Polimorf Berbeza Secara Struktur Agregat Tau Didedahkan Dengan Spektroskopi Inframerah Skala Nano

Abstrak

Pengagregatan protein tau memainkan peranan penting dalam beberapa penyakit neurodegeneratif secara kolektif dikenali sebagai tauopati, termasuk penyakit Alzheimer dan Parkinson. Tau tersalah lipatan ke dalam struktur helaian beta fibrillar yang membentuk filamen heliks berpasangan yang terdapat dalam kusut Neurofibrillary. Adalah diketahui bahawa terdapat heterogeniti struktur yang ketara dalam agregat tau yang dikaitkan dengan penyakit yang berbeza.

Walau bagaimanapun, sementara struktur fibril matang telah dikaji, taburan struktur dalam agregat tau peringkat awal tidak difahami dengan baik. Dalam kajian ini, kami menggunakan AFM-IR untuk menyiasat spektrum skala nano fibril tau individu pada peringkat pengagregatan yang berbeza dan menunjukkan kehadiran polimorf fibrillar berbilang yang mempamerkan struktur sekunder yang berbeza. Kami selanjutnya menunjukkan bahawa gentian matang mengandungi sejumlah besar helaian beta antiselari. Keputusan kami ialah aplikasi pertama spektroskopi inframerah skala nano kepada agregat tau dan menggariskan janji spektroskopi inframerah yang diselesaikan secara spatial untuk menyiasat pengagregatan protein.

Penyakit Alzheimer ialah penyakit neurodegeneratif dengan kejadian yang tinggi, dan ciri-ciri patologi utamanya ialah kehilangan neuron dan sinaps yang teruk serta terkumpul -amyloid ( -amyloid) dan protein Tau (protein berkaitan mikrotubulus) di dalam otak. Protein ini membentuk struktur fibril matang semasa perkembangan penyakit, dan gentian protein struktur ini boleh menyebabkan kematian neuron dan penurunan kognitif. Fibril matang memainkan peranan yang lebih teruk dalam pembentukan penyakit berbanding protein -amyloid dan Tau. Ini kerana pembentukan fibril matang adalah titik terminal mekanisme patogenik, yang memburukkan lagi kehilangan neuron dan sinaps semasa perkembangan penyakit dan mempercepatkan perkembangan penyakit. Oleh itu, untuk penyelidikan dan pembangunan rawatan penyakit Alzheimer, penyelidikan dan penerokaan fibril matang juga telah menjadi tumpuan penyelidikan. Dalam penyelidikan kami, kami mendapati bahawa Cistanche berkesan dalam merawat penyakit Alzheimer. Cistanche mengandungi sejumlah besar anthocyanin dan flavonoid, yang mempunyai kesan antioksidan yang kuat. Bahan-bahan ini boleh membantu mengurangkan pengeluaran radikal bebas dan melindungi sel-sel otak daripada kerosakan oksidatif, dengan itu mengurangkan kemungkinan neurodegenerasi.

Klik suplemen cistanche deserticola

Kata kunci

Tau; pengagregatan; Penyakit Alzheimer; AFM-IR; spektroskopi IR skala nano; AFM; struktur fibril; helaian beta antiselari.

Kesilapan lipatan dan pengagregatan protein tau kepada agregat fibril adalah ciri patologi bagi banyak penyakit neurodegeneratif yang dipanggil tauopati, termasuk penyakit Alzheimer dan Parkinson1-5. Tau ialah protein berkaitan mikrotubulus (MT) yang tersalah lipatan menjadi mendapan selular tidak larut yang dipanggil Neurofibrillary Tangles (NFTs)1-2, 5-6.

Walaupun bukti awal menunjukkan potensi neurotoksisiti NFT, kini dipercayai bahawa himpunan oligomerik prefibrillar ialah spesies neurotoksik utama3, 5-6. Penjelasan laluan fibrilasi tau tertentu boleh memberikan gambaran tentang mekanisme penyakit dan mendedahkan sasaran terapeutik yang berpotensi untuk penemuan ubat. Usaha yang besar telah dilaburkan untuk memahami pengagregatan tau dan peranan faktor berbeza yang memodulasi pengagregatan1-2, 7-18. Peranan protein amiloid lain contohnya, amiloid beta dalam mengubah konformasi tau juga telah disiasat19-21. Adalah diketahui bahawa filamen tau dalam NFT mempunyai struktur silang beta yang serupa dengan plak amiloid. Walau bagaimanapun, menjelaskan secara menyeluruh evolusi struktur tau yang mengakibatkan pembentukan fibril masih menjadi cabaran.

