Salmonella Enterica Serovars Tanpa Gen TtrA Dan PduA Meningkatkan Tindak Balas Imun Sel Semasa Jangkitan Anak Ayam

Salmonella spp. adalah salah satu daripada patogen bawaan makanan utama yang bertanggungjawab menyebabkan kerugian ekonomi kepada industri ayam itik dan membawa akibat kepada kesihatan awam juga. Kedua-dua keupayaan survival patogen dalam persekitaran usus semasa keradangan serta hubungannya dengan sistem imun hos, memainkan peranan penting semasa jangkitan pada ayam. Objektif kajian ini adalah untuk mengukur kehadiran makrofaj dan populasi sel CD4+ /CD8+ menggunakan teknik imunohistokimia, dalam keturunan komersial ayam yang dijangkiti secara eksperimen oleh strain Salmonella jenis liar dan mutan. Enteritidis dan Salmonella Typhimurium tidak mempunyai gen ttrA dan pduA. Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA mencetuskan peratusan kawasan bernoda yang lebih tinggi daripada jenis liar, kecuali ayam bertelur ringan. Jangkitan Salmonella Typhimurium jenis liar dan Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA membawa kepada corak yang sama di mana, pada 1 dan 14 dpi, tonsil caecal dan ileum burung menunjukkan kawasan bernoda yang lebih ekspresif berbanding 3 dan 7 dpi. Dalam semua keturunan yang dikaji, penyusupan makrofaj yang ketara berbanding dengan sel CD4+ dan CD8+ telah diperhatikan. Secara keseluruhannya, haiwan yang dijangkiti strain mutan menunjukkan kawasan bernoda positif lebih tinggi daripada jenis liar. Pemadaman dalam kedua-dua gen ttrA dan pduA mengakibatkan penyusupan makrofaj dan CD{13}} dan CD{14}} yang lebih sengit dalam burung hos, menunjukkan tiada pengecilan patogen, walaupun dalam strain Salmonella yang berbeza.

manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun

Salmonella enterica adalah patogen bawaan makanan yang menimbulkan kerugian kepada ternakan serta memberi kesan secara langsung kepada kesihatan awam. Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (Salmonella Enteritidis) dan Typhimurium (Salmonella Typhimurium) telah dikaitkan terutamanya dengan jangkitan makanan selama beberapa dekad. Antara tahun 1995 dan 2010, Salmonella Enteritidis telah dikenalpasti dalam 34.2% daripada semua sampel positif Salmonella spp1. Selain itu, Winter et al.2 menerbitkan satu kajian besar yang menyiasat peranan gen pengekodan tetrathionate, memilih serotype Salmonella Typhimurium tetapi menggunakan tikus sebagai model eksperimen. Dengan mengambil kira perkara ini, memperdalam pengetahuan kami tentang interaksi hos-patogen boleh membantu meningkatkan kawalan dan pengukuran pembasmian. Beberapa faktor terlibat dalam patogenesis salmonellosis, seperti keupayaan patogen untuk mereplikasi dalam persekitaran mukus yang meradang, bergantung kepada pemerolehan nutrien dan respirasi anaerobik2. Walau bagaimanapun, ketersediaan nutrien tidak menjamin kemandirian bakteria dalam persekitaran yang kompetitif yang padat dihuni oleh mikroorganisma lain. Oleh itu, keupayaan Salmonella enterica untuk memetabolismekan tetrathionate menggunakan reduktase tetrathionate untuk menghasilkan 1,2-propanediol sebagai sumber tenaga memberikan kelebihan kecergasan. Enzim ini dibentuk oleh TtrA, TtrB, dan TtrC. Subunit pertama yang disebut tergolong dalam superfamili molibdopterin (MPT) dan mempunyai domain terikat FeS yang terlibat dalam pengurangan tetrathionate kepada tiosulfat (S2O3 2−)2–4. Te 1,2-propanediol digunakan oleh petak mikro bakteria (MCP). Struktur ini terdiri daripada tujuh protein yang berbeza, antaranya PduA adalah komponen utama struktur MCP5. Pertama, 1,2-propanediol ditukar kepada propionaldehid, yang seterusnya dikurangkan kepada propanol dan propionat oleh aktiviti propanediol dehydratase. Proses ini menjana ATP melalui fosforilasi, kecerunan elektron (1-propanol) kepada penjanaan semula NAD dan perantara (propionyl-CoA) yang boleh digunakan sebagai karbon dan sumber tenaga sepanjang metil sitrat melalui, bergantung kepada vitamin B12 yang disintesis secara endogen6. Semasa jangkitan ayam, keupayaan Salmonella enterica serovar untuk menyerang dan bertahan dalam sel epitelium usus dan makrofaj diikuti oleh pengelakan tindak balas imun7. Dalam konteks itu, jangkitan adalah fasa kritikal yang bergantung kepada interaksi antara sel bakteria dan perumah dan keupayaan bakteria untuk mengatasi halangan epitelium usus untuk menjamin kolonisasi dan replikasinya. Walau bagaimanapun, ia mengaktifkan tindak balas keradangan dan imun8 yang membawa kepada endositosis dan fagositosis oleh sel pembentangan epitelium dan antigen (APC). Aktiviti antimikrob sel ini mencetuskan tindak balas semula jadi melalui makrofaj dan pemasangan tindak balas imun adaptif bergantung pada pengaktifan CD4+ dan CD8+9. Untuk memberi penerangan tentang interaksi hos-patogen di sebalik jangkitan usus oleh Salmonella dalam ayam, kami menilai populasi sel sistem imun semasa kolonisasi usus dan jangkitan sistemik pada burung dari keturunan komersial yang dicabar oleh strain mutan jenis liar Salmonella Enteritidis dan Salmonella Typhimurium , membawa pemadaman dalam gen yang berkaitan dengan metabolisme tetrathionate (ttrA) dan 1,2-propanediol (PDU).

