Pengimejan Dengan Jelas Dan Mengukur Buah Pinggang dalam 3D
Feb 27, 2022
Selama beberapa dekad, pengukuran bagibuah pinggangmikroanatomi menggunakan 2-bahagian dimensi telah memberikan kami pengetahuan terperinci tentang buah pinggang morfologi di bawah keadaan fisiologi dan patologi. Walau bagaimanapun, perkembangan pesat kaedah pembersihan tisu dalam beberapa tahun kebelakangan ini, digabungkan dengan pembangunan modaliti pengimejan dimensi 3-baru telah memberikan pandangan baharu tentangbuah pinggangstruktur dan fungsi. Artikel ulasan ini menerangkan pelbagai cerapan novelbuah pinggangperkembangan dan penyakit yang diperoleh baru-baru ini menggunakan pendekatan metodologi baharu ini. Sebagai contoh, dalam pembangunanbuah pinggangpendekatan ini telah memberikan pemahaman baru tentang morfogenesis cawangan ureterik, percambahan dan komitmen sel progenitor nefron, interaksi antara sel hujung ureterik dan sel progenitor nefron, dan penubuhan segmentasi nefron. Dalam keseluruhan tetikus dewasabuah pinggang, pembersihan tisu digabungkan dengan mikroskop kepingan cahaya boleh imej dan mengukur jumlah glomeruli, satu kejayaan besar dalam bidang. Pendekatan yang sama telah memberikan pandangan baru tentang struktur vaskular buah pinggang dan pemuliharaan, pembentukan semula tubulointerstitial, kehilangan podosit dan hipertrofi, pembentukan sista, evolusi bulan sabit selular, dan struktur penghalang penapisan glomerular. Banyak lagi kemajuan dalam pemahaman tentangbuah pinggangbiologi dan patologi boleh dijangka apabila teknik pembersihan dan pengimejan tambahan dibangunkan dan diterima pakai oleh lebih ramai penyiasat.
Kata kunci:pengimejan 3D; glomerulus; perkembangan buah pinggang; nefropatologi; pembersihan tisu; tubulus; buah pinggang
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI FUNGSI BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
Jumlah nombor nefron dalam setiap manusia biasabuah pinggangberjulat daripada kira-kira 200,000 kepada lebih daripada 2 juta, 1 purata kira-kira 1 juta. Nefron ini serta komponen lain dalambuah pinggangtermasuk saluran pengumpul, saluran darah, interstitia, dan gentian saraf disusun dengan ketepatan mikroanatomi yang indah. 2 Corak yang tepat ini menyokong normalfungsi buah pinggangdan kesihatan, yang boleh sangat terganggu apabila seni bina tisu diubah disebabkan oleh hipertrofi atau pengecutan glomerular atau tiub, kehilangan nefron, keabnormalan kongenital, jarang kapal dan fibrosis interstisial. Pelbagai pendekatan pengimejan telah menyumbang kepada pemahaman komprehensif kami tentangbuah pinggangmikroanatomi semasa pembangunan dan pada orang dewasa yang sihat dan berpenyakitbuah pinggang. Untuk sebahagian besar, pemahaman ini diperoleh daripada analisis 2-bahagian dimensi (2D) sama ada bahagian fizikal mikroskopik cahaya atau elektron atau bahagian optik confocal. Kuantiti mikroanatomi ini kebanyakannya bergantung pada analisis stereologi bahagian yang telah memberikan anggaran nombor, panjang, luas permukaan, dan isipadu glomeruli, tubul, vesel, interstitia, dan komponen selularnya. 3,4 Sehingga baru-baru ini, visualisasi 3D bagibuah pinggangmikrostruktur sebahagian besarnya terhad kepada mikroskopi confocal, yang membolehkan keratan optik dan pembinaan semula 3D sehingga kedalaman 50 hingga 80 m m. Malangnya, sifat biasan komponen protein dan lipid dalam tisu menyerakkan cahaya dan secara mendadak mengurangkan kualiti imej apabila kedalaman meningkat. Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, pelbagai kaedah pembersihan telah dibangunkan untuk membuang kandungan lipid dan pigmen tisu dan memadankan sifat biasan tisu dan media pelekap untuk menjadikan tisu itu telus. 5 Kaedah pembersihan terdiri daripada kerumitan daripada mengeram tisu dalam pelbagai penyelesaian dalam tempoh beberapa jam kepada prosedur lanjutan yang melibatkan peralatan elektrokimia tersuai. Kami mengarahkan pembaca ke ulasan terbaru 5,6 untuk gambaran keseluruhan terperinci kaedah semasa, dan kertas yang dipetik di sini untuk kaedah dan kes penggunaan tertentu.
