Penyiasatan Kesan Hipertiroidisme Terhadap Tekanan Retikulum Endoplasma Dan Reseptor Tran Sient Potensi Kanonik 1 Saluran dalam Buah Pinggang
Mar 14, 2022
untuk maklumat lanjut:ali.ma@wecistanche.com
Nuriye Ezgi BEKTUR AYKANAT1,*,Erhan ŞAHİN2, Sedat KAÇAR2, Rıdvan BAĞCI3, Şerife KARAKAYA2,Dilek BURUKOĞLU DÖNMEZ2, Varol ŞAHİNTÜRK2
1Bahagian Histologi dan Embriologi, Fakulti Perubatan, Universiti Atılım, Ankara, Turki2Jabatan Histologi dan Embriologi, Fakulti Perubatan, Universiti Osmangazi, Ankara, Turki 3Jabatan Makmal Andrologi Unit IVF, Hospital Pendidikan dan Penyelidikan Bandar Adana, Adana, Turki
Latar belakang/matlamat:Hipertiroidismedikaitkan dengan keputusan dalam peningkatan kadar penapisan glomerular serta peningkatan pengaktifan renin-angiotensin-aldosteron. Gangguan homeostasis Ca2 ditambah dalam retikulum endoplasma (ER) dikaitkan dengan banyak penyakit, termasuk nefropati diabetik danhipertiroidisme. Saluran berpotensi reseptor sementara kanonik 1 (TRPC1) ialah protein keluarga TRPC klon pertama. Walaupun ia dinyatakan di banyak tempat dibuah pinggang, fungsinya tidak pasti. TRPC1 terlibat dalam mengawal selia Ca2 ditambah homeostasis, dan penyelarasannya meningkatkan tahap ER Ca2 tambah, mengaktifkan tindak balas protein terungkap, yang membawa kepada kerosakan selular dalambuah pinggang. Kajian ini menyiasat peranan TRPC1 dalambuah pinggangtikus hipertiroid dari segi penanda tekanan ER iaitu protein terkawal glukosa 78 (GRP78), mengaktifkan faktor transkripsi 6 (ATF6), (kinase retikulum endoplasma seperti protein kinase R (PKR) (PERK), enzim yang memerlukan Inositol 1 (IRE1).
Bahan dan kaedah: Dua puluh ekor tikus jantan telah ditugaskan ke dalam kumpulan kawalan dan hipertiroid (n=10).Hipertiroidismetelah diinduksi dengan menambahkan 12 mg/L tiroksin ke dalam air minuman tikus selama 4 minggu. T3 dan T4 bebas serum (fT3, fT4), TSH, nitrogen urea darah (BUN), dan tahap kreatinin diukur. Analisis histokimia bagibuah pinggangbahagian untuk perubahan morfologi dan juga analisis imunohistokimia dan western blot bahagian buah pinggang dilakukan untuk antibodi GRP78, ATF6, PERK, IRE1, TRPC1.
Keputusan: Tahap TSH, BUN, dan kreatinin menurun manakala tahap fT3 dan fT4 meningkat pada tikus hipertiroid. Analisis morfologi menghasilkan penebalan membran basal kapilari dalam glomeruli dan juga western blot, dan keputusan imunohistokimia menunjukkan peningkatan TRPC1, GRP78, dan ATF6 dalam tikus hipertiroid (p <>
Kesimpulan: Kesimpulannya, dalam kajian kami, kami menunjukkan buat kali pertama bahawa hubungan antara tekanan ER dan TRPC1, dan peningkatan ekspresi mereka menyebabkan kerosakan buah pinggang pada tikus hipertiroid.
Kata kunci:Hipertiroidisme, tegasan retikulum endoplasma (ER), potensi reseptor sementara kanonik 1 (TRPC1),buah pinggang, tikus
1. Pengenalan
Triiodothyronine (T3) dan thyroxine (T4) adalah hormon tiroid yang diperlukan untuk perkembangan organ normal dan fungsi metabolik [1]. Selain itu, ia mengawal kadar pertumbuhan, fungsi pam natrium/kalium, denyutan jantung, tekanan darah, pernafasan, penggunaan oksigen, pencernaan, lipid, karbohidrat dan metabolisme protein, fungsi sistem saraf pusat, pergerakan, dan fungsi metabolik kelenjar endokrin yang lain [2] .
Hipertiroidismemempunyai banyak kesan ke atas kolesterol, trigliserida, lipid, pengoksidaan, antioksidan, malondialdehid (MDA), enzim katalase (CAT), enzim hati, asid urik, urea, kreatinin, dan perubahan histopatologi dalam hati dan buah pinggang [3]. Disfungsi tiroid menjejaskan fisiologi dan perkembangan buah pinggang. Dalam kes hipotiroidisme di mana kelenjar tiroid kurang berfungsi, jisim buah pinggang (nisbah jisim buah pinggang/badan) berkurangan, manakala dalam keshipertiroidismedi mana kelenjar bekerja keras, jisim buah pinggang meningkat [4]. Walau bagaimanapun, hipertiroidisme yang teruk mengakibatkan degradasi protein dan akhirnya atrofi buah pinggang. Hipertiroidisme menyebabkan peningkatan aliran darah buah pinggang (RBF) dan kadar penapisan glomerular (GFR) [5]. Dengan hipertiroidisme, penyerapan semula natrium dalam tubul proksimal, basolateral Na plus /K ditambah ATPase [6], pengubah Na plus /H plus apikal [7], dan Na plus /Pi kotransporter [8] meningkat. Juga, hormon tiroid mengaktifkan pengubah Na plus /Ca2 plus, mungkin melalui laluan berkait cAMP, dengan itu meningkatkan penyerapan kalsium dalambuah pinggang[9].