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Keputusan

Eksperimen 1—Cabaran Salmonella Enteritidis.

Keputusan pengiraan kehadiran sel tindak balas imun dalam tonsil caecal, sekum, ileum, dan hati daripada ayam pedaging, ayam petelur ringan, dan ayam petelur separuh berat ditunjukkan dalam Jadual 1, 2, dan 3. Kami mendapati lebih banyak CD 4+ dan penyusupan sel makrofaj daripada ayam pedaging yang dicabar dengan Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA (SEΔttrAΔpduA) berbanding ayam pedaging yang dicabar dengan strain jenis liar Salmonella Enteritidis (wt-SE) atau burung tidak dijangkiti, dalam semua tisu yang dinilai. Pengecualian ditemui untuk penyusupan sel CD4+ pada 3 dpi dalam tonsil caecal, ileum, dan hati, dan untuk penyusupan makrofaj pada 3 dan 14 dpi dalam hati daripada ayam pedaging tercabar SEΔttrAΔpduA. Selain itu, bilangan sel CD{13}} yang menyusup diperhatikan dalam kuantiti yang lebih besar daripada burung yang dicabar dengan SEΔttrAΔpduA pada 1 dan 7 dpi dalam sekum dan hati, pada 3 dpi dalam tonsil caecal, dan 14 dpi dalam ileum. Sebaliknya, burung yang dicabar wt-SE mempunyai penyusupan tinggi sel CD8+ dalam ileum dan tonsil caecal pada 1 dan 7 dpi, masing-masing (Tab. 1; Rajah Tambahan S1). Jadual 2, dan Rajah Tambahan S2 menunjukkan CD4+ dan CD8+, dan penyusupan makrofaj yang ditemui dalam tisu ayam petelur separa berat. Secara amnya, terdapat variasi yang besar antara kawasan infiltrat sel berkenaan kedua-dua ketegangan cabaran dan tisu yang dikaji. Burung yang dicabar dengan SEΔttrAΔpduA menunjukkan kawasan yang lebih tinggi diliputi oleh sel CD4+ (dalam ileum pada 1 dan 14 dpi, dan hati pada 7 dpi), dan makrofaj (dalam ileum pada 7 dpi, dan hati pada 3, 7 dan 14 dpi), berbanding dalam tisu yang sama burung yang dicabar wt-SE. Sebaliknya, sel CD8+ ditemui dalam jumlah yang lebih besar dalam tonsil caecal (pada 1 dan 7 dpi) dan sekum (pada 3 dpi) burung yang dicabar dengan ketegangan wt-SE. Diperhatikan secara berbeza dalam ayam pedaging dan anak ayam bertelur separuh berat, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA mencetuskan kawasan sel tindak balas imun yang kurang sengit daripada jenis liar, dalam cabaran daripada ayam bertelur ringan. Burung Wt-SEchallenged menunjukkan kawasan penyusupan CD{47}} yang lebih besar dalam tonsil caecal (pada 1 dan 3 dpi), sekum (pada 3, 7, dan 14 dpi), ileum (pada 1 dan 7 dpi) dan hati (pada 14 dpi). Begitu juga, cabaran dengan SEΔttrAΔpduA telah mengakibatkan pengurangan kawasan penyusupan kedua-dua CD8+ dalam tonsil caecal (pada 1 dpi) dan ileum (pada 7 dan 14 dpi), dan makrofaj dalam tonsil caecal dan sekum (pada 3 dpi), berbanding dengan burung yang dicabar wt-SE. Tiada perubahan ketara pada kawasan sel sistem imun CD8+ dan sel makrofaj diperhatikan dalam hati daripada burung yang dicabar SEΔttrAΔpduA dan wt-SE. Keputusan terperinci cabaran dengan ayam bertelur ringan ditunjukkan dalam Jadual 3 (lihat Rajah Tambahan S3).

Jadual 1. Perwakilan perbezaan ketara yang berkaitan dengan taburan kuantitatif sel tindak balas imun yang berbeza dalam organ ayam pedaging yang dijangkiti strain liar dan mutan Salmonella Enteritidis pada hari yang berbeza selepas jangkitan. DPI, hari selepas jangkitan; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis jenis liar; ns, tiada perbezaan yang ketara. Dalam setiap organ dan DPI, * bermaksud perbezaan dengan ANOVA dua hala diikuti dengan ujian perbandingan Bonferroni antara nilai strain liar dan mutan (*P Kurang daripada atau sama dengan 0.05; **P Kurang daripada atau sama dengan 0.01; ***P Kurang daripada atau sama dengan 0.001; ****P Kurang daripada atau sama dengan 0.0001). Ketegangan yang dibentangkan dalam jadual (∆-SE atau wt-SE) sebagai penting dalam organ dan DPI ialah yang menunjukkan kawasan inflasi utama kepada setiap sel.