Dalam otak manusia, enam isoform tau yang berbeza telah dikenal pasti yang berbeza mengenai bilangan sisa asid amino2, 5, 22. Isoform dominan dan struktur fibrillar boleh berbeza mengikut penyakit2, 22. Semua isoform tau adalah polipeptida yang besar dan oleh itu mempamerkan struktur. fleksibiliti. Oleh itu, sejumlah besar minat penyelidikan telah tertumpu pada peptida pendek yang mewakili domain pengikat mikrotubule, yang penting untuk pengagregatan tau23-25 dan bukannya protein panjang penuh. Tambahan pula, tau dan isoformnya mempamerkan polimorfisme: pada asasnya peptida yang sama terkumpul menjadi struktur fibrillar yang berbeza, yang berbeza bukan sahaja mengenai morfologi tetapi juga mengenai susunan molekul8-9, 26-27. Semua faktor di atas menjadikan pengasingan dan analisis struktur agregat tau tertentu yang terbentuk pada peringkat pengagregatan yang berbeza sebagai tugas yang sukar. Sifat pengagregatan amiloid secara umum adalah sedemikian rupa sehingga menghasilkan sejumlah besar spesies terkumpul yang bersifat sementara dan berada dalam keseimbangan antara satu sama lain. Baru-baru ini cryo-EM telah berjaya digunakan untuk menyelesaikan struktur fibrillar tau; walau bagaimanapun, aplikasinya kekal terhad kepada fibril matang pada dasarnya yang merupakan titik akhir pengagregatan dan bukan perantaraan9-10.

Khususnya, aspek struktur perantaraan tau peringkat awal tidak difahami dengan baik. Piawaian emas untuk menentukan struktur sekunder agregat seperti amiloid, secara amnya, ialah teknik spektroskopi seperti Resonans Magnetik Nuklear (ssNMR) keadaan pepejal dan Spektroskopi Inframerah Transformasi Fourier (FTIR)15, 28-31. Walau bagaimanapun, tiada satu pun daripada teknik ini mampu memberikan resolusi spatial pada skala agregat individu, dan tanpa resolusi spatial, adalah sukar untuk secara jelas mengaitkan ciri spektrum kepada agregat atau morfologi tertentu atau menentukan spesies fana yang berkembang menjadi morfologi tertentu. Pada asasnya adalah tidak mungkin untuk menentukan sama ada ciri spektrum yang diperhatikan timbul daripada keadaan pengagregatan tertentu atau campuran statistik bagi konformasi yang berbeza.

Akibatnya, hanya struktur purata oligomer dan fibril yang diketahui, dan kepelbagaian variasi struktur dalam setiap keadaan, jika ada, tidak difahami dengan baik. Untuk memajukan pengetahuan kita tentang pengagregatan tau dan protein amyloidogenik lain di bawah keadaan yang berbeza, adalah penting untuk memahami struktur setiap ahli ensembel konformasi pada peringkat pengagregatan yang berbeza. Dekad yang lalu telah menyaksikan pembangunan pendekatan baru untuk meningkatkan resolusi spatial spektroskopi getaran yang menggabungkan spektroskopi inframerah dengan AFM untuk mencapai resolusi skala nanometer.

Salah satu pendekatan berasaskan AFM yang terbaharu dibangunkan mengambil kesempatan daripada resonans teraruh fototerma (PTIR), di mana pengembangan haba tempatan yang terhasil daripada penyerapan inframerah oleh sampel dirasai oleh hujung AFM 32-35. AFM-IR fototerma dengan itu memintas had resolusi dalam mikroskop IR konvensional dengan menggunakan hujung probe AFM untuk mengukur penyerapan inframerah. Penyerapan sinaran melalui pengujaan resonan mod inframerah membawa kepada pengembangan haba sampel, menghasilkan daya impulsif pada julur AFM. Tindak balas siasatan AFM yang terhasil adalah berkadar dengan penyerapan inframerah, dan mengimbas panjang gelombang menghasilkan spektrum penyerapan inframerah yang sepadan dengan kawasan skala nano sampel (Rajah 1).

Oleh itu, tidak seperti teknik optik konvensional, AFM-IR boleh memeriksa struktur skala nano pada perincian kimia yang belum pernah berlaku sebelum ini dan menggabungkan yang terbaik dari kedua-dua dunia: resolusi spatial AFM dan resolusi kimia inframerah. Walaupun AFM-IR telah digunakan untuk mengkaji agregat peptida amyloidogenik seperti beta-amyloid dan alpha synuclein35-38, ia tidak pernah digunakan untuk mengkaji pengagregatan tau. Dalam kajian ini, kami memanfaatkan keupayaan AFM-IR dan menyiasat gentian isomer tau-441 pada peringkat pengagregatan yang berbeza untuk menunjukkan bahawa pada peringkat awal pengagregatan, terdapat heterogeniti yang ketara dalam struktur fibrillar walaupun tanpa sebarang variasi ketara. dalam morfologi. Keputusan kami menunjukkan buat kali pertama bahawa terdapat perbezaan asas dalam struktur sekunder fibril yang mempamerkan morfologi yang sama. Pelbagai polimorf fibril yang berbeza dari segi struktur diperhatikan; satu lebih tersusun secara struktur daripada yang lain, yang juga bersifat sementara dan tidak terdapat dalam fibril matang. Tambahan pula, kami juga menunjukkan bahawa fibril tau boleh mengandungi helaian beta antiselari, yang biasanya tidak dikaitkan dengan morfologi fibrillar.

