Mengimbas Mikroskopi Pengaliran Ion Hidup Glomerulus Manusia Hidup

Untuk maklumat lanjut information:ali.ma@wecistanche.com

Ruslan Bohovyk1,2 | Mykhailo Fedoriuk1,2 | Elena Isaeva1,2 | Andrew Shevchuk3 | Oleg Palygin1 | Alexander Staruschenko1,4

1 Jabatan Fisiologi, Kolej Perubatan Wisconsin, Milwaukee, WI, Amerika Syarikat 2 Jabatan MembranOlogi Selular, Institut Fisiologi Bogomoletz, Kyiv, Ukraine 3 Jabatan Perubatan, Kolej Imperial London, London, UK 4 Pusat Perubatan Clement J. Zablocki VA, Milwaukee, WI, Amerika Syarikat

Menyurat Alexander Staruschenko dan Ruslan Bohovyk, Jabatan Fisiologi, Kolej Perubatan Wisconsin, 8701 Jalan Papan Watertown, Milwaukee, WI 53226, Amerika Syarikat. E-mel: staruschenko@mcw.edu; rbogovik@ gmail.com

Maklumat pembiayaan Jabatan Hal Ehwal Veteran, Geran/ Nombor Anugerah: I01 BX004024; Negara Institut Jantung, Paru-paru, dan Darah, Geran / Nombor Anugerah: P01 HL116264 dan R35 HL135749; Persatuan Fisiologi Amerika, Geran / Anugerah Nombor: Kerjaya Penyelidikan Anugerah Peningkatan; Institut Kebangsaan Diabetes dan Pencernaan dan Pencernaan danBuah pinggangPenyakit, Nombor Geran/Anugerah: DK126720

Abstrak

Kerosakan Podocyte adalah ciri utama penyakit glomerular, seperti glomerulosklerosis segmen fokus, biasanya dikaitkan dengan albuminuria yang ditandakan dan perkembangan patologi buah pinggang. Keabnormalan dan kehilangan struktur Podocyte juga dikaitkan dengan minimum menukar penyakit dan lebih biasapenyakit buah pinggang diabetes. Di sini kami menggunakan teknik mikroskopi pengaliran ion kali pertama (SICM) untuk menilai yang baru manusia terpencilglomerulus'stopologi. SICM beri peluang unik untuk menilaiglomeruluspodocytes serta segmen struktur nephron lain dengan elektron resolusi mikroskopi tetapi dalam sampel langsung. Ditunjukkan di sini adalah aplikasi SICM kaedah dalam manusia hidupglomerulus, yang memberikan bukti prinsip untuk masa depan analisis dinamik morfologi membran dan pelbagai parameter berfungsi dalam sel hidup.

Klik untuk kesan sampingan cistanche dan Cistanche untuk penyakit buah pinggang

1. PENGENALAN

Glomerulusmewakili tuft kapilari yang terletak di bahagian kemasukan nephron, di mana darah ditapis secara selektif di seluruh penghalang penapisan glomerular yang terdiri daripada sel endothelial, membran bawah tanah glomerular, dan podosit. Sekolah rendah dan menengah proses podocytes bersebelahan saling berkaitan, mencipta diafragma celah yang rapat meliputi kapilari glomeruli. Diafragma ini mempunyai morfologi yang kompleks dan membentuk halangan akhir untuk penapisan darah menyumbang kepada selektiviti saiz dan membenarkan kebolehtelapan kepada molekul yang lebih kecil daripada albumin. Pengurangan nombor podocyte dan effacement proses kaki dilaporkan dalam glomerulosklerosis segmen fokus, penyakit perubahan minimum, dan nefropati diabetes.1-3 Lebih-lebih lagi, kehilangan podocytes dan pengubahsuaian seni bina mereka boleh terbukti pada peringkat awalBuah pinggangpenyakit yang boleh mendasari /memburukkan perkembangan mereka. Pengimejan resolusi tinggi sel morfologi menjadi alat yang penting dan berguna untuk belajar struktur selular dan peranan yang mereka mainkan dalam fungsi sel dan perkembangan penyakit.4 Mengimbas mikroskopi elektron (SEM) adalah secara meluas kaedah yang digunakan untuk menjalankan kajian sedemikian. Namun, ia memerlukan berbilang prosedur kompleks untuk penyediaan sampel, menjadikannya mustahil untuk menganalisis sampel hidup.5 Oleh itu, terdapat keperluan kritikal untuk membangunkan alat baru untuk mengkaji perubahan morfologi podocyte dalam sampel langsung. Hopping Probe mod Scanning Ion Conductance Mikroskopi (SICM) adalah teknik yang membolehkan pengimejan resolusi tinggi, bukanoptik permukaan sel hidup dengan morfologi kompleks.6-8 Kelebihan utama kaedah ini adalah hampir dengan beberapa nanometres resolusi spatial dan julat Z panjang (menegak), yang boleh digunakan untuk hidup sampel dengan morfologi berbelit-belit di bawah fisiologi syarat-syarat yang berkaitan. SICM adalah teknik pengimejan multimodal yang boleh digabungkan dengan teknik lain yang ditubuhkan, serentak dan analisis dinamik morfologi membran, dan pelbagai parameter berfungsi, seperti isipadu sel, potensi membran, tunggal arus ion-saluran, dan juga dinamik protein membran kompleks dalam sel hidup.9-11 Di sini, kami memberikan contoh penggunaan SICM untuk menganalisis morfologi manusia hidupglomerulusStruktur.