Jadual 2. Perwakilan perbezaan ketara yang berkaitan dengan taburan kuantitatif sel tindak balas imun yang berbeza dalam organ ayam petelur separuh berat yang dijangkiti strain liar dan mutan Salmonella Enteritidis pada hari yang berbeza selepas jangkitan. DPI, hari selepas jangkitan; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis jenis liar; ns, tiada perbezaan yang ketara. Dalam setiap organ dan DPI, * bermaksud perbezaan dengan ANOVA dua hala diikuti dengan ujian perbandingan Bonferroni antara nilai strain liar dan mutan (*P Kurang daripada atau sama dengan 0.{{10}}5 ; **P Kurang daripada atau sama dengan 0.01; ***P Kurang daripada atau sama dengan 0.001; ****P Kurang daripada atau sama dengan 0.0001). Ketegangan yang dibentangkan dalam jadual (∆-SE atau wt-SE) sebagai penting dalam organ dan DPI ialah yang menunjukkan kawasan inflasi utama kepada setiap sel.

Jadual 3. Perwakilan perbezaan ketara yang berkaitan dengan taburan kuantitatif sel tindak balas imun yang berbeza dalam organ ayam petelur ringan yang dijangkiti strain liar dan mutan Salmonella Enteritidis pada hari yang berbeza selepas jangkitan. DPI, hari selepas jangkitan; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis jenis liar; ns, tiada perbezaan yang ketara. Dalam setiap organ dan DPI, * bermaksud perbezaan dengan ANOVA dua hala diikuti dengan ujian perbandingan Bonferroni antara nilai strain liar dan mutan (*P Kurang daripada atau sama dengan 0.{{10}}5 ; **P Kurang daripada atau sama dengan 0.01; ***P Kurang daripada atau sama dengan 0.001; ****P Kurang daripada atau sama dengan 0.0001). Ketegangan yang dibentangkan dalam jadual (∆-SE atau wt-SE) sebagai ketara dalam organ dan DPI ialah yang menunjukkan kawasan penyusupan utama kepada setiap sel.

sistem imun yang meningkatkan tumbuhan cistanche

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity

【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Eksperimen 2—Cabaran Salmonella Typhimurium.

Keputusan pengiraan kehadiran sel tindak balas imun dalam tonsil cecal, sekum, ileum, dan hati daripada ayam pedaging, ayam petelur separuh berat, dan ayam petelur ringan ditunjukkan dalam Jadual 4, 5, dan 6, masing-masing. Secara keseluruhannya, ayam pedaging yang dijangkiti strain mutan menunjukkan kawasan bertanda positif lebih tinggi daripada yang dicabar dengan strain jenis liar Salmonella Typhimurium (wt-STM), pada keempat-empat hari pensampelan. Selain itu, tiada perubahan sel tindak balas imun diperhatikan dalam kumpulan kawalan yang tidak dijangkiti. Kawasan sel CD4+ dalam semua tisu ayam daging telah mencapai perbezaan statistik pada 1 dpi, dengan penyusupan yang lebih besar untuk cabaran dengan Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA (STM∆ttrA∆pduA). Perbezaan ketara antara kawasan tindak balas imun terkuantif daripada burung yang dicabar STM∆ttrA∆pduA- dan wt-STM, dengan penyusupan yang lebih besar apabila cabarannya adalah dengan ketegangan mutan dalam sekum dan ileum pada 1 dpi, dan hati pada 14 dpi (CD{13}} sel); dalam sekum, ileum, dan hati pada 1 dan 14 dpi (makrofaj) (Jadual 4; Rajah Tambahan S4). Keputusan daripada burung bertelur separa berat tidak menunjukkan perbezaan statistik antara cabaran terikan jenis mutan dan liar untuk sel4+ CD dalam sekum dan sel8+ CD dalam tonsil caecal dan ileum sepanjang 4 hari. jangkitan selepas dinilai (Jadual 5; Gambar Tambahan S5). Walau bagaimanapun, apabila kawasan kepekatan yang signifikan bagi sel sistem imun diperhatikan, ayam bertelur separuh berat telah dicabar oleh STM∆ttrA∆pduA: kawasan penyusupan makrofaj utama dalam semua tisu yang dikaji (pada 1 dan 14 dpi); kawasan penyusupan utama sel CD4+ dalam tonsil caecal dan hati (pada 1, 7, dan 14 dpi) (Jadual 5; Rajah Tambahan S5). Jadual 6, dan Rajah Tambahan S6 menunjukkan CD4+, CD8+ dan penyusupan makrofaj yang terdapat dalam tisu ayam bertelur ringan. Burung yang dicabar dengan STM∆ttrA∆pduA menunjukkan kawasan sel sistem imun utama CD{38}} dan sel makrofaj dalam tonsil caecal dan sekum (pada 14 dpi), dan ileum (pada 1 dan 14 dpi) berbanding dengan sel tindak balas imun. kawasan tisu yang sama daripada burung yang dicabar wt-STM. Tiada perbezaan statistik untuk kawasan penyusupan CD{44}} telah ditemui dalam tonsil caecal, sekum dan ileum daripada burung yang dicabar. Berbeza dengan keputusan yang diperoleh dalam tisu lain, hati daripada burung yang dicabar STM∆ttrA∆pduA mempunyai kawasan bernoda sel tindak balas imun yang lebih ekspresif untuk sel CD4+ dan CD8+ pada semua empat dpi, dan makrofaj pada 1 dan 14 dpi.