Untuk memahami evolusi struktur fibril dengan masa, kami menyiasat fibril pada titik masa pengagregatan yang berbeza, iaitu selepas 3, 5, 10 dan 15 hari pengagregatan. Bagi setiap ukuran, aliquot didepositkan pada substrat emas dan dikeringkan di bawah nitrogen. Imej topografi AFM fibril tau selepas 3 hari pengeraman pada 37 darjah ditunjukkan dalam Rajah 2. Rajah 2A menunjukkan gugusan fibril yang mewakili. Lebih banyak imej AFM bagi gentian individu pada semua peringkat pengagregatan yang berbeza ditunjukkan dalam Rajah S1-S5. Untuk mendapatkan taburan ketinggian keseluruhan fibril dalam sampel, nilai ketinggian fibril individu diukur dan diplot sebagai histogram (Rajah 2B). Data telah dipasang dengan Gaussian untuk menentukan nilai ketinggian purata 6.3±0.7 nm. Imej AFM bagi 5-fibril hari dan analisis ketinggian yang sepadan ditunjukkan dalam Rajah 2C-D. Fibril individu bersama-sama dengan kelompok fibril diperhatikan. Ketinggian fibril ialah 6.5±0.9 nm yang kekal hampir dengan 3-sampel fibril hari.

Seterusnya, gentian tau dengan pengeraman {{0}}hari telah disiasat (Rajah 2E-F). Fibril individu diperhatikan pada permukaan emas (Rajah 2E). Purata ketinggian 10-hari fibril ialah 7.2±1.0 nm. Fibril tau matang, yang dihasilkan selepas 15 hari pengagregatan, ditunjukkan dalam Rajah 2G. 15-fibril hari panjang dan berselirat antara satu sama lain menghasilkan morfologi seperti rangkaian. Pada peringkat pengagregatan ini, fibril yang berasingan tidak lagi kelihatan. Purata ketinggian fibril ialah 42.5±40.5 nm (Rajah 2H) yang jauh lebih tinggi berbanding dengan fibril lain yang telah dihasilkan pada titik masa yang lebih awal. Taburan luas ketinggian fibril menunjukkan bahawa fibril matang mempunyai nilai ketinggian yang berbeza-beza, berbanding dengan taburan sempit fibril terdahulu. Struktur fibrillar yang diperhatikan di sini adalah konsisten dengan laporan AFM sebelumnya tentang pengagregatan tau11, 39-40. Satu lagi pemerhatian penting daripada pengukuran AFM ialah fibril tau yang dihasilkan dalam larutan adalah homogen dalam morfologinya.

Ia lurus, tidak mempunyai sebarang bentuk bercabang atau berpintal, dengan perubahan ketinggian minimum dalam satu fibril. Dengan pematangan fibril, kita melihat peningkatan ketinggian fibril, tetapi tiada morfologi baru berkembang. Ini boleh divisualisasikan dalam Rajah S5, di mana 3-morfologi fibril hari dan 10-hari ditunjukkan dalam peta warna pelangi, menunjukkan bahawa ia mempunyai perubahan ketinggian minimum dalam satu fibril. Walaupun fibril tidak menunjukkan sebarang perbezaan morfologi yang ketara, spektrum IR skala nano bagi fibril mengandungi perbezaan yang ketara.

Khususnya, untuk 3-fibril hari kita memerhati tiga polimorf fibril berbeza dengan spektrum yang berbeza. Untuk 5-hari, 10-hari, dan 15-hari fibril matang, kami memerhatikan hanya satu konformasi. Kami perhatikan bahawa lazimnya polimorfisme digunakan untuk menandakan fibril yang berbeza secara morfologi yang juga boleh berbeza berkenaan struktur molekul2, 26; dalam kes kami morfologi adalah invarian, tetapi gentian boleh dikategorikan kepada tiga subtipe berbeza berdasarkan spektrumnya. Untuk kejelasan, kami merujuk kepada struktur/polimorf ini masing-masing sebagai Jenis 1, Jenis 2 dan Jenis 3 untuk seluruh artikel ini. Spektrum inframerah perwakilan dalam julat amida-I ditunjukkan dalam Rajah 3. Spektrum ialah purata ukuran berbilang yang diambil sepanjang fibril. Lebih banyak spektrum disediakan dalam Maklumat Sokongan (Rajah S6). Spektrum 3-jenis fibril hari-1 mengandungi puncak yang ketara pada ~1628cm−1 dan bahu yang lebih kecil pada ~1670cm−1.

Selain itu, jalur lemah boleh dilihat pada ~1740 sm-1. Spektrum jenis fibril-2 berbeza dengan ketara dan mengandungi jalur amida-I asimetri yang diperluas berpusat pada ~1650 cm-1. Tiada keamatan ketara diperhatikan melebihi 1700cm−1. Untuk jenis fibril-3, kami melihat spektrum amida-I yang hampir serupa dengan jenis-2, dengan satu pengecualian utama: kehadiran jalur yang menonjol pada ~1738 cm-1. Adalah menarik untuk ambil perhatian bahawa spektrum fibril, kecuali jenis{13}} polimorf, tidak mengandungi puncak tajam pada frekuensi helaian beta biasa ~1630cm−1, walaupun agregat fibrillar diketahui sebagai beta selari dalam daftar cadar. Lebar garisan yang lebih luas diperhatikan untuk fibril jenis 2 dan jenis 3, sebagai tambahan kepada kekurangan puncak yang tajam pada frekuensi helaian beta akan menunjukkan kehadiran gangguan struktur.

