Senescence Mendawai Semula Penderiaan Persekitaran Mikro Untuk Memudahkan Kekebalan Antitumor

ABSTRAK

Penuaan selular melibatkan penangkapan kitaran sel yang stabil ditambah dengan program rembesan yang, dalam beberapa keadaan, merangsang pelepasan imun sel-sel tua. Menggunakan model kanser hati yang kompeten imun di mana penuaan mencetuskan penolakan tumor yang dimediasi sel CD8 T, kami menunjukkan bahawa penuaan juga merombak proteom permukaan sel untuk mengubah cara sel tumor merasakan faktor persekitaran, seperti yang ditunjukkan oleh interferon jenis II (IFN ). Berbanding dengan sel yang membiak, sel senescent mengimbangi reseptor IFN, menjadi hipersensitisasi kepada IFN persekitaran mikro, dan dengan lebih mantap mendorong kesan jentera pembentangan antigen yang juga dirumus semula dalam sel tumor manusia yang menjalani penuaan akibat terapi. Gangguan penderiaan IFN dalam sel senescent menumpulkan pelepasan pengantara imun mereka tanpa melumpuhkan keadaan senescence atau program rembesan cirinya. Keputusan kami menunjukkan bahawa sel senescent mempunyai keupayaan yang dipertingkatkan untuk menghantar dan menerima isyarat persekitaran dan membayangkan bahawa setiap proses diperlukan untuk pengawasan imun yang berkesan.

sistem imun yang meningkatkan tumbuhan cistanche

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity

【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

KEPENTINGAN:

Kerja kami mendedahkan interaksi antara pembentukan semula tisu dan program penderiaan tisu yang boleh digunakan oleh penuaan dalam kanser lanjutan untuk menjadikan sel tumor lebih kelihatan kepada sistem imun adaptif. Aspek baru penuaan ini mewujudkan interaksi isyarat heterotip timbal balik yang boleh didorong secara terapeutik untuk meningkatkan imuniti antitumor.

PENGENALAN

Senescence selular ialah program tindak balas tekanan yang dicirikan oleh penangkapan kitaran sel yang stabil dan program penyembunyian yang mampu mengubahsuai persekitaran tisu (1). Dalam tisu biasa, penuaan menyumbang kepada homeostasis tisu semasa penyembuhan luka; walau bagaimanapun, dalam tisu tua atau rosak, pengumpulan menyimpang sel senescent boleh menyebabkan keradangan kronik dan mengurangkan kapasiti regeneratif tisu (2–4). Dalam kanser, penuaan telah ditunjukkan untuk menengahi kedua-dua kesan yang bermanfaat dan memudaratkan pada biologi tisu. Di satu pihak, penuaan memberikan penghalang kepada tumorigenesis yang dimulakan oleh onkogen dan menyumbang kepada aktiviti antitumor beberapa terapi kanser (5, 6). Sebaliknya, kegigihan sel tumor senescent selepas terapi boleh menghasilkan persekitaran tisu yang menggalakkan kambuh dan metastasis (7, 8). Asas molekul keluaran biologi yang bertentangan ini masih kurang difahami. Satu aspek program penuaan yang berkemungkinan menyumbang kepada kepelbagaian biologi tersebut ialah fenotip rembesan yang berkaitan dengan penuaan (SASP; rujukan 9). SASP diaktifkan melalui proses pembentukan semula kromatin global yang berkembang dan dikawal oleh pengawal selia epigenetik utama seperti BRD4 dan faktor transkripsi proinflamasi seperti NF-κB dan C/EBP- (10–12). Ini, seterusnya, membawa kepada induksi gen yang menyandikan protein pembentukan semula tisu seperti matriks metalloproteinase, faktor pertumbuhan, dan faktor fibrinolitik yang diketahui memainkan peranan penting dalam proses penyembuhan luka (3, 13, 14). Komponen SASP lain termasuk kemokin dan sitokin yang boleh mengubah komposisi dan keadaan sel imun dalam tisu, yang membawa kepada penyasaran pengantara imun dan pembersihan sel senescent itu sendiri (15, 16). Walau bagaimanapun, pengumpulan sel senescent yang menyimpang dalam banyak konteks patologi menunjukkan bahawa pelepasan pengantara imun bukanlah hasil universal penuaan atau SASP dan menimbulkan kemungkinan bahawa mekanisme tambahan menentukan kesan penuaan yang menguntungkan dan memudaratkan paradoks dalam biologi tisu dan pengawasan imun. (17–19).

Sudah tentu, pengawasan imun yang berkaitan dengan penuaan boleh mempunyai kesan antikanser yang kuat, walaupun mekanisme effector yang tepat berbeza dengan jenis tisu dan sel (10, 15, 16, 20). Dalam model tetikus karsinoma hepatoselular (HCC), sel tumor hati yang dicetuskan untuk penuaan dihapuskan oleh mekanisme yang bergantung kepada imun yang terlibat oleh jenis liar (WT) p53 (15). Dalam persetujuan, TP53 sering bermutasi dalam HCC manusia, terutamanya dalam tumor "kelas proliferasi" yang menunjukkan prognosis yang paling teruk (21, 22). Walaupun imunoterapi dan ubat penyasaran TP53-muncul sebagai strategi yang menjanjikan untuk meningkatkan hasil penyakit, asas molekul untuk tindak balas dan rintangan masih tidak diketahui (23–25). Oleh itu, memahami mekanisme sel tumor hati senescent menjadi kelihatan kepada sistem imun boleh memudahkan strategi untuk mendapatkan imuniti antitumor dalam TP{15}}HCC bermutasi yang mungkin meluas ke jenis tumor lain.

Di sini, kami menetapkan prinsip yang memodulasi pengecaman imun dan pembersihan sel senescent untuk mengenal pasti mekanisme penuaan yang boleh diambil tindakan yang mungkin dieksploitasi untuk meningkatkan kawalan imun kanser. Untuk tujuan ini, kami membangunkan model "senescence-inducible" novel di mana sel-sel kanser hati boleh ditukar secara selektif kepada keadaan tua melalui modulasi genetik p53 endogen. Kami beralasan ini akan meniru kesan terapi yang mencetuskan penuaan (26, 27) sambil mengelakkan kesan mengelirukan terapi yang mendorong penuaan pada sel imun atau komponen lain dalam persekitaran tisu. Menggunakan model ini dan kemudian memanjangkannya ke sistem lain, kami mendedahkan bahawa, sebagai tambahan kepada SASP, penuaan memacu pembentukan semula utama proteom permukaan sel dan program isyarat dengan cara yang diramalkan secara asasnya mengubah cara sel merasakan dan bertindak balas terhadap persekitaran. isyarat, dicontohkan di sini melalui hipersensitiviti kepada mikroenvironmental jenis II IFN (IFN ). Proses ini membolehkan pengawalseliaan yang lebih teguh bagi pemprosesan antigen dan jentera pembentangan dalam sel tumor senescent yang menyebabkan mereka terdedah kepada pengawasan imun dalam vivo. Oleh itu, keputusan kami mendedahkan program penderiaan tisu berwayar semula dalam sel senescent yang bertindak bersama SASP untuk meningkatkan potensi imunogenik mereka, dengan itu memudahkan penolakan tumor pengantara imun.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

KEPUTUSAN

Satu p53-Model Tumor Imunokompeten Boleh Dipulihkan untuk Mengkaji Pengawasan Senescence

Untuk mengkaji bagaimana penuaan memprogramkan semula keadaan selular dan tisu, kami mengeksploitasi teknik suntikan urat ekor hidrodinamik (HTVI) (28) untuk menjana model kanser hati yang boleh disebabkan oleh penuaan yang dikawal oleh RNA jepit rambut pendek p53 (shRNA) khusus tumor yang boleh dipulihkan. Khususnya, hepatosit hati dewasa tikus Bl/6 imunokompeten telah ditransfeksi dalam vivo dengan vektor transposase SB13 kecantikan tidur dan dua binaan transposon (pengekodan NrasG12D-IRES-rtTA dan TRE-tRFP-shp53, atau "NSP") yang berintegrasi dalam genom . Dalam sistem Tet-On ini, p53 endogen ditindas dengan kehadiran doxycycline (Dox) melalui pengaktifan shRNA inducible yang dikaitkan dengan RFP (Rajah 1A), membolehkan kawalan genetik penuaan dalam tumor yang ditubuhkan. Selaras dengan kejadian bersama mutasi yang menyahaktifkan TP53 dan mengaktifkan laluan isyarat proliferasi sel (contohnya, lata PI3K/AKT dan RAS/MAPK) dalam tumor hati manusia, kerjasama antara RAS onkogenik dan penindasan p53 membawa kepada transformasi hepatosit, dengan kebanyakan tikus mengembangkan tumor dengan ciri yang kurang dibezakan 5 hingga 8 minggu selepas HTVI. Pemprofilan transkrip mendedahkan bahawa tumor murine ini menyerupai kelas "percambahan" HCC manusia (Tambahan Rajah S1A-S1F), yang merupakan kelas tipikal HCC manusia yang mempunyai mutasi TP53 (21, 22, 29).