Struktur subselular dan keseluruhan populasi sel boleh diselesaikan dalam keseluruhan organ yang dibersihkan atau bahagian tebal. Ciri pengimejan yang tepat dalam tisu yang dibersihkan memerlukan mikroskop khusus dan pemprosesan imej untuk menangkap dan membina semula data isipadu daripada sampel yang boleh bersaiz daripada ratusan mikron hingga sentimeter. Mikroskop confocal pengimbasan titik dan cakera berputar telah digunakan dengan berkesan untuk ciri imej yang dikosongkanbuah pinggangtisu tetapi mengalami pengurangan resolusi dalam paksi Z dan pengurangan progresif dalam intensiti pendarfluor pada kedalaman disebabkan oleh paksi tunggal pencahayaan dan pengimejan. Teknik mikroskopi kepingan cahaya amat sesuai untuk pengimejan tisu yang dibersihkan kerana ia membolehkan pemerolehan cepat volum 3D yang besar dan boleh termasuk pencahayaan dan pengimejan berbilang sudut. Tomografi unjuran optik ialah pendekatan lain yang menggabungkan pengimejan berbilang sudut dan pembinaan semula digital untuk menghasilkan data di mana paksi X, Y dan Z bagi setiap voxel adalah resolusi yang sama. Tanpa mengira pendekatan khusus, pembersihan tisu dan pengimejan pemasangan keseluruhan memberikan peluang baharu untuk menerokai persekitaran mikro selular yang belum dipetakan dan struktur tisu peringkat tinggi. Dalam ulasan ini, kami menyerlahkan beberapa cerapan baharubuah pinggangperkembangan, dewasabuah pinggangstruktur, dan patologi yang terhasil daripada pembersihan tisu diikuti dengan analisis kuantitatif 3D.
Pandangan baharu tentang perkembangan buah pinggangBeberapa dekad pemprofilan ekspresi gen dan kajian kalah mati telah membawa kepada pemahaman terperinci tentang jenis sel, rangkaian pengawalseliaan gen, dan laluan isyarat yang mengawal mamalia.buah pinggangpembangunan. Pengetahuan ini memaklumkan diagnosis penyakit kongenital dan membolehkan pengeluaranbuah pinggangjenis sel daripada sel stem pluripotent. 7 Walau bagaimanapun, saiz, kelegapan dan kerumitan pembangunanbuah pinggangmembentangkan halangan yang ketara untuk mengukur dengan tepat morfogenesis organ ini dan pengedaran 3D sel dan protein di dalamnya. Aplikasi pembersihan tisu dan pengimejan berbilang skala dalambuah pinggangtelah membolehkan visualisasi dan analisis kuantitatif morfogenesis cawangan ureter, populasi sel progenitor, dan endowmen nefron dalam organ yang utuh (Rajah 1). 8 Pendekatan ini menyokong kapasiti baharu untuk fenotaip ketepatan dan laluan terbuka untuk menganalisis pemacu selular dan molekulbuah pinggangperkembangan dan penyakit kongenital.
