BCAT2 Membentuk Persekitaran Mikro Tumor Tanpa Radang Dan Mendorong Rintangan Terhadap Imunoterapi Anti-PD-1/PD-L1 Dengan Mengawal Selia Kemokin Proinflamasi Dan Kekebalan Antikanser Secara Negatif
Oct 25, 2023
Untuk meningkatkan kadar tindak balas monoterapi sekatan pusat pemeriksaan imun (ICB), adalah perlu untuk mencari sasaran yang muncul dalam terapi kombinasi. Melalui analisis penunjuk berkaitan persekitaran mikro tumor (TME), ia disahkan bahawa BCAT2 membentuk TME yang tidak meradang dalam kanser pundi kencing. Hasil multiomik menunjukkan bahawa BCAT2 mempunyai kesan perencatan terhadap pengambilan limfosit sitotoksik dengan menghalang aktiviti laluan berkaitan sitokin/kemokin proinflamasi dan laluan kemotaksis sel T. Immunoassay mendedahkan bahawa rembesan CD8+kemokin yang berkaitan dengan sel T mengekalkan korelasi negatif yang teguh dengan BCAT2, menghasilkan kecenderungan penurunan CD8+sel T di sekeliling sel tumor BCAT2+ dari jauh ke dekat. Rawatan bersama kekurangan BCAT2 dan antibodi anti-PD-1 mempunyai kesan sinergistik dalam vivo, membayangkan potensi BCAT2 dalam terapi gabungan. Selain itu, nilai BCAT2 dalam meramalkan keberkesanan imunoterapi disahkan dalam pelbagai kohort imunoterapi. Bersama-sama, sebagai molekul utama dalam TME, BCAT2 ialah sasaran yang muncul dalam kombinasi dengan ICB dan biomarker membimbing terapi ketepatan.
Kebaikan cistanche tubulosa-Antitumor
1. Pengenalan
Kanser pundi kencing (BLCA) adalah salah satu keganasan yang paling biasa dalam sistem kencing.[1] Dianggarkan lebih 430,000 pesakit didiagnosis di seluruh dunia setiap tahun.[2] Walaupun rawatan pembedahan radikal, hampir separuh daripada pesakit kanser pundi kencing invasif otot berlaku metastasis.[3] Oleh itu, terapi sistemik memainkan peranan penting dalam kanser pundi kencing peringkat lanjut. Dengan perkembangan imunoterapi, terutamanya sekatan pusat pemeriksaan imun (ICB), bukti terkumpul menunjukkan bahawa ICB mempunyai prestasi cemerlang dalam menghapuskan beban tumor.[4] Walau bagaimanapun, masih terdapat sebilangan besar pesakit yang gagal bertindak balas terhadap monoterapi ICB kerana rintangan utama atau rintangan yang diperolehi.[5] Untuk menyelesaikan keperluan klinikal yang tidak dipenuhi, gabungan terapi rasional lain dengan ICB memberikan pandangan baharu tentang rintangan monoterapi. Persekitaran mikro tumor (TME) ialah sistem yang rumit dan mempunyai kesan yang mendalam terhadap keberkesanan imunoterapi.[6] Dengan tahap penyusupan limfosit T sitotoksik (CTL) yang tidak mencukupi, TME yang tidak meradang dianggap sebagai faktor kritikal dalam kegagalan menjana tindak balas imun antitumor yang kuat semasa imunoterapi.[7] Oleh itu, adalah penting untuk mencari molekul utama yang boleh mengubah suai TME yang tidak meradang menjadi TME yang meradang dan berpotensi untuk menjadi sasaran terapi gabungan. Branched-chain aminotransferase 2 (BCAT2) ialah enzim teras dalam proses metabolisme asid amino sulfur.[8] Li et al. mendapati bahawa BCAT2 adalah penting untuk perkembangan kanser pankreas dengan mengantara katabolisme asid amino rantai bercabang (BCAA).[9] Lee et al. menunjukkan bahawa kekurangan BCAT2 menghalang pertumbuhan tumor adenokarsinoma duktus pankreas (PDAC) dengan mengawal metabolisme lipid.[10] Walaupun terdapat beberapa penyelidikan yang didokumenkan bahawa BCAT2 secara langsung mempengaruhi proses biologi tumor dengan mengawal selia laluan berkaitan metabolik, peranannya dalam mengawal status imun TME tidak pernah diterokai. Dalam kajian kami, melalui analisis komprehensif penunjuk berkaitan TME dalam kohort Xiangya BLCA dan pelbagai kohort BLCA awam, kami menapis bahawa BCAT2 mungkin membentuk TME imunosupresif dalam BLCA. Untuk meneroka mekanisme molekul, kami selanjutnya melakukan penjujukan RNA sel tunggal (siRNA seq) dan bulk-RNA seq, mendedahkan bahawa BCAT2 memainkan peranan yang menindas dalam pengambilan CTL ke dalam TME, dengan menghalang aktiviti laluan isyarat berkaitan sitokin/kemokin dan Laluan isyarat Tcell-chemotaxis. In vitro, multi-immunoassays menunjukkan bahawa rembesan kemokin berkaitan CTL mempunyai korelasi negatif yang stabil dengan ekspresi BCAT2. Menurut analisis panoramik microarray tisu (TMA), kami mendapati hubungan yang saling eksklusif antara CTL dan BCAT{32}} sel tumor dalam pengedaran spatial. Dalam vivo, kesan kerjasama telah didedahkan dalam terapi gabungan kehilangan BCAT2 dan ICB. Lebih penting lagi, peranannya dalam meramalkan kesan kuratif imunoterapi telah disahkan dalam kohort imunoterapi Xiangya BLCA.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
2. Keputusan
2.1. BCAT2 Berkorelasi Negatif dengan Kekebalan Antikanser TME dalam BLCA
Dalam kebanyakan jenis kanser, ekspresi BCAT2 lebih tinggi dalam tisu kanser daripada tisu biasa (Rajah S1A, Maklumat Sokongan) dan corak ekspresinya dalam BLCA telah disahkan dalam Kohort BLCA Xiangya (Rajah S1B, Maklumat Sokongan). Selain itu, BCAT2 dinyatakan secara meluas dalam pelbagai garisan sel kanser (Rajah S1C, Maklumat Sokongan). Selanjutnya, hasil analisis pan-kanser komprehensif pada sistem chemokine, MHC, imunostimulator dan TIIC menunjukkan bahawa BCAT2 mempunyai kesan imunosupresif yang ketara dalam beberapa jenis kanser, termasuk kanser pundi kencing (BLCA), kanser payudara (BRCA), sel papillary buah pinggang buah pinggang. karsinoma (KIRP), adenokarsinoma pankreas (PAAD), sarkoma (SARC) dan karsinoma tiroid (THCA) (Rajah S2A, B, Maklumat Sokongan). Selain itu, korelasi negatif antara BCAT2 dan pusat pemeriksaan imun perencatan biasa (PD- 1, PD-L1, CTLA-4 dan LAG-3) turut ditemui (Rajah S2C–F, Maklumat Sokongan ). Melalui analisis pan-kanser yang komprehensif, kami mendapati bahawa BCAT2 mempunyai kesan imunosupresif yang paling mendalam dalam BLCA. Oleh itu, kami terus meneroka peranan imunologinya dalam BLCA. Berdasarkan nilai ungkapan median BCAT2, kami membahagikan individu kepada kumpulan BCAT2 tinggi dan kumpulan BCAT2 rendah dalam kohort TCGA-BLCA. Jelas sekali, satu siri kemokin, reseptor kemokin, molekul berkaitan MHC, dan imunostimulator telah diturunkan dalam kumpulan BCAT2 tinggi dan terlalu banyak dinyatakan dalam kumpulan BCAT2 rendah (Rajah 1A). Hasil yang sama ditemui dalam kitaran imuniti kanser, yang merangkumi pelbagai langkah penting dalam merekrut dan menyusup sel imun (Rajah 1B). Selain itu, kami menunjukkan hubungan negatif yang teguh antara tahap penyusupan sel imun (CD{32}}sel T, CD{33}}sel T, sel pembunuh alam (NK) dan sel dendritik (DC) dan BCAT2 dalam pelbagai algoritma (Rajah 1C). Begitu juga, ekspresi gen efektor sel imun yang lebih rendah (sel CD8+T, sel NK, Macrophage, sel T helper 1 (Th1) dan sel DC) ditemui dalam kumpulan BCAT2 tinggi berbanding dengan BCAT2 rendah. kumpulan (Rajah 1D). Lebih penting lagi, apabila mengaitkan BCAT2 dengan skor TIS (Rajah S3, Maklumat Sokongan) dan pusat pemeriksaan imun yang menghalang (Rajah 1E), hubungan negatif yang jelas telah didedahkan di antara mereka. Oleh itu, kami membuat spekulasi bahawa BCAT2 mungkin mengawal secara negatif tindak balas imun TME dan menjejaskan keberkesanan imunoterapi secara mendalam. Selain itu, keputusan di atas telah disahkan dengan baik dalam sembilan kohort BLCA bebas (GSE31684, GSE32894, GSE48075, GSE48276, GSE69795, GSE83586, GSE86411, GSE87304 dan GSE128702) (Figures S 128702). Akhirnya, kami mengesahkan perkaitan antara BCAT2 dan TME sekali lagi dalam Kohort BLCA Xiangya. Secara konsisten, ungkapan BCAT2 mempunyai hubungan negatif dengan aktiviti kitaran imuniti kanser, tahap penyusupan TIIC, skor TIS, dan tahap ekspresi pusat pemeriksaan imun (Rajah 2A-C). Secara kolektif, kami mendedahkan bahawa ekspresi tinggi BCAT2 membentuk TME yang tidak meradang dalam BLCA dan ekspresi rendah BCAT2 membentuk TME yang meradang dalam BLCA.