Berdasarkan kerja sebelumnya (15), kami menjangkakan bahawa pengaktifan semula p53 dalam sistem di atas akan mencetuskan penuaan dan melibatkan imuniti antitumor. Sehubungan itu, penarikan Dox mencetuskan regresi tumor dramatik selama beberapa minggu, membawa kepada kemandirian haiwan yang berpanjangan (Rajah 1B dan C). Analisis tumor pada 14 hari selepas pengeluaran Dox mendedahkan penurunan regulasi jangkaan p53 shRNA (seperti yang divisualisasikan oleh wartawan RFP yang dipautkan) dan pengumpulan -galactosidase (SA- -}gal) yang berkaitan dengan penuaan tanpa sebarang kesan ketara pada RAS-effector p-ERK (Rajah 1D). Begitu juga, peningkatan dalam aktiviti SA- -gal dan profil transkrip yang berkaitan dengan SASP, bersama-sama dengan penahanan proliferatif serentak, diperhatikan dalam sel tumor yang dieksplan 6 hingga 8 hari selepas pemulihan p53 (Tambahan Rajah S2A– S2H). Nota, penggabungan kultur ini (disimpan pada Dox untuk mengekalkan pembungkaman p53) ke dalam tikus imunokompeten yang diberi makan Dox menghasilkan tumor sekunder segerak dan fokus yang mengalami kemunduran dengan kinetik yang sama sebagai tumor utama selepas pengeluaran Dox (Rajah 1B; Rajah Tambahan S3A– S3E). Kawalan eksperimen menggunakan sistem Tet-Off atau menggabungkan shRNA p53 konstitutif menolak kemungkinan bahawa Dox sendiri mempunyai sebarang kesan ke atas tingkah laku tumor dalam model kami (Tambahan Rajah S3F dan S3G). Oleh itu, sistem ini membolehkan induksi penuaan yang cekap dalam sel tumor tanpa menggunakan terapi yang juga boleh mengubah sistem imun hos. Memandangkan fleksibiliti tambahannya, kami menggunakan model pemindahan ortotopik (selepas ini dirujuk sebagai "NSP") untuk kebanyakan kajian mekanistik yang diterangkan di bawah. Seperti yang dijangkakan, regresi tumor yang ditandakan di atas adalah pengantara imun. Oleh itu, tumor NSP yang timbul selepas pemindahan ke dalam tikus Nude dan Rag2−/−Il2rg−/− (R2G2) imunokompromi mengalami tindak balas sitostatik yang menonjol tetapi gagal untuk mundur, dengan haiwan R2G2 menunjukkan kecacatan yang paling mendalam (Rajah 1E–G; Tambahan Rajah S3H dan S3I). Memandangkan tikus bogel rosak dalam imuniti adaptif dan R2G2 juga terjejas untuk aspek imuniti semula jadi, keputusan ini membayangkan bahawa sistem imun adaptif adalah penting untuk regresi tumor yang cekap dalam model dan mewujudkan konteks eksperimen yang terkawal untuk meneroka asas mekanistik untuk kesan-kesan ini.

sistem imun yang meningkatkan tumbuhan cistanche

Senescence Mencetuskan Pertukaran daripada Pengelakan Imun Tumor kepada Pengecaman Imun

Untuk mencirikan kesan paracrine penindasan tumor terhadap penuaan, kami seterusnya mencirikan persekitaran mikro imun bagi tumor yang mempunyai p53-ditindas (dirujuk sebagai "membiak") dan p53-dipulihkan (dirujuk sebagai "penuaan" ) sel-sel tumor selepas 1 minggu pengeluaran Dox, masa apabila penuaan ditubuhkan, tetapi tumor belum mengalami kemunduran (Tambahan Rajah S2, S3, dan S4A). Lesi yang melindungi sel tumor tua menunjukkan ~1.8-peningkatan kali ganda dalam jumlah CD45+ sel imun berbanding dengan kawalan yang membiak (Rajah 2A; rujukan 15, 16). Analisis imunofenotip dan histologi (pada hari ke-9 selepas pengeluaran Dox) mendedahkan bahawa ini melibatkan peningkatan ketara dalam peratusan limfosit (sel B, sel T CD4 dan sel T CD8) dan penurunan dalam peratusan Gr1+ sel penindas/neutrofil terbitan myeloid (CD11b+Gr1+Ly6Clo; Rajah 2B; Rajah Tambahan S4B). Walaupun pecahan makrofaj sebagai peratusan daripada jumlah populasi CD45 kekal tidak berubah, bilangan mutlak telah meningkat dengan ketara (Rajah 2A dan B; Rajah Tambahan S4C–S4E). Dalam populasi sel T, sel T CD8 terkumpul menunjukkan penanda pengalaman antigen (CD44+, CD69+) dan menampung populasi sel effector yang meningkat (CD44+CD62L−; Rajah 2C; rujukan 30). Pengubahsuaian keseluruhan persekitaran imun ini membawa kepada peningkatan ketara dalam nisbah CD3: neutrofil untuk tumor yang melindungi sel senescent (Tambahan Rajah S4F), kesan yang konsisten dengan peningkatan yang sama dalam nisbah CD3: neutrofil yang telah dikaitkan dengan kereaktifan imun pada manusia tumor hati (31). Pembentukan semula boleh divisualisasikan menggunakan pengimejan 3D selepas pembersihan tisu (Rajah 2D; Rajah Tambahan S4G dan S4H; Video Tambahan S1; ruj 32).

Rajah 1. Model tumor p53-yang boleh dipulihkan untuk mengkaji pengawasan imun penuaan. A, Penjanaan p53-model kanser hati tikus yang dipacu oleh NRAS yang boleh dipulihkan menggunakan sistem transposon kecantikan tidur yang dihantar melalui HTVI. (Dicipta dengan BioRender.com.) B, Ultrasonogram perwakilan HTVI dan model kanser hati suntikan orthotopic pada masa yang dinyatakan selepas pemulihan p53. C, Analisis survival tikus dalam model HTVI. D, Representative hematoxylin and eosin (H&E), immunofluorescence (IF), dan senescence-associated -galactosidase (SA- -gal) pewarnaan p53-tindas (p53 off) dan -restored (p53 on for 14 hari) bahagian tumor yang dihasilkan daripada model HVI. Bar skala, 5{{30}} μm. E-G, Suntikan orthotopic sel tumor NSP yang ditransduksi vektor GFP-luciferase ke dalam hati strain tikus immunocompetent dan immunodeficient. E, Perubahan saiz tumor diukur oleh ultrasound semasa pemulihan p53. R2G2, Rag2-Il2rg tetikus double-knockout. Data dibentangkan sebagai min ± SEM. n Lebih besar daripada atau sama dengan 9 untuk setiap terikan. F, Gambar makroskopik perwakilan pada 21 hari p53 pada atau titik akhir p53 dari tumor. G, Perwakilan pewarnaan IHC sel tumor berlabel GFP pada hari ke-21 selepas pemulihan p53. Bar skala, 100 μm. **, P < 0.01; ***, P < 0.001.

Untuk menentukan jenis sel imun khusus yang bertanggungjawab untuk pengawasan imun sel tumor senescent, kami menghasilkan kohort selari tikus yang melindungi tumor NSP orthotopic dan mengkaji kesan pengurangan pelbagai populasi sel imun pada regresi tumor selepas pengeluaran Dox. Manakala antibodi menyekat yang menyasarkan neutrofil/monosit (Gr1), sel pembunuh semulajadi (NK) (NK1.1), dan sel T CD4 (GK1.5) tidak mempunyai kesan, pengurangan sel CD8 T (2.43) dan makrofaj (menggunakan klodronate liposomal , yang secara selektif menyasarkan makrofaj (CD11b+F4/80+) tetapi bukan sel dendritik klasik (CD11b−CD11c+MHC−II+CD103+; rujukan 33, 34) regresi tumor terjejas dengan ketara (Gamb. 2E; Rajah Tambahan S4I). Untuk mencirikan bagaimana p53-penuaan tumor yang didorong menghasilkan imuniti antitumor yang produktif, kami melakukan analisis RNA-seq (scRNA-seq) sel tunggal bagi sel CD45 yang baru diasingkan daripada NSP yang membiak dan tua. tumor awal selepas pengeluaran Dox (8 hari; Rajah Tambahan S5A dan S5B) dan menggunakan algoritma ujian kelimpahan pembezaan Milo (35) untuk menangkap anjakan keadaan sel dalam jenis sel imun yang mengantara proses ini (Rajah Tambahan S5C–S5F). sejajar dengan sumbangan mereka kepada regresi tumor, subpopulasi sel T CD8 dan makrofaj menunjukkan perubahan ketara dalam kuantiti dan keadaan. Berkenaan dengan sel T, tumor yang membiak (p53-ditindas) diperkaya dengan ketara dalam keadaan CD8 T yang menunjukkan ekspresi tinggi kedua-dua penanda disfungsi (Tox, Tigit, Lag3, Ctla4, Pdcd1/PD1 dan Cd160) dan penanda pengaktifan (Prf1). Rajah 2F dan G; Rajah Tambahan S5G; Jadual Tambahan S1). Sel T CD8 ini juga menunjukkan tahap Tnfrsf9 yang tinggi, penanda yang dikenali untuk menggambarkan subset sel T yang mempunyai kapasiti untuk dicergaskan semula dalam HCC manusia dan jenis kanser lain (36, 37). Sebaliknya, dalam lesi senescent (p53-diaktifkan semula), populasi CD8 T kelihatan sangat aktif, menunjukkan tahap penanda disfungsi yang rendah dan ekspresi sitokin effector yang tinggi (cth, Ifng, Tnf; Jadual Tambahan S1). Sehubungan itu, pemprofilan transkrip bagi tisu tumor pukal menunjukkan tandatangan aktif imun dan sitotoksik dalam tumor senescent yang mengalami regresi (Tambahan Rajah S5H; ruj. 38).

Rajah 2. Senescence mencetuskan suis tumor pengesanan pengelakan imun kepada imun. A, Imej perwakilan CD45 dan pewarnaan GFP yang menandakan sel imun dan sel tumor, masing-masing, dalam p53-tumor yang ditindas dan p53-yang dipulihkan (7 hari selepas pemulihan p53). Betul, kuantifikasi kawasan pewarnaan CD45+ dikira daripada 3 medan rawak setiap tetikus. Setiap titik mewakili tetikus. B, Analisis sitometri aliran landskap imun global dalam model tumor hati NSP orthotopic. Imunofenotip tumor senescent dilakukan 9 hari selepas penarikan Dox, titik masa apabila keadaan senescent ditubuhkan sepenuhnya, namun sebelum regresi tumor besar-besaran. G-MDSC, sel penindas terbitan mieloid granulositik; M-MDSC, sel penindas yang berasal dari myeloid monocytic. Data dikumpulkan daripada 2 percubaan bebas, dengan n=7 dalam kumpulan membiak dan n=9 dalam kumpulan tua. Ambil perhatian bahawa, apabila bilangan mutlak sel CD{18}} bertambah dalam lesi tumor NSP senescent (A), begitu juga dengan jumlah bilangan jenis sel yang ditunjukkan. C, Analisis sitometri aliran sel CD8 T. Data dikumpulkan daripada 2 percubaan bebas, dengan n=11 dalam pembiakan dan n=10 dalam kumpulan tua. Eksperimen telah dilakukan 9 hari selepas pengeluaran Dox. D, Imej pembersihan tisu perwakilan tumor hati NSP orthotopic. Sel T, neutrofil, dan vaskular masing-masing dilabel oleh pewarnaan CD3, MPO, dan CD31. Sampel dikumpulkan 9 hari selepas pengeluaran Dox. E, Perubahan saiz tumor diukur oleh ultrasound apabila pemulihan p53 pada tikus selepas mengurangkan jenis sel imun tertentu menggunakan antibodi atau ubat. F, Kiri, plot penghampiran dan unjuran manifold seragam (UMAP) sel CD8 T diasingkan daripada p53-tumor senescent (SEN) tertindas (PRO) dan p{{30}}tumor senescent diaktifkan semula. Betul, analisis pengayaan set gen bagi gen penanda keletihan sel T dalam CD8+ sel T daripada membiak (p45ditindas) berbanding tumor senescent (p53-diaktifkan semula). NES, skor pengayaan normal; Pval, nilai P. G, UMAP plot ekspresi gen terpilih (Cd8a, Cd44, Tnfrsf9, Cd69, Tox dan Fasl) antara sel T CD8 yang diasingkan daripada senescent (p{{4{0}}diaktifkan semula) dan membiak (p{ {41}}ditindas) tumor. H, Imej imunofluoresensi perwakilan sel T CD8 dan pewarnaan makrofaj F4/80-positif dalam tumor hati NSP orthotopic. Sampel tumor dikumpulkan 9 hari selepas pengeluaran Dox. Data dibentangkan sebagai min ± SEM. Semua bar skala, 100 μm. Ujian t Pelajar dua ekor telah digunakan. *, P < 0.05; **, P < 0.01.