Pengimejan dan menganalisis morfogenesis percabangan dalam 3D.Penubuhan pokok ureter adalah ciri yang menentukanbuah pinggangpembangunan dan telah dikaji secara meluas menggunakan genetik tikus dan diratakanbuah pinggangbudaya eksplan. Walau bagaimanapun, memahami bagaimana gen individu menyumbang kepada pertumbuhan, bentuk dan corak struktur saluran epitelium bercabang ini dalam vivo memerlukan kapasiti untuk imej dan menganalisis rangkaian kompleks ini merentasi pelbagai saiz sampel. Pendek et al. 8 menangani isu-isu ini menggunakan immunofluorescence pemasangan keseluruhan, pembersihan berasaskan pelarut (benzyl alcohol benzyl benzoate) dan pengimejan keseluruhan organ dengan tomografi unjuran optik. Menggunakan pendekatan ini untuk menangkap gambar 3D dari awal hingga pertengahanbuah pinggangpembangunan, pasukan membangunkan perisian analisis tersuai untuk memperoleh perincian yang belum pernah berlaku sebelum ini tentang pokok ureterik termasuk nombor hujung, sudut dan panjang cawangan, jumlah cawangan, dan bilangan generasi bercabang daripada pokok ureterik yang utuh (Rajah 1c dan d). 8 Pada mulanya digunakan untuk mencirikan dan mengenal pasti aspek baharu percabangan buah pinggang, 9,10 usaha berterusan berusaha untuk mentakrifkan prinsip dan pengawal selia utama yang mengawal corak cawangan dalam vivo. 1
Menghubungkan dinamik progenitor kepada morfogenesis organ dengan pengimejan berbilang skala.Interaksi molekul antara sel ureterictip dan sel progenitor nefron memainkan peranan utama dalam mewujudkan pelengkap nefron yang memudahkanfungsi buah pinggangdalam kehidupan dewasa. Nefron progenitor yang tidak diinduksi menghasilkan faktor yang menggalakkanbuah pinggangpertumbuhan melalui percabangan ureterik manakala isyarat terhad secara ruang dalam hujung ureteri kedua-duanya mengekalkan keadaan nenek moyang nefron dan mendorong subset nenek moyang ini untuk membezakan menjadi nefron awal. Interaksi ini memacu kitaran percabangan dan induksi nefron yang terhenti sekitar kelahiran, apabila nenek moyang nefron yang tinggal membezakan. Sebelum kaedah pembersihan tisu, pemahaman kami tentang dinamikbuah pinggangmorfogenesis dan kelimpahan relatif populasi sel progenitor merentas masa adalah sangat terhad. Ini berubah dengan pembangunan pendekatan pengimejan berbilang skala menggunakan protokol imunofluoresensi lanjutan, pembersihan tisu, dan pendekatan pengimejan untuk mengukurbuah pinggangperkembangan pada tahap selular (konfokal) dan seluruh organ (tomografi unjuran optik, kepingan cahaya). 9,10 Ia menjadi jelas bahawa kadarbuah pinggangpertumbuhan berbeza secara dramatik dengan kadar percabangan dan percambahan yang pada mulanya pesat menurun dalam fasa yang berkorelasi dengan pengurangan bilangan sel progenitor dalam niche nefrogenik. 10 Pengimejan konfokal tiga dimensi bagi seluruh janin manusia yang dibersihkanbuah pinggang(minggu 11) atau sampel daripadabuah pinggangkorteks (minggu 11–23) mengesahkan bahawa pengurangan saiz niche ini dipelihara merentas spesies. 12 Analisis perbandingan lanjut mengenai ceruk nefrogenik manusia dan tetikus dalam tisu yang dibersihkan membawa kepada model perekrutan baru berdasarkan masa pembentukan nefron, di mana sel progenitor ditambah secara beransur-ansur kepada nefron awal dan menggunakan identiti segmen mengikut susunan ia tiba. . 13 Dalam kajian lain yang menumpukan pada komitmen progenitor nefron, kaedah pembersihan tisu berasaskan hidrogel (Pasif Clear Lipid-exchanged Acryl-amide-hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/In situ hybridization-compatie Tissue-hYdrogel [CLARITY] 14 ) telah digunakan untuknya. keupayaan untuk mengekalkan pendarfluor wartawan tdTomato endogen. Analisis pelabelan tdTomato dalam tisu yang dibersihkan menunjukkan bahawa sel-sel dalam nefron yang melakukan awal boleh kembali ke keadaan progenitor, di mana keputusan terdahulu mencadangkan komitmen adalah satu arah. 15 Oleh itu, pembersihan tisu telah meningkatkan pemahaman kita tentang proses perkembangan dinamik merentas skala dan spesies.