2.2. Meneroka Mekanisme BCAT2 dalam Membentuk TME oleh Pukal RNA-seq dan siRNA-seq
Dalam kohort TCGA-BLCA, DEG antara kumpulan BCAT2 tinggi / rendah, kumpulan skor imun tinggi / rendah, dan kumpulan skor stromal tinggi / rendah telah dikenal pasti dan mengambil persimpangan (Rajah S13A, Maklumat Sokongan). Menariknya, DEG berkaitan positif BCAT2 tidak mempunyai persimpangan dengan DEG berkaitan positif skor imun dan stromal (Rajah 2D). Sementara itu, fenomena yang sama berlaku dalam EG berkaitan negatif di kalangan mereka (Rajah S13B, Maklumat Sokongan). Penemuan ini menunjukkan bahawa BCAT2 mungkin mengawal selia laluan berkaitan imun secara negatif. Secara kebetulan, keputusan analisis GO dan KEGG mendedahkan bahawa BCAT{11}}DEG yang paling ketara diperkaya dalam laluan penghijrahan leukosit, pengaktifan sel T dan interaksi reseptor sitokin-–sitokin (Rajah 2E, F). Oleh itu, kami membuat spekulasi bahawa BCAT2 membentuk TME yang tidak meradang dalam BLCA dengan menghalang aktiviti laluan berkaitan sitokin/kemokin. Walau bagaimanapun, ciri penjujukan NA pukal menentukan hadnya, yang tahap ekspresi gennya dikira dengan nilai min semua sel dalam tisu. Untuk mengatasi batasan, siRNA dilakukan pada tiga sampel BLCA. Lebih daripada 19 000 sel telah dianalisis dan dikelaskan kepada enam kategori: sel epitelium, sel fibroblas, sel T/NK, sel endothelial, sel B dan sel mieloid (Rajah 3A), merujuk kepada biomarker yang diiktiraf (EPCAM, LYZ, CD3D, COL1A1, CD79A, CD19, PECAM1 dan VWF).[11] Secara mengejutkan, BCAT2 terutamanya dinyatakan dalam sel epitelium (EPCAM+), bukannya sel endothelial dan sel imun. Berdasarkan pengumpulan CNV, sel epitelium EPCAM+ dianggap sebagai sel urothelial malignan. Untuk mengesahkan corak ekspresi BCAT2, dua kohort siRNA luaran dimasukkan ke dalam kajian. Dalam kohort scRNA GSE135337, lebih daripada 36,000 sel telah diproses dan dibahagikan kepada lima kelompok, Subjenis sel yang dinyatakan terutamanya BCAT2 masih merupakan sel urothelial pundi kencing yang malignan (Rajah 3B). Corak ungkapan yang sama muncul semula dalam kohort siRNA GSE145137 (Rajah 3C). Oleh itu, corak ekspresi majoriti pada sel malignan menyimpulkan bahawa BCAT2 bertindak sebagai bahagian immunoregulator dalam TME terutamanya melalui ciri-ciri sel kanser yang berbeza-beza. Berdasarkan tahap ekspresi BCAT2, sel urothelial malignan dibahagikan kepada kumpulan BCAT2 tinggi dan kumpulan BCAT2 rendah. Analisis GSEA bagi istilah GO dalam kohort siRNA GSE135337 dan GSE145137 mendedahkan bahawa sekumpulan laluan berkaitan sitokin/kemokin telah dikurangkan dengan ketara dalam kumpulan BCAT2 tinggi, termasuk pengeluaran kemokin, rembesan kemokin, pengawalan laluan isyarat pengantara kemokin, tindak balas kepada kemokin, pengikatan reseptor kemokin, aktiviti sitokin, pengikatan sitokin dan pengikatan reseptor sitokin (Rajah 3D–G; Rajah S14B, Maklumat Sokongan). Sementara itu, kemotaksis leukosit, kemotaksis limfosit, kemotaksis sel T, dan laluan pengawalseliaan mereka mempunyai korelasi negatif yang ketara kepada BCAT2 (Rajah 3E-I; Rajah S14A, Maklumat Sokongan). Analisis GSEA bagi istilah KEGG menunjukkan bahawa laluan interaksi reseptor sitokin-sitokin dan pemprosesan dan pembentangan antigen jelas dikurangkan dalam kumpulan BCAT2 tinggi (Rajah 3F). Bersama-sama, ekspresi tinggi BCAT2 menindas aktiviti sitokin proinflamasi dan laluan berkaitan kemokin, yang membawa kepada penurunan tahap penyusupan TIIC, yang akhirnya membentuk TME yang tidak meradang.
Rajah 1. BCAT2 berkorelasi negatif dengan imuniti antikanser dalam TME BLCA. A) Corak ekspresi kemokin, reseptor kemokin, molekul MHC, dan imunostimulator dalam kumpulan BCAT2 tinggi dan rendah. B) Aktiviti kitaran imuniti kanser dalam kumpulan BCAT2 tinggi dan rendah. Tujuh warna mewakili tujuh langkah dalam kitaran. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. C) Korelasi antara BCAT2 dan pelbagai jenis sel imun (CD{11}}sel T, CD{12}}sel T, sel DC dan sel NK) dalam enam algoritma bebas. D) Corak ekspresi berbilang subjenis sel imun (CD{13}}sel T, sel NK, Makrofaj, sel Th1 dan sel DC) gen efektor berkaitan dalam kumpulan BCAT2 tinggi dan rendah. E) Korelasi antara gen effector berkaitan BCAT2 dan ICB. Nombor dalam bulatan bermaksud pekali korelasi.
Rajah 2. Pengesahan fungsi BCAT2 oleh kohort Xiangya BLCA. A) Korelasi antara kitaran imuniti BCAT2/kanser (kiri) dan BCAT2/TIICs (kanan). Garis pepejal dan bertitik bermaksud hubungan positif dan negatif, ketebalan garisan bermakna pekali korelasi, garisan dengan warna berbeza mewakili nilai p korelasi. B) Korelasi antara gen effector berkaitan BCAT2 dan ICB. C) Korelasi antara gen effector berkaitan skor BCAT2 dan TIS. Nombor dalam bulatan mewakili pekali korelasi. D) Persilangan BCAT2, skor imun dan skor stromal gen berkaitan positif. E,F) 20 laluan isyarat pengayaan teratas analisis GO dan KEGG dalam gen yang berkaitan2-BCAT.
Rajah 3. Meneroka mekanisme BCAT2 dalam membentuk TME dengan pukal RNA-seq dan scRNA-seq. A, B) plot tSNE bagi corak ekspresi sel tunggal BCAT2 dalam kohort Xiangya siRNA dan kohort GSE135337. C) Plot biola corak ekspresi sel tunggal BCAT2 dalam kohort GSE145137. D, E) Analisis GSEA istilah GO menunjukkan aktiviti laluan berkaitan sitokin/kemokin dan laluan berkaitan kemotaksis sel imun antara kumpulan BCAT2 yang berbeza dalam kohort GSE135337. F) Analisis GSEA bagi istilah KEGG menunjukkan aktiviti persembahan antigen dan interaksi laluan reseptor sitokin dan sitokin antara kumpulan BCAT2 yang berbeza dalam kohort GSE145137. G-I) Analisis GSEA bagi istilah GO menunjukkan aktiviti laluan berkaitan sitokin/kemokin, laluan berkaitan kemotaksis sel imun, dan laluan berkaitan penghijrahan sel imun antara kumpulan BCAT2 yang berbeza dalam kohort GSE145137. J, K) Analisis GO dan KEGG bagi DEG antara garisan sel BCAT2 OE dan BCAT2 KD.
2.3. BCAT2 Memvariasikan Corak Ekspresi CD8+Kemokin Berkaitan Sel-T dan Menghalang Kapasiti Sitotoksik CTL
Untuk mengesahkan laluan pengayaan yang disebutkan di atas, garisan sel kanser pundi kencing manusia (T24)/murine (MB49) BCAT2 overexpression (BCAT2 OE) dan BCAT2 knockdown (BCAT2 KD) telah berjaya dibina (Rajah S15A-D, Maklumat Sokongan) dan diuji dengan penjujukan RNA throughput tinggi. Jangkaan, analisis GO bagi garisan sel T24 mendedahkan bahawa DEG telah diperkaya dengan ketara dalam laluan isyarat pengantara kemokin, tindak balas kepada kemokin, migrasi leukosit, dan migrasi leukosit (Rajah 3J). Analisis laluan KEGG bagi garisan sel T24 menunjukkan bahawa laluan isyarat chemokine, laluan interaksi reseptor sitokin--sitokin, dan laluan kanser pundi kencing telah diperkaya dengan ketara (Rajah 3K). Begitu juga, beberapa laluan berkaitan sitokin / kemokin kritikal ditemui dalam analisis GO dan KEGG bagi garisan sel MB49 (Rajah S16A, B, Maklumat Sokongan). Jelas sekali, pelbagai sitokin dan kemokin memainkan peranan penting dalam mengawal TME. Oleh itu, adalah perlu untuk menyaring sitokin/kemokin yang dikawal secara khusus oleh BCAT2. Oleh itu, pelbagai immunoassay ProcartaPlex digunakan untuk mengenal pasti variasi rembesan sitokin/kemokin dalam sel-sel kanser pundi kencing manusia dan tikus. Yang menghairankan, tahap rembesan CCL3, CCL4, CCL5 dan CXCL10 dikawal selia dalam saluran sel KD manusia dan murine2-KD dan dikurangkan dalam talian sel BCAT manusia dan murine2-OE (Rajah 4A, B; Rajah S16C , D, Maklumat Sokongan). Dalam kajian terdahulu, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 dan CXCL10 dianggap sebagai kemokin penting untuk merekrut CD{32}}sel T ke dalam TME.[12] Oleh yang demikian, untuk analisis komprehensif yang lebih baik terhadap8+kemokin berkaitan CD{34}}sel T, kesemuanya disertakan untuk pengesahan selanjutnya. Secara mengejutkan, tahap ekspresi RNA CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, dan CXCL10 telah dikurangkan dengan ketara dalam sel BCAT2 OE dan dikawal dengan ketara dalam sel BCAT2 KD (Rajah 4C). Begitu juga, hasil ELISA menunjukkan bahawa tahap protein yang dirembeskan juga mempunyai korelasi negatif dengan ungkapan BCAT2 (Rajah 4D). Penemuan ini menunjukkan bahawa ekspresi berlebihan BCAT2 menghalang transkriptom dan tahap protein CD{48}}kemokin berkaitan sel T, termasuk CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 dan CXCL10. Lebih penting lagi, ujian chemotaxis mendedahkan bahawa garisan sel BCAT2 OE secara ketara menghalang keupayaan chemotaxis sel CD8+T (Rajah 4E, kiri). Sebaliknya, supernatan sel bagi garisan sel BCAT2 KD mampu menarik lebih banyak sel8+T CD daripada kawalan negatifnya (Rajah 4E, kanan). Penemuan ini menunjukkan bahawa BCAT2 boleh menjejaskan kapasiti kemotaksis sel8+T CD dengan mengawal selia mRNA dan tahap protein kemokin yang berkaitan. Tambahan pula, ujian pembunuhan sel kanser yang dimediasi oleh sel T digunakan untuk meneroka variasi sitotoksisiti sel T selepas hubungan langsung dengan sel tumor yang menyatakan tahap BCAT2 yang berbeza. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4F dan Rajah S17A, B (Maklumat Sokongan), overexpression BCAT2 pada sel tumor secara langsung menindas fungsi sitotoksik sel T dan knockdown BCAT2 pada sel tumor dengan ketara membalikkan kecenderungan. Analisis sitometri aliran sel T yang dikumpul mendapati bahawa perkadaran sel T CD8+TNF-𝛼+ dan sel T CD8+IFN-𝛾+ mempunyai perbezaan yang ketara dalam sistem kultur yang berbeza, yang bermaksud perubahan besar dalam aktiviti CD8+sel T (Rajah 4G; Rajah S17C, D, Maklumat Sokongan). Secara kolektif, BCAT2 mampu menghalang keupayaan pengambilan sel8+T CD dengan mengawal selia tahap kemokin yang berkaitan serta menyekat aktiviti CTL melalui sentuhan langsung. Selain itu, hasil ujian pembunuhan sel kanser yang dimediasi sel T (tanpa kumpulan sel T) boleh membuat kesimpulan bahawa BCAT2 memainkan peranan onkogenik dalam kanser pundi kencing. Oleh itu, ujian koloni plat dan ujian migrasi / pencerobohan transwell digunakan untuk mengesahkan hipotesis ini. Seperti yang dijangkakan, overexpression BCAT2 dengan ketara meningkatkan keupayaan percambahan, penghijrahan, dan pencerobohan sel tumor, dan ketukan BCAT2 dengan ketara menindas tingkah laku ini (Rajah S18A-F, Maklumat Sokongan).
