Peranan Terapi Mitokondria Untuk Kecederaan Iskemia-Reperfusi Dan Kecederaan Buah Pinggang Akut

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrak

Akutkecederaan buah pinggang (AKI) adalah gangguan klinikal biasa yang dikaitkan dengan penurunan dalamfungsi buah pinggangkerana penghinaan iskemia dan nefrotoksik. Patofisiologi AKI melibatkan pelbagai mekanisme selular, sepertibuah pinggangdisfungsi sel parenkim (epitelium dan endothelial) dan penyusupan sel imun. Kecederaan mitokondria yang menyebabkan pengurangan ATP dan mencetuskan apoptosis dan nekrosis adalah nadi kecederaan reperfusi iskemia (IRI). Farmakologi (SS-31 atau MitoQ), selular (sel dendritik atau sel stem mesenchymal) atau strategi genetik yang sama ada secara langsung atau tidak langsung memelihara integriti dan fungsi mitokondria telah ditunjukkan untuk mengurangkan AKI berkaitan IRI dalam model praklinikal. Menariknya, mitokondria terpencil baru-baru ini telah ditunjukkan untuk diambil oleh pelbagai sel mamalia yang mengakibatkan penggabungan mitokondria yang dipindahkan ke dalam rangkaian mitokondria endogen sel penerima dan menyumbang kepada perlindungan daripada kecederaan iskemia dalam pelbagai model praklinikal iskemia termasuk jantung, hati, danbuah pinggang. Kajian mini meringkaskan strategi terapeutik semasa yang ada yang bertambah baikfungsi buah pinggangdengan menyasarkan kesihatan mitokondria.

Kata kunci:Kecederaan buah pinggang akut; Mitokondria; kecederaan reperfusi iskemia; kecederaan buah pinggang; fungsi buah pinggang

pengenalan

buah pinggangkecederaan iskemia-reperfusi (IRI) adalah punca utama akutkecederaan buah pinggang(AKI), yang sebagai tambahan kepadapemindahan buah pinggangberlaku dalam pelbagai tetapan klinikal lain seperti pembedahan jantung, sepsis, dan kejutan. Patofisiologi IRI adalah kompleks dan melibatkan pelbagai aspek termasuk kecederaan hipoksik yang mengakibatkan pengeluaran spesies oksigen reaktif, mencetuskan kitaran sel Sumbangan daripada Simposium AKI dan CRRT 2021 di Persidangan Antarabangsa Ke-26 tentang Kemajuan dalam Nefrologi Penjagaan Kritikal, A Maya/ Acara Hibrid dari San Diego, CA, Amerika Syarikat, 28 Februari–5 Mac 2021. Simposium ini sebahagiannya disokong oleh Universiti Alabama yang dibiayai oleh NIDDK di Birmingham-University of California San Diego O'Brien Center for AcuteKecederaan Buah PinggangPenyelidikan (P30DK079337). kematian dan keradangan antara sel epitelium dan imun. Sebagai tambahan kepada peranan fungsi mereka sebagai pengeluar tenaga metabolik, mitokondria juga boleh mengawal kematian sel. IRI melibatkan rangkaian kejadian yang rumit di peringkat mitokondria yang merangkumi kehilangan tenaga yang cepat, penurunan potensi membran mitokondria, dan kehilangan hemostasis ionik dan memuncak dalam pengeluaran ROS dan kematian sel. Pemerhatian ini menunjukkan bahawa mitokondria adalah organel kritikal yang mengalami perubahan patofisiologi utama semasa IRI. Yang penting, mitokondria mempunyai peranan penting bukan sahaja dalam permulaan dan perkembangan kecederaan iskemia tetapi juga terlibat dalam pemulihan dan proses yang menyumbang kepada perkembangan kepada kronik.penyakit buah pinggang.Berbilang farmakologi sasaran mitokondria (SS-31 [1] atau MitoQ), selular (sel stromal mesenchymal [2] atau sel dendritik yang berasal dari sumsum tulang [3]), dan strategi terapeutik pemindahan mitokondria [4] baru-baru ini telah diuji untuk meningkatkan kesihatan mitokondria untuk akhirnya mengurangkan disfungsi dalam model praklinikalbuah pinggangIRI. Walaupun terapeutik farmakologi dan selular ini telah menunjukkan beberapa faedah dalam memeliharakesihatan buah pinggang, perkembangan mereka untuk digunakan dalam persekitaran klinikal adalah terhad disebabkan oleh bioavailabiliti dan kesan buruk luar sasaran. Selain itu, kajian ini tidak mempunyai model haiwan yang lebih besar (babi) untuk menunjukkan potensi penggunaannya, terutamanya jika penghantaran terus kebuah pinggangdiperlukan. Penggunaan terapeutik pemindahan mitokondria untuk mencegah kecederaan telah ditunjukkan dalam pelbagai model praklinikal kecederaan iskemia dalam pelbagai organ termasuk jantung, hati,buah pinggang, dan paru-paru. Strategi dos dan rawatan kajian ini diringkaskan dalam ulasan semasa.

CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI KEGAGALAN BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG

Penglibatan Mitokondria dalam IRI Buah PinggangDi bawah keadaan sihat biasa, pengangkutan elektron di sepanjang rantai pengangkutan elektron (ETC) digabungkan dengan fosforilasi oksidatif untuk menghasilkan ATP. Air ialah hasil sampingan muktamad oksigen yang digunakan dalam ETC yang menjana elektron semasa ia bergerak melalui kompleks I ke kompleks IV. Sebilangan kecil ROS yang dihasilkan dalam ETC diperlukan untuk mengekalkan keadaan redoks sel dan penting untuk fungsi pelbagai enzim. Dalam iskemia, terdapat penurunan dalam aktiviti di pelbagai kompleks yang mengakibatkan kebocoran elektron dan mengurangkan radikal superoksida pembentuk oksigen apabila oksigen tersedia semasa reperfusi, akhirnya mengurangkan jumlah ATP yang tersedia. Di antarabuah pinggang, tubul proksimal (PT) mempunyai ketumpatan tertinggi mitokondria, dan sel epitelium PT sangat bergantung pada fosforilasi oksidatif untuk menjalankan pengangkutan cecair dan bahan terlarut yang normal. Semasa iskemia, sebagai tambahan kepada fungsi mitokondria yang berkurangan, analisis ultrastruktur mendedahkan mitokondria yang berpecah-belah dalam masa 15 minit selepas reperfusi, akhirnya mengakibatkan pembengkakan mitokondria dan gangguan cristae yang padat [5, 6]. Perubahan patofisiologi yang dikaitkan dengan IRI ini menunjukkan bahawa morfologi dan fungsi mitokondria sangat diselaraskan dan boleh bertindak balas dengan cepat kepada tekanan metabolik dan selular. Patogenesis daripadabuah pinggangIRI melibatkan pelbagai interaksi kompleks antarabuah pinggangsel parenkim dan sel imun yang menyusup [7]. Sebagai tindak balas kepada sama ada kecederaan kimia atau toksin, kemerosotan fungsi selular boleh dicetuskan oleh pembebasan ROS daripada mitokondria yang rosak. Kerosakan struktur kepada mitokondria berlaku dalam beberapa minit selepas reperfusi yang membawa kepada pembebasan sitokrom c dan pembebasan selanjutnya DNA mitokondria yang boleh mencetuskan apoptosis lagi [8]. Dalam model tetikusbuah pinggangPotensi membran mitokondria IRI, PT berkurangan dengan cepat, mengakibatkan mitokondria berserpihan lebih pendek berbanding tikus yang dikendalikan secara palsu. Untuk melihat perubahan struktur dalam mitokondria PT ini, kami menghasilkan tikus wartawan mitokondria khusus PT untuk digunakan sebagai alat untuk menilai morfologi mitokondria dalam pelbagai model tetikus AKI. Menariknya, tikus ini juga boleh digunakan untuk menilai mitokondria yang dikeluarkan selepas kecederaan dalam pelbagai petak lain termasuk limpa, hati, dan air kencing. Oleh itu, ini seterusnya membolehkan penilaian tentang bagaimana pembebasan mitokondria yang disasarkan daripada organ yang rosak boleh mempengaruhi kecederaan organ distal kerana keupayaannya untuk bertindak sebagai corak molekul yang berkaitan dengan kerosakan mitokondria. Tikus PepcKCre (hadiah daripada Dr. Volker Haase, Universiti Vanderbilt) telah dibiakkan ke Phamfl/fl (dibeli daripada Makmal Jackson) untuk menghasilkan tikus PepcKCrePhamfl/fl transgenik yang mempunyai mitokondria PT yang dilabelkan dengan tag hijau pendarfluor. Tikus-tikus ini digunakan sama ada untuk iskemia palsu atau dua hala selama 26 minit dengan 24 jam reperfusi. Darah dikumpulkan di bawah anestesia dari sinus retro-orbital, dan kreatinin plasma (mg/dL) ditentukan dengan menggunakan kaedah enzimatik daripada protokol pengilang (Diazyme Laboratories, Poway, CA, USA), dan nitrogen urea darah (BUN) dan pengukuran kreatinin telah dilakukan menggunakan Kit Ujian Urea QuantiChrom (DIUR-100). Berbanding dengan tikus palsu, IRI menghasilkan peningkatan ketara dalam kreatinin plasma (Rajah 1a) dan BUN (Rajah 1b). Untuk histologi,buah pinggangtelah ditetapkan semalaman dalam 10 peratus formalin dan tertanam dalam parafin.buah pinggangtelah disediakan untuk H&E. Untuk kuantifikasi skor kecederaan tubular (tubul akut