Fenotaip ketepatan. Kemajuan dalam pembersihan tisu dan analisis kuantitatif telah membolehkan kapasiti baharu untuk fenotaip ketepatan. Perubahan teguh secara statistik dalam percabangan dan nombor nefron telah dikenal pasti dalam model tetikus dengan fenotip halus seperti Ret þ/? dan Enam2 þ/? tikus (Rajah 2), yang sebelum ini diklasifikasikan sebagai "normal." 10,16 Pengimejan confocal resolusi tinggi bagi Wnt11 ?/?buah pinggangmengenal pasti fenotip selular baru di mana nenek moyang nefron kelihatan tidak teratur kerana ketidakupayaan untuk membentuk lampiran selular yang stabil dengan hujung ureterik dan membezakan secara pramatang. 17 Kaedah ini juga telah digunakan untuk mengukur bagaimana pengawal selia baharu keadaan sel progenitor nefron seperti DNA methyltransferase 1, mikroRNA Lin28 dan Let7, dan TSC1 mempengaruhibuah pinggangperkembangan dan nombor nefron. 18–20 Fenotaip ketepatan berkemungkinan menjadi alat penting dalam usaha kita untuk memahami kesan tambahan faktor genetik dan persekitaran yang menyumbang kepada bilangan nefron yang rendah dan kecenderungan kepada kronik.penyakit buah pinggang.
Permodelan matematik bagibuah pinggangmorfogenesis. Data yang dihasilkan daripada pembangunan yang dibersihkanbuah pinggangsedang memacu gelombang pemodelan matematik berasaskan imej yang cuba membezakan bagaimana bentuk dan fungsi makroskopik tisu timbul daripada interaksi molekul antara populasi sel progenitor. 11,21–23 Aplikasi lanjut pengimejan keseluruhan organ dalam tisu yang dibersihkan akan menjadi penting untuk memahami pemacu molekul dan selular pencorak tisu 3D dan mungkin memegang kunci untuk meningkatkan struktur dan ketepatan model sel stem bagibuah pinggang.
Morfologi dan patologi 3D buah pinggang dewasaMorfologi rumit orang dewasabuah pinggangmengehadkan penggunaan alat morfologi 2D kerana ia mungkin menyampaikan persepsi yang tidak lengkap atau mengelirukan terhadap struktur 3D. Di sini, kami membincangkan beberapa kemajuan metodologi penting dalam beberapa tahun kebelakangan ini yang kini membenarkan analisis struktur 3D yang mantap pada orang dewasa.buah pinggang, bermula daripada utuhbuah pinggangsehingga ke komponen penghalang penapisan glomerular (Rajah 3). 2
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI KEGAGALAN BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
Nombor dan saiz nefron.Manusiabuah pinggangmenunjukkan tahap kebolehubahan intra dan antara subjek yang tinggi dalam nombor dan isipadu nefron, yang telah diterangkan dalam kajian autopsi daripada subjek tanpa jelas.penyakit buah pinggang1,30,31 dan telah dikaitkan dengan gangguan perkembangan. Selama beberapa dekad, alat piawai emas untuk mengukur nombor nefron dalam sampel eksperimen dan manusia ialah kaedah disector/fractionator, kaedah stereologi berasaskan reka bentuk. 3,4 Walaupun pendekatan ini adalah tepat dan tepat, ia juga praktikal, memakan masa, dan memerlukan latihan yang ketara. Atas sebab ini, pendekatan alternatif telah dicadangkan untuk merangka kaedah cekap yang boleh memberikan titik akhir berkualiti tinggi: 32 contohnya, gabungan kaedah pembersihan optik, termasuk hidrofobik (sebelum ini dikenali sebagai berasaskan pelarut), berasaskan hidrofilik atau hidrogel, dengan termaju mikroskop cahaya (cth, confocal, multifoton, atau kepingan cahaya).