2.4. Pengesahan Hubungan Spatial Eksklusif antara BCAT2+ Tumor Cell dan CD8+T Cell oleh TMA dari Xiangya BLCA Cohort
Mengikut hasil eksperimen pukal RNA-seq, scRNA-seq dan vitro, kami menunjukkan bahawa BCAT2 memainkan peranan imunosupresif dalam BLCA dengan menyekat pengambilan dan sitotoksisiti CD8+sel T. Walau bagaimanapun, interaksi sel tumor BCAT2+ dan sel CD8+T masih tidak diketahui pada peringkat tisu manusia. Dalam kohort Xiangya BLCA, imej perwakilan dan skor keseluruhan IHC mendedahkan korelasi negatif antara BCAT2 dan CD8 (R=−0.38, p=0.0 038) (Rajah 5A, B). Pewarnaan pelbagai warna IF sel tumor BCAT2+ (BCAT2+CK19+) dan2+CD{18}}BCAT sel T telah dijalankan dalam TMA dan dianalisis separa automatik menggunakan Platform pengiraan panoramik TissueFAXS. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5C, skop ungkapan BCAT2 dan CK19 sebahagian besarnya bertindih. Sebaliknya, skop ungkapan BCAT2 dan CD8 adalah berbeza dan berasingan. Perkadaran ekspresi bersama terperinci sel BCAT2+CK19+ dan sel T2+BCAT8+T ialah 87.29% dan 5.09% (Rajah 5D, E), yang konsisten dengan corak ekspresi BCAT2 dalam scRNA-seq. Dalam keseluruhan TMA, masih terdapat perbezaan yang signifikan dalam bahagian ekspresi bersama antara mereka (Rajah S19A, Maklumat Sokongan). Lebih penting lagi, dalam analisis kecerunan jarak berbilang dimensi (0–25, 25–50, 50–100, dan 100–150 μm) di sekitar sel tumor BCAT2+, bilangan sel CD8+T meningkat secara beransur-ansur dari dekat ke jauh (Rajah 5F; Rajah S19B, Maklumat Sokongan). Bersama-sama, kami menunjukkan bahawa pada peringkat tisu manusia, BCAT2 juga dinyatakan terutamanya dalam sel tumor dan sel tumor BCAT2+ mempunyai hubungan ruang eksklusif dengan sel8+T CD.
Kebaikan cistanche tubulosa-Antitumor
2.5. Kehilangan BCAT2 Meningkatkan Keberkesanan Terapi Anti-PD-1
Dengan kesan buruk yang ketara terhadap TME dan korelasi rapat negatif terhadap sekatan pusat pemeriksaan yang menghalang, ia menimbulkan minat yang besar untuk meneroka kesan sinergistik kehilangan BCAT2 dan rawatan anti-PD- 1. Menjelang imunoterapi, model kanser pundi kencing subkutan telah dibina oleh BCAT2 KD dan mengawal garisan sel murine. Kemudian, terapi anti-PD-1 dan terapi kawalan digunakan pada tikus yang membawa tumor (Rajah 6A). Selaras dengan peranan onkogenik dan mekanisme pengawalseliaannya pada kemokin secara in vitro, kekurangan BCAT2 menghalang pertumbuhan tumor dan masa kelangsungan hidup yang berpanjangan dalam vivo, dengan mengawal selia kemokin berkaitan CD8+T (Rajah 6B–E; Rajah S20A, Maklumat Sokongan). Dalam aspek keberkesanan imunoterapi, walaupun monoterapi anti-PD{13}} sebahagiannya boleh mengurangkan beban tumor, rawatan bersama BCAT2 KD dan antibodi monoklonal (mab) anti-PD-1 menunjukkan kesan penindasan tumor yang lebih baik dan memperoleh lebih banyak faedah kelangsungan hidup. Pada hari yang dijadualkan, tumor dituai dan disediakan untuk analisis lanjut. Sebahagian daripadanya telah dicernakan ke dalam penggantungan sel tunggal dan menjalankan analisis sitometri aliran. Dengan populasi leukosit dan sel T yang serupa (Rajah S20B–E, Maklumat Sokongan) dalam tumor, bahagian CD{19}}T sel yang lebih tinggi ditunjukkan dalam kumpulan kekurangan BCAT2 berbanding kumpulan kawalan negatif. Begitu juga, kumpulan terapi gabungan mempunyai penyusupan CTL yang lebih besar daripada kumpulan monoterapi (Rajah 6F-H). Lebih penting lagi, penunjuk sitotoksisiti (GZMB, IFN-𝛾, TNF-𝛼, dan Perforin) CTL juga diperkukuh dalam tumor murine dengan kehilangan BCAT2 dan rawatan gabungan berbanding kawalan yang sepadan (Rajah 6G, I-L). Bahagian tumor yang lain dibuat menjadi bahagian beku dan dilaksanakan pewarnaan JIKA. Seperti yang dijangkakan, ketumpatan sel CD8+T dalam kawasan minat (ROI) menunjukkan kecenderungan yang sama dengan analisis sitometri aliran (Rajah 6M, N). Penemuan ini menunjukkan bahawa kekurangan BCAT2 pada sel tumor boleh membentuk TME yang meradang dan mempunyai keberkesanan yang hebat dengan rawatan imunoterapi. Untuk mengetahui peranan CD8+sel T dalam kesan sinergistik rawatan bersama, CD8𝛼 mab digunakan untuk menentangnya dalam tikus yang cekap imun (Rajah S21A, Maklumat Sokongan) dan mengesahkan kesan penipisannya dengan sitometri aliran dan IF (Rajah S21B, C, Maklumat Sokongan). Jelas sekali, selepas penyusutan, beban tumor dan masa kelangsungan hidup telah diterbalikkan dengan ketara (Rajah S21D-G, Maklumat Sokongan). Penemuan ini menunjukkan bahawa sel CD{35}}T memainkan peranan yang amat diperlukan dalam kesan sinergi terapi gabungan.
Rajah 4. BCAT2 mengubah corak ekspresi CD8+kemokin berkaitan sel T dan menghalang kapasiti sitotoksik CTL. A, B) Peta haba ProcartaPlex berbilang immunoassays memaparkan variasi rembesan sitokin dan kemokin biasa dalam BCAT2 OE, BCAT2 KD dan kumpulan kawalan negatif (n=3 setiap kumpulan). C,D) Histogram menunjukkan tahap ekspresi mRNA yang dinormalisasi dan kepekatan rembesan protein CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 dan CXCL10 dalam BCAT2 OE (kiri), BCAT2 KD (kanan) dan kumpulan kawalan negatif (n {{ 15}} setiap kumpulan). *p < 0.{{20}}}5; **p < 0.01; ***p < 0.001. E) Ujian kemotaksis menunjukkan keupayaan kemotaksis berbeza CTL dalam BCAT2 OE, BCAT2 KD dan kumpulan kawalan negatif (n=3 setiap kumpulan). *p < 0.05; **p < 0.01. F) Ujian pembunuhan sel kanser pengantaraan sel T menunjukkan kebolehan membunuh sel T yang berbeza yang dikultur dengan BCAT2 OE, BCAT2 KD dan garisan sel kawalan negatif (n=3 setiap kumpulan). G) Analisis sitometri aliran menunjukkan aktiviti berbeza CD8+sel T dalam kumpulan kultur berbeza (n=3 setiap kumpulan).
Rajah 5. Pengesahan hubungan spatial eksklusif sel tumor BCAT2+ dan sel8+T CD oleh TMA kohort Xiangya BLCA. A) Imej IHC BCAT2 dan CD8 dalam jenis TME yang meradang dan tidak meradang. Bar skala: 50 μm. B) Korelasi antara BCAT2 dan CD8 berdasarkan skor IHC mereka dalam keseluruhan TMA. C) Imej JIKA pelbagai warna bagi BCAT2, CK19, CD8 dan indeks gabungan dalam jenis TME yang meradang dan tidak meradang. Sel BCAT2+ (merah jambu), sel CK19+ (cyan), sel8+T CD (oren) dan nukleus sel (biru). Bar skala: 50 μm. D,E) Kadar ekspresi bersama terperinci sel BCAT2+CK19+ dan BCAT2+CD8+ dalam sampel biasa. F) Analisis kecerunan jarak (0–25, 25–50, 50–100 dan 100–150 μm) CD8+sel T sekitar sel BCAT2+CK19+ dalam sel biasa sampel.
Rajah 6. Kehilangan BCAT2 meningkatkan keberkesanan terapi anti-PD-1. A) Gambarajah alir pelan rawatan. B) Tumor yang dituai daripada rejimen terapi yang berbeza (n=5 setiap kumpulan). C–E) Kuantifikasi isipadu tumor, berat badan dan masa hidup dalam rejimen terapi yang berbeza (n=5 setiap kumpulan). ns: tiada kepentingan; *hlm< 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. F) Contour plots indicate the proportion of CD8+T cells; G) proportions of GZMB+CD8+T cells, IFN-𝛾+CD8+T cells, TNF- 𝛼+CD8+T cells, and Perforin+CD8+T cells in different therapy regimens. H) Quantified scatter plots exhibit proportion of CD8+T cells; I–L) proportions of GZMB+ CD8+T cells, IFN-𝛾+ CD8+T cells, TNF-𝛼+ CD8+T cells, and Perforin+ CD8+T cells in different therapy regimens (n = 5 per group). ns: no significance; *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. M, N) IF image and quantified histogram show densities of CD8+T cells in different therapy regimens (n = 3 per group). Scale bar: 20 μm. CD8+T cell (green) and cell nucleus (blue). ns: no significance, *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.
Tambahan pula, di samping sel tumor, sebahagian kecil BCAT2 juga dinyatakan dalam sel8+T CD. Oleh itu, kami terus meneroka sama ada tahap ekspresi berbeza BCAT2 pada CD8+sel T boleh menjejaskan aktivitinya. Selepas mengotorkan penggantungan sel tunggal limpa murine dengan antibodi pendarfluor berkaitan BCAT2 dan sel T, kami membandingkan perkadaran sel CD8+ TNF-𝛼+T dan CD8+ IFN-𝛾+T antara BCAT Kumpulan 2+CD8+ dan BCAT2−CD8+. Menariknya, kami mendapati bahawa perkadaran adalah serupa antara kedua-dua kumpulan, mendedahkan bahawa aktiviti CD{17}}sel T adalah bebas daripada tahap ekspresi BCAT2 (Rajah S22A–C, Maklumat Sokongan).