Menariknya, kami tidak menemui sebarang varians utama dalam spektrum sepanjang fibril tunggal (Rajah S5), menunjukkan bahawa fibril adalah struktur yang jelas, dan mempunyai gangguan struktur intrinsik. Perlu diambil perhatian dalam konteks ini bahawa terdapat variasi dalam spektrum sepanjang gentian, khususnya untuk jenis-3 gentian seperti yang dibuktikan oleh sisihan piawai spektrum yang lebih besar (Rajah 3). Walau bagaimanapun, perbezaan utama antara tiga subjenis fibril adalah dari segi keamatan jalur pada 1628cm-1 dan 1738cm-1. Variasi yang dinyatakan di atas tidak menjejaskan klasifikasi fibril kepada satu subjenis atau yang lain.

Fibril matang 5-hari, 10-hari dan 15-hari tidak mempamerkan sebarang heterogeniti spektrum dan satu polimorf diperhatikan untuk setiap kes (Rajah 3). Spektrum fibril 5-hari dianjak sedikit (~6cm−1) kepada nombor gelombang yang lebih tinggi berbanding dengan fibril jenis 2 dan jenis 3 dan juga menunjukkan peningkatan lebar talian. Fibril matang 10-hari dan 15-hari mempunyai spektrum yang serupa dengan fibril jenis 2, dengan fibril yang kedua beralih kepada nombor gelombang yang lebih tinggi sebanyak ~4cm−1. Kesemua 5-hari, 10-hari dan 15-fibril hari tidak mempunyai puncak yang jelas melebihi 1700 sm-1.

Wawasan utama dari spektrum fibril ialah semasa peringkat awal pematangan, mungkin terdapat heterogeniti yang ketara dalam struktur fibril, dan apabila matang, fibril berkembang menjadi satu struktur. Walau bagaimanapun, adalah sukar untuk memahami dengan tepat perubahan struktur asas yang tepat daripada pemeriksaan spektrum sahaja. Oleh itu, untuk mendapatkan maklumat lanjut tentang variasi spektrum dan struktur antara polimorf yang diperhatikan, spektrum telah dinyahbelitkan melalui pemasangan spektrum. Spektrum protein Amida I biasanya mengandungi sumbangan daripada struktur sekunder yang berbeza41-42.

Oleh kerana struktur sekunder yang menyumbang kepada setiap spektrum yang diperhatikan tidak diketahui secara priori, kami beralih kepada spektrum terbitan kedua untuk menentukan bilangan puncak (Rajah S8). Menggunakan derivatif kedua data spektrum untuk menentukan puncak asas ialah amalan yang terkenal dalam spektroskopi43-44. Kami menggunakan bilangan puncak dalam spektrum terbitan kedua dan frekuensi sepadannya sebagai titik permulaan untuk pemasangan spektrum. Hasil padanan untuk spektrum purata 3-hari, 5-hari, 10-hari dan 15-hari gentian matang ditunjukkan dalam Rajah 4A-F. Sumbangan peratus puncak yang dipasang kepada spektrum keseluruhan ditunjukkan dalam Rajah 4G-L. Spektrum dinormalisasi kepada keamatan maksimum, tetapi itu menskalakan setiap sub-jalur secara sama rata untuk spektrum tertentu. Oleh itu populasi relatif jalur, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4G-L, tidak terjejas oleh normalisasi. Parameter muat disediakan dalam Jadual Sokongan 1.

Untuk jenis-1 3-fibril hari, tiga jalur Gaussian sesuai dengan kedua-dua spektrum dengan kesetiaan tinggi, dengan frekuensi tengah pada 1628cm−1, 1659cm−1 dan 1670cm−1. Spektrum fibril jenis-2 3-hari sesuai dengan lima jalur asas, dengan frekuensi 1626cm−1, 1642cm−1, 1662cm−1, 1680cm−1 dan 1694cm−1. Seperti yang dijangkakan daripada persamaan spektrum, jenis{18}} fibril sesuai dengan lima jalur yang sama tetapi juga memerlukan puncak tambahan pada 1736 sm-1. Memperluas analisis penyahkonvolusi spektrum kami kepada gentian yang lebih matang, kami melihat bahawa 5-hari, 10-hari dan 15-fibril hari semuanya pada asasnya mengandungi taburan struktur sekunder yang sama. Spektrum fibril 5-hari, 10-hari dan 15-hari semuanya memerlukan enam jalur untuk pemasangan optimum, di mana puncak nombor gelombang tinggi beralih kepada ~1725cm−1, dan lima puncak yang lain adalah serupa dengan jenis{29}} gentian.