Perubahan pada petak makrofaj memberikan bukti lanjut bahawa penuaan sel tumor mencetuskan suis pengelakan-ke-pengawasan imun. Oleh itu, scRNA-seq, immunophenotyping dan histologi menunjukkan bahawa fenotip makrofaj yang berkaitan dengan tumor beralih daripada F4/80lo; Keadaan CD11chi (kluster 8), termasuk populasi PD-L1+ yang menindas imun (ciri tumor HCC manusia dengan prognosis yang buruk; rujukan 39, 40) hingga F4/80hi; CD11c− menyatakan (kluster 0), ditakrifkan oleh ekspresi tinggi tandatangan gen pembentangan antigen (Tambahan Rajah S5E-S5J dan S6A dan S6B; Jadual Tambahan S1). Daripada perhatian, F4/80hi yang berkaitan dengan penuaan ini; Makrofaj CD11c− sangat sensitif terhadap rawatan clodronate liposomal (Tambahan Rajah S6C–S6E), yang juga mengakibatkan pengurangan ketara dalam pecahan CD8 aktif tetapi bukan sel CD4 T (Tambahan Rajah S6F dan S6G), menunjukkan CD8 Tindak balas imun yang bergantung kepada T yang melibatkan kerjasama dengan makrofaj. Sehubungan itu, analisis histologi mengesahkan bahawa terkumpul sel T CD8 dan makrofaj F4/80+ kerap diperkaya berikutan induksi penuaan dalam tumor (Rajah 2H; Rajah Tambahan S4D). Secara kolektif, analisis biologi dan molekul ini menyokong model di mana penuaan sel tumor mendorong peralihan mendadak daripada pengelakan imun kepada pengawasan imun yang dimediasi oleh perubahan dalam makrofaj dan keadaan sel T CD8, yang membawa kepada imuniti antitumor yang produktif dan, akhirnya, penolakan tumor.

Senescence Mengubahsuai Program Penderiaan Tisu dan Landskap Sel-Permukaan

Kami seterusnya menetapkan untuk mengeksploitasi model di atas untuk memahami mekanisme molekul yang bertanggungjawab untuk menjadikan sel tumor senescent kelihatan kepada sistem imun. Induksi Senes cence melibatkan program pengubahsuaian kromatin yang menyenyapkan gen proliferatif dan mengaktifkan banyak gen pengekodan faktor SASP, dengan program yang terakhir ini sebahagian besarnya bergantung pada pembaca penambah BRD4 (10). Oleh itu, kami melakukan eksperimen pemprofilan transkrip pada sel NSP dalam keadaan membiak (p53-ditindas) berbanding keadaan senescent (p53- dipulihkan) jika tiada dan kehadiran JQ1, ubat yang menghalang fungsi BRD4 (Jadual Tambahan S2 ). Selaras dengan jangkaan, pemulihan p53 secara mendadak mengurangkan ekspresi gen proliferatif dan mendorong ekspresi faktor SASP yang terkenal (Rajah 3A; Rajah Tambahan S7A; rujukan 7), termasuk beberapa sitokin yang dikenali untuk merangsang sel T (Cxcl16, Il18). ) atau pengaktifan dan pengambilan makrofaj (Csf2, pengekodan protein GM-CSF) atau sebelum ini dikaitkan dengan penuaan (Igfbp7, Igfbp3, Pdgfa). Seperti yang dijangkakan daripada kerja sebelumnya (10), kebanyakan transkrip pengekodan SASP yang dikawal selia (~65%) adalah bergantung kepada BRD4-(Tambahan Rajah S7B). Begitu juga, pelbagai faktor pertumbuhan dan modulator imun dirembeskan daripada sel senescent, seperti yang dinilai oleh ujian sitokin berganda, termasuk sel T dan penarik makrofaj CCL5, CXCL9, dan GMCSF, serta faktor pembentukan semula vaskular VEGF (Tambahan Rajah . S7C). Oleh itu, penuaan dalam p53-sel tumor NSP yang dipulihkan dikaitkan dengan SASP yang teguh, selaras dengan pembentukan semula yang ketara bagi ekosistem imun yang dicirikan di atas.

Secara mengejutkan, pemeriksaan penyetempatan subselular untuk gen yang dinyatakan secara berbeza (DEG) mendedahkan bahawa sel tumor senescent bukan sahaja meningkatkan ekspresi faktor SASP ("ekstraselular," EC) yang dirembeskan, tetapi juga menunjukkan perubahan besar dalam tahap ekspresi transkrip yang mengekod protein permukaan. ("membran plasma," PM; Rajah 3B). Sememangnya, 25% daripada jumlah DEG terkawal mengekod protein PM, pengayaan ketara yang menyimpang daripada taburan rawak (15%; Rajah 3B). PM-DEG dinamik dikaitkan dengan transduksi isyarat tirosin kinase protein (Nrp1, Egfr), aktiviti reseptor sitokin (Ifngr1), reseptor matriks ekstraselular (Itgb3, Cd44), dan pengangkut ion (Slc12a1, Slc24a3) dan menangkap molekul yang berkaitan dengan penuaan ( Cd44, Vcam1, dan Itgb3), mencadangkan sel senescent mungkin mempunyai keupayaan yang dipertingkatkan untuk berinteraksi dan merasakan persekitarannya (Rajah 3C; Rajah Tambahan S7D; rujukan 41–43). Menariknya, peningkatan yang berkaitan dengan penuaan dalam ekspresi kebanyakan protein PM ini telah ditumpulkan oleh JQ1, menunjukkan bahawa induksi mereka mungkin sebahagian daripada program pembentukan semula kromatin yang lebih luas ditambah dengan SASP (Rajah 3D; ruj. 10). Daripada makluman, perubahan mendalam dalam transkripsi gen yang mengekod protein PM juga berlaku dalam p53-sel tumor NSP kekurangan yang dirawat dengan gabungan ubat penggerak penuaan trametinib dan palbociclib (Tambahan Rajah S7E, panel atas; Jadual Tambahan S2; ruj. 20) dan dalam satu siri 13 garisan kanser manusia mutan TP53 WT dan TP{32}} pelbagai genetik yang diperoleh daripada kanser hati, payudara, paru-paru dan kolon yang disebabkan oleh pelbagai pencetus (Rajah 3E; Rajah Tambahan. S7F; ruj. 44). Ini amat teguh untuk PM-DEG yang dikawal (tetapi tidak dikurangkan), mengingatkan kesan yang diperhatikan untuk faktor EC SASP (Rajah 3E; Rajah Tambahan S7E, panel bawah). Oleh itu, ekspresi protein permukaan sel yang telah diubah dengan ketara yang kami perhatikan dalam model kami melangkaui p53-penuaan teraruh dan mungkin menjadi ciri bagi keadaan tua.

Rajah 3. Senescence merombak program pengesan tisu dan landskap permukaan sel. A, analisis pengayaan set gen (Reactome) data RNA-seq daripada membiak (PRO, p53 mati) berbanding senescent (SEN, p53 hidup selama 8 hari) sel tumor hati NSP secara in vitro. NES, skor pengayaan normal. B, Penyetempatan subselular DEG (P < 0.05; perubahan lipatan > 2) dalam semua gen yang dikesan [transkrip per kilobase million (TPM) > 1] daripada RNA-seq. C, Analisis ontologi gen (GO) DEG yang mengekod protein PM yang dikawal selia dalam sel senescent. TM, transmembran. D, Analisis transkriptomik semua DEG (berkembang vs. senescent) dengan kehadiran atau ketiadaan rawatan JQ1. Kelompok C1 (berwarna merah) mengandungi gen khusus penuaan yang sensitif kepada JQ1, dan kelompok C4 (berwarna biru) mengandungi gen khusus percambahan yang sensitif kepada JQ1. E, Meta-analisis dataset RNA-seq daripada SENESCopedia dengan melakukan penyetempatan subselular DEGs (sama seperti Rajah 2D) dan ujian tepat Fisher untuk mengkaji pengayaan relatif EC/PM-DEG terkawal dan terkawal yang terpesong daripada taburan rawak. Lihat juga Rajah Tambahan. S7E dan S7F. F, Analisis spektrometri jisim (MS) proteom yang diperkayakan PM dalam sel yang membiak dan senescent. Tahap protein dinormalisasi kepada ungkapan min protein semua sampel. Kawalan ialah sampel tanpa pelabelan biotin berfungsi sebagai latar belakang. Kotak merah dan biru masing-masing mewakili protein yang diperkayakan dalam sel senescent dan proliferasi. n=6 untuk kedua-dua kumpulan percubaan yang tua dan berkembang biak, dan n=3 dan 4, masing-masing, untuk kawalan mereka. G, Pengagihan protein PM beranotasi GeneCards yang dikawal selia dan dikurangkan yang diprofilkan oleh MS. NC, tiada perubahan. H, Plot gunung berapi protein PM beranotasi GeneCards yang diprofilkan oleh MS.