2.6. BCAT2 Meramalkan Respons terhadap Imunoterapi dalam Beberapa Kohort Imunoterapi Dunia Sebenar
Penemuan di atas telah menunjukkan peranan imunosupresif BCAT2 dalam TME dan kesan sinergik menggabungkan kehilangan BCAT2 dengan terapi anti-PD-1. Walau bagaimanapun, potensi ramalannya mengenai keberkesanan imunoterapi tidak jelas. Oleh itu, dalam kohort TCGA-BLCA, skor pengayaan laluan berkaitan imunoterapi dibandingkan antara kumpulan BCAT2 tinggi dan rendah. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah S23A (Maklumat Sokongan), kumpulan BCAT2 rendah mempunyai gen yang lebih aktif dalam laluan berkaitan imunoterapi, yang boleh membuat kesimpulan bahawa ekspresi rendah BCAT2 mewakili keadaan yang lebih sensitif terhadap imunoterapi. Untuk pengesahan lanjut, 58 pesakit kanser pundi kencing invasif otot (MIBC) yang menerima terapi anti-PD{15}} neoadjuvant di hospital kami telah dimasukkan dalam kohort imunoterapi Xiangya BLCA. Imej perwakilan IHC, IF, dan CT bagi responden dan bukan responden menunjukkan bahawa tahap ekspresi BCAT2 mempunyai kaitan rapat dengan keberkesanan imunoterapi-individu yang mempunyai tahap ekspresi BCAT2 yang rendah lebih berkemungkinan untuk bertindak balas terhadap imunoterapi daripada individu dengan tahap ekspresi BCAT2 yang tinggi (Rajah 7A–C). Selain itu, skor IHC bagi kohort imunoterapi Xiangya BLCA dan matriks ekspresi mRNA bagi kohort IMvigor210 menunjukkan korelasi negatif yang teguh antara BCAT2 dan PD-L1 (R=−{{3{{32} }}}.4, p=0.002; R=−0.41, p < 0.001) (Rajah S23B, C, Maklumat Sokongan). Oleh itu, kami secara langsung membandingkan keberkesanan imunoterapi antara kumpulan BCAT2 tinggi dan rendah dalam kohort imunoterapi BLCA Xiangya dan mendapati bahawa kumpulan BCAT2 rendah mempunyai bahagian responden yang jauh lebih tinggi daripada kumpulan BCAT2 tinggi (p=0.001) (Rajah 7D). Selain itu, kami menilai nilai ramalan BCAT2, PD-L1 dan indeks gabungan (BCAT2+PD-L1) pada tindak balas patologi terhadap imunoterapi dan mendapati prestasi hebat indeks gabungan (BCAT2+PD- L1) pada ketepatan ramalan (Rajah 7E). Secara inspiratif, dalam aspek hasil kelangsungan hidup, kumpulan BCAT2 yang rendah mempunyai survival bebas penyakit (DFS) yang lebih lama daripada kumpulan BCAT2 yang tinggi (p=0.032) (Rajah 7F), menunjukkan nilai prognosis BCAT2 dalam Imunoterapi BLCA. Dalam klinikal, individu dengan TME padang pasir lebih berkemungkinan mempunyai keberkesanan imunoterapi yang terhad berbanding individu dengan TME yang meradang, seterusnya menyerlahkan kepentingan penunjuk ramalan. Akibatnya, kami memilih semua individu dengan TME padang pasir dalam kohort IMvigor210 dan menjalankan penilaian komprehensif. Dalam perbandingan langsung tahap ekspresi BCAT2 antara kumpulan tindak balas yang berbeza, kumpulan CR (responder) mempunyai tahap ekspresi BCAT2 yang jauh lebih rendah daripada kumpulan SD dan PD (bukan responder) (Rajah 7G). Lebih penting lagi, indeks gabungan (BCAT2+PD-L1) juga mempunyai prestasi hebat pada ketepatan ramalan (Rajah 7H). Walaupun tidak terdapat perbezaan yang signifikan dalam keseluruhan survival (OS) antara kumpulan BCAT2 tinggi dan rendah dalam kohort jenis IMvigor210 padang pasir, kecenderungan prognosis masih serupa dengan hasil kohort imunoterapi Xiangya BLCA (Rajah 7I). Selain daripada PD-L1, ketidakstabilan mikrosatelit (MSI) adalah peramal penting lain bagi keberkesanan imunoterapi. Status pembaikan tidak sepadan (MMR)—MMR (pMMR) mahir dan MMR kekurangan (dMMR) mengekalkan pematuhan tinggi dengan MSI (MSI-L) frekuensi rendah dan MSI frekuensi tinggi (MSI-H).[13] Oleh itu, kami menjalankan penilaian menyeluruh terhadap semua individu dalam kohort imunoterapi Xiangya BLCA berdasarkan hasil pewarnaan empat gen penanda MMR (MLH1, MSH2, MSH6, dan PMS2). Hasilnya menunjukkan bahagian dMMR (MSI-H) yang jauh lebih tinggi dalam kumpulan BCAT2 rendah berbanding kumpulan BCAT2 tinggi (p=0.02) (Rajah S23D, E, Maklumat Sokongan). Selain itu, kami menilai nilai ramalan MMR, BCAT2, dan indeks gabungan (MMR+BCAT2) pada keberkesanan imunoterapi dan mendapati indeks gabungan (MMR+BCAT2) mempunyai prestasi yang layak pada ketepatan ramalan (Rajah S23F, Maklumat Sokongan). Bersama-sama, penemuan ini menunjukkan bahawa BCAT2 layak untuk bertindak sebagai peramal pelengkap keberkesanan imunoterapi BLCA. Akhirnya, nilai ramalan BCAT2 sebagai tindak balas kepada imunoterapi telah diterokai dalam pelbagai jenis kanser. Kami mendapati bahawa individu yang mempunyai ekspresi tinggi BCAT2 menunjukkan kadar tindak balas yang jauh lebih lemah (p=0.04) dalam kohort GSE35640 (melanoma) (Rajah 7J). Walaupun tidak terdapat perbezaan ketara dalam kadar tindak balas antara kumpulan BCAT2 tinggi dan rendah dalam GSE173839 (kanser payudara), GSE135222 (NSCLC), dan kohort Gide 2019 (melanoma), pesakit dengan ekspresi rendah BCAT2 masih lebih berkemungkinan mendapat tindak balas positif kepada imunoterapi (Rajah 7K–M).
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity
【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2.7. Nilai BCAT2 dalam Peramalan Subjenis Molekul dan Terapi Ketepatan Membimbing
Dengan heterogeniti yang besar yang wujud dalam klasifikasi histologi tradisional, peningkatan bukti menunjukkan bahawa subjenis molekul mampu memberikan pengelasan yang lebih tepat berdasarkan profil transkrip dalam BLCA.[14] Tambahan pula, dengan ciri imunologi yang serupa dalam subjenis yang sama, klasifikasi molekul mempunyai potensi besar untuk meramalkan TME dan membimbing terapi ketepatan dalam klinikal.[15] Melalui analisis komprehensif sistem subjenis molekul yang berbeza dalam kohort TCGA-BLCA, kami mendapati bahawa individu dengan ekspresi rendah BCAT2 lebih berkemungkinan diklasifikasikan ke dalam subtipe basal, disertai dengan laluan diaktifkan pembezaan basal, pembezaan EMT, pembezaan imun, tindak balas interferon, dan sebagainya. Individu yang mempunyai ekspresi tinggi BCAT2 terutamanya dikelaskan kepada subtipe luminal, disertai dengan laluan aktif pembezaan luminal, pembezaan urothelial, dan Ta (Rajah S24A, Maklumat Sokongan). Menurut konsensus subjenis molekul, subjenis basal mempunyai lebih banyak tahap penyusupan limfosit efektor dan laluan isyarat IFN-𝛾 yang lebih aktif daripada subjenis luminal,[16] yang membayangkan keberkesanan imunoterapi yang lebih baik. Kemudian, AUC digunakan untuk menilai ketepatan ramalan. Hebatnya, kecuali sistem subjenis Baylor (AUC=0.76), kebanyakan AUC melebihi 0.90 dalam sistem lain (Rajah S24B, Maklumat Sokongan), yang bermaksud ketepatan ramalan BCAT2 yang mantap dalam subjenis molekul. Untuk meneroka lebih lanjut peranannya dalam meramalkan keberkesanan terapi lain, kami membandingkan aktiviti terapi sasaran reseptor faktor pertumbuhan epidermis (EGFR) dan laluan berkaitan radioterapi antara kumpulan BCAT2 tinggi dan rendah. Dengan aktiviti terkawal yang jelas, pesakit dalam kumpulan BCAT2 rendah lebih berkemungkinan mempunyai tindak balas positif terhadap terapi dan radioterapi sasaran EGFR (Rajah S24C, Maklumat Sokongan). Untuk meningkatkan kebolehpercayaan ramalan pada subjenis molekul dan sensitiviti rawatan, lapan kohort BLCA (Xiangya BLCA kohort, GSE31684, GSE69795, GSE48075, GSE128702, GSE83586, GSE52329 dan E-BLMTAB) {28}0}Imunoterapi{28}0}Kohorvigori{28}0} dipohon untuk pengesahan luaran. Bersama dengan ketepatan ramalan yang sangat baik, penemuan serupa ditemui dalam kohort ini (Rajah S25-S27, Maklumat Sokongan). Penyakit hiperprogresif (HPD) adalah keadaan yang sangat tidak sensitif terhadap imunoterapi. Untuk meneroka pengaruh BCAT2 pada HPD, biomarker berkaitan HPD telah dikumpulkan daripada kajian terdahulu [17] dan CNV biomarker dibandingkan antara kumpulan BCAT2 rendah dan tinggi. Kecuali untuk EGFR, kadar penguatan CNV bagi biomarker berkaitan HPD-positif lain (simbol merah) adalah lebih tinggi dalam kumpulan BCAT2 tinggi, terutamanya MDM2 (p=0.0116). Kadar pemadaman CNV biomarker berkaitan HPD-negatif (simbol hijau) adalah lebih rendah dalam kumpulan BCAT2 tinggi (Rajah S24D, Maklumat Sokongan). Hasilnya menunjukkan bahawa pesakit dengan ekspresi tinggi BCAT2 mempunyai potensi risiko HPD semasa imunoterapi. Kemoterapi neoadjuvant (NAC) ialah terapi penting dalam BLCA. Maklum balas ramalan penanda kepada NAC dalam BLCA telah dikumpul daripada semakan Buttigliero et al.[18] dan kadar mutasi mereka dibandingkan antara kedua-dua kumpulan. Berdasarkan kadar mutasi keseluruhan biomarker yang lebih tinggi dan mutasi RB1 yang lebih kerap dalam kumpulan BCAT2 rendah, kami membuat spekulasi bahawa individu dengan ekspresi rendah BCAT2 mempunyai keberkesanan NAC yang lebih baik dalam klinikal (Rajah S24E, Maklumat Sokongan). Oleh itu, pangkalan data Drugbank telah digunakan untuk membandingkan keberkesanan beberapa rejimen kemoterapi biasa antara dua kumpulan dan mendapati bahawa individu yang mempunyai ekspresi rendah BCAT2 lebih cenderung untuk bertindak balas terhadap kemoterapi. Di samping itu, kumpulan BCAT2 rendah juga menunjukkan keberkesanan yang lebih baik dalam rejimen biasa imunoterapi dan terapi ERBB. Tanpa diduga, pesakit dengan ekspresi tinggi BCAT2 mungkin mendapat kesan kuratif yang lebih baik dalam terapi antiangiogenik (Rajah S24F, Maklumat Sokongan). Secara kolektif, individu dengan ekspresi rendah BCAT2 tergolong dalam subjenis molekul yang meradang, subjenis basal, yang bermaksud tindak balas yang lebih positif terhadap imunoterapi, kemoterapi, radioterapi, terapi sasaran EGFR dan terapi ERBB. Malangnya, pesakit dengan ekspresi tinggi BCAT2 mempunyai tindak balas yang lemah terhadap rawatan ini. Walau bagaimanapun, terapi antiangiogenik mungkin merupakan sinaran cahaya kepada mereka.
Rajah 7. BCAT2 meramalkan tindak balas kepada imunoterapi dalam beberapa kohort imunoterapi dunia sebenar. A) Imej IHC BCAT2 dan PD-L1 antara responden dan bukan responden dalam kohort imunoterapi Xiangya BLCA. Bar skala: 50 μm. B) Imej pelbagai warna JIKA BCAT2 dan PD-L1 antara responden dan bukan responden dalam kohort imunoterapi Xiangya BLCA. Bar skala: 50 μm. Sel BCAT2+(hijau), sel PD-L1+(kuning) dan nukleus sel (biru). C) Imej CT perbezaan keberkesanan imunoterapi antara individu yang mempunyai tahap ekspresi tinggi dan rendah BCAT2. Anak panah merah menunjuk ke kawasan tumor. D) Perbezaan keseluruhan dalam kadar tindak balas antara kumpulan BCAT2 tinggi dan rendah dalam kohort imunoterapi Xiangya BLCA. E) Ketepatan ramalan BCAT2, PD-L1 dan indeks gabungan (BCAT2+PD-L1) mengenai tindak balas kepada imunoterapi dalam kohort imunoterapi Xiangya BLCA. F) Perbezaan dalam survival bebas penyakit (DFS) antara kumpulan BCAT2 tinggi dan rendah dalam kohort imunoterapi BLCA Xiangya. G) Perbezaan dalam tahap ekspresi BCAT2 antara kumpulan CR, PR, SD dan PD dalam kohort jenis IMvigor210 padang pasir. *p < 0.05; ns: tidak penting. H) Ketepatan ramalan BCAT2, PD-L1 dan indeks gabungan (BCAT2+PD-L1) mengenai tindak balas kepada imunoterapi dalam kohort IMvigor210 jenis padang pasir. I) Perbezaan dalam survival keseluruhan (OS) antara kumpulan BCAT2 tinggi dan rendah dalam kohort IMvigor210 jenis padang pasir. J–M) Perbezaan dalam tindak balas kepada imunoterapi antara kumpulan BCAT2 tinggi dan rendah dalam kohort GSE35640, GSE173839, GSE135222 dan Gide2019.