Jadual 4. Perwakilan perbezaan ketara yang berkaitan dengan taburan kuantitatif sel tindak balas imun yang berbeza dalam organ ayam pedaging yang dijangkiti strain liar dan mutan Salmonella Typhimurium pada hari yang berbeza selepas jangkitan. DPI, hari selepas jangkitan; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium jenis liar; ns, tiada perbezaan yang ketara. Dalam setiap organ dan DPI, * bermaksud perbezaan dengan ANOVA dua hala diikuti dengan ujian perbandingan Bonferroni antara nilai strain liar dan mutan (*P Kurang daripada atau sama dengan 0.05; **P Kurang daripada atau sama dengan 0.01; ***P Kurang daripada atau sama dengan 0.001; ****P Kurang daripada atau sama dengan 0.0001). Ketegangan yang dibentangkan dalam jadual (∆-STM atau wt-STM) sebagai penting dalam organ dan DPI ialah yang menunjukkan kawasan inflasi utama kepada setiap sel.

Jadual 5. Perwakilan perbezaan ketara yang berkaitan dengan taburan kuantitatif sel tindak balas imun yang berbeza dalam organ ayam petelur separuh berat yang dijangkiti strain liar dan mutan Salmonella Typhimurium pada hari yang berbeza selepas jangkitan. DPI, hari selepas jangkitan; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium jenis liar; ns, tiada perbezaan yang ketara. Dalam setiap organ dan DPI, * bermaksud perbezaan dengan ANOVA dua hala diikuti dengan ujian perbandingan Bonferroni antara nilai strain liar dan mutan (*P Kurang daripada atau sama dengan 0.{{10}}5 ; **P Kurang daripada atau sama dengan 0.01; ***P Kurang daripada atau sama dengan 0.001; ****P Kurang daripada atau sama dengan 0.0001). Ketegangan yang dibentangkan dalam jadual (∆-STM atau wt-STM) sebagai penting dalam organ dan DPI ialah yang menunjukkan kawasan inflasi utama kepada setiap sel.

Jadual 6. Perwakilan perbezaan ketara yang berkaitan dengan taburan kuantitatif sel tindak balas imun yang berbeza dalam organ ayam bertelur ringan yang dijangkiti strain liar dan mutan Salmonella Typhimurium pada hari yang berbeza selepas jangkitan. DPI, hari selepas jangkitan; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium jenis liar; ns, tiada perbezaan yang ketara. Dalam setiap organ dan DPI, * bermaksud perbezaan dengan ANOVA dua hala diikuti dengan ujian perbandingan Bonferroni antara nilai strain liar dan mutan (*P Kurang daripada atau sama dengan 0.{{10}}5 ; **P Kurang daripada atau sama dengan 0.01; ***P Kurang daripada atau sama dengan 0.001; ****P Kurang daripada atau sama dengan 0.0001). Ketegangan yang dibentangkan dalam jadual (∆-STM atau wt-STM) sebagai signifikan dalam organ dan DPI yang menunjukkan kawasan penyusupan utama kepada setiap sel.

Perbincangan

Bakteria, apabila terdedah kepada keadaan anaerobik, boleh menggunakan substrat metabolik tetrathionate dan 1,2-propanediol untuk sumber tenaga dan pernafasan10. Oleh itu, Salmonella spp. telah lama tertakluk kepada penyiasatan tentang bagaimana pemadaman gen yang diketahui bertanggungjawab untuk laluan ini akan menjejaskan kemandirian mereka dalam perumah. Untuk pengetahuan terbaik kami, hanya satu kajian yang menyiasat peranan gen pengekodan tetrathionate dan propanediol secara serentak telah diterbitkan. Kumpulan penyelidikan kami melaporkan kesan pemadaman ini dengan menilai jangkitan sistemik dan perkumuhan najis Salmonella Enteritidis dan Salmonella Typhimurium dalam keturunan komersial anak ayam11. Untuk meningkatkan perbincangan mengenai subjek ini, keputusan sekarang menyerlahkan sel imun yang menyusup dalam tisu berlainan keturunan anak ayam yang dicabar dengan kedua-dua jenis liar dan strain mutan yang membawa penghapusan dalam gen ttrA dan pduA. Sepanjang 2-percubaan minggu, kawasan sel CD4+ dan CD{9}} yang diwarnakan secara positif dan makrofaj mengikut kebanyakannya corak yang serupa, di mana pada 1 dan 14 dpi menunjukkan bilangan tindak balas imun yang lebih tinggi sel. Ini boleh dijelaskan oleh sentuhan utama sistem pertahanan perumah apabila patogen menyerang. Laporan sebelum ini telah menunjukkan bahawa pada ayam yang dijangkiti, walaupun Salmonella tidak dikumuhkan pada 12 dpi, jangkitan boleh menjadi positif dengan swab kloaka dari 13 dpi12, menjelaskan mengapa kawasan sel sistem imun pada 3 dan 7 dpi lebih rendah tetapi kembali kepada peningkatan. . Pada pandangan pertama, dijangkakan bahawa tindak balas yang ditimbulkan oleh tuan rumah akan dikurangkan apabila kedua-dua pduA dan ttrA dipadamkan kerana gen ini memainkan peranan penting dalam kelangsungan hidup semasa jangkitan oleh Salmonella2,4,13-15. Walau bagaimanapun, keputusan kami membandingkan mutan berganda yang tidak mempunyai kedua-dua gen menunjukkan sebaliknya, strain mutan Salmonella Enteritidis dan Salmonella Typhimurium mencetuskan sel tindak balas imun yang lebih tinggi daripada jenis strain liar.