Gejala penyakit Cistanche-kidney

2. BAHAN DAN KAEDAH

Untuk eksperimen, kami menggunakan sebahagian daripada kawasan kortikal dari manusia pemindahan yang dibuangBuah pinggangdibedah dan disimpan di Wisconsin penyelesaian pemeliharaan diikuti oleh inkubasi dalam oksigen penyelesaian salin fisiologi (PSS).12 Glomeruli buah pinggang telah diasingkan menggunakan teknik vibrodissociation seperti yang diterangkan sebelum ini.13 Ini pendekatan membolehkan pengasingan cepat glomeruli buah pinggang yang dipelihara dengan baik dari manusiaBuah pinggang. Untuk melakukan pengimejan SICM, manusia yang baru terpencilglomerulustelah dilekatkan pada permukaan kaca poly-L-lysine diletakkan ke dalam ruang sel yang dipenuhi dengan penyelesaian PSS. Sampel adalah diposisikan secara manual dalam arah x-y di bawah optik terbalik mikroskop Nikon TE2000-U (Instrumen Nikon). Untuk melompat probe, SICM pengimejan borosilicate nanopipettes kaca dengan rintangan kira-kira 100 MΩ, yang sepadan dengan anggaran diameter hujung sekitar 120 nm, telah digunakan. Nanopipettes telah ditarik dengan penarik jenis nyalaan api/coklat mendatar P-97 (Sutter Instruments, Novato, CA). nanopipettes dipenuhi dengan penyelesaian PSS yang sama yang digunakan untuk mandi dan diletakkan di arah z dengan penggerak piezoelektrik. Arus ion yang mengalir melalui nanopipettes diukur dengan penguat tampalan Axopatch 700B (Instrumen Axon) dalam mod voltan-pengapit dan dipantau oleh pengawal sejagat yang diubahsuai khas (ICAPPIC Ltd, UK), yang pada masa yang sama mengawal sampel dan kedudukan pipet.6 Semua eksperimen dijalankan pada suhu bilik (20-22 ° C). Untuk pengimejan struktur berbelit-belit kompleks seperti proses kaki podocytes di theglomerulus, kami menggunakan mod backstep/hopping SICM yang paling terpakai untuk pengimejan topografi sel hidup dengan resolusi tinggi.6,14 Langkah tunggal prinsip melompat terdiri daripada peristiwa apabila arus rujukan diukur dengan meletakkan nanopipette jauh di atas sampel. Kemudian, pendekatan nanopipette sepanjang paksi z ke permukaan sampel sehingga arus yang diukur tahap jatuh ke titik set pratetap sepadan dengan ~ 1.0%-1.2% daripada arus rujukan. Pada masa ini, pendekatan ditamatkan, koordinat XYZ penggerak XY dan Z piezo direkodkan sebagai koordinat permukaan sampel untuk titik pengimejan pertama, dan pipet ditarik balik dari permukaan. Prosedur ini kemudian berulang pada setiap titik pengimejan tunggal di sepanjang paksi x-y yang ditentukan oleh resolusi pratetap dan julat kawasan imbasan. Untuk Rajah 1B, julat imbasan dan resolusi imej ialah 30 μm × 30 μm dan 512 px × 512 px, dan untuk Rajah 1C ialah 5 μm × 5 μm dan 480 px × 480 px, masing-masing. Mentah Data topografi TOPografi SICM dan imej selepas pemprosesan telah dilakukan menggunakan perisian analisis mikroskopi SICM ImageViewer (ICAPPIC Ltd, UK).