nekrosis), bahagian telah dinilai dengan mengira peratusan tubul yang menunjukkan nekrosis sel, kehilangan sempadan berus, pembentukan tuang dan pelebaran tubul seperti berikut: 0=normal; 1 =<10%; 2="10–25%;" 3="26–50%;" 4="51–75%;"  and="" 5="">75 peratus. Lima hingga 10 medan dari setiap medula luar dinilai dan dijaringkan secara buta.buah pinggangtikus IRI telah meningkatkan nekrosis tubular akut berbanding tikus palsu (Rajah 1c) dan wakil H&E daripada sham dan IRIbuah pinggang(Gamb. 1d). Selain itu, perubahan dalam morfologi mitokondria dalam tikus PepcKCrePhamfl/fl yang ditunjukkan dalam mitokondria tikus palsu diselaraskan secara seragam dalam PT, manakala morfologi mitokondria terganggu selepas IRI (Rajah 1e). Kehadiran isyarat mitokondria (hijau) selanjutnya disahkan disetempat dalam segmen PTbuah pinggangdalam tikus PepcKCrePhamfl/fl dengan melabelkan dengan CD13 terhadap sempadan berus PT dan CD31 (PECAM) untuk endothelium (Rajah 1f).

Terapi Mitokondria dan IRITerdapat beberapa kajian setakat ini dalam pelbagai model IRI praklinikal yang menunjukkan pemindahan mitokondria boleh digunakan sebagai modaliti terapeutik untuk mengurangkan atau merawat disfungsi berkaitan IRI. Kajian menyeluruh model, sumber, dos, dan laluan penghantaran mitokondria terpencil dalam pelbagai model disenaraikan di bawah.HatiDalam satu siri kajian, kumpulan McCully telah menunjukkan bahawa IRI jantung boleh dipertingkatkan dengan ketara melalui pemindahan mitokondria terpencil. Secara keseluruhan, dalam model IRI jantung (babi dan arnab), kumpulan mereka menunjukkan bahawa mitokondria yang disuntik secara khusus diambil oleh kardiomiosit dan menyumbang kepada penggunaan oksigen yang dipertingkatkan, sintesis fosfat bertenaga tinggi, pengeluaran sitokin yang berkurangan secara keseluruhan, energetik miokardium yang dipelihara dan daya maju sel, dan keseluruhan fungsi jantung selepas infark dipertingkatkan. Kumpulan McCully dalam 2017 melaporkan aplikasi klinikal pertama mitokondria terapeutik dalam pesakit pediatrik dengan kawasan akinesis atau hipokinesis miokardium. Dalam 5 pesakit ini, mitokondria yang berdaya maju telah diasingkan daripada sekeping autologous 6 × 6-mm abdominis rektus yang sihat dan disuntik pada dos 1 × 108 ± 1 × 105 dengan 1 × 107 ± 1 × 104 /0.1 mL setiap tapak [9]. Empat daripada lima pesakit dengan pemindahan mitokondria tunggal, walaupun di beberapa tapak, fungsi ventrikel bertambah baik, dan pesakit ini berjaya dikeluarkan dari sokongan mekanikal extracorporeal.

SumberMitokondria telah diasingkan daripada otot (pectoralis major) oleh protokol standard yang dibangunkan oleh kumpulan McCully yang mengambil masa 30 minit tanpa sebarang langkah sentrifugasi pembezaan untuk semua kajian in vivo [10].