Puncak 1626-1628cm−1 dalam semua padanan boleh dikaitkan dengan helaian beta, menunjukkan bahawa semua polimorf fibrillar mengandungi struktur helaian beta28, 30, 41-42. Puncak 1642cm-1 lazimnya timbul daripada gegelung rawak, manakala puncak pada ~1660cm−1 dan 1682cm−1 lazimnya ditetapkan kepada pusingan beta 41-42. Diambil bersama, dekonvolusi spektrum menunjukkan bahawa apabila matang, terdapat lebih banyak gangguan dalam struktur fibril, seperti yang dibuktikan oleh peningkatan puncak gegelung rawak berbanding puncak helaian beta. Kehadiran belitan beta dan peningkatan relatifnya, dibuktikan oleh keamatan puncak dipasang 1660cm−1, adalah konsisten dengan struktur beta silang gentian yang dijangkakan. Kehadiran jalur pada ~1694cm−1 dan ~1725cm−1, bagaimanapun, agak tidak dijangka. Yang pertama biasanya dikaitkan dengan helaian beta antiselari41-42, 45 dan telah diperhatikan dalam beta amyloid45-46 dan oligomer alpha-synuclein38. Walaupun struktur helaian beta antiselari terkenal dengan himpunan amiloid oligomerik, kewujudannya dalam fibril jarang diperhatikan. Kajian IR 2D telah mengenal pasti tandatangan helaian beta antiselari dalam fibril synuclein47; mutan spesifik beta-amyloid juga mempamerkan struktur helaian beta antiselari47. Keputusan kami, sepanjang pengetahuan kami, adalah pemerhatian pertama helaian beta antiselari untuk agregat tau. Puncak helaian beta antiselari tidak hadir dengan jelas dalam jenis-1 polimorf. Ini menunjukkan bahawa fibril boleh menggunakan sama ada struktur tersusun baik tegar (jenis polimorf-1) yang terutamanya helaian beta selari tetapi peningkatan fleksibiliti dan/atau gangguan struktur boleh membawa kepada pembentukan helaian beta antiselari.

Walau bagaimanapun, adalah penting untuk ambil perhatian bahawa puncak ~1626cm−1 biasanya tidak berubah dengan ketara antara helaian beta selari dan antiselari. Keputusan kami, oleh itu, tidak menghalang kemungkinan helaian beta selari dalam mana-mana fibril di mana puncak ~1694cm−1 diperhatikan. Puncak pada ~1725cm−1 tidak boleh dikaitkan dengan getaran amida tulang belakang, dan kemungkinan besar timbul daripada regangan COOH asid karboksilik rantai sisi41-42. Kerja terbaru daripada Pinto dan rakan sekerja telah menunjukkan strategi untuk mengira spektrum IR bagi jalur karbonil kumpulan COOH asid aspartik menggunakan kaedah pengiraan kuantum/klasik hibrid48. Penemuan mereka telah menunjukkan bahawa rantai sisi terprotonasi muncul dalam kawasan 1700-1780 cm−1 dan anjakan frekuensi 5-10 cm−1 boleh digunakan sebagai probe untuk interaksi antara rantai sisi dan tulang belakang. Jujukan peptida Tau 441 mempunyai berbilang asid karboksilik, termasuk dalam domain ulangan pengikat mikrotubulus, yang telah ditunjukkan mempunyai kecenderungan tinggi untuk membentuk helaian beta5-6.

Pengukuran AFM-IR bagi agregat amiloid lain telah mengenal pasti puncak yang sama36, yang telah dikaitkan dengan asid karboksilik. Walau bagaimanapun, jalur asid karboksilik ini lebih menonjol dalam sesetengah fibril berbanding yang lain: sumbangannya kepada puncak keseluruhan adalah paling ketara hanya untuk jenis-3 3-fibril hari dan 5-fibril hari, seperti yang boleh dilihat dalam Rajah 4. Dalam spektroskopi inframerah, penjajaran dipolar dalam struktur tersusun selalunya membawa kepada peningkatan intensiti jalur penyerapan; contoh yang relevan ialah pembentukan helaian beta tersusun daripada peptida tidak tertib, yang membawa kepada jalur sengit yang tajam pada ~1625cm−1. Oleh itu, kehadiran jalur asid karboksilik sengit mungkin timbul daripada susunan struktur rantai sisi asid glutamat dan aspartik. Walau bagaimanapun, terdapat berbilang rantai sisi karboksilat dalam tau-446, dan interaksi dan orientasi molekul spesifiknya tidak diketahui dengan tepat untuk struktur yang diperhatikan di sini.