FIGURE 1 Permohonan Mengimbas Pengimejan Mikroskopi Kelakuan Ion. A, manusia yang baru terpencilglomerulusdilampirkan pada permukaan kaca poly-Llysine. Ditunjukkan di sebelah kiri adalah micropipette menghampiri permukaan glomerulus untuk melakukan pengimejan SICM. B, Contoh komponen penghalang penapisan glomerulus, termasuk podocyte dan proses kaki yang dilindungi kapal, digambarkan oleh SICM. 45 minit untuk jumlah kawasan imbasan (30 × 30 μm, resolusi 512 × 512 piksel; perubahan paksi z 15 μm). C, Pandangan yang diperluaskan pada seni bina podocyte manusia sekunder proses kaki didedahkan oleh SICM resolusi tinggi. 12 minit untuk jumlah imbasan kawasan (resolusi 5 × 5 μm, resolusi 480 × 480 piksel; perubahan paksi z 3 μm). Bar skala ditunjukkan

3. KEPUTUSAN DAN PERBINCANGAN

Kualiti imej SICM adalah setanding dengan SEM dan membolehkan pemeriksaan yang tepatglomerulusstruktur permukaan, termasuk saluran darah dan podocytes, dan seni bina proses kaki sekunder.4 Di kajian kami sebelum ini, kami menggunakan pengimejan SICM untuk menganggarkan perubahan struktur patologi dalam proses kaki podocyte dalam jenis 2 diabetes nephropathy (T2DN) tikus.15 Kami menjalankan analisis perbandingan seni bina tiga dimensi penghalang penapisan podocyte dalam tikus bukan diabetes dan T2DN. Data kami mendedahkan kerugian yang ketara proses kaki podocyte dalam glomeruli T2DN memberikan yang tepat penilaian untuk perubahan histopatologi yang berlaku dalam nefropati diabetes yang mendasari nephrinuria dan albuminuria dalam tikus ini.15 Di sini, buat kali pertama, kami menunjukkan pendekatan yang berjaya dalam menilai struktur permukaan tiga dimensi yang baru terpencil, hidup glomerulus manusia. Glomeruli buah pinggang manusia adalah struktur sfera dengan diameter sekitar 300 μm16; oleh itu, hujung pipet mesti berhati-hati mendekati bahagian atas rantau yang menarik. SICM Kami set-up mempunyai 25 μm z-axis dan 30 × 30 μm x-y-axis julat pengimbas, yang membolehkan kami mendapatkan imej resolusi tinggi sebahagian besar bahagian besarglomerulusPermukaansurface. Masa pemerolehan sangat bergantung kepada julat imbasan, resolusi, dan saiz hujung elektrod melompat. Untuk pengimejan sel hidup dalam struktur kompleks seperti glomerulus yang baru terpencil, masa pengimbasan berbeza dari 10 hingga 50 minit setiap bingkai (lihat Legenda rajah untuk maklumat lanjut). Kesan kumulatif resolusi tinggi, besar kawasan pengimbasan, dan turun naik stochastic dalam sistem hidup boleh mengakibatkan artifak pengimejan diwakili sebagai peralihan mendatar dan menegak antara berharap kitaran penyusunan semula pipet. Perhatikan bahawa dalam geometri kompleks dengan perubahan mendadak di lokasi permukaan, kedua-duanya masa pemerolehan dan artifak pengimejan, seperti piksel gelap atau buruk, boleh Meningkatkan. Imej topografi SICM (Rajah 1A) menggambarkan kapilari glomerular yang diliputi oleh primer dan sekunder yang jelas kelihatan proses kaki podocyte. SICM membolehkan memperoleh imej sampel dengan julat imbasan yang berbeza dalam skala nanometre, mengekalkan tahap resolusi yang mencukupi.17 Rajah 1B mewakili seni bina proses kaki sekunder podocyte manusia yang didedahkan oleh SICM resolusi tinggi. Analisis lanjut imej topografi sedemikian boleh digunakan untuk mengkaji perubahan morfologi proses kaki podocyte di bawah keadaan patologi dan sebagai tindak balas kepada pelbagai aplikasi ubat.