Kalsium ialah utusan kedua yang mengawal selia kebanyakan fungsi selular, termasuk ekspresi gen dan homeostasis selular [10], pelepasan neurotransmitter dan fungsi neuron [11], metabolisme, dan modulasi kehidupan sel [12]. Keluarga saluran potensi reseptor sementara (TRP) adalah salah satu daripada keluarga saluran kation terbesar. Keluarga TRP dibahagikan kepada subkumpulan TRPC (kanonikal), TRPM (melastatin), TRPP (polycystin), TRPV (vanilloid), TRPML (bucolic), TRPA (ankyrin), dan TRPN (seperti NOMPC). Telah diketahui bahawa protein TRPC membentuk saluran kation tidak selektif Ca2 ditambah telap dan oleh itu memainkan peranan penting dalam transduksi isyarat Ca2 ditambah. Keluarga TRPC mamalia mempunyai tujuh ahli yang dipanggil TRPC1-TRPC7 [13]. Ahli keluarga TRPC dinyatakan di bahagian yang berlainan dibuah pinggang. TRPC1, yang memainkan peranan terutamanya dalam nefropati diabetik, dinyatakan hampir di mana-mana, dalam sel mesangial buah pinggang, glomeruli, sel tubul proksimal, dan di bahagian menurun nipis gelung Henle, tetapi fungsi sebenar masih tidak diketahui [14].
Gangguan Ca2 plus yang teruk boleh mencetuskan kerosakan sel yang disebabkan oleh tekanan retikulum endoplasma (ER) sebagai tindak balas kepada pelbagai keadaan patologi [5,15]. Gangguan dalam Ca2 ditambah homeostasis dalam ER dikaitkan dengan banyak penyakit [16]. ER ialah organel intrasel yang penting untuk mengawal Ca2 ditambah homeostasis dan sintesis dan lipatan protein. Modulasi ekspresi/fungsi saluran telap Ca2 ditambah juga mempengaruhi kepekatan Ca2 ditambah intrasel dan seterusnya proses berkaitan Ca2 ditambah seperti percambahan sel, tekanan ER, apoptosis, dan autophagy. Tekanan ER ialah keadaan yang mengganggu keseimbangan redoks dan luminal Ca2 ditambah homeostasis, menyebabkan pengumpulan protein terbentang/salah lipatan. Pengaktifan tindak balas protein terungkap (UPR) menyebabkan peningkatan protein terkawal glukosa 78 (GRP78), pendamping ER, yang meningkatkan kapasiti lipatan protein ER [17]. Pengaktifan tekanan ER memulakan UPR yang dipelihara secara evolusi oleh tiga transduser isyarat utama membran ER: PERK, IRE1 dan ATF6. Disfungsi selular dan kematian sel berlaku dalam keadaan di mana tekanan ER berpanjangan secara kronik dan beban protein pada ER secara ketara melebihi. Adalah diketahui bahawa salah satu laluan yang menyebabkan kematian sel yang diperhatikan dalam penyakit kronik seperti hipoksia, iskemia / kecederaan reperfusi, neurodegenerasi, penyakit jantung, dan diabetes adalah disebabkan oleh tekanan ER [12].
Berdasarkan semua maklumat ini, kami berhasrat untuk menyiasat hubungan antara laluan transduksi isyarat TRPC1 dan tekanan ER dalambuah pinggang, yang terjejas secara amnya dalamhipertiroidisme.
Klik untukKegunaan Cistanche untuk gejala penyakit buah pinggang
2. Bahan-bahan dan cara-cara
2.1. Haiwan
Kajian kami telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Tempatan Universiti Eskişehir Osmangazi (keputusan no. 634 dalam mesyuarat no. 117 pada 30.11.2017) dan mengikuti Panduan Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal yang diterbitkan oleh Institut Kesihatan Nasional. Dua puluh ekor tikus dewasa (7–8 minggu) Wistar albino jantan, diperoleh dari Pusat Penyelidikan Eksperimen Perubatan dan Pembedahan (TICAM), dikekalkan pada 24 ± 2 darjah dan kelembapan 55 ± 5 peratus selama 12 jam dalam persekitaran yang terang/gelap semasa eksperimen itu. Haiwan diletakkan dalam sangkar polikarbonat selama 2 minggu sebelum eksperimen dan dibenarkan menyesuaikan diri dengan keadaan ambien, dan kemudian secara rawak ditugaskan untuk mengawal dan kumpulan hipertiroid. Kumpulan kawalan (euthyroid) diberi makan dengan makanan tikus standard dan air paip semasa eksperimen. Kumpulan hipertiroid ditubuhkan dengan makanan tikus standard selama 4 minggu dan minum air paip yang mengandungi 12 mg/L tiroksin [18]. Pada akhir minggu keempat, tikus telah dimatikan dengan suntikan intramuskular ketamin (45 mg/kg) dan xylazine (5 mg/kg). Dengan serta-merta, sampel darah intrakardiak diambil dari semua haiwan. Keseluruhanbuah pinggangtelah dikeluarkan melalui proses nefrectomy. Kemudian, kanan dan kiribuah pinggangtikus dipotong memanjang kepada dua bahagian. Kedua-dua buah pinggang kanan dan kiri digunakan untuk analisis western blot dan mikroskop cahaya
2.2. Analisis biokimia
Sampel darah telah disentrifugasi pada 11,000 rpm selama 10 minit. Sera diletakkan di dalam tiub dan disimpan pada -80 darjah sehingga hari analisis. Tahap T3 (fT3), T4 (fT4) bebas serum dan hormon perangsang tiroid (TSH) kemudian diukur menggunakan teknik ELISA mengikut protokol pengeluar. Tahap ekspresi Ketumpatan Optik (OD) dibaca pada 450 nm oleh pembaca plat mikro BioTek 800 (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA), kemudian hasilnya dikira. Kit komersial untuk fT3 (YLA0127RA), fT4 (YLA0239RA) dan TSH (YLA0047RA) telah dibeli dari Shanghai YL Biotech, China. Juga, serum darah urea nitrogen (BUN) dan tahap kreatinin diukur dengan kaedah fotometri penyerapan oleh Cobas Integra 400 Plus Roche (Roche Diagnostics Ltd., Switzerland).
2.3. Penilaian histologi
buah pinggangkepingan yang diambil untuk diperiksa pada aras mikroskop cahaya telah ditetapkan dalam 10 peratus formaldehid selama 48 jam. Selepas pemprosesan tisu rutin, blok parafin diperolehi. Kemudian, bahagian bersiri 5 µm diambil dan diwarnakan dengan teknik asid-Schiff berkala (PAS). Penilaian mikroskopik telah dilakukan untuk glomeruli dan tubul di bawah mikroskop Olympus BX-51 (Olympus America, Inc., New York, Amerika Syarikat). Bahagian dijaringkan secara buta, separa kuantitatif menggunakan skala pemarkahan yang ditetapkan. Bagi setiap tikus dalam kumpulan, sekurang-kurangnya 10 medan kuasa tinggi (×1000) telah diperiksa. Peratusan glomeruli yang menunjukkan penebalan membran bawah tanah glomerulus dijaringkan seperti berikut: 0=tiada, 1 Kurang daripada atau sama dengan 25 peratus , 2=25 peratus hingga 50 peratus , 3 =50 peratus hingga 75 peratus , 4 Lebih besar daripada atau sama dengan 75 peratus [19]. Ketebalan membran bawah tanah glomerular (µm) diukur oleh Perisian Mikroskop ZEISS ZEN 3.0 (Carl Zeiss Microscopy GmbH ZEISS Group, München, Jerman).