Tambahan pula, keamatan dalam spektrum AFM-IR adalah berkadar dengan FTIR32-33, tetapi faktor korelasi berangka antara AFM-IR dan FTIR belum dilaporkan untuk getaran asid karboksilik. Oleh itu, mengaitkan keamatan puncak kepada rantai sisi karboksilik tertentu memerlukan pengiraan/pertimbangan teoritis tindak balas AFM-IR yang berada di luar skop kerja ini. Penting juga untuk diperhatikan dalam konteks ini bahawa pengukuran AFM-IR adalah berbeza daripada spektrum inframerah isotropik yang diperoleh dalam larutan, dan spektrum yang diukur dalam AFM-IR ialah konvolusi polarisasi laser dan konfigurasi pencahayaan49-50. Oleh itu, adalah sukar untuk mengenal pasti dengan tepat asas struktur puncak ini, dan lebih banyak kajian diperlukan untuk menentukan asal usulnya yang tepat. Kami berhasrat untuk menangani perkara ini dalam kerja akan datang.

Pengagregatan isomer tau in vitro telah disiasat secara terperinci; bagaimanapun, struktur perantaraan awal dan/atau sementara tidak begitu diketahui. Spesies oligomerik dalam pengagregatan protein amiloid telah dikenal pasti sama ada di dalam atau di luar laluan ke arah pembentukan fibril. Memandangkan fibril dipercayai sebagai titik akhir pengagregatan, struktur fibril, termasuk polimorf berbeza daripadanya, tidak secara umumnya dianggap sebagai sementara atau luar laluan. Heterogeniti dalam struktur fibril diketahui wujud tetapi telah diketahui menunjukkan dirinya secara serentak dengan variasi morfologi2, 8, 26, 51. Keputusan kami adalah unik kerana ia menunjukkan variasi dalam struktur sekunder fibril walaupun tiada perbezaan morfologi yang dapat dilihat. . Kami ambil perhatian bahawa kecuali jenis fibril-1, semua spektrum fibril mengandungi set jalur pendasar yang sama, menunjukkan bahawa jenis-1 fibril ialah perantaraan sementara yang akhirnya mengalami penyusunan semula struktur dengan kematangan. Kemungkinan lain ialah polimorf helaian beta selari tersusun ini mewakili struktur 'luar laluan', ia mesti hancur menjadi agregat monomerik atau prefibril untuk disepadukan semula menjadi gentian 'on-pathway'. Kami tidak menemui sebarang kehadiran ketara deposit bukan fibrillar dalam spesimen yang dikaji; bagaimanapun, yang hadir memang mempunyai spektrum yang lebih menyerupai serabut bercelaru (Rajah S9). Ini selaras dengan hipotesis luar laluan dan dengan itu mencadangkan bahawa 3-polimorf hari lain yang diperhatikan boleh dilihat sebagai agregat atas laluan.

Walau bagaimanapun, perlu diingatkan bahawa spektrum fibril yang dilaporkan di sini tidak semestinya menangkap keseluruhan ensembel konformasi yang berlaku semasa pengagregatan tau. Untuk menjelaskan dengan tepat evolusi struktur agregat peringkat awal menjadi gentian matang, analisis kinetik agregasi yang lebih terperinci adalah perlu, yang kami sasarkan untuk menangani pada masa hadapan. Pemerhatian menarik lain yang didayakan oleh AFM-IR ialah pengenalpastian helaian beta antiselari dalam fibril matang. Secara amnya dipercayai dan telah dibuktikan oleh banyak kajian, bahawa agregat amiloid peringkat awal boleh mengandungi struktur antiselari, yang akan ditukar kepada helaian beta selari secbeta-sheetucture dalam agregat matang. Kami memerhatikan arah aliran yang bertentangan: agregat peringkat awal boleh mengandungi helaian beta selari tersusun manakala fibril yang lebih matang mengandungi helaian beta helaian beta antiselari yang dibuktikan oleh populasi relatif bagi puncak yang sepadan (Rajah 4G-L).

Ringkasnya, kami telah menunjukkan menggunakan spektroskopi AFM-IR skala nano bahawa fibril tau boleh mempunyai variasi struktur yang ketara, terutamanya pada peringkat awal pengagregatan. Heterogenitas ditunjukkan dalam bentuk polimorf yang berbeza dari segi struktur, yang mempamerkan morfologi yang sama tetapi struktur sekunder yang berbeza. Secara khusus, kami mengenal pasti helaian beta-sheebeta selari tertib sementara dalam fibril peringkat awal, yang apabila matang berkembang menjadi struktur fibril yang lebih tidak teratur yang mengandungi helaian beta antiselari. Keputusan ini menggariskan keperluan untuk menggabungkan spektroskopi dengan teknik yang diselesaikan secara spatial seperti AFM, kerana tidak mungkin untuk membuat penentuan ini secara jelas daripada teknik purata ruang seperti FTIR. Keputusan eksperimen yang diterangkan dalam kajian ini menunjukkan bahawa agregat fibrillar tau adalah heterogen dan kerja masa depan akan menangani sama ada polimorf ini berterusan di bawah keadaan pengagregatan yang berbeza dan dalam pengagregatan berbiji daripada lisat otak untuk memahami kepentingannya dalam konteks tauopati yang berbeza.

Bahan Tambahan

Rujuk versi Web di PubMed Central untuk bahan tambahan.

PENGAKUAN

Kerja ini disokong oleh Institut Kesihatan Negara (Anugerah 1 R35 GM138162 kepada AG).