Untuk mengesahkan pembentukan semula global faktor PM dalam penuaan pada tahap protein, kami melakukan proteomik permukaan pada sel tumor NSP yang membiak dan senescent isogenik, menggunakan kaedah pengayaan pelabelan biotin, di mana protein permukaan sel dilabelkan dengan biotin tidak telap membran, disucikan, dan tertakluk kepada spektrometri jisim (Rajah 3F; Rajah Tambahan S7G; Ruj. 45). Korelasi yang kuat antara replika biologi di bawah setiap keadaan diperhatikan (Tambahan Rajah S7H), dengan protein yang dikesan diperkaya untuk protein PM beranotasi sebanyak 60% selepas induksi p53-penuaan teraruh. Daripada 887 protein yang dikesan secara semula, lebih daripada 50% dinyatakan secara berbeza. Kebanyakan protein yang dinyatakan secara berbeza berkorelasi dengan baik dengan arah yang diperhatikan dalam data profil transkrip kami, walaupun ada yang dinyatakan secara berbeza tanpa perubahan yang sepadan dalam tahap transkrip (Tambahan Rajah S7I).

manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun

Protein permukaan sel beranotasi yang dikesan oleh spektrometri jisim semasa induksi penuaan termasuk beberapa yang sebelum ini dikaitkan dengan penuaan (cth, CD44 dan VCAM1), pelbagai faktor pertumbuhan dan reseptor sitokin (cth, EGFR, ICAM1, dan IFNGR1), dan faktor lain yang kurang dicirikan (Rajah). 3F–H; Rajah Tambahan S7J dan S7K). Daripada nota, set protein diperkaya permukaan sel yang dikenal pasti dalam model kami menunjukkan pertindihan terhad dengan yang dikenal pasti dalam fibroblas manusia yang menjalani penuaan yang disebabkan oleh onkogen (46), mencadangkan heterogen antara jenis sel atau pencetus penuaan. Walau apa pun, keputusan ini menunjukkan bahawa sebagai tambahan kepada pendawaian semula dalam program penyembunyian mereka, sel senescent mengalami perubahan mendalam dalam kandungan dan kelimpahan protein permukaan sel dan membayangkan bahawa sel senescent memperoleh ciri pengesan alam sekitar mikro tersendiri yang boleh mempengaruhi keadaan dan nasib mereka dalam vivo. .

Sel Senescent Diutamakan untuk Mengesan IFNg dan Menguatkan Isyarat IFNg

Untuk mengenal pasti laluan yang secara fungsinya mungkin mempengaruhi cara sel senescent merasakan persekitarannya, kami melombong set data transkrip dan proteomik untuk perubahan yang berkaitan dengan penuaan yang dikaitkan dengan imuniti antitumor. Menariknya, analisis ontologi gen (GO) mendedahkan bahawa tindak balas interferon gamma (IFN) jenis II (47) adalah antara 5 laluan beranotasi teratas yang diperkaya semasa penuaan dan bergantung pada program penambah keadaan sel khusus (iaitu, JQ1-sensitif ; iaitu, "C1" Rajah 3D; Rajah Tambahan S8A). Antara transkrip yang diubah, kami mencatatkan beberapa pengawal selia positif isyarat IFN, termasuk subunit reseptor IFN IFNGR1 (salah satu protein terkawal yang paling ketara daripada data proteomik kami) dan pelbagai pengesan interferon (Irf1, Irf7, dan Irf9; rujukan 47, 48 Rajah 4A–C; Rajah Tambahan S8B dan S8C). Selain gen Brd4-terkawal sensitif ini, transkrip yang mengekod pengawal selia negatif isyarat IFN (Ptpn2, Socs1 dan Socs3) telah berkurangan dengan ketara (Rajah 4C; rujukan 49, 50). Perubahan yang sama telah dicatatkan dalam sel tumor NSP yang dirawat dengan inducers senescence yang berbeza (Rajah 4C; Rajah Tambahan S8D-S8G) dan, secara lebih luas, dalam panel 13 kanser yang berasal dari payudara, paru-paru, hati, dan kolon manusia. garisan sel dicetuskan kepada penuaan (Rajah 4D; ruj. 44). Oleh itu, perubahan dalam ekspresi komponen isyarat IFN jenis II adalah ciri umum sel senescent, bebas daripada jenis sel, genotip sel, spesies dan sifat inducer senescence. Peningkatan serentak dalam pengesan isyarat IFN dan penurunan dalam pengawal selia negatif menyebabkan kami membuat hipotesis bahawa sel senescent menjadi bersedia untuk merasakan IFN dalam persekitaran mereka. Untuk menguji hipotesis ini secara langsung, kami merawat sel NSP yang membiak dan senescent dengan IFN rekombinan dan melakukan analisis imunoblotting pengaktifan isyarat JAK-STAT. Walaupun IFN secara mendadak meningkatkan tahap asas STAT1 di kedua-dua negeri, sel senescent terkumpul lebih STAT1 terfosforilasi, tanpa mengira pencetus penuaan (Rajah 4E; Rajah Tambahan S8H). Selain itu, kami juga mendapati peningkatan tahap JAK1 terfosforilasi dalam p53- sel senescent yang dipulihkan, seterusnya menyokong penemuan kami pada laluan isyarat JAK-STAT yang lebih aktif dalam sel senescent yang mengesan IFN (Tambahan Rajah S8I). Seperti yang diramalkan daripada analisis transkrip, penuaan juga mencetuskan penurunan dalam protein PTPN2 (51), tanpa mengira kehadiran IFN eksogen (Rajah 4E). Oleh itu, sel senescent dengan lebih cekap mengaktifkan isyarat IFN sebagai tindak balas kepada mengehadkan kepekatan IFN dalam persekitaran.

Senescence dan EC IFNg Bekerjasama Menimbangkan Jentera Pemprosesan dan Pembentangan Antigen

Untuk lebih memahami sumbangan fungsi penderiaan IFN kepada program penuaan, kami seterusnya membandingkan keadaan fenotip dan transkrip bagi pembiakan dan p53-sel tumor NSP tua yang dipulihkan yang dirawat dengan IFN rekombinan pada tahap rendah (50 pg/mL) atau lebih tinggi (1 ng/mL) dos. Walaupun penambahan IFN eksogen kepada sel tumor yang membiak atau senescent mempunyai kesan yang boleh diabaikan ke atas daya maju, percambahan, atau ekspresi gen SASP bagi sama ada jenis sel pada dos yang diuji (Rajah 5A; Rajah Tambahan S9A-S9D), perubahan yang ketara dalam Ekspresi gen laluan IFN yang dikaitkan dengan keadaan senescent telah diperhatikan. Khususnya, pengelompokan diselia "Tandatangan respons IFN" merentas sel yang membiak dan senescent mendedahkan tiga modul DEG: (i) gen yang dikurangkan semasa penuaan tanpa mengira IFN (termasuk pengawal selia negatif yang disebutkan di atas); (ii) gen yang dikawal selia semasa penuaan tanpa mengira IFN; dan, menariknya, (iii) satu set banyak DEG yang didorong secara kooperatif oleh gabungan penuaan dan IFN (Rajah 5B). Oleh itu, penuaan mencetuskan perubahan kuantitatif dan kualitatif dalam tindak balas transkrip kepada IFN . Satu output yang mantap bagi isyarat IFN yang mengawal kerentanan sel terhadap pengawasan imun adaptif ialah peningkatan kapasiti untuk pembentangan antigen yang dimediasi oleh molekul kelas I MHC (MHC-I; rujukan 47, 52). Malah, kebanyakan gen yang dikawal selia dalam sel senescent (gen kelas ii) atau superinduced dengan kehadiran IFN eksogen (gen kelas iii) termasuk komponen jentera persembahan antigen. Antara gen yang diinduksi semasa penuaan (gen kelas ii) ialah Tap1, pengangkut yang dikaitkan dengan pemprosesan antigen, dan Psme1, faktor proteasom yang dikaitkan dengan pemprosesan antigen (53). Mereka yang hipersensitif kepada IFN eksogen (gen kelas iii) termasuk Nlrc5, coactivator transkrip gen MHC-I (54); faktor pemasangan MHC-I Tapbp; dan subunit MHC-I B2m. Dua gen kelas iii yang lain adalah komponen immunoproteasome (Psmb8 dan Psmb9) yang tindakannya boleh mengubah himpunan peptida yang dibentangkan apabila diekspresikan secara berlebihan dan dikaitkan dengan tindak balas tumor yang lebih baik terhadap sekatan pusat pemeriksaan imun (55). Pengeluaran IFN yang diperkuatkan dalam sel senescent ini telah disahkan oleh RT-qPCR dan dikekalkan pada tahap IFN eksogen yang lebih tinggi (Rajah 5C; Jadual Tambahan S3). Selaras dengan proses multifaktorial yang diterangkan di atas, kesan ini tidak diperhatikan dalam sel tumor yang membiak, malah mereka yang terlalu mengekspresikan cDNA IFNGR1 dan/atau dirawat dengan IFN (Supplementary Fig. S10A–S10D).

Rajah 4. Sel sensen disiapkan untuk mengesan dan menguatkan isyarat IFN. A dan B, tahap IFNGR1 pada sel pembiakan dan senescent yang diprofilkan oleh spektrometri jisim (A) dan disahkan oleh sitometri aliran (B). AU ialah unit sewenang-wenangnya. Data dibentangkan sebagai min ± SEM. n=6 untuk kedua-dua kumpulan yang membiak dan tua. C, Analisis transkriptik gen terpilih yang mengawal isyarat IFN daripada data RNA-seq bagi 3 garisan sel boleh pulih p53-bebas (NSP, NSM2 dan NSP5) yang memulihkan p53 bersama-sama dengan sel NSP yang dirawat dengan dua pencetus penuaan lain. SEN/PRO, senescent/proliferating; T + P, trametinib ditambah palbociclib. D, ekspresi mRNA gen terpilih yang terlibat dalam isyarat IFN dalam garisan sel manusia yang dicetuskan untuk penuaan. Rawatan: Ali, alisertib; Eto, etoposide; nombor menunjukkan tempoh rawatan (hari). Data diperoleh daripada dataset awam SENESCopedia (44). E, Atas, analisis imunoblot sel NSP di bawah pencetus senescent yang berbeza dengan kehadiran atau ketiadaan IFN (1 ng/mL). Bawah, kuantifikasi keamatan isyarat daripada imunoblot. p-STAT1, phospho-STAT1 (Tyr701).