3. Perbincangan
Sebagai enzim utama dalam proses katabolisme BCAA, penyelidikan terdahulu tertumpu terutamanya pada peranan berkaitan metabolik BCAT2 dalam penyakit, seperti obesiti, diabetes, dan aritmia. Ma et al. menunjukkan bahawa menyingkirkan BCAT2 dalam tisu adipos boleh mempercepatkan peperangan adiposa dan termogenesis, yang membawa kepada pengurangan kadar obesiti pada tikus.[19] Melalui pengesanan sampel darah lebih daripada 2000 individu, Gerszten et al. menggambarkan profil metabolit berkaitan diabetes dan mendapati bahawa BCAT2-transformasi BCAA memainkan peranan penting dalam perkembangan penyakit.[20] Portero et al. mendedahkan bahawa mutasi karut BCAT2p.Q300*/p.Q300* mengakibatkan peningkatan tahap BCAA dan menyebabkan aritmia pada tikus.[21] Baru-baru ini, beberapa kajian mendapati bahawa BCAT2 mempunyai hubungan rapat dengan kanser. Lei et al. mendedahkan bahawa degradasi pengantara asetilasi BCAT2 boleh melambatkan perkembangan adenokarsinoma duktus pankreas (PDAC) dengan menurunkan kadar metabolisme BCAA.[22] Wang et al. menganggap bahawa tahap transkripsi terkawal BCAT2 membawa kepada penurunan tahap glutamat intraselular, yang merangsang ferroptosis sel hepatoma.[23] Walau bagaimanapun, semua penyelidikan sedia ada menekankan pengaruh BCAT2-pengantara katabolisme BCAA pada proses biologi kanser dan bukannya meneroka mekanisme yang serba baharu. Dalam kajian ini, kami mendedahkan peranan imunosupresif BCAT2 dalam TME buat kali pertama. Penggunaan imunoterapi memperhalusi semula rawatan kanser, dengan kualiti hidup yang hebat dan masa hidup yang berpanjangan. Walau bagaimanapun, disebabkan kepelbagaian sistem ekologi imun tumor, hanya sebahagian daripada individu yang mendapat keberkesanan yang memuaskan. TME ialah sistem yang rumit, terdiri daripada sel tumor, sel imun, sel stroma, dan kapilari.[24] Mengikut tahap penyusupan CTL, TME boleh dikelaskan kepada jenis yang meradang dan tidak meradang secara umum.[25] Bukti yang semakin meningkat menunjukkan bahawa TME yang meradang memainkan peranan positif dalam menimbulkan tindak balas imun antitumor yang berkesan semasa terapi.[26] Oleh itu, kami secara komprehensif menganalisis pelbagai penunjuk berkaitan TME dan mendapati bahawa ekspresi tinggi BCAT2 membentuk TME yang tidak meradang, dengan kitaran imuniti kanser yang terhalang, corak ekspresi menindas profil chemokine, molekul MHC, dan tahap penyusupan TIIC yang tidak mencukupi. Di samping itu, BCAT2 berkaitan secara negatif dengan TIS dan gen effector ICB, yang membayangkan bahawa individu yang mempunyai ekspresi tinggi BCAT2 lebih berkemungkinan tidak bertindak balas terhadap imunoterapi. Untuk mengesahkan hipotesis kami, kami membandingkan kadar tindak balas antara kumpulan BCAT2 tinggi dan rendah dalam kohort imunoterapi Xiangya BLCA dan kohort imunoterapi lain. Yang menghairankan, terdapat perbezaan yang ketara dalam pelbagai kohort, yang menunjukkan bahawa BCAT2 juga mampu memainkan peramal keberkesanan imunoterapi, terutamanya dalam BLCA. Tambahan pula, scRNA-seq digunakan untuk meneroka mekanisme pengawalseliaan BCAT2 dalam TME dan menunjukkan bahawa aktiviti laluan isyarat berkaitan sitokin/kemokin, laluan isyarat chemotaxis sel T, dan laluan isyarat migrasi sel T mempunyai korelasi negatif yang ketara dengan BCAT2. Sebagai rangkaian pengawalseliaan kritikal, sitokin dan kemokin amat diperlukan untuk memperdagangkan pelbagai sel imun ke dalam TME. Sistem kemokin mempunyai empat superfamili: C, CC, CXC, dan CX3C, dengan redundansi yang besar dalam gandingan ligan dan reseptor.[27] Sitokin boleh dibahagikan kepada subfamili Th1, Th2, dan Th17 berdasarkan fungsi biologinya.[28] Melalui rembesan tahap yang berbeza daripada mereka, pergelutan antara sel tumor dan sel imun sudah cukup untuk memprogram semula ciri-ciri TME.[29] Walau bagaimanapun, antara sebahagian besar sitokin dan kemokin, adalah diperlukan untuk menyaring kelompok yang paling berharga. Menggunakan 34-panel immunoassay sitokin dan chemokine, kami mendedahkan bahawa kemokin termasuk CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 dan CXCL10, berkorelasi secara negatif dengan ekspresi BCAT2 dalam sel kanser pundi kencing manusia dan murine. Umum mengetahui bahawa CXCL9 dan CXCL10 bertanggungjawab untuk merekrut sel8+T CD ke dalam TME.[30] Untuk memastikan fungsi CCL3, CCL4 dan CCL5, kami mencari penyelidikan terdahulu. Harlin et al. menggunakan tatasusunan protein dan qPCR untuk mendedahkan bahawa pengawalseliaan CCL3, CCL4 dan CCL5 mampu menggalakkan penghijrahan sel8+T CD ke dalam melanoma.[31] Noman et al. mendapati bahawa peningkatan populasi rembesan CCL5 membantu dalam mewujudkan TME proinflamasi dengan memperdagangkan CTL ke dalam tisu kanser kolorektal.[32] Melalui IHC dan RNA-seq profil chemokine dalam pelbagai kohort, Romero et al. menunjukkan bahawa CCL4 dan CCL5 mempunyai perkaitan yang kuat dengan tahap penyusupan sel CD8+T dalam kanser pankreas.[33] Oleh itu, kami menganggap bahawa kemokin berkaitan CD8+T adalah kemokin utama yang dikawal oleh BCAT2 dalam kanser pundi kencing. Walaupun kami menunjukkan korelasi negatif yang teguh antara BCAT2 dan CD{72}}kemokin berkaitan sel T, mekanisme pengawalseliaan yang mendasari antara mereka masih perlu diterokai dengan lebih lanjut. Kajian Peterson et al. menunjukkan bahawa pengaktifan laluan isyarat MAP kinase (MAPK) boleh mendorong pengeluaran CX3CL1.[34] Xu et al. mendedahkan bahawa laluan isyarat JAK-STAT mengawal rembesan kemokin Th1-yang menyebabkan penurunan tahap penyusupan TIL.[35] Baru-baru ini, Peng et al. mendapati bahawa demethylase JMJD3 boleh menghalang ekspresi CD4+kemokin berkaitan Tsel dan mengurangkan tahap penyusupan sel T sitotoksisiti dalam TME, yang mewakili peranan penting pengubahsuaian epigenetik dalam mengawal selia ekspresi chemokine.[36] Mayo et al. turut mendedahkan bahawa perencat epigenetik, histon deacetylase 1, mempunyai kapasiti yang besar untuk menyekat ekspresi CXCL8 melalui pengaktifan laluan isyarat faktor nuklear-𝜅B (NF-𝜅B).[37] Selain itu, sebagai simbol metabolisme sel tumor, glikolisis aerobik dan spesies oksigen reaktif (ROS), menunjukkan prestasi hebat dalam mendorong ekspresi CXCL8 dan CXCL14 dengan meningkatkan aktiviti laluan isyarat NF-𝜅B dan protein pengaktif faktor transkripsi 1 (AP{{93 }}).[38] Menariknya, dalam kajian kami, laluan isyarat NF-𝜅B, STAT, dan MAPK telah diperkaya dengan ketara antara garisan sel BCAT2 tinggi dan rendah (Rajah 3K; Rajah S16A, B, Maklumat Sokongan). Oleh itu, menggabungkan dengan kajian di atas, kami akan meneroka lebih lanjut molekul utama dalam mekanisme pengawalseliaan BCAT2 dan kemokin berkaitan CD{100}}T. Kadar tindak balas objektif terhad monoterapi dengan ICB mendorong kemunculan strategi terapi gabungan. Untuk menukar TME bukan imunologi kepada TME imunologi, Wolchok et al. menggunakan rawatan bersama nivolumab (terapi anti-PD{103}}) dan ipilimumab (terapi anti-CTLA{105}}) pada pesakit melanoma dan mendapati kesan penyembuhan yang menggalakkan, merujuk kepada penyebuan, pengaktifan dan pembunuhan CTL yang dipertingkatkan secara serentak .[39] Lebih daripada menggabungkan dengan jenis ICB lain, kemoterapi ditambah imunoterapi adalah pilihan terapi alternatif. Sebagai rejimen rawatan barisan pertama untuk karsinoma urothelial lanjutan, beberapa kajian mendapati bahawa kemoterapi berasaskan cisplatin mampu membentuk TME proinflamasi dengan meningkatkan tahap ekspresi kelas MHC I pada sel dendritik dan merosakkan MDSC dan Treg.[40] Secara kebetulan, Homma et al. mendedahkan bahawa satu lagi ubat kemoterapi biasa untuk kanser pundi kencing— gemcitabine—boleh meningkatkan kuantiti penyusupan CD{110}}sel T dan menjejaskan sel imun imunosupresif dalam TME.[41] Dalam eksperimen haiwan praklinikal kami, rawatan bersama kehilangan BCAT2 dan mab anti-PD{114}} menunjukkan keberkesanan antitumor yang lebih jelas berbanding dengan monoterapi mab anti-PD-1 dalam tikus kompeten imun, yang menyediakan rawatan yang inovatif strategi untuk pesakit rintangan ICB. Sementara itu, melalui analisis sitometri aliran dan IF, kami menunjukkan bahawa pemusnahan BCAT2 bukan sahaja merekrut lebih banyak populasi CTL ke dalam TME tetapi juga meningkatkan aktiviti pembunuhan CTL. Begitu juga, Peng et al. mendapati bahawa ekspresi berlebihan LGALS2 mengurangkan kuantiti CTL yang menyusup serta biomarker sitotoksik dalam tikus yang mengandungi kanser payudara.[42] Yang et al. menggambarkan bahawa CXCL13 mampu meningkatkan tindak balas terhadap imunoterapi dalam model tetikus kanser ovari dengan meningkatkan tahap penyusupan CD{123}}sel T dan tahap rembesan GZMB, IFN-𝛾 dan IL-2.[43] Mengiringi tindak balas antikanser yang lebih kuat, terapi kombinasi mengganggu lagi gelung maklum balas imun sedia ada, yang mungkin membawa kepada kesan sampingan yang teruk. Mengikut corak ekspresi BCAT2 pada tahap siRNA, secara khusus dinyatakan dalam sel tumor dan bukannya dalam sel imun dan sel endothelial, kita boleh membuat kesimpulan awal bahawa kehilangan BCAT2 atau perencat BCAT2 kurang berkemungkinan mengakibatkan kesan buruk yang dahsyat. Walau bagaimanapun, dos optimum dan masa selang perencat BCAT2 dan anti-PD{132}} mab dalam terapi gabungan masih perlu diterokai.