RUJUKAN

1. Šimić G; Babić Leko M; Wray S; Harrington C; Della I; Jovanov-Milošević N; Bažadona D; Buée L; de Silva R; Di Giovanni G; Wischik C; Hiperfosforilasi dan Pengagregatan Protein Hof PR Tau dalam Penyakit Alzheimer dan Tauopati Lain, dan Kemungkinan Strategi Neuroprotektif. Biomolekul 2016, 6 (1), 6–6. [PubMed: 26751493]

2. Li D; Liu C Penentuan kimia hierarki polimorf amiloid dalam penyakit neurodegeneratif. Biologi Kimia Alam 2021, 17 (3), 237–245. [PubMed: 33432239]

3. Kametani F; Hasegawa M Pertimbangan Semula Hipotesis Amyloid dan Hipotesis Tau dalam Penyakit Alzheimer. Frontiers dalam Neuroscience 2018, 12 (25).

4. Iadanza MG; Ahli Parlimen Jackson; Hewitt EW; Ranson NA; Radford SE Era baharu untuk memahami struktur dan penyakit amiloid. Kajian Alam Semulajadi Biologi Sel Molekul 2018, 19 (12), 755–773. [PubMed: 30237470]

5. Ballatore C; Lee VMY; Trojanowski JQ Tau-mediated neurodegeneration dalam penyakit Alzheimer dan gangguan yang berkaitan. Kajian Alam Neurosains 2007, 8 (9), 663–672. [PubMed: 17684513]

6. Kolarova M; Garc; #00ED; a-Sierra F; Bartos A; Ricny ​​J; Ripova D Struktur dan Patologi Tau Protein dalam Penyakit Alzheimer. Jurnal Antarabangsa Penyakit Alzheimer 2012, 2012, 13.

7. Tapiola T; Alafuzoff I; Herukka SK; Parkkinen L; Hartikainen P; Soininen H; Cecair Serebrospinal Pirttilä T -Amyloid 42 dan Protein Tau sebagai Biomarker Perubahan Patologi Jenis Alzheimer dalam Otak. JAMA Neurology 2009, 66 (3), 382–389.

8. Mukrasch MD; Bibow S; Korukottu J; Jeganathan S; Biernat J; Griesinger C; Mandelkow E; Zweckstetter M Polimorfisme Struktur 441-Tau Residu pada Resolusi Residu Tunggal. PLOS Biology 2009, 7 (2), e1000034.

9. Scheres SHW; Zhang W; Falcon B; Goedert M Cryo-EM struktur filamen tau. Pendapat Semasa dalam Biologi Struktur 2020, 64, 17–25. [PubMed: 32603876]

10. Fitzpatrick AWP; Falcon B; Beliau S; Murzin AG; Murshudov G; Garringer HJ; Crowther RA; Ghetti B; Goedert M; Scheres SHW Cryo-EM struktur filamen tau daripada penyakit Alzheimer. Alam 2017, 547 (7662), 185–190. [PubMed: 28678775]

11. Makky A; Bousset L; Madiona K; Pengimejan Mikroskopi Daya Atom Melki R dan Sifat Nanomekanikal bagi Himpunan Enam Tau Isoform. Jurnal Biofizik 2020, 119 (12), 2497–2507. [PubMed: 33217380]

12. Metrik MA; Ferreira NDC; Saijo E; Kraus A; Newell K; Zanusso G; Vendruscolo M; Ghetti B; Caughey BA ujian ultrasensitif tunggal untuk pengesanan dan diskriminasi tau agregat penyakit Alzheimer dan Pick. Acta Neuropathologica Communications 2020, 8 (1), 22. [PubMed: 32087764]

13. Haili Z; Meng SR; Kipas JB; Chen J; Liang Y Fibrilasi Tau Manusia Dipercepatkan oleh Pendedahan kepada Plumbum melalui Interaksi dengan-330 dan miliknya-362. PloS satu 2011, 6, e25020. [PubMed: 21966400]

14. Von Bergen M; Barghorn S; Li L; Marx A; Biernat J; Mutasi Mandelkow EM Protein Tau dalam Demensia Frontotemporal Menggalakkan Pengagregatan Filamen Heliks Berpasangan dengan Mempertingkatkan Struktur Setempat. Jurnal kimia biologi 2002, 276, 48165–74.

15. Frost B; Ollesch J; Wille H; Kepelbagaian Konformasi Diamond MI bagi Gentian Tau jenis Liar Ditentukan oleh Perubahan Konformasi Templat. Jurnal Kimia Biologi 2009, 284 (6), 3546–3551.