Juga selaras dengan perubahan ekspresi gen yang diterangkan di atas, sel-sel tumor senescent lebih teguh mengimbangi MHC-I sebagai tindak balas kepada tahap IFN eksogen yang rendah berbanding dengan rakan sejawat yang membiak. Oleh itu, manakala tahap permukaan sel MHC-I bagi kedua-dua sel yang membiak dan sel senescent adalah rendah pada garis dasar dan disebabkan oleh IFN eksogen, sel senescent menunjukkan peningkatan ketara dalam ekspresi protein MHC-I (Rajah 5D). Sinergi serupa diperhatikan untuk ekspresi HLA permukaan sel (sama dengan MHC-I pada tikus) dalam sel-sel kanser manusia daripada hati dan jenis kanser lain yang dicetuskan kepada penuaan dengan Butlin, yang melibatkan ap53-program penuaan yang bergantung (56) , atau trametinib/palbociclib, yang lebih suka menyasarkan sel tumor dengan laluan MAPK yang diaktifkan (Tambahan Rajah S11A–S11D; ruj. 20). Nota, kesan gabungan rawatan ubat dan IFN pada ekspresi HLA memerlukan induksi penuaan dan tidak berlaku dalam sel tumor hati yang gagal menua disebabkan mutasi p53 spontan atau kejuruteraan (tidak responsif kepada garis besar) atau laluan MAPK yang tidak hiperaktif (tidak responsif). kepada trametinib/palbociclib). Tambahan pula, walaupun laluan tindak balas IFN jenis I dan II termasuk komponen yang bertindih, rawatan IFN eksogen tidak boleh menggantikan IFN dalam menghasilkan induksi MHC-I yang teguh dalam sel senescent mahupun induksi pembezaan yang kuat antara sel membiak dan senescent dalam model pemulihan p53 kami ( Rajah Tambahan S11E dan S11F). Data ini membayangkan bahawa sel murine dan manusia yang dicetuskan untuk penuaan memperoleh kapasiti yang lebih tinggi untuk pemprosesan dan pembentangan antigen dengan kehadiran kuantiti IFN yang terhad.

Sel Tumor Senescent Hiperaktifkan Laluan Isyarat IFNg Dalam Vivo

Untuk menentukan akibat in vivo pendawaian semula isyarat IFN yang dikenal pasti dalam sel senescent, kami seterusnya menyesuaikan sistem wartawan penderiaan IFN (IGS) untuk memvisualisasikan secara langsung pengaktifan isyarat IFN intraselular dalam masa nyata (57). Wartawan ini terdiri daripada satu siri jujukan yang diaktifkan IFN konsensus, yang mempunyai kekhususan untuk menaip II IFN berbanding isyarat lain (57), diikuti oleh pengekodan jujukan cDNA protein pendarfluor ZsGreen1 dan dikaitkan dengan transgen RFP yang dinyatakan secara konstitutif untuk menggambarkan sel yang ditransduksi ( Rajah 6A). Sel tumor NSP yang menyatakan binaan ini adalah RFP positif dan menunjukkan peningkatan bergantung dos dalam isyarat ZsGreen1 semasa rawatan dengan IFN in vitro yang meningkat selepas induksi p53 atau selepas rawatan dengan ubat-ubatan yang mendorong penuaan (Rajah 6B; Rajah Tambahan S12A dan S12B) .

Kami seterusnya menggunakan sistem ini untuk memantau aktiviti isyarat berikutan induksi senescence dalam tumor. Sel tumor yang ditransduksi oleh reporter (pada Dox) yang menyatakan RFP konstitutif telah disuntik ke dalam hati penerima syngeneic yang diberi makan Dox, dan, selepas manifestasi tumor, Dox dikeluarkan untuk mendorong ekspresi p53 dan mencetuskan penuaan seperti di atas (lihat Rajah 1 dan 2). Tumor yang mundur telah diasingkan 9 hari selepas pengeluaran Dox untuk pengimejan 3D aktiviti wartawan dan penilaian selari isyarat IFN berbanding dengan kawalan yang membiak (daripada tikus yang dikekalkan pada Dox). Seperti yang digambarkan dalam Rajah 6C, sel tumor yang membiak menunjukkan sedikit, jika ada, ekspresi wartawan, manakala sel tumor yang dicetuskan untuk penuaan dalam vivo memaparkan isyarat ZsGreen1 yang lebih menonjol (Rajah 6C dan D; Video Tambahan S2). Kesan ini bertepatan dengan peningkatan khusus dalam tahap protein IFN (tetapi bukan jenis IFN) dalam ekstrak tisu tumor (Rajah 6E; Rajah Tambahan S12C).

Untuk menguji sama ada komposisi sel imun yang diubah dalam tumor senescent (Rajah 2; Rajah Tambahan S5-S6) menyumbang kepada isyarat dipertingkatkan wartawan IGS, kami melakukan ujian kokultur in vitro yang membenarkan pendedahan sel tumor senescent atau membiak kepada bilangan sel CD8 T diaktifkan yang sama, yang kami kenal pasti melalui data scRNA-seq sebagai sumber selular utama IFN dalam vivo (Rajah 6F–H). Sel senescent masih menunjukkan peningkatan ketara bagi isyarat ZsGreen1 berbanding dengan kawalan membiak (Rajah 6I). Selaras dengan pengaktifan isyarat bukan sel autonomi, IFN tidak dikesan dalam media terkondisi daripada sel tumor NSP di bawah keadaan proliferatif atau senescent (Tambahan Rajah S12D), namun IFN mudah dikesan apabila kultur dengan sel T CD8, kesan yang dipertingkatkan lagi dengan penambahan makrofaj dan dikaitkan dengan peningkatan MHC kelas I pada sel senescent serta peningkatan pengaktifan sel CD8 T (Tambahan Rajah S12E-S12J). Secara kolektif, data ini menyokong model di mana interaksi heterotip antara sel tumor senescent dan sel imun mesensitasikan tumor kepada IFN eksogen, yang membawa kepada persembahan antigen yang dipertingkatkan dan pengawasan imun yang cekap.

Rajah 5. Senescence dan EC IFN bekerjasama untuk mengawal selia jentera pemprosesan dan pembentangan antigen. A dan B, ekspresi mRNA gen dalam sel NSP yang membiak dan tua secara in vitro dengan kehadiran atau ketiadaan rawatan IFN (50 pg/mL). Tahap mRNA dinormalisasi kepada ekspresi min gen dalam semua sampel. A, faktor SASP pengekodan DEG dalam model kami. B, gen tindak balas IFN daripada pangkalan data tandatangan Hallmark. C, RT-qPCR gen laluan pembentangan antigen terpilih dalam sel pembiakan dan senescent dirawat dengan kepekatan rendah (50 pg/mL) atau tinggi (1 ng/mL) IFN . Sampel adalah daripada 2 replika biologi. D, MHC-I tahap pembiakan dan sel senescent dirawat dengan IFN selama 24 jam diukur dengan sitometri aliran. MFI, keamatan pendarfluor median. Data dibentangkan sebagai min ± SEM.

Rajah 6. Senescence meningkatkan isyarat heterotip pengantara IFN daripada sel imun yang diaktifkan kepada sel tumor. Ilustrasi grafik wartawan IGS. (Dicipta dengan BioRender.com.) B, Kiri, plot sitometri aliran perwakilan yang mengukur isyarat ZsGreen1 dalam sel NSP yang membiak dan tua yang dirawat dengan 1 ng/mL IFN . Betul, kuantifikasi peratusan ZsGreen1-sel positif semasa rawatan IFN. MFI, keamatan pendarfluor median. C dan D, Pengimejan 3D Perwakilan tumor yang dibersihkan tisu daripada saluran sel NSP hati yang disuntik secara ortotop yang menyatakan wartawan IGS (C). Kuantifikasi 3 medan yang dipilih secara rawak daripada tumor hati setiap tetikus (D). n=5 dan n=3 untuk kumpulan yang membiak dan menua (9 hari selepas pemulihan p53), masing-masing. Bar skala, 100 μm. E, Atas, ujian tatasusunan manik sitometrik untuk tahap IFN daripada sampel lisat tisu tumor dalam vivo (7 hari selepas pemulihan p53). Bawah, transkrip gen yang ditunjukkan daripada RNA-seq sampel pukal in vivo tumor yang dihasilkan oleh HTVI (PRO, p53 off; SEN, p53 pemulihan selama 12 hari). TPM, transkrip setiap kilobase juta. Kelompok Ifna/b yang tercatat mengandungi 14 subjenis Ifna dan 1 gen Ifnb. F dan G, Ungkapan Ifng dalam sel imun yang menyusup tumor yang diprofilkan oleh scRNA-seq dalam model pemindahan NSP (seperti dalam Rajah 2, sampel yang dikumpul pada hari ke-8 selepas pemulihan p53). H, Penghampiran manifold seragam dan plot unjuran ungkapan Havcr2 (pengekodan TIM3) dan Ifng dalam sel CD8 T yang dituai daripada lesi tumor yang membiak (P) dan senescent (S). Panel atas direplikasi daripada Rajah 2F (kiri) untuk menunjukkan sel yang sepadan dengan setiap keadaan. I, Kuantifikasi keamatan ZsGreen1 sel tumor NSP dalam sel T OT-I dan eksperimen kokultur sel tumor yang mengekspresikan SIINFEKL (nisbah kesan kepada sasaran, 5:1) selepas 20 jam kokultur. Isyarat diukur dengan sitometri aliran. T + P, trametinib ditambah palbociclib. Lihat butiran percubaan dalam Rajah Tambahan S12E. Data dibentangkan sebagai min ± SEM. Ujian t Pelajar dua ekor telah digunakan. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001.

Isyarat IFNg dalam Sel Tumor Senescent Adalah Diperlukan untuk Pengawasan Imun

Keputusan kami menunjukkan bahawa pembersihan pengantara imun sel tumor NSP senescent melibatkan kesan gabungan SASP, yang dikenali untuk merangsang pengambilan sel imun (10, 20, 58), bersama-sama dengan kapasiti sel senescent yang kurang dihargai sebelum ini untuk penderiaan dan tindak balas yang dipertingkatkan kepada Isyarat EC, seperti yang ditunjukkan di sini dengan IFN . Untuk menguji sumbangan program penderiaan IFN yang berkaitan dengan penuaan kepada pengawasan imun sel tumor tua, kami mengkaji bagaimana gangguan IFNGR dalam sel tumor, atau pengurangan IFN dalam hos, mempengaruhi pembersihan sel tumor NSP apabila induksi penuaan. . Malah, regresi tumor (tetapi bukan penuaan per se; Rajah Tambahan S13A–S13D) telah terjejas apabila kalah mati (KO) IFNGR1 (Rajah 7A dan B; Rajah Tambahan S14A–S14C), kesan yang lebih ketara untuk Tumor utuh IFNGR yang dicantumkan ke dalam tikus Ifng−/− (Rajah 7C dan D) dan dikaitkan dengan jangkaan kehilangan permukaan MHC-I dalam sel tumor (Tambahan Rajah S14D dan S14E).