2.4. Penilaian imunohistokimia
Bahagian blok parafin dari setiap bahagianbuah pinggangtisu dibawa ke slaid bercas positif. Selepas penyahparafinan, slaid dipindahkan melalui siri etanol terdegradasi dan kemudian xylol. Bahagian tersebut diinkubasi dengan 3 peratus hidrogen peroksida untuk mengelakkan aktiviti peroksidase endogen. Selepas pengambilan antigen dengan penimbal sitrat, bahagian-bahagian telah dibatasi oleh pap-pen, dibasuh 3 × 5 minit dengan garam penampan fosfat (PBS), dan kemudian disekat dengan blok Ultra V selama 1 jam pada suhu bilik. Bahagian tersebut diinkubasi dengan antibodi ATF6 poliklonal arnab (ab203119, Abcam Inc., Cambridge, Amerika Syarikat), antibodi IRE1 poliklonal arnab (YID5384, Shanghai YL Biotech Co., Ltd, China), antibodi PERK monoklonal tetikus (sc377400, Santa Cruz Biotechnology Inc. ., Heidelberg, Jerman) dan antibodi TRPC1 monoklonal tikus (sc133076, Santa Cruz Biotechnology Inc.) semalaman pada ditambah 4 darjah dalam keadaan lembap. Selepas mencuci 3 × 5 minit dengan PBS, bahagian tersebut diinkubasi dengan antibodi sekunder yang sesuai (sc2359, sc2781, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) selama 1 jam pada suhu bilik. Kemudian, mereka telah dibasuh semula selama 3 × 5 minit dengan PBS dan diwarnakan dengan hematoxylin. Slaid telah digunakan penutup penutup menggunakan media berasaskan air. Pemeriksaan mikroskopik dilakukan menggunakan mikroskop Olympus BX51 dan sistem pengimejan berbantukan komputer (Olympus America, Inc., New York, USA).
Semua bahagian imunostain telah dinilai dengan cara berkod oleh pengarang utama, yang buta terhadap nama kumpulan eksperimen. Ekspresi TRPC1, ATF6, IRE1, dan PERK dikesan terutamanya dalam tubulus dan/atau glomeruli. Ungkapan ditentukan secara semikuantitatif mengikut peratusan positifbuah pinggangbahagian. Keamatan pewarnaan dikelaskan kepada empat gred: tiada ({{0}}), lemah (1), sederhana (2) dan kuat (3). Peratusan bahagian histologi buah pinggang positif dikelaskan sebagai 4 gred: 0 (0 peratus ), 1 (1 peratus –10 peratus ), 2 (11 peratus –49 peratus ) dan 3 (50 peratus –100 peratus). Jumlah skor adalah hasil dua markah dan skor akhir satu sampel ialah min bagi 10 medan mikroskopik. TRPC1, ATF6, IE1, dan PERK dinilai mengikut kaedah yang dilaporkan [20].
Fungsi cistanche-buah pinggang
2.5. Analisis Western blot
Untuk menentukan perubahan dalam jumlah protein tertentu dalambuah pinggangtisu daripadahipertiroidismedan kumpulan kawalan, buah pinggang dipotong menjadi kepingan kecil, dan penghomogenan dilakukan dengan menambahkan penimbal lisis RIPA kepada 2 mL tiub manik. Selepas penghomogenan, tiub diinkubasi pada 4 darjah selama sekurang-kurangnya 30 min, dan kemudian lisat tisu disentrifugasi pada 4 darjah, 15,000 g selama 20 minit. Supernatan yang mengandungi jumlah protein dipindahkan ke dalam tiub baru. Penentuan protein dilakukan dari supernatan dengan peranti Qubit 2.0 (Invitrogen Inc., Waltham, MA, USA). Lima puluh µg protein dimuatkan ke dalam setiap telaga, dielektroforesis dengan SDS-PAGE Bio-Rad MiniTrans Blot (Bio-Rad Laboratories, Inc., California, USA), dan kemudian dipindahkan ke membran PVDF dengan peranti Bio-Rad Trans Turbo. Membran telah disekat dengan 5 peratus albumin serum lembu (BSA) selama 1 jam pada suhu bilik dan kemudian, diinkubasi dengan antibodi GRP78 monoklonal tikus (sc166490, Santa Cruz Biotechnology Inc.), antibodi ATF6 poliklonal arnab (ab203119, Abcam Inc., Cam jambatan, Amerika Syarikat), antibodi IRE1 poliklonal arnab (YID5384, Shanghai YL Biotech Co. Ltd., China), antibodi PERK monoklonal tetikus (sc377400, Santa Cruz Biotechnology Inc.), antibodi TRPC1 monoklonal tikus (sc133076, Santa Cruz Biotechnology, Inc. ) dan antibodi monoklonal -aktin tikus (sc47778, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (untuk kawalan pemuatan) semalaman pada 4 darjah . Selepas itu, membran dibasuh selama 3 × 10 minit dengan larutan pencuci (TBST), diikuti dengan inkubasi dengan antibodi sekunder yang sesuai (sc2005, sc2030, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Selepas membran dibasuh selama 3 × 10 minit dengan TBST, tahap ekspresi protein dalam jalur imunoreaktif dipantau oleh sistem pengimejan (C-Digit, Licor, Cambridge, UK). Keputusan imej dianalisis dengan program Image J 1.49v.