16. Liu W; Hu X; Zhou L; Tu Y; Shi S; Perspektif Berinspirasikan Orientasi Yao T tentang Perencat Molekul Pengagregatan Tau oleh Curcumin Berkonjugasi dengan Perancah Kompleks Ruthenium(II). Jurnal Kimia Fizikal B 2020, 124 (12), 2343–2353. [PubMed: 32130010]

17. Prokopovich DV; Whittaker JW; Muthee MM; Ahmed A; Larini L Kesan Fosforilasi dan Pseudophosphorylation pada Peringkat Awal Pengagregatan Tau Protein Berkaitan Mikrotubule. Jurnal Kimia Fizikal B 2017, 121 (9), 2095–2103. [PubMed: 28218850]

18. Arya S; Ganguly P; Arsiccio A; Claud SL; Trapp B; Schonfeld GE; Liu X; Lazar Cantrell K; Shea JE; Pembatasan Terminal Bowers MT bagi Serpihan Tau Amiloidogenik Memodulasi Kecenderungan Fibrilasinya. Jurnal Kimia Fizikal B 2020, 124 (40), 8772–8783. [PubMed: 32816481]

19. Rojas AV; Maisuradze GG; Scheraga HA Kebergantungan Pembentukan Agregat Campuran Tau dan A Peptida pada Struktur Sekunder Rantau N-Terminal A . Jurnal Kimia Fizikal B 2018, 122 (28), 7049–7056. [PubMed: 29940109]

20. Qi R; Luo Y; Wei G; Nussinov R; Mekanisme Penyemaian Silang Ma BA "Regangan-dan-Pembungkusan" Boleh Mencetuskan Pengagregatan Protein Tau. The Journal of Physical Chemistry Letters 2015, 6 (16), 3276–3282.

21. Lakukan TD; Economou NJ; Chamas A; Buratto SK; Shea JE; Interaksi Bowers MT antara Fragmen Amyloid- dan Tau Menggalakkan Agregat Aberrant: Implikasi untuk Ketoksikan Amyloid. Jurnal Kimia Fizikal B 2014, 118 (38), 11220–11230. [PubMed: 25153942]

22. Buée L; Bussière T; Buée-Scherrer V; Delacourte A; Isoform protein Hof PR Tau, fosforilasi, dan peranan dalam gangguan neurodegeneratif. Kajian Penyelidikan Otak 2000, 33 (1), 95–130. [PubMed: 10967355]

23. Luo Y; Ma B; Nussinov R; Wawasan Struktur Wei G tentang Paradoks Protein Tau terhadap Tingkah Laku Gangguan Intrinsik, Aktiviti Asetilasi Diri dan Pengagregatan. Jurnal Surat Kimia Fizikal 2014, 5 (17), 3026–3031. [PubMed: 25206938]

24. Dong X; Bera S; Qiao Q; Tang Y; Lao Z; Luo Y; Gazit E; Wei G Pemisahan Fasa Cecair-Cecair bagi Protein Tau Dikodkan pada Tahap Monomerik. Jurnal Surat Kimia Fizikal 2021, 12 (10), 2576–2586. [PubMed: 33686854]

25. Goux WJ; Kopplin L; Nguyen AD; Kebocoran K; Rutkofsky M; Shanmuganandam VD; Sharma D; Inouye H; Kirschner DA Pembentukan Filamen Lurus dan Berpintal daripada Peptida Tau Pendek. Jurnal Kimia Biologi 2004, 279 (26), 26868–26875.

26. Fändrich M; Nyström S; Nilsson KPR; Böckmann A; LeVine H ke-3; Hammarström P Polimorfisme fibril amiloid: cabaran untuk pengimejan dan terapi molekul. J Intern Med 2018, 283 (3), 218–237. [PubMed: 29360284]

27. Fibril Amyloid Härd T: Pembentukan, Polimorfisme, dan Perencatan. The Journal of Physical Chemistry Letters 2014, 5 (3), 607–614. [PubMed: 26276617]

28. Bela Diri B; Lefèvre T; Auger M Memahami pembentukan fibril amiloid menggunakan serpihan protein: penyiasatan struktur melalui spektroskopi getaran dan NMR keadaan pepejal. Biophys Rev 2018, 10 (4), 1133–1149. [PubMed: 29855812]

29. Eisenberg DS; Kajian Struktur MR Sawaya Protein Amyloid di Peringkat Molekul. Semakan Tahunan Biokimia 2017, 86 (1), 69–95.

30. Moran SD; Zanni MT Bagaimana Mendapatkan Wawasan tentang Struktur dan Pembentukan Amyloid daripada Spektroskopi Inframerah. The Journal of Physical Chemistry Letters 2014, 5 (11), 1984–1993. [PubMed: 24932380]

31. Kajian NMR Keadaan Pepejal Tycko R Struktur Fibril Amyloid. Kajian Tahunan Kimia Fizikal 2011, 62 (1), 279–299.

32. Dazzi A; Prater CB AFM-IR: Teknologi dan Aplikasi dalam Spektroskopi Inframerah Berskala Nano dan Pengimejan Kimia. Ulasan Kimia 2017, 117 (7), 5146–5173. [PubMed: 27958707]

33. Dazzi A; Prater CB; Hu Q; Kejar DB; Rabolt JF; Marcott C AFM-IR: Menggabungkan Mikroskopi Daya Atom dan Spektroskopi Inframerah untuk Pencirian Kimia Skala Nano. Appl. Spectrosc. 2012, 66 (12), 1365. [PubMed: 23231899]

For more information:1950477648nn@gmail.com