Untuk pengetahuan kami, laporan pertama yang menggabungkan penjelasan optik dan mikroskop lembaran cahaya untuk analisis nombor dan saiz nefron telah diterbitkan oleh Klingberg et al. 24 dalam kertas penting yang memaparkan pelbagai kemajuan penting. Mula-mula, laporan ini memperkenalkan etil sinamat, pelarut tidak berbahaya yang boleh menggantikan bahan kimia toksik seperti benzyl alcohol–benzyl benzoate, yang sehingga ketika itu kerap digunakan dalam protokol pembersihan hidrofobik. Kedua, penyiasat melakukan pengiraan nefron dalam tetikus utuhbuah pinggang in model pengantara imun yang agresif dan progresifpenyakit buah pinggang, mengenal pasti kehilangan nefron semasa perjalanan penyakit. Di samping itu, langkah penting ke arah automasi berkomputer bagi algoritma pembahagian imej telah diperkenalkan, menyediakan laluan kepada peningkatan kecekapan yang ketara. Baru-baru ini, Østergaard et al. 25 mempersembahkan kaedah pembersihan hidrofobik yang serupa digabungkan dengan mikroskopi kepingan cahaya dan pembahagian imej automatik yang menyediakan kedua-dua jumlah nombor nefron dan volum glomerular tunggal dalam model tetikus nefropati diabetik. Tambahan pula, kajian ini menunjukkan pelabelan fungsional tubuli proksimal yang elegan melalui suntikan albumin in vivo untuk menggambarkan persimpangan glomerulartubular dan protokol mudah untuk histopatologi korelatif dalam sampel yang dibersihkan secara optikal. Laporan ini menunjukkan fleksibiliti protokol ini, yang menjadi saluran paip berbilang lapisan untuk pemprofilan tisu komprehensif.
Pembuluh darah dan innervation buah pinggang.Mengikuti jejak pembuluh darah bercabang atau gentian saraf pada orang dewasabuah pingganghampir mustahil dalam histologi konvensional 2D kerana saiz organ dan kerumitan taburan struktur memerlukan keratan bersiri yang meluas dan pakar. Baru-baru ini, Huang et al. 33 melaporkan pewarna pendarfluor inframerah dekat kationik (MHI148-PEI) untuk melabelkan saluran darah secara khusus, yang boleh digabungkan dengan protokol pembersihan yang diubah suai dan dipercepatkan berdasarkan etil sinamat untuk memendekkan masa pemprosesan tisu. Pendekatan ini membuka jalan baru untuk penyelidikan vaskular dalambuah pinggang,terutamanya apabila pengimejan resolusi tinggi dalam 3D diperlukan. Begitu juga, Hasegawa et al. 26 menggunakan Koktel Pengimejan Otak/Badan Yang Jelas Tidak Terhalang dan Analisis Pengiraan (CUBIC) bersama-sama dengan sistem mikroskop kepingan cahaya tersuai untuk mengenal pasti taburan pemuliharaan simpatetik dalam buah pinggang tetikus yang utuh. Saraf simpatik terutamanya diedarkan di sekitar arteri. Selepas 10 hari mengalami iskemia atau kecederaan reperfusi, ketumpatan inervasi simpatetik berkurangan dengan ketara, berkait rapat dengan pengurangan paras norepinefrin dalamtisu buah pinggang. Perubahan ini sebahagiannya berterusan 28 hari selepas kecederaan awal, menunjukkan bahawa perubahan simpatetik berterusan boleh didapati semasa perkembangan kronik.penyakit buah pinggang.