2.6. Analisis statistik
Semua analisis statistik telah dilakukan dengan program pakej statistik IBM SPSS 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA). Percubaan Western blot diulang tiga kali untuk setiap kumpulan. Aras keertian telah diterima sebagai p < 0.05.="" ujian="" shapiro-wilk="" digunakan="" untuk="" menentukan="" taburan="" normal="" data.="" kehomogenan="" ujian="" varians="" (ujian="" levene)="" digunakan="" untuk="" menilai="" sama="" ada="" kumpulan="" mempunyai="" varians="" yang="" sama.="" ujian-t="" sampel="" bebas="" telah="" dilakukan="" untuk="" data="" yang="" menunjukkan="" taburan="" normal.="" ujian="" mann-whitney="" u="" dilakukan="" untuk="" data="" yang="" menunjukkan="" taburan="" bukan="">
3. Keputusan
3.1. Keputusan biokimia
Tahap serum fT3, fT4, dan TSH, serum BUN, dan tahap kreatinin kumpulan tikus ditunjukkan dalam Rajah 1. Keputusan mencadangkan bahawa tahap fT3 dan fT4 meningkat dengan ketara dalam kumpulan hipertiroid berbanding kumpulan kawalan (kedua-dua p < {{5="" }}.05).="" selain="" itu,="" penurunan="" ketara="" didapati="" dalam="" tahap="" tsh="" dalam="" kumpulan="" hipertiroid="" berbanding="" kumpulan="" kawalan="" (p="">< 0.05)="" (rajah="" 1a).="" tahap="" bun="" serum="" (rajah="" 1b)="" dan="" kreatinin="" (rajah="" 1c)="" menurun="" dengan="" ketara="" dalam="" kumpulan="" hipertiroid="" berbanding="" kumpulan="" kawalan="" (kedua-dua="" p=""><>
3.2. Keputusan histokimia
Perubahan histologi bagibuah pinggangdaripada kumpulan tikus ditunjukkan dalam Rajah 2. Histologi buah pinggang (glomeruli, tubul, dan struktur vaskular) adalah tipikal dalam kumpulan kawalan (Rajah 2A). Walau bagaimanapun,hipertiroidismemenyebabkan penebalan membran basal kapilari dalam glomerulus (Rajah 2B). Ketebalan membran bawah tanah glomerular meningkat dengan ketara dalam kumpulan hipertiroid berbanding kumpulan kawalan (Rajah 3–4), (p < 0.05).="" tiada="" perbezaan="" yang="" jelas="" antara="" kumpulan="" kawalan="" dan="" hipertiroid="" dari="" segi="" histologi="">
Rajah 1. Paras triiodothyronine (fT3) percuma, tiroksin bebas (fT4), dan hormon perangsang tiroid (TSH) bagi kumpulan tikus (a). * Berbeza daripada kumpulan kawalan (p < 0.05).="" tahap="" serum="" bun="" (b)="" dan="" kreatinin="" (c)="" kumpulan="" tikus.="" *berbeza="" daripada="" kumpulan="" kawalan="" (p=""><0.001), ujian-t="" sampel="" bebas="" telah="">
Rajah 2. Mikrograf bagibuah pinggangkumpulan tisu kawalan (A) dan hipertiroid (B). Dalam kumpulan kawalan, histologi buah pinggang tipikal dilihat (A). Dalam kumpulan hipertiroid,hipertiroidismemenyebabkan penebalan membran basal kapilari dalam glomerulus. Penebalan membran basal kapilari dalam glomerulus (anak panah) diperhatikan (B). Tiada perbezaan yang jelas dalam medula buah pinggang dalam kedua-dua kumpulan tikus. (Pewarnaan asid berkala-Schiff (PAS). Bar ialah 20 µm dan 50 µm.
3.3. Keputusan imunohistokimia
Tindak balas imunohistokimia TRPC1, GRP78, ATF6, IRE1, PERK, dan ekspresinya ditentukan secara separuh kuantitatif mengikut peratusan positifbuah pinggangdaripada kumpulan tikus (Rajah 5–9). Juga, variasi purata mereka ditunjukkan dalam Jadual. Berbanding dengan kumpulan kawalan TRPC1, GRP78, ATF6, IRE1, dan ekspresi protein PERK meningkat dengan ketara dalam kumpulan hipertiroid dalam glomerulus dan tubul (Rajah 5–9) (p < 0,000).="" keputusan="" menunjukkan="" bahawa="" trpc1="" dinyatakan="" dalam="" kedua-dua="" struktur="" glomerular="" dan="" tiub="" dalam="" kumpulan="" kawalan="" (rajah="" 5-1ab)="" dan="" ekspresinya="" meningkat="" dalam="" kumpulan="" hipertiroid="" (rajah="" 5-2ab).="" grp78="" tidak="" dinyatakan="" dalam="" kumpulan="" kawalan="" (rajah="" 6-1ab)="" dan="" tindak="" balas="" positifnya="" diperhatikan="" dalam="" kedua-dua="" tubul="" dan="" glomeruli="" dalam="" kumpulan="" hipertiroid="" (rajah="" 6-2ab);="" sedangkan,="" atf6="" tidak="" dinyatakan="" dalam="" kumpulan="" kawalan="" (rajah="" 7-1ab),="" ungkapannya="" telah="" bertindak="" balas="" secara="" positif="" dalam="" kedua-dua="" tubul="" dan="" glomeruli="" dalam="" kumpulan="" hipertiroid="" (rajah="" 7-2ab).="" ire1="" tidak="" dinyatakan="" dalam="" kumpulan="" kawalan="" (rajah="" 8-1ab),="" dan="" tindak="" balas="" positifnya="" diperhatikan="" dalam="" kedua-dua="" tubul="" dan="" glomeruli="" dalam="" kumpulan="" hipertiroid="" (rajah="" 8-2ab).="" manakala,="" perk="" tidak="" dinyatakan="" dalam="" kumpulan="" kawalan="" (rajah="" 9-1ab),="" ungkapan="" perk="" dihadkan="" kepada="" tubul="" dalam="" kumpulan="" hipertiroid="" (rajah="">
Rajah 3. Perbandingan ketebalan membran bawah tanah glomerular antara kumpulan kawalan dan hipertiroid. *Berbeza daripada kumpulan kawalan (p < 0.05),="" ujian-t="" sampel="" bebas="" telah="">
Rajah 4. Perbandingan pemarkahan ketebalan membran bawah tanah glomerular antara kumpulan kawalan dan hipertiroid. *Berbeza daripada kumpulan kawalan (p < 0.05),="" ujian="" mann–whitney="" u="" telah="">
3.4. Keputusan Western blot
Keputusan Western blot (Rajah 10) menunjukkan peningkatan ketara secara statistik dalam ungkapan TRPC1, PERK, ATF6 dan GRP78 dalam kumpulan hipertiroid berbanding kumpulan kawalan (p < 0.05).="" peningkatan="" ire1="" adalah="" ketara="" secara="" statistik,="" walaupun="" tidak="" sebanyak="" tahap="" protein="" lain="" (p=""><>Hipertiroidismemenyebabkan peningkatan dalam ekspresi GRP78 (2.16 kali ganda), ATF6 (2.82 kali ganda), PERK (1.95 kali ganda), IRE1 (1.60 kali ganda), dan TRPC1 (1.53 kali ganda) jika dibandingkan dengan kumpulan kawalan.