Penggunaan teknik SICM untuk menyiasat struktur permukaan tiga dimensi sampel tisu lembut, termasukglomerulusdan sel podocyte, pada mulanya diperkenalkan oleh Nakajima et al4. Penulis yang digunakanBuah pinggangkepingan untuk membandingkan teknik ini dengan SEM konvensional. Di sini, kami memperluaskan kajian ini kepada hidup glomerulus manusia. Dengan menggunakan pendekatan ini, kami mengungkapkan yang besar potensi teknik SICM untuk pemeriksaan yang cepat dan boleh dipercayaiglomerulushalangan penapisan. Salah satu kelebihan yang hebat SICM (sebagai tambahan kepada penggunaan sampel langsung) adalah bahawa ia tidak memerlukan pelbagai prosedur penyediaan sampel yang biasanya diperlukan untuk Pengimejan mikroskopi EM, termasuk penyelesaian dehidrasi dan penetapan. Oleh itu, SICM membolehkan mengelakkan pengecutan sampel yang diperhatikan dengan EM, yang boleh membawa kepada dimensi sebenar yang mengelirukan. Paling penting SICM masa nyata pada glomeruli yang baru terpencil juga membolehkan ujian dinamik pergerakan proses kaki sebagai tindak balas kepada pendedahan akut kepada ubat-ubatan yang menarik. Akhirnya, pipet SICM boleh digunakan untuk melakukan rakaman tampalan-pengapit arus saluran tunggal.18 Untuk tujuan ini, selepas pembinaan semula peta topografi, perisian pemerolehan (ICAPPIC Ltd, UK) dibenarkan untuk dikawal brek probe melompat kaca SICM pada permukaan ruang, mengurangkan rintangan mikroelektrod kepada keadaan tampalan-pengapit (7 hingga 12 MΩ) dan menjadikannya sesuai untuk rakaman saluran tunggal dalam percubaan yang sama. SICM benarkan pemilihan lokasi tepat elektrod tampalan-pengapit pada permukaan sel berdasarkan data topografi oleh pendekatan menegak yang dikawal dengan baik dengan ketepatan nanometre, menghasilkan pembentukan mudah gigaseal kenalan dengan membran selular yang dipanggil Smart Patch.19

Ringkasnya, kaedah yang diterangkan di sini mempunyai potensi yang sangat baik untuk kajian glomeruli dan segmen nephron lain yang baru terpencil. Tambahan pula, ia menunjukkan bahawa ia adalah mungkin untuk menggunakan manusiaBuah pinggangsampel tanpa penyediaan terperinci untuk menilai morfologi perubahan dalam kajian patologi.

Cistanche untuk penyakit buah pinggang

PENGHARGAAN

Penyelidikan di makmal penulis dibiayai oleh Jabatan Jabatan Hal Ehwal Veteran I01 BX004024, Jantung, Paru-paru, dan Darah Kebangsaan Institut R35 HL135749 dan P01 HL116264, Institut Kebangsaan Diabetes dan Pencernaan dan Pencernaan danBuah pinggangPenyakit R01 DK126720, dan Peningkatan Kerjaya Penyelidikan Persatuan Fisiologi Amerika Anugerah.

KONFLIK KEPENTINGAN

Dr. Andrew Shevchuk adalah pemegang saham dan menerima perundingan yuran daripada ICAPPIC Ltd. Semua penulis lain menyatakan tidak bersaing Kepentingan

SUMBANGAN PENGARANG

Ruslan Bohovyk: Konseptualisasi (sama); Pemilihan data (petunjuk); Analisis formal (memimpin); Draf penulisan-asal (sama); Penulisan-ulasan & mengedit (sama). Mykhailo Fedoriuk: Data curation (menyokong); Analisis formal (menyokong); Penulisan-ulasan & penyuntingan (sama). Elena Isaeva: Konseptualisasi (menyokong); Pemilihan data (menyokong); Analisis formal (menyokong); Draf penulisan-asal (menyokong); Penulisan-ulasan & penyuntingan (sama). Andrew Shevchuk: Konseptualisasi (menyokong); Perisian (menyokong); Menulis draf asli (menyokong); Penulisan-ulasan & penyuntingan (sama). Oleg Palygin: Konseptualisasi (sama); Analisis formal (menyokong); Metodologi (menyokong); Pentadbiran projek (menyokong); Draf penulisan-asal (menyokong); Penulisan-ulasan & penyuntingan (sama). Alexander Staruschenko: Konseptualisasi (memimpin); Pentadbiran projek (lead); Sumber (petunjuk); Penyeliaan (petunjuk); Penulisan-asal draf (sama); Penulisan-ulasan & penyuntingan (sama).

PENYATA KETERSEDIAAN DATA

Data yang menyokong penemuan kajian ini boleh didapati dari pengarang yang sepadan atas permintaan yang munasabah.