Kebaikan cistanche tubulosa-menguatkan sistem imun

Kawasan bernoda terpendek boleh membawa kepada bilangan koloni yang tinggi pada saluran usus, menyokong kajian terdahulu, di mana strain Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA dan Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA ditemui dalam jumlah yang lebih tinggi daripada swab kloaka berbanding jenis liarnya yang berkorelasi11 . Salmonella boleh bertindak sebagai bakteria ekstraselular atau intrasel, bergantung pada himpunan nutrien yang ada, dan berlaku sebagai pertukaran antara kolonisasi usus dan internalisasi ke dalam sel perumah16. Apabila bakteria ditelan dan dibunuh oleh makrofaj, beberapa serpihan peptida dipindahkan ke permukaan sel pembentang antigen, dikodkan oleh kompleks histokompatibiliti utama (MHC), kelas II. Pengikatan peptida–MHC II ini merangsang limfosit4+ T CD. Walau bagaimanapun, jika bakteria memutuskan untuk menyerang sel perumah, memasuki sitoplasma makrofaj, sambungan peptida dengan jenis MHC lain, kelas I, merangsang pengeluaran limfosit8+ T CD17. Menariknya, sel CD4+ dan CD8+ membentangkan corak makrofaj yang sama sepanjang percubaan, malah mewakili tindak balas imun yang berbeza. Memandangkan sel CD4+ dan CD8+ terutamanya mewakili limfosit T yang merupakan sebahagian daripada tindak balas imun adaptif, makrofaj, adalah sebahagian daripada tindak balas imun semula jadi9. Di samping itu, kami memerhatikan bahawa ayam pedaging menunjukkan kawasan bertanda positif yang lebih ekspresif daripada ayam petelur, disahkan oleh kajian terdahulu di mana ayam pedaging yang dicabar dengan strain mutan menunjukkan, sebagai contoh, penjajahan usus yang lebih invasif dan jangkitan sistemik11. Penemuan kami mencadangkan bahawa pendekatan imunohistokimia memberikan maklumat menarik tentang kelakuan sel tindak balas imun pada pelbagai organ keturunan komersial yang berbeza semasa jangkitan oleh Salmonella enterica serovars. Lebih-lebih lagi, bukti kajian sekarang bahawa pemadaman kedua-dua gen, walaupun dalam strain Salmonella yang berbeza, mengakibatkan bakteria yang menimbulkan sel tindak balas imun yang lebih tinggi dalam tuan rumah, menunjukkan bahawa patogen belum dilemahkan. Kita boleh menganggap bahawa mungkin Salmonella dapat mencari satu lagi mekanisme kelangsungan hidup yang menjadi lebih patogenik. Penggunaan ttr dan pdu operon selaras dengan cob dan PRP operon telah ditunjukkan, dalam kajian terdahulu, seperti yang diperlukan untuk respirasi anaerobik16, membawa kita untuk percaya bahawa bukan sahaja diperlukan untuk memadam lebih banyak gen daripada setiap operon18, tetapi kita juga mempunyai untuk merenung memadam keseluruhan set ini, untuk mencapai kurang strain patogenik Salmonella enterica.

Bahan dan kaedah

Eksperimen, yang dilakukan mengikut garis panduan dan peraturan yang berkaitan, telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Penggunaan Haiwan Universiti Negeri Sao Paulo (CEUA/Unesp Process—006621/18; pada 10 Mei 2018), telah dijalankan dalam Patologi Burung Makmal Jabatan Patologi, Teriogenologi, dan Satu Kesihatan dari Pusat Pengajian Sains Pertanian dan Veterinar, Universiti Negeri Sao Paulo (FCAV/ Unesp), Jaboticabal, Brazil.

Strain bakteria dan pembinaan mutan.

Strain bakteria yang digunakan di sini disimpan dalam medium cryoprotectant yang dikompaun oleh sup Lysogeny (LB; BD DifcoTM, USA) ditambah dengan 30% gliserol (Merck, BR—H30402394 228) dan penyimpanan dalam penyejuk beku ultra (− 80 darjah ) di Makmal Patologi Burung dari FCAV/UNESP. Salmonella Enteritidis P125109 (nombor penyertaan: AM933172) dan Salmonella Typhimurium str. 9819 telah diinduksi kepada rintangan asid nalidiksik dan spektinomisin (Nalr Spcr) dan mereka menyediakan latar belakang genetik untuk membina strain mutan oleh teknik Lambda-red20 dengan pengubahsuaian kecil, diterangkan dalam Saraiva et al.11. Bakteria mutan yang dibina di sini dikenal pasti pada teks sebagai SEΔttrAΔpduA (Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA) dan STMΔttrAΔpduA (Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆due).