4. Perbincangan
Dalam kajian ini, kami mencadangkan buat kali pertama bagaimana tisu buah pinggang terjejashipertiroidismedari segi peranan tekanan ER dan saluran TRPC1 dalam proses ini. Dalam kajian kami, peningkatan ekspresi TRPC1 menyebabkan peningkatan kepekatan Ca2 ditambah dalam sel, khususnya, penebalan membran basal kapilari dan peningkatan ekspresi GRP78 dalam tubul, terutamanya dalam glomeruli. Kami berpendapat bahawa tekanan ER memainkan peranan aktif dalam proses kerosakan selular ini, terutamanya melalui transduser isyarat ATF6 dan PERK dalam laluan UPR (tindak balas protein terungkap).
Seperti yang dilihat dalam banyak kajian seperti dalam kajian kami [18], nilai fT3 dan fT4 meningkat dalam kes hipertiroidisme, manakala tahap TSH menurun. Sebarang disfungsi dalam tiroid boleh menjejaskan pengeluaran fT3 dan fT4 yang boleh dikaitkan dengan pelbagai patologi di seluruh badan [21]. Thebuah pinggangmemainkan peranan penting dalam perkumuhan bahan buangan dan toksin seperti urea, kreatinin, dan asid urik. Penilaian fungsi buah pinggang adalah penting dalam pengurusan pesakit dengan penyakit buah pinggang atau patologi yang menjejaskan fungsi buah pinggang. Ujian fungsi buah pinggang mempunyai kegunaan dalam mengenal pasti kehadiran penyakit buah pinggang, memantau tindak balas buah pinggang terhadap rawatan, dan menentukan perkembangan penyakit buah pinggang. Tahap kreatinin serum berkurangan dalam hipertiroidisme, bukan sahaja disebabkan oleh peningkatan GFR tetapi juga peningkatan kemusnahan otot. Juga, penurunan kepekatan BUN dalamhipertiroidismedianggap disebabkan oleh penurunan ekspresi aquaporin 1 dan 2. Oleh itu, tahap BUN dan kreatinin menurun dalam banyak kajian [22] seperti dalam kajian kami. Di bawah keadaan patologi, sel-sel mungkin kehilangan proteostasis yang mengakibatkan pengumpulan protein terbentang dan tersalah lipat dalam ER, yang mencetuskan tekanan UPR atau ER [23].
Rajah 5. Pewarnaan imunohistokimia untuk kumpulan TRPC1 dalam kawalan (1A-B) dan hipertiroid (2A-B) dalambuah pinggangtisu. Ekspresi TRPC meningkat dalam kumpulan hipertiroid berbanding kumpulan kawalan (anak panah). Bar ialah 50 µm. *Berbeza daripada kumpulan kawalan (p < 0.000),="" ujian="" mann–whitney="" u="" telah="">
Rajah 6. Pewarnaan imunohistokimia untuk kumpulan GRP78 dalam kawalan (1A-B) dan hipertiroid (2A-B) dalambuah pinggangtisu. Ekspresi GRP78 meningkat dalam kumpulan hipertiroid (anak panah). Bar ialah 50 µm. *Berbeza daripada kumpulan kawalan (p < 0.000),="" ujian="" mann–whitney="" u="" telah="">
Rajah 7. Pewarnaan imunohistokimia untuk kumpulan ATF6 dalam kawalan (1A-B) dan hipertiroid (2A-B) dalambuah pinggangtisu. Ekspresi ATF6 meningkat dalam kumpulan hipertiroid (anak panah). Bar ialah 50 µm. *Berbeza daripada kumpulan kawalan (p < 0.000),="" ujian="" mann–whit="" ney="" u="" telah="">
Rajah 8. Pewarnaan imunohistokimia untuk kumpulan IRE1 dalam kawalan (1A-B) dan hipertiroid (2A-B) dalambuah pinggangtisu. Ekspresi IRE1 meningkat dalam kumpulan hipertiroid (anak panah). Bar ialah 50 µm. *Berbeza daripada kumpulan kawalan (p < 0.000),="" ujian="" mann–whitney="" u="" telah="">
Rajah 9. Pewarnaan imunohistokimia untuk kumpulan PERK dalam kawalan (1A-B) dan hipertiroid (2A-B) dalambuah pinggangtisu. Ekspresi PERK meningkat dalam kumpulan hipertiroid (anak panah). Bar ialah 50 µm. *Berbeza daripada kumpulan kawalan (p < 0.000),="" ujian="" mann–whitney="" u="" telah="">
Gangguan dalam ER dan sitosolik Ca2 ditambah homeostasis dikaitkan dengan banyak penyakit, termasukbuah pinggang. Gangguan ER Ca2 ditambah homeostasis mencetuskan UPR, yang menghalang pengumpulan selanjutnya protein yang baru disintesis dalam ER. Oleh itu, ia menunjukkan mekanisme pertahanan prosurvival dengan mengurangkan beban ER [24].