Untuk membimbing terapi ketepatan dalam individu, kami mengaitkan BCAT2 kepada subjenis molekul BLCA dan biomarker kritikal pelbagai terapi. Berdasarkan ramalan yang boleh dipercayai dalam pelbagai kohort, kami mendapati bahawa imunoterapi, kemoterapi, radioterapi dan terapi sasaran EFGR sesuai untuk pesakit yang mempunyai ekspresi rendah BCAT2. Terapi antiangiogenik disyorkan untuk pesakit dengan ekspresi tinggi BCAT2. Berbeza daripada proses pengesanan rumit subjenis molekul, BCAT2 ialah peramal mudah alih untuk terapi ketepatan. Tidak dapat tidak, terdapat beberapa batasan dalam kajian kami. Pertama, saiz sampel dan masa susulan kohort Xiangya BLCA dan kohort imunoterapi Xiangya BLCA adalah terhad. Kita perlu memperbesarkan lagi saiz sampel dan meneruskan tindakan susulan yang standard. Kedua, sebagai kohort dunia sebenar, kohort imunoterapi Xiangya BLCA mengandungi pilihan pembedahan yang berbeza yang mungkin menyebabkan kecenderungan yang berpotensi. Kami akan memperbesarkan kohort kami dan menjalankan analisis subkumpulan berdasarkan pilihan pembedahan yang sama. Ketiga, kesan kerjasama terapi kombinasi dalam vivo perlu disahkan lagi menggunakan aplikasi sistem perencat BCAT2. Ringkasnya, sebagai peranan imunosupresif dalam TME BLCA, BCAT2 ialah sasaran yang muncul dalam terapi gabungan ICB dan biomarker tepat terapi ketepatan.
Kebaikan cistanche tubulosa-menguatkan sistem imun
4. Bahagian Eksperimen
cohort: As illustrated in a previous study,[44] 56 eligible BLCA patients accepted surgical treatment (TURBT (transurethral resection of bladder tumor) or radical cystectomy) in Xiangya Hospital. All the samples were conducted through high throughput RNA sequencing (RNA-seq) to acquire transcriptome information. Then, data on RNA-seq, clinicopathologic features, and follow-up information of these patients were utilized to construct the Xiangya BLCA cohort (Table S1, Supporting Information). Xiangya BLCA immunotherapy cohort: 58 MIBC patients were included in the Xiangya BLCA immunotherapy cohort. All the samples were obtained by diagnostic TURBT before the implementation of neoadjuvant anti-PD-1 therapy. After at least two cycles standard neoadjuvant immunotherapy (NAI), TURBT, or radical cystectomy (RC) were conducted based on treatment response and patients' willingness. 17 individuals with complete response (CR) and 16 individuals with partial response (PR) were classified into responders, 17 individuals with stable disease (SD), and 8 individuals with progressive disease (PD) were classified into nonresponders. The detailed clinicopathological characteristics are listed in Table S2 (Supporting Information). Xiangya scRNA cohort: Three samples of muscle-invasive bladder cancer were implemented scRNA-seq, constituting the Xiangya scRNA cohort. Detailed preparation of single-cell suspension, data transformation, and cell quality control have been elaborated in previous articles.[45] In simple terms, three tumor samples were loaded on a Chromium Single Cell Controller instrument (10×Genomics, USA) to produce single-cell gel beads in suspension. Seurat R package was applied to transform the count matrix into Seurat format. Four standards were set up for excluding low-quality cells in the matrix: unique molecular identifier (UMI) amount < 1000, gene quantity < 200, log10GenesPerUMI < 0.70, and mitochondrial-originated UMI counts > 20%. After integrating the samples based on the top 3000 variable traits, principal component analysis (PCA) and the Findclusters algorithm were employed to identify main cell clusters. Based on the level of copy number variation (CNV) in epithelial cells, malignant bladder carcinoma cells were selected from clusters. The study plan was approved by the ethics committee of Xiangya Hospital, Central South University (Item number: 2021101175). All the specific men were collected complying with informed consent rights. The Cancer Genome Atlas (TCGA) Database: RNA expression matrix, survival outcome, and CNV of 33 types of carcinomas were acquired from the UCSC Xena database. Log2 transformation was employed to normalize RNA-seq data and the GISTIC algorithm was applied to process CNV data. Gene Expression Omnibus (GEO) Database: Transcriptome data of 1740 samples from nine BLCA cohorts: GSE31684 (93 samples), GSE48075 (142 samples), GSE69795(61 samples), GSE32894 (308 samples), GSE48276 (116 samples), GSE83586 (307 samples), GSE86411 (132 samples), GSE52329 (20 samples), GSE87304 (305 samples), and GSE128702 (256 samples) were obtained from GEO database. RNA-seq data of three immunotherapy cohorts: GSE35640 (14 samples, melanoma, and MAGE-A3 therapy), GSE173839 (105 samples, breast cancer, and anti-PD-L1 therapy), and GSE135222 (27 samples, nonsmall cell lung carcinoma (NSCLC), and anti-PD-1/PD-L1 therapy) were downloaded from GEO database. Single-cell transcriptomic characterization of two BLCA scRNA cohorts: GSE135337 (8 samples) and GSE145137 (3 samples) was obtained from the GEO database. Data processing was similar to the Xiangya siRNA cohort. Other Databases: RNA expression matrix and clinicopathologic characteristics of immunotherapy cohorts: IMvigor210 (348 samples, bladder cancer, and anti-PD-1 therapy) and Gide2019 (58 samples, melanoma, anti-PD-1, or anti-CTLA-4 therapy) were collected from http://researchpub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies and TIDE database (http://tide. dfci.harvard.edu/). Data of RNA-seq and clinical characteristics of a BLCA cohort—E-MTAB-1803 (85 samples)—was downloaded from ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/). BCAT2 expression levels in various types of cancer cell lines were downloaded from the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) database. Specific clinicopathologic and follow-up information from public databases were listed in our previous studies.[44,46] Assessment of Immunological Identity of TME in BLCA: As depicted in our previous study,[44] a comprehensive evaluation of the immunological trait of TME in BLCA was summarized. The tracking tumor immunophenotype (TIP) website (http://biocc.hrbmu.edu.cn/TIP/) was used to assess the activities of cancer immunity cycles, which reflected the effectiveness of antitumor immunity. It is separated into seven concrete steps: release and presentation of tumor antigen (steps 1 and 2), startup and activation of effector T cells (step 3), trafficking and assisting diverse immune cells into TME (steps 4 and 5), recognition and killing cancer cells (steps 6 and 7).[47] Six independent algorithms (TIMER, CIBERSORT, CIBERSORT-ABS, MCP-COUNTER, TISIDB, and XCELL) were employed to calculate the infiltration levels of tumor-infiltrating immune cells (TIICs).[48] Furthermore, effector genes of immune cells, ligands and receptors of chemokines, major histocompatibility complex (MHC) molecules, and immunostimulators were collected for evaluating immunological characteristics of TME multi-dimensionally. T cell-inflamed score (TIS) and markers of ICB were utilized to assess the host sensitivity state to immunotherapy.[49] Enrichment Pathways Analysis: Limma R package with empirical Bayesian function was employed to screen differentially expressed genes (DEGs) between high and low expression of BCAT2 in the RNA expression matrix.[50] Screening thresholds were |log (fold change) (log FC) |>1.5 dan nilai p terlaras < 0.05. Analisis Gene Ontologi (GO) dan Ensiklopedia Gen dan Genom Kyoto (KEGG) telah dijalankan pada DEG yang dikenal pasti oleh pakej ClusterProfiler R.[51] Pakej Seurat R dengan algoritma Findmarker telah digunakan untuk mengira tahap ekspresi BCAT2 pada sel epitelium dalam scRNA-seq. Berdasarkan pemeringkatan ekspresi gen yang berbeza-beza mengikut nilai perubahan lipatan (FC), analisis pengayaan set gen (GSEA) telah dilaksanakan untuk menilai korelasi positif dan negatif. Pengenalpastian DEG Berkaitan Kekebalan: Pakej ESTIMATE R digunakan untuk mengira skor imun dan stromal dalam kohort TCGA-BLCA. Mengikut nilai median dua skor dan tahap ekspresi BCAT2, pakej Limma R telah digunakan untuk mengenal pasti DEG berkaitan imun positif/negatif dan berkaitan stromal. Rajah Venn Pakej R digunakan untuk mengambil persimpangan pelbagai kumpulan dan memastikan DEG biasa. Klasifikasi Individu Menggunakan Subjenis Molekul BLCA: Tujuh subjenis molekul BLCA (UNC, Baylor, TCGA, MDA, Lund, CIT, dan Consensus) digunakan secara meluas dalam klinikal untuk menilai ciri-ciri TME dan keberkesanan pelbagai terapi.[52] Dalam pertimbangan interaksi kompleks pelbagai subjenis, kami secara kolektif membahagikannya kepada dua kategori utama—subjenis basal dan luminal.[16] Pakej R Konsensus MIBC dan subtaip BLCA digunakan untuk mengklasifikasikan individu kepada subjenis tertentu. Selepas normalisasi, kawasan di bawah lengkung ROC (AUC) telah digunakan untuk menilai kebolehpercayaan BCAT2 dalam meramalkan klasifikasi. Penilaian Terapi Ketepatan Pesakit: Seperti yang digambarkan dalam kajian terdahulu kami,[53] satu siri tandatangan gen kritikal, yang boleh meramalkan keberkesanan kemoterapi, radioterapi, terapi sasaran dan imunoterapi, telah dikumpulkan daripada kajian dan pangkalan data yang berbeza.[16, 54] Algoritma ssGSEA digunakan untuk mengira skor pengayaan tandatangan gen.[55] Talian Sel: Sel kanser pundi kencing manusia (T24) dan sel kanser pundi kencing murine (MB49) masing-masing dibeli daripada Procell Life Science & Technology (Wuhan, China) dan Meisen CTCC (Jinhua, China). Ia dikekalkan dalam medium DMEM (BasalMedia, China) dengan 10% serum lembu janin (FBS) (BI, Israel), 1% penisilin dan streptomycin (NCM Biotech, China) dan dikultur dalam inkubator pada 37 suhu darjah yang mengandungi 5% CO2. Pembinaan dan RNA-seq Sel Transfeksi Stabil: Vektor lentiviral plenti-BCAT2-flag-puromycin (GV341) telah direka dan dibina oleh GeneChem (Shanghai, China) untuk BCAT2-overexpression yang stabil (BCAT2 OE) garisan sel dan kawalan negatifnya (oe-vektor). Selain itu, BCAT2- RNA jepit rambut pendek (shRNA) telah diklonkan ke GV112-vektor lentiviral oleh GeneChem (Shanghai, China) untuk barisan sel BCAT2-knock down (BCAT2 KD) yang stabil . Urutan sasaran shRNA disenaraikan dalam Jadual S3 (Maklumat Sokongan). Kemudian, lentivirus BCAT2 rekombinan telah dipindahkan ke dalam sel objektif mengikut arahan pengeluar. 