Percubaan dalam vivo.

Eksperimen 1—Salmonella Enteritidis. Anak ayam berumur tiga puluh enam 1-hari daripada setiap tiga keturunan berbeza (ayam pedaging, ayam petelur separuh berat dan ayam petelur ringan), berjumlah seratus lapan ekor, diperoleh daripada penetasan komersial. Semasa ketibaan, bahagian bawah kotak kad pengangkutan telah diperiksa untuk mengesahkan status bebas Salmonella burung21, dan haiwan itu ditempatkan di dalam sangkar logam di dalam bilik yang disesuaikan dan menerima suapan tanpa antibiotik dan air secara ad libitum. Program cahaya 24-h telah dipilih pada hari pertama untuk memastikan pengambilan air dan makanan yang optimum, kemudian program cahaya 12-h telah diterima pakai pada minggu pertama, menurun kepada 8 jam pada hari yang tinggal. Inokulum disediakan mengikut Berchieri Junior et al.22. Untuk ini, kultur beku telah diinokulasi dalam LB dan diinkubasi semalaman pada 37 darjah di bawah 15{15}} rpm. Pada hari berikutnya, kultur bakteria dipindahkan ke dalam media segar dan diinkubasi selama 18 jam di bawah keadaan yang sama seperti sebelumnya. Kemudian, 0.2 mL daripada kultur yang mengandungi 108 unit pembentuk koloni per mL (CFU/mL) telah disuntik secara lisan oleh gavage logam terus ke dalam tanaman burung. Sembilan kumpulan telah dibentuk (A hingga I) dan dibahagikan secara rawak mengikut keturunan dan strain yang berbeza (Jadual 7). Pada satu, tiga, tujuh, dan 14-hari selepas jangkitan (dpi), tiga ekor burung setiap kumpulan setiap hari, pada waktu pagi, telah dieutanasi dengan dislokasi serviks untuk menuai bahagian medial tonsil caecal, sekum, dan ileum, dan bahagian distal lobus kiri hati untuk analisis imunohistokimia (IHC) selanjutnya. Untuk ini, sampel telah direndam dalam n-Hexane pa (n-Hexano pa, Synth, Brazil) yang sebelum ini disejukkan dalam nitrogen cecair. Sejurus selepas pembekuan tisu, ia dipindahkan ke dalam 2 mL cryotube (Corning, USA) dan dikondisikan dalam nitrogen cecair. Selepas pensampelan, tisu disimpan pada -80 darjah sehingga proses untuk IHC.

Eksperimen 2—Salmonella Typhimurium. Eksperimen ini dijalankan mengikut ciri-ciri yang sama yang dinyatakan di atas dalam Eksperimen 1. Tiga puluh enam ekor anak ayam (1 hari) dibahagikan secara rawak kepada sembilan kumpulan (A hingga I) berdasarkan keturunan dan strain mereka (Jadual 7).

Jadual 7. Menubuhkan kumpulan mengikut keturunan dan strain yang berbeza. SE∆ttrA∆pduA, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; STM∆ttrA∆pduA, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis jenis liar; wt-STM, Salmonella Typhimurium jenis liar; NC, kawalan negatif.

Imunohistokimia.

