjukkan bahawa PrC-210 boleh menyediakan perlindungan organ yang boleh digunakan secara meluas untuk banyak keadaan pemindahan allograf; ia boleh melindungi buah pinggang yang dipindahkan semasa dan selepas semua peringkat proses pemindahan—daripada pendermaan organ, melalui pengangkutan, implantasi semula, dan keradangan selepas pembedahan—untuk meminimumkan penolakan akut dan kronik.
Cistanche tubulosa mencegah penyakit buah pinggang, klik di sini untuk mendapatkan sampel
Sumbangan Pengarang:NAW, WZ (Weifeng Zeng), WZ (Weixiong Zhong), BMV dan MMCG mengambil bahagian dalam prestasi penyelidikan dan analisis data; TRG dan NAW mengambil bahagian dalam reka bentuk penyelidikan dan analisis data; WEF dan TRG mengambil bahagian dalam reka bentuk penyelidikan, prestasi penyelidikan, analisis data, dan penulisan kertas kerja. Semua pengarang telah membaca dan bersetuju dengan versi manuskrip yang diterbitkan.
Pembiayaan:Penyelidikan ini dibiayai oleh Institut Penyelidikan Klinikal dan Terjemahan UW dan memberikan UL1TR002373 kepada UW ICTR daripada NIH/NCATS, Persatuan Pakar Bedah Transplantasi Amerika (133 AAA1552), Kolej Pakar Bedah Amerika (133 AAB2176), dan memberikan sokongan kepada WEF (# R03CA176799).
Penyata Lembaga Kajian Institusi: Penyelidikan ini telah diluluskan secara prospektif oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Pusat Pengajian Perubatan dan Kesihatan Awam di Universiti Wisconsin (Protokol Haiwan #M005204).
Penyata Ketersediaan Data:Data kajian tersedia sepenuhnya dalam manuskrip ini. Konflik Kepentingan: Pengarang mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.
Rujukan
1. Wang, H.; Naghavi, M.; Allen, C.; Tukang Gunting Rambut, RM; Bhutta, ZA; Casey, DC; Charlson, FJ; Chen, AZ; Coates, MM; Coggeshall, M.; et al. Jangka hayat global, serantau dan kebangsaan, kematian semua sebab, dan kematian sebab khusus untuk 249 punca kematian, 1980–2015: Analisis sistematik untuk Kajian Beban Global 2015. Lancet 2016, 388, 1459–1544. [CrossRef]
2. Rawat, E.; Chow, E.; Peipert, JD; Waterman, A.; Kwan, L.; Massie, AB; Thomas, AG; Bowring, MG; Leeser, D.; Flechner, S.; et al. Menghantar buah pinggang penderma hidup dan hasil penerima pemindahan. Arab. Archaeol. Epigr. 2017, 18, 632–641. [CrossRef] [PubMed]
3. Berat, SC; Bell, PR; Nicholson, ML Kecederaan iskemia-reperfusi buah pinggang. Br. J. Surg. 1996, 83, 162–170. [PubMed]
4. Sellarés, J.; De Freitas, DG; Mengel, M.; Reeve, J.; Reinecke, G.; Kak, B.; Hidalgo, LG; Famulski, K.; Matas, A.; Halloran, PF Memahami Punca Kegagalan Pemindahan Buah Pinggang: Peranan Dominan Penolakan dan Ketidakpatuhan Pengantaraan Antibodi. Am. J. Pemindahan. 2012, 12, 388–399. [CrossRef]
5. Siedlecki, A.; Irish, W.; Brennan, DC Kelewatan Fungsi Graft dalam Pemindahan Buah Pinggang. Arab. Archaeol. Epigr. 2011, 11, 2279–2296. [CrossRef]
6. Hidalgo, LG; Campbell, PM; Kak, B.; Meinecke, G.; Mengel, M.; Chang, J.; Sellars, J.; Reeve, J.; Halloran, PF; Hidalgo, LG; et al. Antibodi Khusus De NovoDonor pada Masa Biopsi Pemindahan Buah Pinggang Bersekutu dengan Patologi Mikrovaskular dan Kegagalan Cantuman Lewat. Arab. Archaeol. Epigr. 2009, 9, 2532–2541. [CrossRef]