2 ug mL−1 puromycin (Amersco, Amerika Syarikat) telah digunakan untuk menapis sel transfeksi yang stabil selama tiga hari. Western blot dan PCR transkripsi terbalik kuantitatif (qRT-PCR) telah digunakan untuk mengesahkan keberkesanan pemindahan. Akhirnya, sel transfeksi yang stabil dengan keberkesanan terbaik telah dipilih untuk RNA-seq dan eksperimen selanjutnya. Tiga sampel pendua setiap baris sel dihantar ke platform BGI RNA-seq (Shenzhen, China). Kriteria untuk memilih DEG dan analisis laluan pengayaan adalah sama seperti yang digambarkan dalam 2.3 (analisis laluan pengayaan). ProcartaPlex Multiple Immunoassays untuk Mengesan Tahap Rembesan Kemokin dan Sitokin Talian Sel Kanser: Panel immunoassay ProcartaPlex Manusia (Kucing: EPX340-12167-901) dan panel immunoassay ProcartaPlex tetikus (Kucing: EPX{{50}}) telah dibeli daripada ThermoFisher Scientific (Massachusetts, USA) untuk mengesan tahap ekspresi protein lebih daripada 3{367}} kemokin dan sitokin penting dalam sel kanser transfeksi yang stabil. Secara ringkasnya, supernatan kultur sel dikumpul daripada 24-plat perigi dan sentrifugasi untuk membuang sel dan serpihan sel. Kemudian, supernatan yang menjelaskan telah diinkubasi dengan manik dalam panel mengikut arahan pengilang. Platform pengesanan Luminex (ThermoFisher Scientific, USA) telah digunakan untuk melakukan analisis kuantitatif pada setiap sampel. Penunjuk yang tidak dikesan dikecualikan daripada analisis. qRT-PCR: Jumlah RNA telah diasingkan daripada sel dengan Kit Pengasingan RNA Jumlah Sel dan Kit Pengasingan RNA Jumlah Haiwan (Foregene, China) mengikut protokol pengeluar. cDNA telah disintesis menggunakan Sistem UeIris II RTPCR untuk Sintesis cDNA Strand Pertama (US Everbright, China). qRTPCR dilakukan menggunakan SYBR Green qPCR Master Mix (US Everbright, China) pada CFX Connect System (Bio-Rad, USA). GAPDH digunakan sebagai kawalan standard dalaman. Primer telah direka bentuk dan disintesis oleh Sangon Biotech (Shanghai, China) dan urutan primer terperinci disenaraikan dalam Jadual S4 (Maklumat Sokongan). ELISA: Kepekatan CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 (MIG) dan CXCL10 (IP10) dalam supernatan kultur sel kanser pundi kencing manusia ditentukan oleh kit ELISA manusia mengikut protokol pengeluar (Proteintech, USA). Pembaca plat mikro bioteknologi (ThermoFisher Scientific, USA) digunakan untuk mengukur nilai ketumpatan optik (OD). Memandangkan kepelbagaian besar tahap rembesan antara sitokin dan kemokin yang berbeza, kami menjalankan penyeragaman data (transformasi log 2) sebelum analisis. Western Blot: Penampan RIPA (bioteknologi NCM, China) ditambah dengan Koktel Perencat Protease 1% (bioteknologi NCM, China) telah digunakan untuk melisiskan sel. Kit Ujian Protein BCA (bioteknologi NCM, China) digunakan untuk menentukan kepekatan protein. Selepas dipindahkan ke membran PVDF, protein sel diinkubasi dengan antibodi primer dan antibodi sekunder konjugasi HRP spesifik berturut-turut. Isyarat telah ditangkap oleh sistem pengimejan XRS (Bio-Rad, Amerika Syarikat). Antibodi utama termasuk antibodi anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, USA) dan antibodi anti-GAPDH (Cat: ab8245, Abcam, USA). Antibodi sekunder termasuk kambing HRP anti-arnab IgG (Cat: 7074, Cell Signaling Technology, USA) dan HRP goat anti-mouse IgG (Cat: 7076, Cell Signaling Technology, USA). T Ujian Pembunuhan Sel Kanser Pengantaraan Limfosit dan Ujian Kokultur: Sampel darah dikumpulkan daripada 10 penderma yang sihat di hospital kami. Mengikut arahan pengeluar, sentrifugasi kecerunan digunakan untuk mengekstrak sel mononuklear darah periferal (PBMC) oleh Lymphoprep (Cat: 07851, StemCell Technologies, USA). Di samping itu, Penampan Lisis Sel Darah Merah (Solarbio, China) digunakan untuk menghapuskan sel darah merah yang bercampur dengan PBMC. Untuk mengaktifkan sel T, PBMC telah dibiakkan dalam medium DMEM (Gibco, USA), menambah IL Manusia Rekombinan- 2 (10 ng mL−1, Kucing: 202-1L-050, R&D , USA), dan pengaktif sel T CD3/CD28/CD2 Manusia ImmunoCult (25 μL mL−1, Cat: 10970; STEMCELL Technologies, USA) selama 1 minggu. Pada nisbah 1:5, sel-sel kanser pundi kencing manusia (BCAT2-OE, BCAT2-KD dan kawalan negatifnya) telah dikultur bersama dengan sel T yang diaktifkan dalam medium DMEM dengan antibodi anti-CD3 (100 ng mL−1, Thermo Scientific, USA) dan IL-2 (10 ng mL−1) daripada satu penderma dalam 12- plat telaga selama 72 jam. Kemudian, sel T dikumpulkan untuk analisis sitometri aliran. Strategi get terperinci analisis aliran ditunjukkan dalam Rajah S28 (Maklumat Sokongan). Sel-sel kanser yang tinggal diwarnai dengan kristal ungu dan diukur nilai OD pada 570 nm oleh pembaca plat mikro. Antibodi untuk analisis cytometry aliran termasuk Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Cat: 423101, Biolegend, USA), APC/ Cy7 anti-human CD45 (Cat: 368516, Biolegend, USA), Pacific Blue anti-human CD3 Antibody (Cat: 300329, Biolegend, USA), Antibodi CD4 anti-manusia PerCP/Cy5.5 (Cat: 317427, Biolegend, USA), Antibodi CD8a anti-manusia FITC (Cat: 301006, Biolegend, USA), PE/Dazzle 594 anti-manusia TNF- 𝛼 Antibodi (Kucing: 502946, Biolegend, Amerika Syarikat), dan Brilliant Violet 711 anti-manusia IFN- 𝛾 Antibodi (Kucing: 502540, Biolegend, Amerika Syarikat). Chemotaxis Assay: Chemotaxis assay telah dilaksanakan dalam 24-plat transwell telaga dengan diameter teras 3 μm (Corning, USA). CD manusia8+Kit Pengasingan Sel T (Cat: 480012, Biolegend, USA) telah digunakan untuk mengekstrak CD{135}}sel T daripada PBMC. 1 × 105 sel terpencil dalam isipadu 200 μL telah ditambah ke dalam ruang atas dan 600 μL supernatan garisan sel transfeksi stabil yang berbeza telah ditambah ke dalam ruang bawah. Selepas pengeraman selama 6 jam pada 37 darjah, sel berhijrah ke ruang bawah dan dituai dan dikira oleh sitometri aliran. Ujian Percambahan Sel, Migrasi dan Pencerobohan: Ujian pembentukan koloni plat digunakan untuk menilai keupayaan percambahan sel. BCAT2-OE, BCAT2-KD dan sel-sel kanser pundi kencing manusia kawalan negatif telah dikultur ke dalam 6-plat perigi setiap telaga. Selepas mengeram dalam suasana lembap 37 darjah selama 2 minggu, koloni telah ditetapkan dan dicelup dengan paraformaldehid dan ungu kristal, masing-masing. Ruang Transwell dengan sisipan membran polikarbonat liang 8.0 μm (Corning, USA) digunakan untuk menilai kapasiti penghijrahan dan pencerobohan sel secara in vitro. 1 × 105 sel transfeksi yang stabil telah digantung dalam medium bebas serum dan disemai ke dalam ruang atas dengan atau tanpa Matrigel (Corning, Amerika Syarikat), untuk ujian pencerobohan dan penghijrahan secara berasingan. Selepas mengeram selama 24 jam (ujian migrasi) dan 48 jam (ujian pencerobohan), sel-sel yang melekat pada permukaan bawah membran telah diperbaiki dan diwarnakan. Sel-sel yang tinggal di ruang atas telah dikeluarkan oleh swab. Lima medan rawak telah dipilih di bawah mikroskop untuk mengira nombor sel. Imunofluoresensi (IF) dan Imunohistokimia (IHC): Multicolor IF pada TMA Kohort Xiangya BLCA dan Kohort imunoterapi Xiangya BLCA telah dilaksanakan oleh kit pewarnaan imunohistokimia pendarfluor berbilang (Absin, China). Secara ringkas, selepas dewaxing, penghidratan semula, dan pengubahsuaian antigen, TMA diinkubasi dengan antibodi primer dan antibodi sekunder yang mendorong pengikatan luciferin yang berbeza oleh penguatan isyarat tyramide (TSA). Selepas menyapu antibodi yang tidak terikat dengan penimbal sitrat, proses pengeraman diulang dua kali. DAPI telah digunakan untuk mengimbangi nukleus sel dan imej telah diimbas oleh platform MIDI Pannoramic (3DHISTECH, Hungary). Antibodi utama pada TMA kohort Xiangya BLCA termasuk anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, USA), anti-Cytokeratin 19 (CK19) (Cat: ab52625, Abcam, USA), anti-CD8 (Cat: ab237709, Abcam, USA ) dan DAPI (Invitrogen, Amerika Syarikat). Antibodi sekunder dan fluorochrome pada TMA kohort Xiangya BLCA termasuk HRP Goat Anti-Arnab/Tetikus IgG, Absin 520 TSA Plus, Absin 570 TSA Plus, Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). Antibodi utama pada TMA kohort imunoterapi Xiangya BLCA termasuk anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, USA), anti-PD-L1 (Cat: ab213524, Abcam, USA) dan DAPI (Invitrogen, USA). Antibodi sekunder dan fluorokrom pada TMA bagi kohort imunoterapi Xiangya BLCA termasuk HRP Goat Anti-Arnab/IgG Tetikus, Absin 520 TSA Plus dan Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). JIKA pada tisu tumor murine diinkubasi dengan antibodi primer—anti-CD8 (Cat: 372902, BioLegend, USA)—dan antibodi sekunder—anti-tikus konjugat pewarna Alexa Fluor 488 (Invitrogen, USA) secara berurutan. DAPI telah digunakan pada nukleus sel yang divisualisasikan. Lima medan rawak telah dipilih di bawah mikroskop untuk mengira nombor sel pewarnaan positif. IHC pada TMA Kohort Xiangya BLCA dan Kohort imunoterapi Xiangya BLCA telah dijalankan oleh SP{186}} Kit (ZSGB-BIO, China). Selepas pengambilan dan penyekatan antigen, antibodi primer, dan antibodi sekunder diinkubasi dengan tisu tumor secara bergilir. Kemudian, diaminobenzidine (DAB) digunakan untuk pewarna antigen sasaran. Isyarat coklat dianggap sebagai pewarnaan positif. Skor keamatan pewarnaan (tiada=0, lemah=1, sederhana=2 dan kuat=3) skor pendaraban peratusan positif (tiada pewarnaan=0, sel pewarna kurang daripada 25%=1, 25%–50% sel pewarna=2, 50%–75% sel pewarna=3 dan sel pewarna lebih daripada 75%=4) adalah skor IHC muktamad sampel. Markah BCAT2/CD8/PD-L1 kurang daripada enam mata diklasifikasikan sebagai