Bahagian tisu. Sampel yang dikumpul telah dipindahkan dari -80 darjah ke cryostat (Leica CM1860, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Jerman) pada -22 darjah di mana disekat secara individu dalam kompaun OCT (Tissue-Tek®, Sakura Finetek Europe BV, Belanda) setiap 30 minit sebelum kepada bahagian 6 µm menggunakan bilah pakai buang profil rendah (Leica 819, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Jerman). Perlu diperhatikan bahawa bahagian telah dilakukan pada -22 darjah, kecuali bahagian hati, yang dilakukan pada -15 darjah. Slaid yang mengandungi tiga ulangan pembahagian setiap organ setiap tindak balas sel imun yang ditanda telah disediakan, dengan penipisan antara setiap ulangan. Menggunakan berus cat, potongan bahagian tisu diletakkan pada slaid histologi yang telah dirawat dengan poli-l-lisin (Sigma-Aldrich, United Kingdom, Cat no. P4832) dan silane (Sigma-Aldrich, Amerika Syarikat. Cat no. 440574). Slaid disimpan pada -20 darjah selepas itu sehingga pewarnaan IHC. Pewarnaan sel imun. Pertama, slaid telah direndam dalam 200 mL aseton yang disejukkan (Acetone PA-ACS, Synth, Brazil) dan diinkubasi pada -20 darjah selama 10 minit. Selepas itu, slaid dipindahkan ke dalam ruang kelembapan (EasyPath®, Brazil) pada suhu bilik selama 5 minit untuk mengeringkan sampel. Slaid itu dibasuh selepas itu dengan PBS dan lopak dibiarkan selama 5 minit untuk mengelakkan dehidrasi tisu. Sepuluh, tisu direndam dalam 200 mL 4% H2O2 setiap 10 minit di tempat yang gelap dan dibasuh semula dengan PBS. Kawasan di sekeliling bahagian tisu telah dikeringkan dengan kertas penyerap dan sampel telah dipintas oleh pen hidrofobik (Dako Pen, Dako Denmark A/S, Denmark). Langkah membasuh meninggalkan lopak diulang seperti sebelumnya. Kit bebas biotin Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB IHC Detection—Micropolymer (Abcam©, USA) digunakan untuk mengotorkan sel imun, memilih kaedah Avidin-Biotin Streptavidin Peroxidase Complex (ABC). Untuk ini, lopak telah dialihkan, dan titisan reagen penyekat warna latar belakang yang tidak khusus telah ditambahkan pada tisu. Slaid dikekalkan di dalam ruang kelembapan di tempat gelap selama 30 minit, langkah mencuci diulang dan 200 µL antibodi primer (CD Anti-Ayam Tetikus4-UNLB; CD Anti-Ayam Tetikus{{34} } UNLB; Monocyte Anti-Chicken Monocyte/Macrophage-UNLB, Southern Biotech, USA) dicairkan dalam perkadaran 1:200 (v/v) dalam reagen pencair antibodi (Pencair antibodi, Abcam©, USA) telah ditambah selepas itu. Slaid diinkubasi pada 4 darjah selama 18 jam. Pada hari berikutnya, slaid dicuci seperti sebelumnya. Sepuluh, titisan antibodi sekunder (Reveal Complement, Abcam©, USA) telah ditambah selepas mengeluarkan PBS yang berlebihan, dan ruang kelembapan diletakkan dalam ambien gelap selama 30 minit. Selepas itu, setitik 3,3'-diaminobenzidine (DAB Chromogen 50×, Abcam©, USA) telah dicairkan dalam 1 mL substrat (DAB Substrat, Abcam©, USA), yang jumlahnya cukup untuk tiga slaid, dan ditambah kepada bahagian tisu. Satu minit kemudian, slaid direndam dalam 200 mL dH2O selama 5 minit. Selepas itu, mereka dipindahkan ke kiub plastik yang mengandungi Harris hematoxylin (Êxodo Científca, Brazil) dan dibiarkan selama 1 minit. Di bahagian belakang, slaid dibasuh selama 10 minit di bawah air yang mengalir pada tekanan rendah. Slaid telah diserahkan kepada siri alkohol-xilena (70% Alkohol, 90% Alkohol, 100% Alkohol, Xylena I, dan Xylena II). Pada akhirnya, slip penutup diletakkan pada slaid selepas menambah setitik medium pelekap tanpa air (Entellan®, Merck, Brazil). Imej daripada bahagian tisu diambil secara rawak, memilih lima medan pandangan rawak, menggunakan mikroskop optik (kanta 400×) (Coleman®, model N-120) dengan penyesuai kamera digital, untuk analisis statistik selanjutnya (Gamb. 1 ).

Analisis data.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Peratusan CD{{0}} dan CD8+ sel dan makrofaj telah dikira menggunakan Image-Pro Plus v.4.5.0.29 (MediaCybernetics, USA). Mereka dikira sebagai nilai peratusan oleh penanda sel imun kawasan positif/jumlah kawasan. Analisis statistik dan grafik telah dilakukan menggunakan perisian GraphPad Prism v.8.0.1 untuk macOS (GraphPad Sofware, La Jolla California, USA) dan data telah diserahkan kepada Analisis Varians (ANOVA) diikuti dengan perbandingan berbilang Bonferroni, mengambil kira tahap keertian yang lebih rendah daripada 5% (P Kurang daripada atau sama dengan 0.05).

Rajah 1. Bahagian sekum ayam daging yang dijangkiti Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA menunjukkan imunoreaksi dalam makrofaj, 7 hari selepas jangkitan (×400; Avidin–Biotin Streptavidin Peroksidase, diwarnakan dengan Hematoxylin).

Rujukan

1. Freitas Neto, OC, Penha Filho, RC & Barrow, PA Sumber salmonellosis bukan kepialu manusia: Kajian semula. Braz. J. Poult. Sci. 12(1), 1–11. https://doi.org/10.1590/S1516-635X2010000100001 (2010).

2. Musim sejuk, SE et al. Keradangan usus menyediakan penerima elektron pernafasan untuk Salmonella. Alam 467, 426–429. https://doi.org/ 10.1038/nature09415 (2010).

3. Hinsley, AP & Berks, BC Kekhususan laluan pernafasan yang terlibat dalam pengurangan sebatian sulfur oleh Salmonella enterica. Mikrobiologi (Membaca) 148, 3631–3638. https://doi.org/10.1099/00221287-148-11-3631 (2002).

4. Tiennimitr, P. et al. Keradangan usus membolehkan Salmonella menggunakan etanolamin untuk bersaing dengan mikrobiota. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 17480–17485. https://doi.org/10.1073/pnas.1107857108 (2011).