Pengubahsuaian tubulointerstitial.Sistem tiub buah pinggang amat sukar untuk dianalisis dalam 3D. Morfologi yang berbelit dan kompleks menimbulkan pelbagai cabaran untuk kaedah konvensional berdasarkan keratan bersiri dan mikroskop cahaya standard. Walau bagaimanapun, pembersihan optik membolehkan analisis tubuli utuh dan persekitaran mikro sekitarnya. Saritas et al. 34 melakukan gabungan pembersihan optik berasaskan hidrogel dan hidrofobik diikuti oleh mikroskop cahaya lanjutan dan analisis 3D semiautomatik untuk mencirikan pembentukan semula tiub distal akibat kekurangan kalium diet. Penyiasat mengukur hiperplasia tiub dan mengesan peningkatan dalam sel yang membiak dalam tubulointerstitium. Kajian ini menggunakan fleksibiliti kedua-dua pembersihan optik dan
Rajah 3| Morfometri tiga dimensi (3D) dalam buah pinggang dewasa. (a) Mengira nefron dalam keseluruhan buah pinggang menggunakan pelabelan CD31 sel endothelial. Panel menunjukkan pembinaan semula 3D (kiri), bahagian optik dalam pandangan dua dimensi (2D) (tengah) dan kawasan khas yang menunjukkan glomeruli tunggal dalam perbandingan antara mikroskop kepingan cahaya (LSFM) dan confocal dan 2- mikroskop foton (2P). Diadaptasi dengan kebenaran Persatuan Nefrologi Amerika, daripada Jurnal Persatuan Nefrologi Amerika, Penilaian Automatik Sepenuhnya Jumlah Nombor Glomerular dan Saiz Tuft Kapilari dalam Buah Pinggang Nefritik Menggunakan Mikroskopi Lightsheet, Klingberg A, Hasenberg A, Ludwig-Portugall I, et al ., jilid 28, keluaran 2, 2017; kebenaran disampaikan melalui Pusat Pembersihan Hak Cipta, Inc. 24 (b) Saiz glomeruli dengan pendaftaran spatial—pengekodan warna mewakili saiz glomerular, di mana merah ialah objek terbesar dan merah jambu terkecil. Diadaptasi dengan kebenaran American Society of Nephrology, daripada Kidney360, Automated Image Analyzes of Glomerular Hypertrophy in a Mouse Model of Diabetic Nephropathy, Østergaard MV, Sembach FE, Skytte JL, et al., jilid 6, isu 6 , 2020; kebenaran disampaikan melalui Pusat Pembersihan Hak Cipta, Inc. 25 (c) Menjejaki vaskular dan pemuliharaan, menampilkan pembinaan semula 3D buah pinggang yang utuh dengan pelabelan imunosaraf simpatik (hijau), vaskular (magenta) dan bergabung (kiri). Diadaptasi daripada Kidney International, jilid 96, isu 1, Hasegawa S, Susaki EA, Tanaka T, et al., Analisis tiga dimensi yang komprehensif (CUBIC-buah pinggang) menggambarkan saraf simpatis buah pinggang yang tidak normal selepas kecederaan iskemia/reperfusi, muka surat 129–138, Hak Cipta ª 2019, dengan kebenaran daripada Persatuan Nefrologi Antarabangsa. 26 (d) Morfometri podosit dalam glomeruli individu menggunakan pelabelan imunosit untuk penanda khusus podosit p57 (hijau) dan penanda DNA 4 0 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Panel menunjukkan (kiri) pembinaan semula 3D dan (kanan) permukaan yang diberikan. Diadaptasi dengan kebenaran Persatuan Nefrologi Amerika, daripada Jurnal Persatuan Nefrologi Amerika, Pengesahan Kaedah Tiga Dimensi untuk Mengira dan Mengukur Podosit dalam Seluruh Glomeruli, Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al., jilid 27, keluaran 10, 2016; kebenaran disampaikan melalui Pusat Pembersihan Hak Cipta, Inc. 27 (e) Dinamik selular menggunakan pengesanan keturunan, menunjukkan podosit (kiri sekali), sel epitelium parietal (PEC) membentuk bulan sabit selular dalam 3D (tengah-kiri), paparan 2D PEC yang menyerang bahagian glomerular dengan kecederaan vaskular (tengah-kanan), dan visualisasi 2D saluran keluar tiub (kanan sekali). Diadaptasi daripada Kidney International, jilid 96, isu 2, Puelles VG, Fleck D, Ortz L, et al., Analisis 3D Novel menggunakan pembersihan tisu optik mendokumentasikan evolusi glomerulonephritis progresif cepat murine, halaman 505–516, Hak Cipta ª 2019, Antarabangsa Persatuan Nefrologi, di bawah lesen CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 28 (f) Visualisasi diafragma celah pada pembesaran meningkat dari kiri ke kanan. Diadaptasi daripada Kidney International, jilid 99, isu 4, Unnersjö-Jess D, Butt L, Höhne M, et al., Protokol pembersihan dan pembengkakan yang cepat dan mudah untuk pengimejan in-situ 3D buah pinggang merentas skala, halaman 1010–1020 , Hak Cipta ª 2021, International Society of Nephrology, di bawah lesen CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 29 Untuk mengoptimumkan paparan imej ini, sila lihat versi dalam talian artikel ini diwww.kidney-international.org.