Selaras dengan sumbangan isyarat IFN dan sel tumor MHC-I yang diketahui kepada penglibatan CD8+ (59), tumor yang kekurangan IFNGR1 atau yang berkembang dalam penerima Ifng−/− mengandungi lebih sedikit sel T CD8 daripada rakan WT mereka dalam kedua-dua keadaan membiak dan senescent (Tambahan Rajah S14F) sementara masih mendorong infiltrat imun yang teguh termasuk makrofaj yang banyak (Rajah 7E dan F; Rajah Tambahan S14G). Walau apa pun, fenotip pengawasan senescence terjejas bukan semata-mata hasil daripada penurunan dalam sel T CD8 ini. Ujian Coculture memberikan pendedahan seragam sel tumor IFNGR1 KO dan WT kepada sel T CD8 dan makrofaj masih menunjukkan pembunuhan bergantung{11}}IFNGR terhadap sel tumor senescent (Tambahan Rajah S15A–S15E)-pergantungan yang memerlukan kehadiran kedua-dua T sel dan makrofaj dan yang tidak diperhatikan dalam sel tumor yang membiak di bawah keadaan yang sama. Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahawa keupayaan sel senescent yang dipertingkatkan untuk mengesan IFN persekitaran mikro bertindak bersama-sama dengan pengambilan sel imun yang dirangsang SASP untuk membolehkan interaksi heterotip saling menguatkan antara sel tumor, makrofaj dan sel T diaktifkan yang meningkatkan persembahan antigen dan pengawasan imun. , membawa kepada regresi tumor yang kuat.

PERBINCANGAN

Didayakan oleh model tumor murine di mana pengelakan imun kanser berbanding pengawasan penuaan berada di bawah kawalan genetik yang ketat, kami mendedahkan bagaimana sel senescent secara dramatik mengubah keupayaan mereka untuk menghantar dan menerima isyarat persekitaran (Tambahan Rajah S16). Selaras dengan program penuaan yang diketahui, induksi penuaan terdorong p53-menyebabkan pembungkaman gen proliferatif dan mendorong SASP. Walau bagaimanapun, kami juga melihat kesan mendalam pada ekspresi gen untuk protein PM, termasuk pelbagai reseptor faktor pertumbuhan dan reseptor sitokin yang diramalkan secara drastik mengubah cara sel senescent bertindak balas terhadap isyarat persekitaran. Yang penting, walaupun kami menggunakan model kanser hati sebagai sistem eksperimen utama kami, pendawaian semula yang serupa dalam ekspresi penderia permukaan sel dan program gen yang peka kepada isyarat alam sekitar diperhatikan dalam pelbagai sel tumor murine dan manusia yang dirawat dengan penggerak penuaan. ejen, membayangkan bahawa program penderiaan yang diubah adalah ciri umum keadaan tua.

manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun

Salah satu laluan penderiaan yang menonjol yang diubah dalam sel senescent melibatkan isyarat IFN jenis II. Dalam model kanser hati kami dan merentasi semua keadaan senescent yang kami periksa, senescence disertai dengan perubahan ekspresi transkripsi dan protein intrinsik sel yang diramalkan untuk meningkatkan isyarat daripada IFN eksogen. Sememangnya, sel senescent mengaktifkan effector IFN dengan lebih teguh sebagai tindak balas kepada IFN in vitro dan in vivo, dan kedua-dua laluan effector IFN yang utuh dan IFN dalam persekitaran diperlukan untuk pembersihan sel-sel tumor senescent yang cekap oleh CD8 T. Walaupun analisis laluan transkriptom sel senescent selalu mengenal pasti isyarat IFN jenis II sebagai ciri yang diperkaya, bertindih antara komponen isyarat jenis I dan II dan fakta bahawa IFN biasanya tidak dikesan sebagai faktor SASP telah meninggalkan persoalan mekanistik mengenai isyarat IFN jenis II dalam penuaan. sebahagian besarnya belum diterokai. Kajian kami menunjukkan bahawa pengayaan sedemikian dalam tandatangan isyarat IFN sel senescent mencerminkan kapasiti yang dipertingkatkan untuk penderiaan IFN yang outputnya paling menonjol dalam vivo.

Rajah 7. Isyarat IFN dalam sel tumor senescent adalah perlu untuk pengawasan imun. A, Ifngr1 KO kedua-dua sel NSP yang membiak dan senescent disahkan oleh sitometri aliran. B, fenotip regresi tumor Ifngr1 KO atau mengawal sel tumor yang ditransfeksi sgRNA secara orthotopically disuntik ke dalam tikus Bl / 6N semasa pemulihan p53. SgRNA kawalan yang menyasarkan gurun gen yang terletak pada Chr8 (Ctrl KO) berfungsi sebagai kawalan. C, Fenotip regresi tumor sel tumor NSP ibu bapa disuntik secara ortotop ke dalam tikus WT atau Ifng KO selepas pemulihan p53. D, Imej makroskopik perwakilan tumor yang dikumpul pada hari ke-21 selepas pemulihan p53 daripada C. E, Analisis sitometri aliran kelimpahan CD45 dalam tumor daripada kumpulan yang ditunjukkan. F, Representative immunofluorescence dalam tumor p{{10}}ditindas (membiak) dan p{11}}dipulihkan (senescent, 7 hari selepas pemulihan p53) daripada hos yang ditunjukkan. Sel tumor NSP telah ditransduksi dengan vektor ekspresi GFP untuk visualisasi. Bar skala, 50 μm. Data dibentangkan sebagai min ± SEM. Ujian t Pelajar dua ekor telah digunakan. **, P < 0.01; ***, P < 0.001.

Mungkin output isyarat IFN jenis II yang paling mantap melibatkan keupayaannya untuk mendorong jentera pembentangan antigen. Sesungguhnya, ekspresi permukaan sel yang disebabkan oleh IFN MHC-I (atau HLA dalam sel manusia) dalam model kami di bawah kedua-dua keadaan pembiakan dan penuaan. Walau bagaimanapun, regulasi MHC-I yang disebabkan oleh IFN lebih ketara dalam sel senescent, kesan yang dikaitkan dengan peningkatan ekspresi pengangkut yang dikaitkan dengan pemprosesan antigen, faktor pemprosesan antigen lain dan komponen struktur MHC-I. Hipersensitiviti yang sama kepada IFN dalam mendorong MHC-I/ HLA diperhatikan dalam sel-sel kanser hati dan paru-paru manusia yang dicetuskan untuk penuaan. Keputusan ini membayangkan bahawa program penuaan boleh meningkatkan persembahan antigen dalam sel bukan imun, dengan itu memudahkan pengawasan imunotumour. Keputusan kami menyokong model di mana kesan muktamad sel senescent pada biologi tisu ditentukan oleh kesan gabungan cara mereka menghantar dan menerima isyarat alam sekitar. Bukan sahaja sel senescent mendorong SASP, yang mencetuskan pembentukan semula tisu dan mengubah keadaan sel dan komposisi sel imun dalam persekitaran, tetapi ia juga mengubah permukaannya secara dramatik, yang membawa kepada keupayaan pembezaan untuk mengesan faktor persekitaran, yang ditunjukkan oleh IFN . Yang penting, gangguan isyarat IFN tidak mempunyai kesan ke atas induksi penuaan atau SASP dalam sistem kami, namun menjejaskan regresi tumor seterusnya, menunjukkan bahawa penderiaan alam sekitar yang diubah bertindak bersama-sama dengan SASP untuk menentukan output muktamad program penuaan-dalam kes ini, pengawasan imun. Kesan ini nampaknya merupakan sebahagian daripada program epigenetik yang diselaraskan, kerana kedua-dua program SASP dan penderiaan menunjukkan pergantungan yang ketara pada faktor pembentukan semula kromatin BRD4.

Walaupun mekanisme pengawasan imun dalam model kami bergantung pada kesan kerjasama CD8 sel T dan populasi makrofaj yang mencerminkan peralihan daripada "imun selsema" kepada persekitaran mikro tumor "imun panas", jenis sel imun semula jadi atau adaptif lain mungkin mengenali. dan sel senescent yang jelas dalam konteks yang berbeza, atau, sebagai alternatif, pengawasan imun mungkin tidak berlaku sama sekali (18, 19). Tidak dinafikan, beberapa perbezaan ini mencerminkan heterogeniti dalam rembesan faktor SASP (13, 14), walaupun keputusan kami menimbulkan kemungkinan bahawa tahap dan sifat penderiaan alam sekitar yang diubah juga boleh mempengaruhi bagaimana sel senescent mempengaruhi biologi tisu. Walaupun kalah mati penderiaan IFN (melalui Ifngr1 KO) dan pemadaman MHC-I (B2M KO) dalam sel tumor senescent menjejaskan pengawasan imun mereka dalam vivo, ia tidak sepenuhnya menghapuskan regresi tumor selepas induksi senescence, menunjukkan bahawa penderiaan IFN dalam sel senescent adalah bukan satu-satunya laluan yang menyumbang kepada regresi tumor. Walau apa pun, hakikat bahawa sel senescent boleh bertindak balas secara berbeza kepada isyarat persekitaran menunjukkan bahawa keadaan molekul muktamad mereka dalam tisu akan berbeza daripada dalam budaya sel, menonjolkan keperluan untuk mencirikan proses yang lebih baik dalam vivo.