5. Staib, L. & Fuchs, TM Peraturan fucose dan 1,2-penggunaan propanediol oleh Salmonella enterica serovar Typhimurium. Depan. mikrobiol. 6, 1116. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.01116 (2015). 6. Horswill, AR & Escalante-Semerena, JC Propionate catabolism dalam Salmonella Typhimurium LT2: Dua unit yang ditranskripsi secara mencapah terdiri daripada lokus prp pada 8.5 centisomes, prpR mengekod ahli keluarga sigma-54 pengaktif dan gen prpBCDE membentuk operon. J. Bakteria. 179, 928–940. https://doi.org/10.1128/jb.179.3.928-940.1997 (1997).

7. Soria, MC, Soria, MA, Bueno, DJ & Terzolo, HR Perbandingan 3 kaedah kultur dan ujian PCR untuk pengesanan Salmonella Gallinarum dan Salmonella Pullorum dalam makanan ayam. Poult. Sci. 92, 1505–1515. https://doi.org/10.3382/ps.2012-02926 (2013).

8. Van Immerseel, F. et al. Dinamik penyusupan sel imun dalam lamina propria caecal ayam selepas jangkitan neonatal dengan strain Salmonella Enteritidis. Dev. Komp. Immunol. 26, 355–364. https://doi.org/10.1016/s0145-305x(01)00084-2 (2002).

9. Montassier, HJ Fisiopatologia melakukan sistem imun. Dalam Doenças das Aves (eds AndreattiFilho, RL et al.) 467–489 (FACTA, 2020).

10. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, TA & Roth, JR Penerima elektron alternatif tetrathionate menyokong B12-pertumbuhan anaerobik bergantung kepada Salmonella enterica serovar Typhimurium pada etanolamin atau 1,{{4} }propanediol. J. Bakteria. 183, 2463–2475. https://doi.org/10.1128/JB.183.8.2463-2475.2001 (2001).

11. Saraiva, M. et al. Mentafsir peranan gen ttrA dan pduA untuk Salmonella enterica serovar dalam model jangkitan ayam. Pathol Burung. https://doi.org/10.1080/03079457.2021.1909703 (2021).

12. Beal, RK, Wigley, P., Powers, C., Barrow, PA & Smith, AL Respons imun selular dan humoral silang reaktif terhadap Salmonella enterica serovar Typhimurium dan Enteritidis dikaitkan dengan perlindungan kepada cabaran semula heterolog. Doktor haiwan. Immunol. Imunopathol. 114, 84–93. https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2006.07.011 (2006).

13. Musim Sejuk, SE & Bäumler, AJ Satu pencapaian yang menakjubkan: Untuk bersaing dengan mikrobiota usus, Salmonella memacu perumahnya untuk menyediakan penerima elektron pernafasan. Mikrob Usus 2, 58–60. https://doi.org/10.4161/gmic.2.1.14911 (2011).

14. Rivera-Chávez, FI et al. Salmonella menggunakan teksi tenaga untuk mendapat manfaat daripada keradangan usus. Pathog PLoS. 9, e1003267. https:// doi.org/10.1371/journal.ppat.1003267 (2013).

15. Khan, CM Te Interaksi Dinamik antara Salmonella dan mikrobiota, dalam ceruk saluran gastrousus yang mencabar. Int. Sch. Res. Tidak. 2014, 1–23. https://doi.org/10.1155/2014/846049 (2014).

16. Yoo, W., Kim, D., Yoon, H. & Ryu, S. Enzyme IIANtr mengawal pencerobohan Salmonella melalui 1,2-propanediol dan katabolisme propionat. Sci. Rep. 7, 44827. https://doi.org/10.1038/srep44827 (2017).

17. Salyers, AA & Whitt, DD Pertahanan tuan rumah terhadap patogen bakteria: Pertahanan tisu dan darah. Dalam Patogenesis Bakteria: Pendekatan Molekul (eds Salyers, AA & Whitt, DD) 16–29 (ASM Press, 1994).

18. Góes, V. et al. Salmonella Heidelberg langkah sampingan gen kehilangan keperluan pernafasan dalam model jangkitan ayam. Pathog Mikrob. 171, 105725. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2022.105725 (2022).

19. Barrow, PA, Hassan, JO & Berchieri, A. Jr. Pengurangan dalam perkumuhan najis strain Salmonella Typhimurium F98 dalam ayam yang divaksin dengan nyawa dan membunuh organisma S. Typhimurium. Epidemiol. Jangkitan. 104, 413–426. https://doi.org/10.1017/s095026880 0047439 (1990).

20. Datsenko, KA & Wanner, BL Penyahaktifan satu langkah gen kromosom dalam Escherichia coli K-12 menggunakan produk PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640–6645. https://doi.org/10.1073/pnas.1201632977 (2000).

21. Zancan, FB, Berchieri Junior, A., Fernandes, SA & Gama, NMSQ Salmonella spp. penyiasatan dalam kotak pengangkutan burung berumur sehari. Braz. J. Mikrobiol. 31, 230–232. https://doi.org/10.1590/S1517-83822000000300016 (2000).

22. Berchieri, A. Jr., Murphy, CK, Marston, K. & Barrow, PA Pemerhatian terhadap kegigihan dan penghantaran menegak Salmonella enterica serovars Pullorum dan Gallinarum dalam ayam: Kesan latar belakang genetik bakteria dan perumah. Pathol Burung. 30, 221–231. https://doi.org/10.1080/03079450120054631 (2001).