Pelbagai faktor diketahui menyebabkan tekanan dan pencetus ERbuah pinggangkerosakan. Tekanan ER dalam buah pinggang boleh menyebabkan pembezaan sel epitelium tiub oleh peralihan mesenchymal dari epitelium, kehilangan sel epitelium tiub renal oleh apoptosis, dan akhirnya patologi buah pinggang termasuk kehilangan nefron, yang mengurangkan kapasiti penapisan buah pinggang. Dalam kajian Dickhout et al., proses peralihan epitelium-mesenchymal yang disebabkan oleh tekanan ER dalam garisan sel tubul proksimal renal HK-2 untuk penyakit buah pinggang kronik ditunjukkan [25]. Sebagai tambahan kepada banyak kajian [9] seperti yang dilihat dalam kajian kami,hipertiroidismemenyebabkan penebalan membran basal kapilari dalam glomerulus. Adalah dicadangkan bahawa peningkatan penebalan membran basal kapilari dalam glomeruli terbentuk akibat proses peralihan epitelium-mesenchymal disebabkan oleh peningkatan ekspresi penukar isyarat GRP78 dan ER-tekanan. Kepentingan tekanan ER telah ditunjukkan dalam kronikbuah pinggangpenyakit dalam banyak keadaan patologi. Dalam model diabetes yang disebabkan oleh streptozotocin dalam tikus C57BL / 6, tekanan ER berkembang, dan nefropati teruk yang berlaku pada bulan kedua puluh dua dikaitkan dengan peraturan CHOP / GADD153, salah satu komponen laluan apoptosis pengantara tekanan ER [26]. ]. Pada pesakit dengan sindrom nefrotik, nefropati IgA, glomerulonefritis proliferatif mesangial primer, dan nefropati membran, termasuk pesakit bergejala minimum, GRP78 dan molekul pendamping retikulum endoplasma (ER) yang boleh diinduksi protein terkawal oksigen 150 (ORP150) berbanding ekspresi imunohistokimia kawalan. Ekspresi CHOP / GADD153 juga meningkat dan penyetempatan nuklear diperhatikan dalam epitelium tubul proksimal pesakit nefrotik. Dalam sel buah pinggang manusia yang terdedah kepada albumin serum yang tinggi, induksi tekanan ER diperhatikan dan ditunjukkan menyebabkan apoptosis melalui laluan CHOP / GADD153 [25]. Tindak balas tekanan ER tubulointerstitial didapati dalam penyakit glomerular dengan apoptosis sel tubular yang dikaitkan dengan nefrosis nukleosida amino puromycin, kelebihan protein, dan proteinuria yang dikaitkan dengan nefropati diabetik eksperimen atau manusia [27]. Lorz et al. melaporkan bahawa paracetamol, agen analgesik, dan antipiretik, menyebabkan kerosakan tiub buah pinggang dan apoptosis akibat tekanan ER [28]. Paracetamol mendorong tindak balas tekanan ER termasuk aruhan CHOP dan belahan caspase-12. Pengumpulan protein rembesan yang berlebihan mendorong tekanan ER, menyebabkan kerosakan podosit [29]. Serangan pelengkap juga mendorong tekanan ER dan mengaktifkan laluan PERK yang membawa kepada kerosakan sel epitelium glomerular. Kesemua penemuan ini menunjukkan bahawa tekanan ER adalah salah satu punca utama kerosakan buah pinggang dan tindak balas tekanan ER adalah mekanisme pertahanan terhadapbuah pinggangkerosakan [30]. Dalam kajian kami, kami berpendapat bahawa 12 mg/L hipertiroidisme yang disebabkan oleh tiroksin menyebabkan tekanan ER dalam tisu buah pinggang, dan kerosakan yang disebabkan olehhipertiroidismedalam tisu buah pinggang dikaitkan dengan peraturan terutamanya ATF6 dan PERK.
Saluran TRP mamalia klon pertama, saluran ion TRPC1, terdapat dalam sel dalam ER, membran plasma, vesikel intraselular, dan ciliary primer. Ia mengekspresikan hampir di mana-mana dalam tisu manusia dan tikus. TRPC1 berinteraksi dengan pelbagai kumpulan protein, termasuk subunit saluran ion, reseptor, dan protein sitosol untuk mengantara kesannya pada isyarat Ca2 tambah. Ia bertindak sebagai saluran kation tidak selektif dalam laluan yang mengawal kemasukan Ca2 ditambah sebagai tindak balas kepada pengaktifan reseptor permukaan sel. Melalui fungsi ini, percambahan, kelangsungan hidup, pembezaan, rembesan, dan penghijrahan sel, serta ciri-ciri seperti kon pertumbuhan neuron dan gabungan myoblast bagi fungsi khusus sel kemotropik juga tersedia [12].
Terdapat banyak kajian mengenai perubahan ekspresi TRPC1 dalam banyak keadaan patologi yang menyebabkan tekanan ER. Sukumaran et al. menunjukkan bahawa terdapat korelasi antara tekanan ER dan ekspresi TRPC1 yang boleh mengubah survival sel dalam kelenjar air liur. Mereka menyatakan bahawa ekspresi TRPC1 menurun di bawah keadaan tekanan ER dan juga kematian sel akibat tekanan ER bergantung kepada ekspresi CHOP. Peningkatan tekanan ER dan penyusupan dalam sel kelenjar air liur TRPC1-/- tikus kalah mati diperhatikan [16].
Rajah 10. Thebuah pinggangTahap ekspresi protein GRP78, ATF6, TRPC1, IRE1 dan PERK serta graf perubahan lipatan. Peningkatan semua protein adalah ketara secara statistik (*p < 0.05),="" ujian-t="" sampel="" bebas="" telah="">
Bilabuah pinggangmodel tikus diabetes telah diperiksa, dilaporkan bahawa ekspresi mRNA TRPC1 telah menurun [31]. Pada pesakit dengan nefropati diabetik atau tikus diabetes Zucker berbanding dengan kawalan, penurunan ekspresi TRPC1 mencadangkan bahawa TRPC1 menjejaskan perkembangan nefropati diabetik [32]. TRPC1 memainkan peranan penting dalam penyelenggaraan ER Ca2 ditambah homeostasis, dan fungsi yang dikurangkan membawa kepada pengaktifan laluan UPR yang berpanjangan dan mengganggu pengaktifan AKT, yang kemudiannya membawa kepada neurodegenerasi. Penurunan dalam ekspresi TRPC1 diperhatikan dalam model penyakit Parkinson tikus yang disebabkan oleh neurotoksin. Peningkatan ekspresi TRPC1 meningkatkan survival neuron dengan mengawal laluan AKT / mTOR, walaupun tekanan ER dan UPR disebabkan oleh neurotoksin [33]. Li et al. melaporkan bahawa ekspresi TRPC1 juga meningkat dalam hipertrofi kardiomiosit yang disebabkan oleh Namptin bergantung pada masa. Apabila gen TRPC1 disenyapkan, ia mengakibatkan perencatan hipertrofi jantung yang disebabkan oleh nicotinamide phosphoribosyl transferase. Walau bagaimanapun, dengan overexpression TRPC1, nicotinamide phosphoribosyltransferase dianggap menyebabkan hipertrofi kardiomiosit oleh laluan yang disebabkan oleh tekanan ER. Dari sudut pandangan ini, pembungkaman gen TRPC1 mungkin memainkan peranan perlindungan dalam pencegahan hipertrofi jantung [34]. Dalam kajian kami, tekanan ER dan TRPC1 juga meningkat dengan ketara. Ini menunjukkan bahawa penebalan membran basal kapilari disebabkan oleh peningkatan tekanan ER dalam tisu buah pinggang disebabkan olehhipertiroidismeadalah disebabkan oleh peningkatan ekspresi TRPC1.