Keputusan kami boleh membantu menjelaskan kesan paradoks biologi penuaan dalam fisiologi dan penyakit dan mempunyai implikasi untuk penggunaan berkesan terapeutik pemodulasi penuaan. Sebagai contoh, dalam model kami, perbezaan antara pelepasan sel senescent tumor dan kegigihan ditentukan, sekurang-kurangnya sebahagiannya, dengan kehadiran IFN alam sekitar dan integriti isyarat IFN jenis II dalam sel senescent. Ini menunjukkan bahawa variasi dalam keupayaan sel senescent untuk merekrut dan merasakan sel imun yang merembeskan IFN atau jenis sel imun yang lain boleh menjejaskan pembersihan sel senescent secara mendalam, oleh itu pengurangan IFN persekitaran atau isyarat IFN jenis II yang berkurangan boleh membolehkan kegigihan sel senescent dalam tisu. Dalam konteks kanser, terapi yang mendorong penuaan sel tumor-program sitostatik-boleh mencetuskan regresi tumor yang dimediasi imun atau mensensitisasi semula tumor kepada sekatan pusat pemeriksaan imun, namun ini bukanlah hasil sejagat. Oleh itu, kepelbagaian dalam SASP (yang boleh berbeza-beza antara jenis sel tumor dan inducers senescence) atau penderiaan dan output IFN [mungkin dipengaruhi oleh pemadaman atau mutasi laluan IFN atau komponen HLA (60) atau mekanisme transkrip boleh balik yang ditemui di sini] mungkin mempengaruhi keberkesanan terapi sedemikian pada pesakit. Selaras dengan tanggapan ini, induksi dipacu terapi profil SASP tertentu meramalkan hasil pesakit dalam subkumpulan pesakit dengan kanser ovari (61). Sebaliknya, strategi untuk meningkatkan pengawasan imun sel senescent dengan meningkatkan sensitiviti mereka kepada IFN (cth, dengan perencat PTPN2) boleh membantu output program berat sebelah ke arah penolakan sel tumor. Kami membayangkan bahawa menyiasat ini dan program pengubahsuaian dan pengesanan tisu lain dalam biopsi tumor sebelum dan selepas rawatan (cth, melalui profil transkriptom atau proteomik) boleh mendedahkan biomarker tindak balas baharu dan/atau strategi gabungan untuk meningkatkan pengurusan klinikal kanser.

RUJUKAN

1. Di Micco R, Krizhanovsky V, Baker D, d'Adda di Fagagna F. Penuaan selular dalam penuaan: daripada mekanisme kepada peluang terapeutik. Nat Rev Mol Cell Biol 2021;22:75–95.

2. Munoz-Espin D, Serrano M. Senescence selular: dari fisiologi kepada patologi. Nat Rev Mol Cell Biol 2014;15:482–96.

3. Demaria M, Ohtani N, Youssef SA, Rodier F, Toussaint W, Mitchell JR, et al. Peranan penting untuk sel senescent dalam penyembuhan luka yang optimum melalui rembesan PDGF-AA. Sel Dev 2014;31:722–33.

4. Xu M, Pirtskhalava T, Farr JN, Weigand BM, Palmer AK, Weivoda MM, et al. Senolitik meningkatkan fungsi fizikal dan meningkatkan jangka hayat pada usia tua. Nat Med 2018;24:1246–56.

5. Serrano M, Lin AW, McCurrach ME, Beach D, Lowe SW. Ras onkogenik mencetuskan penuaan sel pramatang yang dikaitkan dengan pengumpulan p53 dan p16INK4a. Sel 1997;88:593–602.

6. Ewald JA, Desotelle JA, Wilding G, Jarrard DF. Penuaan akibat terapi dalam kanser. J Natl Cancer Inst 2010;102:1536–46.

7. Coppe JP, Desprez PY, Krtolica A, Campisi J. Fenotip rembesan yang berkaitan dengan penuaan: bahagian gelap penindasan tumor. Annu Rev Pathol 2010;5:99–118.

8. Demaria M, O'Leary MN, Chang J, Shao L, Liu S, Alimirah F, et al. Penuaan selular menggalakkan kesan buruk kemoterapi dan kanser berulang. Discov Kanser 2017;7:165–76.

9. Coppe JP, Patil CK, Rodier F, Sun Y, Munoz DP, Goldstein J, et al. Fenotip rembesan yang berkaitan dengan senescence mendedahkan fungsi sel-nonautonomi RAS onkogenik dan penindas tumor p53. PLoS Biol 2008;6:2853–68.

10. Tasdemir N, Banito A, Roe JS, Alonso-Curbelo D, Camiolo M, Tschaharganeh DF, et al. BRD4 menghubungkan pengubahsuaian penambah kepada pengawasan imun penuaan. Discov Kanser 2016;6:612–29.

11. Chien Y, Scuoppo C, Wang X, Fang X, Balgley B, Bolden JE, et al. Kawalan fenotip rembesan yang berkaitan dengan penuaan oleh NF-kappaB menggalakkan penuaan dan meningkatkan kemosensitiviti. Genes Dev 2011;25:2125–36.

12. Kuilman T, Michaloglou C, Vredeveld LC, Douma S, van Doorn R, Desmet CJ, et al. Penuaan yang disebabkan oleh onkogen disampaikan oleh rangkaian keradangan yang bergantung kepada interleukin. Sel 2008;133:1019–31.

13. Basisty N, Kale A, Jeon OH, Kuehnemann C, Payne T, Rao C, et al. Atlas proteomik rembesan yang berkaitan dengan penuaan untuk pembangunan biomarker penuaan. PLoS Biol 2020;18:e3000599.

14. Hernandez-Segura A, de Jong TV, Melov S, Guryev V, Campisi J, Demaria M. Membongkar heterogeniti transkrip dalam sel senescent. Curr Biol 2017;27:2652–60.

15. Xue W, Zender L, Miething C, Dickins RA, Hernando E, Krizhanovsky V, et al. Senescence dan pembersihan tumor dicetuskan oleh pemulihan p53 dalam karsinoma hati murine. Alam 2007;445:656–60.

16. Kang TW, Yevsa T, Woller N, Hoenicke L, Wuestefeld T, Dauch D, et al. Pengawasan senescence hepatosit pra-malignan mengehadkan perkembangan kanser hati. Alam 2011;479:547–51.

17. Ovadya Y, Landsberger T, Leins H, Vadai E, Gal H, Biran A, et al. Pengawasan imun yang terjejas mempercepatkan pengumpulan sel senescent dan penuaan. Nat Commun 2018;9:5435.

18. Lujambio A. Untuk membersihkan, atau tidak untuk membersihkan (sel senescent)? Itulah soalannya. Bioessays 2016;38 Suppl 1:S56–64. 19. Di Mitri D, Toso A, Chen JJ, Sarti M, Pinton S, Jost TR, et al. Tumor yang menyusup Gr-1+ sel myeloid menentang penuaan dalam kanser. Alam 2014;515:134–7.

20. Ruscetti M, Leibold J, Bott MJ, Fennell M, Kulick A, Salgado NR, et al. Sitotoksisiti pengantaraan sel NK menyumbang kepada kawalan tumor oleh gabungan ubat sitostatik. Sains 2018;362:1416–22.

21. Llovet JM, Kelley RK, Villanueva A, Singal AG, Pikarsky E, Roayaie S, et al. Karsinoma hepatoselular. Nat Rev Dis Primers 2021;7:6.

22. Chiang DY, Villanueva A, Hoshida Y, Peix J, Newell P, Minguez B, et al. Keuntungan fokus VEGFA dan klasifikasi molekul karsinoma hepatoselular. Kanser Res 2008;68:6779–88.

23. Llovet JM, Castet F, Heikenwalder M, Maini MK, Mazzaferro V, Pinato DJ, et al. Imunoterapi untuk karsinoma hepatoselular. Nat Rev Clin Oncol 2022;19:151–72.

24. Sangro B, Sarobe P, Hervas-Stubbs S, Melero I. Kemajuan dalam imunoterapi untuk karsinoma hepatoselular. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2021;18:525–43.

25. Levine AJ. Menyasarkan protein P53 untuk terapi kanser: kesan translasi penyelidikan P53. Kanser Res 2022;82:362–4.

26. Xiao Y, Chen J, Zhou H, Zeng X, Ruan Z, Pu Z, et al. Menggabungkan monoterapi mRNA p53 dengan sekatan pusat pemeriksaan imun memprogram semula persekitaran mikro imun untuk terapi kanser yang berkesan. Nat Commun 2022;13:758.

27. Demir O, Barros EP, Offutt TL, Rosenfeld M, Amaro RE. Pandangan bersepadu bagi dinamik, fungsi dan pengaktifan semula p53. Curr Opin Struct Biol 2021;67:187–94.

28. Suda T, Liu D. Penghantaran gen hidrodinamik: prinsip dan aplikasinya. Mol Ther 2007;15:2063–9.

29. Hoshida Y, Nijman SM, Kobayashi M, Chan JA, Brunet JP, Chiang DY, et al. Analisis transkrip integratif mendedahkan subkelas molekul biasa karsinoma hepatoselular manusia. Kanser Res 2009;69:7385–92.

30. Kaech SM, Hemby S, Kersh E, Ahmed R. Pemprofilan molekul dan fungsi pembezaan sel CD8 T memori. Sel 2002;111:837–51.

31. Bruix J, Cheng AL, Meinhardt G, Nakajima K, De Sanctis Y, Llovet J. Faktor prognostik dan peramal manfaat sorafenib pada pesakit dengan karsinoma hepatoselular: analisis dua kajian fasa III. J Hepatol 2017;67:999–1008.

32. Adrover JM, Aroca-Crevillen A, Crainiciuc G, Ostos F, Rojas-Vega Y, Rubio-Ponce A, et al. Program 'melucutkan senjata' proteom neutrofil mengurangkan magnitud keradangan. Nat Immunol 2020;21: 135–44.

33. Zeisberger SM, Odermatt B, Marty C, Zehnder-Fjallman AH, Ballmer-Hofer K, Schwendener RA. Kekurangan klodronate-liposom-pengantara makrofaj yang berkaitan dengan tumor: pendekatan terapi antiangiogenik yang baru dan sangat berkesan. Br J Cancer 2006;95:272–81.

34. De Simone G, Andreata F, Bleriot C, Fumagalli V, Laura C, Garcia-Manteiga JM, et al. Pengenalpastian subset sel Kupffer yang mampu memulihkan disfungsi sel T yang disebabkan oleh penyebuan hepatoselular. Kekebalan 2021;54:2089–100.

35. Dann E, Henderson NC, Teichmann SA, Morgan MD, Marioni JC. Ujian kelimpahan pembezaan pada data sel tunggal menggunakan graf jiran terhampir k. Nat Biotechnol 2022;40:245–53.

36. Kim HD, Park S, Jeong S, Lee YJ, Lee H, Kim CG, et al. 4–1BB menggambarkan status pengaktifan yang berbeza bagi sel T CD8(+) yang menyusup tumor yang letih dalam karsinoma hepatoselular. Hepatologi 2020;71:955–71.