ekspresi rendah, markahnya lebih besar daripada atau sama dengan enam mata diklasifikasikan sebagai ekspresi tinggi. Untuk menilai status individu pada MMR, semua sampel dari kohort imunoterapi Xiangya BLCA dinilai berdasarkan hasil pewarnaan empat gen penanda MMR (MLH1, MSH2, MSH6, dan PMS2). Seperti yang digambarkan dalam kajian terdahulu, [56] apabila keempat-empat gen penanda adalah pewarnaan positif, individu itu ditandakan sebagai MMR. Apabila mana-mana daripada empat gen penanda mempunyai pewarnaan negatif, individu itu ditandakan sebagai dMMR. Dua ahli patologi bebas telah dijemput untuk menjalankan penilaian. Antibodi termasuk: anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, USA), anti-CD8 (Cat: ab4055, Abcam, USA), anti-PD-L1 (Cat: ab213524, Abcam, USA), anti-MLH1(Cat: A4858, Abcolonal, China), anti-MSH2 (Cat: A22177, Abcolonal, China), anti-MSH6 (Cat: A16381, Abcolonal, China), anti-PMS2 (Cat: A4577, Abcolonal, China) dan HRP Goat Anti -IgG Arnab/Tetikus (ZSGB-BIO, China). Analisis Panoramik TissueFAXS Interaksi Ruang dalam TME: Untuk menilai interaksi spatial sel malignan BCAT{236}} dan sel T effector, platform panoramik TissueFAXS (Tissue Gnostics, Austria) digunakan untuk mengimbas dan menganalisis sel objektif secara separa automatik yang diwarnai oleh IF pelbagai warna TMA Kohort Xiangya BLCA. TMA terdiri daripada biopsi teras 1.5 mm daripada spesimen tisu tumor yang tertanam parafin. Secara terperinci, sel BCAT2+, sel malignan dan sel8+T CD telah diwarnai oleh antibodi primer dan antibodi sekunder tertentu. DAPI (Invitrogen, USA) digunakan untuk mengotorkan nukleus sel. Langkah-langkah terperinci telah diterangkan dalam kajian Makarevic et al.[57] Secara ringkasnya, mengikut intensiti pendarfluor penunjuk yang berbeza dan sifat fizikal sel, sel positif telah ditanda dan dikira. Lebih penting lagi, taburan ruang sel CD8+T di sekeliling sel BCAT2+CK19+ digambarkan oleh plot serakan berdasarkan jarak ruang (0–25, 25–50, 50– 100, dan 100–150 μm). Dua pakar patologi berpengalaman telah dijemput untuk menyemak keputusan keputusan platform panoramik TissueFAXS. Eksperimen Haiwan: Tikus C57BL/6 betina (6–7 minggu) diperoleh daripada Jabatan Haiwan Makmal, Universiti Selatan Tengah. Semua operasi pada tikus telah diperiksa dan diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Hospital Xiangya, Central South University (Nombor item: 2021101175). Di atas semua itu, untuk menyiasat peranan BCAT2 pada pertumbuhan tumor dalam vivo, sel BCAT2 KD MB49 (5 × 105) dan sel kawalannya dalam 100 μL isipadu sederhana telah disuntik secara subkutan ke bahagian kanan tikus. Selain itu, selepas berjaya membina model tumor subkutaneus (isipadu tumor sehingga 100 mm3), 100 ug InVivomAb anti-tikus PD-1 (Cat: BE0146, Bioxcell, USA) dan kawalan isotype IgG2a (Cat: BE0089, Bioxcell, USA) disuntik secara intraperitoneal ke dalam setiap tetikus, untuk menilai kesan sinergistik kehilangan BCAT2 dan terapi anti-PD-1. Terapi anti-PD-1 telah dilaksanakan pada tikus setiap 3 hari dan berlangsung sehingga lima kursus. Selanjutnya, untuk menilai sama ada kesan kerjasama rawatan bersama bergantung pada sel8+T CD. Mengiringi terapi gabungan, 100 ug InVivoPlus anti-tikus CD8𝛼 (Cat: BP0117, Bioxcell, USA) dan kawalan isotaip IgG2b (Cat: BP0090, Bioxcell, USA) telah digunakan untuk menghabiskan CD8+sel T dalam tikus. Berat badan tikus direkodkan setiap tiga hari. Pada tarikh yang dijadualkan, tumor dituai, diukur, dan disediakan untuk analisis sitometri aliran, pewarnaan IF, dan qRT-PCR. Untuk meneroka interaksi antara tahap ekspresi BCAT2 pada CD8+sel T dan aktiviti CD8+sel T, limpa tikus C57BL/6 betina (6– 7 minggu) tanpa membawa tumor adalah dipisahkan dan disediakan untuk penggantungan sel tunggal untuk analisis lanjut. Analisis Sitometri Aliran: Tumor Murine dikisar dan dicernakan ke dalam suspensi sel tunggal oleh Collagenase IV (Cat: C5138, Sigma, USA), hyaluronidase (Cat: H3506, Sigma, USA) dan DNase I (Cat: DN25, Sigma, USA). ). Penapis sel 70 μm (BIOFIL, China) digunakan untuk menapis kekotoran dan kaunter sel (Countstar, China) digunakan untuk mendapatkan (3-5) × 106 sel dalam setiap sampel. Selepas mengenal pasti sel hidup menggunakan Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Cat: 423101, Biolegend, USA) dan menyekat reseptor Fc dengan antibodi CD16/32 anti-tikus (Cat: 156603, Biolegend, USA), antigen membran sel telah diwarnai oleh APC-Cy7 anti-tikus CD45 (Cat: 103116, Biolegend, USA), BV421 anti-mouse CD3 (Cat: 100341, Biolegend, USA), BV605 anti-mouse CD8a (Cat: 100744, Biolegend, USA) dan PerCPCy5.5 anti-mouse CD4 (Cat: 100540, Biolegend, USA). Kemudian, Biosains Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (Cat: 2400632, Invitrogen, USA) telah digunakan untuk membetulkan dan meresap sel dan membran nukleus. Antigen berkaitan kesan sitotoksik telah dicelup oleh PE anti-manusia/tikus Granzyme B (Cat: 372208, Biolegend, USA), PE-Cy7 anti-tikus TNF-𝛼 (Cat: 506324, Biolegend, USA), PE-Dazzle 594 anti- tetikus IFN-𝛾 (Cat: 505846, Biolegend, USA), APC anti-mouse Perforin (Cat: 154304, Biolegend, USA). Strategi gating analisis sitometri aliran ditunjukkan dalam Rajah S29 (Maklumat Sokongan). BCAT2 anti-manusia/tikus (Kucing: A7426, Abclonal, China) diinkubasi dengan kit pelabelan antibodi Fleksibel 488 (Kucing: KFA001, Proteintech, Amerika Syarikat) untuk mensintesis antibodi pendarfluor BCAT2 yang diperibadikan untuk analisis sitometri aliran. Kemudian, antibodi BCAT2 dan antibodi berkaitan sel T dicampur dan ditambah ke dalam penggantungan sel tunggal limpa murine untuk meneroka interaksi antara tahap ekspresi BCAT2 pada CD8+sel T dan aktiviti CD{{357} }sel T. Strategi gating analisis sitometri aliran ditunjukkan dalam Rajah S30 (Maklumat Sokongan). Sampel berwarna telah dikesan pada Cytek DxpAthena Flow cytometry (Cytek Biosciences, USA) dan data dianalisis oleh perisian versi Flowjo (BD Biosciences, USA). Analisis Statistik: Data dibentangkan sebagai min ± SD. ujian-t dengan atau tanpa pembetulan Welch digunakan untuk membandingkan pembolehubah berterusan antara dua kumpulan. Analisis ANOVA sehala dengan atau tanpa ujian Brown-Forsythe dan Welch digunakan untuk membandingkan pembolehubah berterusan antara berbilang kumpulan. Ujian khi kuasa dua atau ujian tepat Fisher digunakan untuk membandingkan pembolehubah dikotomi. Ujian pekali korelasi Pearson atau Spearman digunakan untuk menganggarkan keamatan korelasi antara pembolehubah yang berbeza. Kurva survival Kaplan-Meier digunakan untuk menunjukkan analisis prognostik pembolehubah dikotomi, dan ujian peringkat log digunakan untuk menilai perbezaan statistik. P dua belah <0.05 ditakrifkan sebagai ambang kepentingan. Perisian R (versi 4.0) dan GraphPad Prism8 digunakan untuk memproses data dalam kajian.
Rujukan
[1] RL Siegel, KD Miller, HE Fuchs, A. Jemal, CA: Kanser J. Clin. 2021, 71, 7.
[2] VG Patel, WK Oh, MD Galsky, Ca-Cancer J. Clin. 2020, 70, 404.
[3] R. Nadal, J. Bellmunt, Rawatan Kanser. Wahyu 2019, 76, 10.
[4] a) MD Galsky, A. Arija JÁ, A. Bamias, ID Davis, M. De Santis, E. Kikuchi, X. Garcia-Del-Muro, U. De Giorgi, M. Mencinger, K. Izumi, S. Panni, M. Gumus, M. Özgüro˘glu, AR Kalebasty, SH Park, B. Alekseev, FA Schutz, JR Li, D. Ye, NJ Vogelzang, S. Bernhard, D. Tayama, S. Mariathasan, A Mecke, A. Thåström, E. Grande, Lancet 2020, 395, 1547; b) MD Galsky, A. Mortazavi, MI Milowsky, S. George, S. Gupta, MT Fleming, LH Dang, DM Geynisman, R. Walling, RS Alter, M. Kassar, J. Wang, S. Gupta, N. Davis, J. Picus, G. Philips, DI Quinn, GK Haines 3rd, NM Hahn, Q. Zhao, M. Yu, SK Pal, J. Clin. Oncol. 2020, 38, 1797; c) T. Powles, SH Park, E. Voog, C. Caserta, BP Valderrama, H. Gurney, H. Kalofonos, S. Radulovi´c, W. Demey, A. Ullen, Y. Loriot, SS Sridhar, N Tsuchiya, E. Kopyltsov, CN Sternberg, J. Bellmunt, JB Aragon-Ching, DP Petrylak, R. Laliberte, J. Wang, B. Huang, C. Davis, C. Fowst, N. Costa, JA Blake-Haskins , A. di Pietro, P. Grivas, N. Engl. J. Med. 2020, 383, 1218.
[5] a) RW Jenkins, DA Barbie, KT Flaherty, Br. J. Kanser 2018, 118, 9; b) AJ Schoenfeld, MD Hellmann, Sel Kanser 2020, 37, 443.
[6] a) DS Chen, I. Mellman, Nature 2017, 541, 321; b) TF Gajewski, L. Corrales, J. Williams, B. Horton, A. Sivan, S. Spranger, Adv. Exp. Med. biol. 2017, 1036, 19; c) DC Hinshaw, LA Shevde, Kanser Res. 2019, 79, 4557.
[7] a) SM Vareki, J. Immunother. Kanser 2018, 6, 157; b) B. Zhang, Q. Wu, B. Li, D. Wang, L. Wang, YL Zhou, Mol. Kanser 2020, 19, 53.
[8] JR Mayers, ME Torrence, LV Danai, T. Papagiannakopoulos, SM Davidson, MR Bauer, AN Lau, BW Ji, PD Dixit, AM Hosios, A. Muir, CR Chin, E. Freinkman, T. Jacks, BM Wolpin, D. Vitkup, MG Vander Heiden, Sains 2016, 353, 1161.
[9] JT Li, M. Yin, D. Wang, J. Wang, MZ Lei, Y. Zhang, Y. Liu, L. Zhang, SW Zou, LP Hu, ZG Zhang, YP Wang, WY Wen, HJ Lu , ZJ Chen, D. Su, QY Lei, Nat. Biol Sel. 2020, 22, 167.
[10] JH Lee, YR Cho, JH Kim, J. Kim, HY Nam, SW Kim, J. Son, Exp. Mol. Med. 2019, 51, 146.
[11] a) H. Lai, X. Cheng, Q. Liu, W. Luo, M. Liu, M. Zhang, J. Miao, Z. Ji, GN Lin, W. Song, L. Zhang, J. Bo, G. Yang, J. Wang, WQ Gao, Int. J. Kanser 2021, 149, 2099; b) D. Lambrechts, E. Wauters, B. Boeckx, S. Aibar, D. Nittner, O. Burton, A. Bassez, H. Decaluwé, A. Pircher, K. Van den Eynde, B. Weynand, E. Verbeken, P. De Leyn, A. Liston, J. Vansteenkiste, P. Carmeliet, S. Aerts, B. Thienpont, Nat. Med. 2018, 24, 1277.
[12] N. Nagarsheth, MS Wicha, W. Zou, Nat. Rev. Immunol. 2017, 17, 559.
[13] a) E. Stelloo, AML Jansen, EM Osse, RA Nout, CL Creutzberg, D. Ruano, Gereja DN, H. Morreau, V. Smit, T. van Wezel, T. Bosse, Ann. Oncol. 2017, 28, 96; b) AS Tjalsma, A. Wagner, WNM Din jens, PC Ewing-Graham, LSM Alcalá, MER de Groot, KE Hamoen, AC van Hof, W. Hofhuis, LN Hofman, KJ Hoogduin, J. Kaijser, ACF Makkus, SJJ Mol, GM Plaisier, K. Schelfhout, HPM Smedts, RA Smit, PJ Timmers, P. Vencken, B. Visschers, AAM van der Wurff, HC van Doorn, Gynecol. Oncol. 2021, 160, 771.