Kajian ini mempunyai beberapa batasan. Tikus yang diubah suai secara genetik mungkin telah digunakan dan bukannya model tikus hipertiroidisme yang disebabkan oleh tiroksin. Dengan air kencing yang dikumpul menggunakan sangkar metabolik, beberapabuah pinggangujian fungsi mungkin juga diukur dalam air kencing. Perubahan dalam tahap tekanan ER boleh disiasat menggunakan perencat TRPC1.
Hasil daripada kajian literatur kami, kesan hipertiroidisme terhadap hubungan antara tekanan ER dan saluran TRPC1 dalam tisu buah pinggang pertama kali ditunjukkan dalam kajian ini. Ia telah ditentukan bahawahipertiroidismemenyebabkan peningkatan ekspresi TRPC1 yang mendorong tekanan ER. Kami mencadangkan bahawa mengurangkan ekspresi TRPC1 mungkin merupakan strategi terapeutik yang berpotensi untuk yang disebabkan oleh hipertiroidbuah pinggangdan mungkin kerosakan organ lain.
Rujukan
1. Kim D, Kim W, Joo SK, Bae JM, Kim JH et al. Hipotiroidisme subklinikal, dan fungsi tiroid rendah yang normal dikaitkan dengan steatohepatitis dan fibrosis bukan alkohol. Gastroenterologi dan Hepatologi Klinikal 2018; 16 (1): 123-131. DOI: 10.1016/j.cgh.2017.08.014
2. Bolkiny Y, Toulson E, El-Atrsh A, Akela M, Farg E. Ekstrak akar Costus mengurangkan kelainan biokimia darah hipo-dan yang disebabkan oleh eksperimen.hipertiroidismepada tikus. Penyelidikan & Kajian Tahunan dalam Biologi 2019; 31 (5): 1-10. DOI: 10.9734/arb/2019/v31i530063
3. Sakr S, Abdel-Ghafar FR, Abo-El-Yazid SM. Selenium memperbaiki hepatotoksisiti akibat carbimazole dan tekanan oksidatif dalam tikus albino. Journal Coastal Life Medicine 2015; 3 (2): 930-936. DOI: 10.1016/j.jtemb.2010.07.002
4. Vargas F, Moreno JM, Rodríguez-Gómez I, Wangensteen R, Osuna A, et al. Fungsi vaskular dan buah pinggang dalam gangguan tiroid eksperimen. Jurnal Endokrinologi Eropah 2006; 154 (2): 197-212. DOI: 10.1530/tee.1.02093
5. Rhee CM. Interaksi antara tiroid danbuah pinggangpenyakit: gambaran keseluruhan bukti. Pendapat Semasa dalam Endokrinologi 2016; 23 (5): 407-415. DOI: 10.1097/Med.0000000000000275
6. Wijkhuisen A, Djouadi F, Vilar J, Merlet-Benichou C, Bastin J. Hormon tiroid mengawal perkembangan enzim metabolisme tenaga dalam tubul berbelit proksimal tikus. American Journal of Physiology-Renal Physiology 1995; 268 (4): 634-642. DOI: 10.1152/ajprenal.1995.268.4.F634
7. Baum M, Dwarakanath V, Alpern RJ, Moe OW. Kesan hormon tiroid pada kortikal renal neonatal Na plus /H plus antiporter. Buah Pinggang Antarabangsa 1998; 53 (5): 1254-1258. DOI: 10.1046/j.1523-1755.1998.00879.x
8. Alcalde AI, Sarasa M, Raldúa D, Aramayona J, Morales R et al. Peranan hormon tiroid dalam pengawalan pengangkutan fosfat buah pinggang pada tikus muda dan tua. Endokrinologi 1999; 140 (4): 1544-1551. DOI: 10.1210/endo.140.4.6658
9. Iglesias P, Bajo MA, Selgas R, Díez JJ. Disfungsi tiroid dan penyakit buah pinggang: kemas kini. Ulasan dalam Gangguan Endokrin dan Metabolik 2017; 18 (1): 131-144. DOI:
10.1007/s11154-016-9395-710. Selvaraj S, Watt JA, Singh BB. TRPC1 menghalang degenerasi sel apoptosis yang disebabkan oleh neurotoksin dopaminergik MPTP/MPP plus . Kalsium Sel 2009; 46 (3): 209-218. DOI: 10.1016/j.ceca.2009.07.008
11. Goda Y, Südhof TC. Peraturan kalsium pelepasan neurotransmitter: boleh dipercayai tidak boleh dipercayai? Pendapat Semasa dalam Biologi Sel 1997; 9 (4): 513-518. DOI: 10.1016/s0955-0674(97)80027-0
12. Sukumaran P, Schaar A, Sun Y, Singh BB. Peranan fungsi saluran TRP dalam memodulasi tekanan ER dan autophagy. Kalsium Sel 2016; 60 (2): 123-132. DOI: 10.1016/j.ceca.2016.02.012
13. Goel M, Sinkins WG, Zuo CD, Estacion M, Schilling WP. Pengenalpastian dan penyetempatan saluran TRPC dalam tikusbuah pinggang. American Journal of Physiology-Renal Physiology 2006; 290 (5): 1241-1252. DOI: 10.1152/ajprenal.00376.2005
14. Cubanov V, Kubanek S, Fiedler S, Mittermeier L, Gudermann T et al. Fungsi buah pinggang saluran TRP dalam kesihatan dan penyakit. Dalam: Emir TLR (editor). Neurobiologi Saluran TRP. ed pertama. Boca Raton, Florida, Amerika Syarikat: CRC Press/Taylor & Francis; 2017. ms 187-212.