37. Li Y, Wang Z, Jiang W, Zeng H, Liu Z, Lin Z, et al. Sel T TNFRSF9(+) CD8(+) yang menyusup tumor mentakrifkan subset berbeza bagi karsinoma sel renal sel jelas dengan prognosis dan tindak balas imunoterapeutik. Onkoimunologi 2020;9:1838141.

38. Bindea G, Mlecnik B, Tosolini M, Kirilovsky A, Waldner M, Obenauf AC, et al. Dinamik spatiotemporal sel imun intratumoral mendedahkan landskap imun dalam kanser manusia. Kekebalan 2013;39:782–95.

39. Kuang DM, Zhao Q, Peng C, Xu J, Zhang JP, Wu C, et al. Monosit yang diaktifkan dalam stroma peritumoral karsinoma hepatoselular memupuk keistimewaan imun dan perkembangan penyakit melalui PD-L1. J Exp Med 2009;206:1327–37.

40. Lu LG, Zhou ZL, Wang XY, Liu BY, Lu JY, Liu S, et al. Sekatan PD-L1 membebaskan sifat antitumorigenik intrinsik makrofaj glikolitik dalam karsinoma hepatoselular. Gut 2022;71:2551–60.

41. Milanovic M, Fan DNY, Belenki D, Dabritz JHM, Zhao Z, Yu Y, et al. Pengaturcaraan semula yang berkaitan dengan senescence menggalakkan kekangan kanser. Alam 2018;553:96–100.

42. Yousef H, Czupalla CJ, Lee D, Chen MB, Burke AN, Zera KA, et al. Darah tua menjejaskan aktiviti prekursor saraf hippocampal dan mengaktifkan mikroglia melalui sel endothelial otak VCAM1. Nat Med 2019;25:988–1000.

43. Rapisarda V, Borghesan M, Miguela V, Encheva V, Snijders AP, Lujambio A, et al. Integrin beta 3 mengawal penuaan selular dengan mengaktifkan laluan TGF-beta. Rep Sel 2017;18:2480–93.

44. Jochems F, Thijssen B, De Conti G, Jansen R, Pogacar Z, Groot K, et al. Kanser SENESCopedia: delineasi penuaan sel kanser. Rep Sel 2021;36:109441.

45. Perna F, Berman SH, Soni RK, Mansilla-Soto J, Eyquem J, Hamieh M, et al. Mengintegrasikan proteomik dan transkriptomi untuk terapi reseptor antigen chimeric kombinatorial sistematik AML. Sel Kanser 2017;32:506–19.

46. ​​Hoare M, Ito Y, Kang TW, Ahli Parlimen Weekes, Matheson NJ, Patten DA, et al. NOTCH1 mengantara suis antara dua rembesan berbeza semasa penuaan. Nat Cell Biol 2016;18:979–92.

47. Castro F, Cardoso AP, Goncalves RM, Serre K, Oliveira MJ. Interferon-gamma di persimpangan pengawasan atau pengelakan imun tumor. Immunol Depan 2018;9:847.

48. Platanias LC. Mekanisme isyarat pengantara jenis-I- dan jenis-II-interferon. Nat Rev Immunol 2005;5:375–86.

49. Manguso RT, Pope HW, Zimmer MD, Brown FD, Yates KB, Miller BC, et al. Pemeriksaan CRISPR in vivo mengenal pasti Ptpn2 sebagai sasaran imunoterapi kanser. Alam 2017;547:413–8.

50. Song MM, Shuai K. Penekan isyarat sitokin (SOCS) 1 dan SOCS3 tetapi bukan protein SOCS2 menghalang aktiviti antiviral dan antiproliferatif pengantara interferon. J Biol Chem 1998;273:35056–62.

51. Kleppe M, Soulier J, Asnafi V, Mentens N, Hornakova T, Knoops L, et al. PTPN2 secara negatif mengawal JAK1 onkogenik dalam leukemia limfoblastik akut sel T. Darah 2011;117:7090–8.

52. Zhou F. Mekanisme molekul IFN-gamma untuk mengawal selia pemprosesan dan pembentangan antigen MHC kelas I. Int Rev Immunol 2009;28:239–60.

53. McCarthy MK, Weinberg JB. Imunoproteasome dan jangkitan virus: pengawal selia kompleks keradangan. Mikrobiol Depan 2015; 6:21.

54. Yoshihama S, Vijayan S, Sidiq T, Kobayashi KS. NLRC5/CITA: pemain utama dalam pengawasan imun kanser. Kanser Trend 2017;3:28–38.

55. Kalaora S, Lee JS, Barnea E, Levy R, Greenberg P, Alon M, et al. Ekspresi imunoproteasom dikaitkan dengan prognosis dan tindak balas yang lebih baik terhadap terapi pusat pemeriksaan dalam melanoma. Nat Commun 2020; 11:896.

56. Efeyan A, Ortega-Molina A, Velasco-Miguel S, Herranz D, Vassilev LT, Serrano M. Induksi p53-penuaan bergantung oleh nutlin antagonis MDM2-3a dalam sel tikus fibroblas asal usul. Kanser Res 2007;67:7350–7.

57. Hoekstra ME, Bornes L, Dijkgraaf FE, Philips D, Pardieck IN, Toebes M, et al. Modulasi jarak jauh sel tumor pemerhati oleh CD8(+) T yang dirembeskan sel T IFNgamma. Kanser Nat 2020;1:291–301.

58. Ruscetti M, Morris JPt, Mezzadra R, Russell J, Leibold J, Romesser PB, et al. Pembentukan semula vaskular yang disebabkan oleh senescence mewujudkan kelemahan terapeutik dalam kanser pankreas. Sel 2020;181:424–41.

59. Dighe AS, Richards E, LJ Lama, Schreiber RD. Pertumbuhan in vivo dipertingkatkan dan penentangan terhadap penolakan sel tumor yang menyatakan reseptor gamma IFN negatif dominan. Kekebalan 1994;1:447–56.

60. Gao J, Shi LZ, Zhao H, Chen J, Xiong L, He Q, et al. Kehilangan gen laluan gamma IFN dalam sel tumor sebagai mekanisme penentangan terhadap terapi anti-CTLA-4. Sel 2016;167:397–404.

61. Paffenholz SV, Salvagno C, Ho YJ, Limjoco M, Baslan T, Tian S, et al. Induksi senescence menentukan tindak balas kepada kemoterapi dan imunoterapi dalam model praklinikal kanser ovari. Proc Natl Acad Sci USA 2022;119:e2117754119.

62. Shao DD, Xue W, Krall EB, Bhutkar A, Piccioni F, Wang X, et al. KRAS dan YAP1 berkumpul untuk mengawal EMT dan survival tumor. Sel 2014;158:171–84.

63. Zhu C, Kim K, Wang X, Bartolome A, Salomao M, Dongiovanni P, et al. Pengaktifan Notch Hepatocyte mendorong fibrosis hati dalam steatohepatitis bukan alkohol. Sci Transl Med 2018;10:eaat0344.

64. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, Yukinaga H, Kuno A, Ueda HR. Protokol CUBIC lanjutan untuk pembersihan dan pengimejan seluruh otak dan seluruh badan. Nat Protoc 2015;10:1709–27.

65. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: perapi fleksibel untuk data jujukan Illumina. Bioinformatik 2014;30:2114–20. 66. Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, et al. STAR: penjajar RNA-seq universal ultrafast. Bioinformatik 2013;29:15–21.

67. Anders S, Pyl PT, Huber W. HTSeq-a rangka kerja Python untuk berfungsi dengan data penjujukan throughput tinggi. Bioinformatik 2015;31:166–9.

68. Love MI, Huber W, Anders S. Anggaran sederhana perubahan lipatan dan serakan untuk data RNA-seq dengan DESeq2. Genome Biol 2014;15:550.

69. Chen EY, Tan CM, Kou Y, Duan Q, Wang Z, Meirelles GV, et al. Enrichr: alat analisis pengayaan senarai gen HTML5 interaktif dan kolaboratif. BMC Bioinf 2013;14:128.

70. Foroutan M, Bhuva DD, Lyu R, Horan K, Cursons J, Davis MJ. Pemarkahan sampel tunggal fenotip molekul. BMC Bioinf 2018;19:404.

71. Pengikat JX, Pletscher-Frankild S, Tsafou K, Stolte C, O'Donoghue SI, Schneider R, et al. KOMPARTMEN: penyatuan dan visualisasi bukti penyetempatan subselular protein. Pangkalan Data (Oxford) 2014;2014:bau012.

72. Rangkaian Penyelidikan Atlas Genom Kanser. Pencirian genomik yang komprehensif dan integratif bagi karsinoma hepatoselular. Sel 2017; 169:1327–41.

73. Colaprico A, Silva TC, Olsen C, Garofano L, Cava C, Garolini D, et al. TCGAbiolinks: pakej R/Bioconductor untuk analisis integratif data TCGA. Asid Nukleik Res 2016;44:e71.

74. Hanzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: analisis variasi set gen untuk data microarray dan RNA-seq. BMC Bioinf 2013;14:7.

75. Bankhead P, Loughrey MB, Fernandez JA, Dombrowski Y, McArt DG, Dunne PD, et al. QuPath: perisian sumber terbuka untuk analisis imej patologi digital. Sci Rep 2017;7:16878.

76. Bernstein NJ, Fong NL, Lam I, Roy MA, Hendrickson DG, Kelley DR. Solo: pengenalan berganda dalam RNA-Seq sel tunggal melalui pembelajaran mendalam separa diselia. Sistem Sel 2020;11:95–101.

77. Satija R, Farrell JA, Gennert D, Schier AF, Regev A. Pembinaan semula spatial data ekspresi gen sel tunggal. Nat Biotechnol 2015;33:495–502.

78. McInnes L, Healy J, Melville J. UMAP: anggaran manifold seragam dan unjuran untuk pengurangan dimensi. arXiv: 1802.03426 [Pracetak]. 2018. Boleh didapati daripada: https://doi.org/10.48550/arXiv.1802.03426.

79. Traag VA, Waltman L, van Eck NJ. Dari Louvain ke Leiden: menjamin komuniti yang mempunyai hubungan baik. Sci Rep 2019;9:5233.

80. Korsunsky I, Millard N, Fan J, Slowikowski K, Zhang F, Wei K, et al. Penyepaduan data sel tunggal yang pantas, sensitif dan tepat dengan Harmony. Kaedah Nat 2019;16:1289–96.