mikroskop cahaya untuk melakukan analisis tiub dalam buah pinggang utuh menggunakan hidrogel-benam dan mikroskop kepingan cahaya, serta kuantifikasi sel tunggal dalam hirisan buah pinggang menggunakan penjelasan hidrofobik dan mikroskopi confocal, kerana setiap kombinasi lebih sesuai untuk soalan penyelidikan tertentu. Gabungan pembersihan optik dan mikroskop cahaya lanjutan telah digunakan oleh Tahaei et al. 35 yang mencirikan dimorfisme seksual dalam panjang tubul berbelit distal, yang mungkin menentukan kapasitinya untuk menyesuaikan diri dengan tekanan fisiologi, dan Schuh et al. 36 yang mendedahkan perbezaan paksi dalam pengambilan ligan tubul proksimal dan fungsi endolisosomal, menonjolkan bahawa segmen S1 sangat khusus untuk menyerap semula protein melalui endositosis pengantara reseptor. Dalam kajian baru-baru ini, Blanc et al. 2 menganalisis model pembentukan sista, menunjukkan bahawa sista hanya berkembang dalam segmen nefron tertentu, yang menentukan bentuknya dan terletak bersebelahan dengan tubul nondilasi biasa. Secara keseluruhannya, kami kini mempunyai beberapa contoh aplikasi langsung pembersihan optik untuk analisis sistematik petak tubulointerstitial.
Kehilangan podosit dan hipertrofi.Glomerulus menyediakan contoh unik untuk analisis unit berfungsi utuh dalam organ. Khususnya, kajian tentang pengurangan podosit telah mendapat manfaat secara langsung daripada kemajuan teknologi ini kerana metodologi berasaskan reka bentuk standard emas memerlukan pelaburan masa dan sumber yang besar. 37 Alat pertama untuk analisis morfometrik podosit 3D bagi glomeruli tetikus utuh gabungan imunolabelbuah pinggangkepingan menggunakan protokol yang diubah suai bagi sens immunofluores tidak langsung, pembersihan optik hidrofobik, dan mikroskopi confocal, yang memudahkan pengiraan jumlah bilangan podosit dalam keseluruhan glomeruli individu volum yang diketahui. Kami percaya pendekatan ini sesuai untuk kajian proses yang mempengaruhi subset struktur tertentu (cth, kehilangan podosit yang membawa kepada glomerulosklerosis fokus dan segmental). 27 Teknik yang sama kemudiannya digunakan untuk mencirikan peranan hipertrofi podocyte sebagai tindak balas pampasan berikutan kehilangan podosit, satu mekanisme yang dimediasi oleh sasaran mamalia laluan isyarat rapamycin. 38 Walaupun 2 kajian ini memfokuskan pada analisis podosit glomerular, saluran paip berdasarkan imunolabel konvensional ini boleh digunakan untuk mencirikan perubahan morfologi mana-mana jenis sel pada resolusi spatial yang tinggi.