15. Jeschke MG, Gauglitz GG, Lagu J, Kulp GA, Finnerty CC et al. Tekanan kalsium dan ER mengantara apoptosis hepatik selepas kecederaan terbakar. Jurnal Perubatan Selular dan Molekul 2009; 13 (8b): 1857-1865. DOI: 10.1111/j.1582-4934.2009.00644.x
16. Sukumaran P, Sun Y, Zangbede FQ, Nascimento da Conceicao V, Mishra B et al. Ekspresi dan fungsi TRPC1 menghalang tekanan ER dan kematian sel dalam sel kelenjar air liur. FASEB BioAdvanc es 2019; 1 (1): 40-50. DOI: 10.1096/fab.1021
17. Zhao Y, Yan Y, Zhao Z, Li S, Yin J. Perubahan dinamik penanda laluan tekanan retikulum endoplasma GRP78 dan CHOP dalam hippocampus tikus diabetes. Buletin Penyelidikan Otak 2015; 111: 27-35. DOI: 10.1016/j.brainresbull.2014.12.00618. Araujo A, Schenkel P, Enzveiler A, Fernandes T, Partita W et al. Peranan isyarat redoks dalam hipertrofi jantung yang disebabkan oleh eksperimenhipertiroidisme. Jurnal Endokrinologi Molekul 2008; 41 (6): 423-430. DOI: 10.1677/JME-08-002419. Wang Z, melakukan Carmo JM, Aberdein N, Zhou X, Williams JM et al. Interaksi sinergistik hipertensi dan diabetes dalam menggalakkan kecederaan buah pinggang dan peranan tekanan retikulum endoplasma. Hipertensi 2017; 69 (5): 879-891. DOI: 10.1161/hiper tensionaha.116.08560
20. Zhang LY, Zhang YQ, Zeng YZ, Zhu JL, Chen H et al. TRPC1 menghalang percambahan dan penghijrahan kanser payudara positif reseptor estrogen dan memberikan prognosis yang lebih baik dengan menghalang laluan PI3K/AKT. Penyelidikan dan Rawatan Kanser Payudara 2020; 182 (1): 21-33. DOI: 10.1007/s10549-020-05673-8
21. Aldubayan MA. Proanthocyanidin biji anggur mengurangkan tekanan oksidatif dan apoptosis yang terlibat dalam hati tikus hipertiroid. Penyelidikan & Semakan Tahunan dalam Biologi 2019: 1-11. DOI: 10.9734/arb/2019/v33i630138
22. Sonmez E, Bulur O, Ertugrul DT, Sahin K, Beyan E et al.Hipertiroidismemempengaruhi fungsi buah pinggang. Endokrin 2019; 65 (1): 144-148. DOI: 10.1007/s12020-019-01903-2
23. Yan M, Shu S, Guo C, Tang C, Dong Z. Tekanan retikulum endoplasma dalam akut iskemia dan nefrotoksikbuah pinggangkecederaan. Riwayat Perubatan 2018; 50 (5): 381-390. DOI: 10.1080/07853890.2018.1489142
24. Bezprozvanny I, MP Mattson. Kesalahan pengendalian kalsium neuron dan patogenesis penyakit Alzheimer. Trend dalam Neurosains 2008; 31 (9): 454-463. DOI: 10.1016/j.tins.2008.06.005
25. Dickhout JG, Carlisle RE, Austin RC. Hubungan antara hipertrofi jantung, kegagalan jantung, dan penyakit buah pinggang kronik: tekanan retikulum endoplasma sebagai pengantara patogenesis. Penyelidikan Peredaran 2011; 108 (5): 629-642. DOI: 10.1161/circresaha.110.226803
26. Wu J, Zhang R, Torreggiani M, Ting A, Xiong H et al. Induksi diabetes pada tikus C57B6 berumur mengakibatkan nefropati yang teruk: perkaitan dengan tekanan oksidatif, tekanan retikulum endoplasma dan keradangan. The American Journal of Pathology 2010; 176 (5): 2163-2176. DOI: 10.2353/ajpath.2010.090386
27. Cybulsky AV. Tekanan retikulum endoplasma dalam penyakit buah pinggang proteinurik.buah pinggangAntarabangsa 2010; 77 (3): 187-193. DOI: 10.1038/bulan.2009.389
28. Lorz C, Justo P, Sanz A, Subirá D, Egido J et al. Kecederaan tiub buah pinggang yang disebabkan oleh paracetamoli: peranan untuk tekanan ER. Journal of the American Society of Nephrology 2004; 15 (2): 380-389. DOI: 10.1097/01.asn.0000111289.91206.b0
29. Inagi R, Nangaku M, Onogi H, Ueyama H, Kitao Y et al. Penglibatan tekanan retikulum endoplasma (ER) dalam kecederaan podosit yang disebabkan oleh pengumpulan protein yang berlebihan.buah pinggangAntarabangsa 2005; 68 (6): 2639-2650. DOI: 10.1111/j.1523-1755.2005.00736.x
30. Yoshida H. ER tekanan dan penyakit. Jurnal FEBS 2007; 274 (3): 630-658. DOI: 10.1111/j.1742-4658.2007.05639.x
31. Nesin V, Tsiokas L. TRPC1. Dalam: Nilius B, Flockerzi V (penyunting). Saluran Kation Potensi Reseptor Transien Mamalia (TRP). ed ke-24. Berlin, Heidelberg, Jerman: Springer; 2014. ms 15-51.
32. He F, Peng F, Xia X, Zhao C, Luo Q et al. MiR-135a menggalakkan fibrosis buah pinggang dalam nefropati diabetik dengan mengawal selia TRPC1. Diabetologia 2014; 57 (8): 1726-1736. DOI: 10.1007/s00125-014-3282-0
33. Selvaraj S, Sun Y, Watt JA, Wang S, Lei S et al. Tekanan ER yang disebabkan oleh neurotoksin dalam neuron dopaminergik tetikus melibatkan pengurangan kawalan TRPC1 dan perencatan isyarat AKT / mTOR. The Journal of Clinical Investigation 2012; 122 (4): 1354-1367. DOI: 10.1172/JCI61332
34. Li J, Wu W, Zhao M, Liu X. Penglibatan TRPC1 dalam hipertrofi kardiomiosit yang disebabkan oleh Nampt melalui pengaktifan tekanan ER. Biologi Selular dan Molekul 2017; 63 (4): 33-37. DOI: 10.14715/CMB/2017.63.4.6