7. Loupy, A.; Bukit, GS; Jordan, SC Kesan antibodi anti-HLA khusus penderma pada kegagalan allograft buah pinggang lewat. Nat. Rev. Nephrol. 2012, 8, 348–357. [CrossRef]
8. Huang, G.; Wilson, NA; Reese, SR; Jacobson, LM; Zhong, W.; Djamali, A. Pencirian Penolakan Pengantaraan Antibodi Akut yang Ditimbulkan Transfusi dalam Model Pemindahan Buah Pinggang Tikus. Arab. Archaeol. Epigr. 2014, 14, 1061–1072. [CrossRef] [PubMed]
9. Jordan, SC; Pescovitz, MD Presensitization: Masalah dan Pengurusannya. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 2006, 1, 421–432. [CrossRef] [PubMed]
10. Stegall, M.; Gloor, J.; Winters, J.; Moore, S.; DeGoey, S. Perbandingan Plasmapheresis Berbanding Penyahpekaan IVIG Dos Tinggi dalam Penerima Allograft Renal dengan Tahap Tinggi Alloantibody Khusus Penderma. Arab. Archaeol. Epigr. 2006, 6, 346–351. [CrossRef] [PubMed]
11. Peebles, DD; Soref, CM; Fahl, WE ROS-pemusnah dan keberkesanan radioprotektif PrC-210 aminothiol baharu. Sinaran. Res. 2012, 178, 57–68. [CrossRef]
12. Soref, CM; Penggodam, TA; Fahl, KAMI Aktif Secara Oral Baharu, Aminothiol Radioprotector Bebas Loya dan Kesan Sampingan Hipotensi pada Dos Radioprotektif Tertingginya. Int. J. Radiat. Oncol. 2012, 82, e701–e707. [CrossRef]
13. Techapiesancharoenkij, N.; Fiala, JL; Navasumrit, P.; Croy, RG; Wogan, GN; Groopman, JD Sulforaphane, agen chemopreventive kanser, mendorong laluan yang berkaitan dengan biosintesis membran sebagai tindak balas kepada kerosakan tisu oleh aflatoksin B1. Toksik. Appl. Pharmacol. 2015, 282, 52–60. [CrossRef] [PubMed]
14. Jermusek, F.; Benedict, C.; Dreischmeier, E.; Jenama, M.; Di bawah, M.; Jeffery, JJ; Ranallo, FN; Fahl, WE Penindasan Ketara Kerosakan DNA Akibat Sinaran CT dalam Sel Manusia Normal oleh PrC-210 Radioprotector. Sinaran. Res. 2018, 190, 133–141. [CrossRef] [PubMed]
15. Penggodam, TA; Diarra, G.; Fahl, BL; Kembali, S.; Kaufmann, E.; Fahl, WE Pengurangan ketara kematian sel reperfusi iskemia dalam infark miokardium tetikus menggunakan PrC{3}} ROS-scavenger bertindak segera. Pharmacol. Res. Perspek. 2019, 7, e00500. [CrossRef]
16. Bath, NM; Fahl, KAMI; Redfield, RR Pengurangan ketara kematian sel reperfusi iskemia renal murine menggunakan PrC bertindak segera-210 pemulung spesies oksigen reaktif. Pemindahan. Langsung. 2019, 5, e549–e555. [CrossRef] [PubMed]
17. Verhoven, BM; Karim, AS; Bath, NM; Fahl, CJS; Wilson, NA; Redfield, RR; Fahl, KAMI Penambahbaikan Ketara dalam Penyimpanan Sejuk Buah Pinggang Tikus Menggunakan Penyelesaian Pemeliharaan Organ UW Dilengkapi dengan PrC Bertindak Segera-210 Pemusnah Radikal Bebas. Pemindahan. Langsung 2020, 6, e578. [CrossRef]
18. Giese, APJ; Guarnaschelli, JG; Ward, JA; Choo, DI; Riazuddin, S.; Ahmed, ZM Kesan Radioprotektif Aminothiol PrC-210 pada Telinga Dalaman Bersinar Guinea Babi. PLoS ONE 2015, 10, e0143606. [CrossRef]
19. Copp, RR; Peebles, DD; Fahl, WE Sintesis dan aktiviti pengawalseliaan pertumbuhan ahli prototaip keluarga baru radioprotektor aminothiol. Bioorganik Med. Kimia. Lett. 2011, 21, 7426–7430. [CrossRef]
20. Fahl, KAMI; Peebles, D.; Copp, RR Amino Thiol Sebatian dan Komposisi untuk Kegunaan Bersama Terapi Kanser. Paten AS 7,314,959, 12 April 2004.