Evolusi bulan sabit selular.Satu lagi alat penting yang perlu berjaya disepadukan ke dalam kotak alat untuk 3Dbuah pinggangmorfometri ialah pengesanan keturunan genetik. Kebanyakan kaedah pembersihan optik cenderung untuk mendorong tahap tertentu pelindapkejutan pendarfluor (yang berbeza dari ringan hingga teruk). 6 Kami baru-baru ini membentangkan protokol yang menggabungkan pengesanan keturunan, pembersihan optik, dan mikroskop multifoton untuk analisis komprehensif kehilangan podosit dan pengaktifan sel epitelium parietal. 28 Dalam kajian ini, kehilangan podosit dikenal pasti sebagai ciri nefritis bulan sabit eksperimen menggunakan pelabelan metabolik podosit dengan protein pendarfluor hijau yang dipertingkatkan. Evolusi bulan sabit selular telah divisualisasikan dan dikira berdasarkan percambahan dan penghijrahan sel epitelium parietal, yang juga ditandakan oleh protein pendarfluor hijau yang dipertingkatkan dan dijejaki semasa model eksperimen nefritis bulan sabit. Analisis glomeruli utuh membolehkan pengenalpastian kehilangan podosit fokus dan pembentukan lesi, yang berkembang menjadi oklusi tubular oleh sel epitelium parietal, yang membawa kepada pembentukan glomeruli atubular. Kajian ini membuka jalan untuk kajian masa depan tentang interaksi imun-epitelium yang kompleks dalam keadaan utuhbuah pinggang.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI DIALISIS BUAH PINGGANG/PINGGUL
Penghalang penapisan glomerular.Alat diagnostik penting untuk penilaian rutin penyakit glomerular ialah analisis struktur ultra biopsi buah pinggang oleh mikroskop elektron. Alternatif kepada mikroskop elektron boleh didapati dalam bidang mikroskop pengembangan, yang mengikut definisi bertujuan untuk meningkatkan resolusi optik dengan meningkatkan dimensi tisu. Selama bertahun-tahun, Unnersjo-Jess et al. 39,40 telah menyediakan pelbagai protokol untuk visualisasi struktur skala nano dalambuah pinggang.Baru-baru ini, penyiasat ini melaporkan prosedur yang pantas dan mudah untuk visualisasi 3Dbuah pinggangmorfologi, menggabungkan konsep pembersihan optik dan pengembangan tisu untuk menyelesaikan struktur skala nano menggunakan mikroskop confocal konvensional. 29 Protokol ini digunakan untuk menggambarkan dan mengukur pelbagai ciri patologi dalam tetikus dan manusiabuah pinggangbiopsi termasuk pembersihan proses kaki, perubahan membran bawah tanah glomerular, panjang diafragma celah, deposit IgG, dan ciri patologi klasik (cth, glomerulo-sklerosis, fibrosis tubulointerstitial, dan atrofi tiub). Ringkasnya, kaedah ini membolehkan visualisasi berbilang skala dan kuantifikasi patologi buah pinggang menggunakan kaedah mudah dan alat analisis imej yang boleh diakses. Kebolehskalaan dan pelaksanaan pendekatan ini dalam amalan klinikal mungkin akan ditentukan oleh keperluan peralatan mikroskop cahaya canggih dan pembangunan alat analisis imej automatik.
Kesimpulan
Spektrum kaedah pembersihan tisu semasa termasuk teknik mudah yang boleh dilaksanakan di kebanyakan makmal untuk meningkatkan pengimejan 3D pada mikroskop yang biasa tersedia. Memandangkan peluang yang diberikan oleh pendekatan baharu ini semakin ketara, kami menjangkakan penggunaan sistem mikroskop khusus yang lebih luas untuk mengimej tisu yang dibersihkan secara berkesan pada resolusi tinggi dan pembangunan penyelidikan dan aliran kerja klinikal yang disesuaikan untuk menangani soalan khusus. Bidang neurosains telah berfungsi sebagai tempat ujian untuk kaedah dan aplikasi pengimejan tisu yang dibersihkan. Analisis imej automatik, pendekatan baru untuk mengkaji sambungan selular, dan projek atlas ekspresi gen dan protein seluruh tisu telah dibangunkan dalam konteks ini. Kemungkinan pendekatan yang sama akan menghasilkan pandangan baharu tentang anatomi selular dan saling kebergantungan populasi sel dalam pembangunan dan dewasa.buah pinggang.
Had praktikal untuk kemajuan ini termasuk kos perkakasan pengimejan dan kesukaran dalam mengendalikan, menyimpan dan menganalisis set data yang besar. Had lain timbul daripada kekurangan kebolehulangan pewarnaan dengan tisu yang dipengaruhi oleh keadaan fiksasi dan pelabelan antibodi. Akibatnya, terdapat keperluan untuk analisis 3D baharu untuk dinilai secara kritikal dan dibandingkan dengan kaedah yang telah ditetapkan. Walaupun kemajuan yang mengagumkan dalam menilaibuah pinggangperkembangan dan dewasabuah pinggangstruktur dan penyakit yang diserlahkan dalam ulasan ini, kami percaya bahawa pembersihan tisu dan pengimejan 3D yang terbaik masih akan datang dan berkemungkinan menjadi kawasan pertumbuhan yang menarik untukbuah pinggangpenyelidikan untuk beberapa dekad yang akan datang.