ModelIRI jantung arnab (3{12}} min iskemia dengan 2 jam hingga 28 hari reperfusi). Mitokondria terpencil (9.7 × 106 ± 1.7 × 106 /mL, 1.2 × 106 /0.1 mL di 8 tapak) telah disuntik pada masa reperfusi [11]. IRI jantung babi (25 minit iskemia dengan 28 hari reperfusi). Mitokondria terpencil (9.9 × 107 ± 1.4 × 107 /mL, 1.3 × 107 /0.1 mL di 8 tapak) telah disuntik pada masa reperfusi [12]. Semua mitokondria disuntik terus ke dalam jantung di tapak iskemia serantau.

buah pinggangDalambuah pinggangIRI, 2 kajian yang diterbitkan baru-baru ini telah menunjukkan dalam model haiwan kecil dan besar penggunaan terapeutik mitokondria sihat terpencil. Kerjasama kami dengan kumpulan McCully menggunakan model babi besar [4] dan tikus [13]. Dalam model haiwan yang lebih besar, Doulamis et al. [4], membuat kesimpulan bahawa mitokondria yang disuntik dilindungi dengan ketarabuah pinggangdaripada kecederaan iskemia dengan bertambah baikfungsi buah pinggang, kurang kerosakan histologi, nekrosis koagulatif yang lebih rendah pada PT, dan lebih rendahbuah pinggangtahap IL6 [4]. Dalam tikus, haiwan yang dirawat mitokondria mempunyai kreatin dan BUN yang jauh lebih rendah bermula pada 12 jam reperfusi dan kekal signifikan sehingga 72 jam. Menariknya, kedua-dua haiwan yang dirawat kenderaan dan mitokondria mempunyai tahap kreatinin dan BUN yang sama pada titik masa 1 minggu. Secara keseluruhan, tikus yang dirawat mitokondria mempunyai lebih tinggibuah pinggangungkapan Ki67, PCNA, aquaporin 1 (AQP1, penanda PT) dan tahap Kim1, cystatine C, dan TUNEL yang lebih rendah [13]. Kedua-dua set kajian membuat kesimpulan dengan menyatakan bahawa suntikan terus mitokondria sihat terpencil dengan ketara melindungi buah pinggang daripada IRI dan berpotensi membantu dengan pembaikan dengan meningkatkan kapasiti proliferatif epitelium kecederaan.

CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI SAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG

SumberBabi, mitokondria telah diasingkan daripada otot sternokleidomastoid [10]. Tikus, mitokondria telah diasingkan daripada otot pectoralis major [10].ModelBabibuah pinggangIRI (60 minit iskemia dengan 24 jam reperfusi). Mitokondria autologous terpencil (1 × 109 / 6 mL, tunggal × 1 atau berbilang × 3) telah disuntik intra-arteri pada masa reperfusi [4]. Tikusbuah pinggangIRI (Sepihak, kanan-buah pinggangnefrektomi dan 45 minit kiri-buah pinggangadalah kimia dengan reperfusi sehingga 1 minggu). Mitokondria terpencil (7.5 × 106 /1 mL, 0.4 mL disuntik) telah disuntik ke dalambuah pinggangarteri pada masa reperfusi [13].hatiDalam kajian oleh Lin et al. [14], telah ditunjukkan bahawa tikus yang dirawat dengan mitokondria yang baru diasingkan 45 minit selepas IRI hati dilindungi dengan ketara berbanding tikus yang dirawat dengan kenderaan. Tikus yang dirawat dengan mitokondria mengalami kecederaan hati yang lebih sedikit dengan paras ALT yang lebih rendah, kurang pendarahan kesesakan, nekrosis hepatosit dan kurang sel TUNEL-positif.SumberMitokondria diasingkan daripada hati tikus dengan kaedah sentrifugasi pembezaan piawai.ModelIRI hati tikus (45 minit iskemia dengan 4 jam reperfusi). Mitokondria terpencil (7.7 × 106 ± 1.5 × 106 / mL) disuntik melalui suntikan intrasplenik pada masa reperfusi.Paru-paruDalam kajian ini oleh Zhu et al. [15], penulis menggunakan model hipertensi pulmonari hipoksik tikus untuk menilai penggunaan terapeutik pemindahan mitokondria. Tikus yang dirawat dengan mitokondria telah mengurangkan pembentukan semula vaskular pulmonari akibat hipoksia kronik yang mengakibatkan pencegahan hipertensi pulmonari. Selain itu, kajian semasa juga menunjukkan bahawa pemindahan mitokondria juga boleh digunakan untuk merawat tikus yang telah mengalami hipoksia kronik.SumberSel otot licin daripada arteri pulmonari dan femoral yang dieksplantasi. Kaedah yang digunakan untuk mengasingkan mitokondria tidak disenaraikan.ModelTikus ditempatkan di dalam ruang hipoksik (10 peratus O2) selama 8 ha hari selama 4 minggu. Tikus telah dirawat secara intravena dengan 2.25 × 108 (~ 2 µg protein) mitokondria setiap hari selama 2 minggu, sama ada 2 minggu atau 4 minggu selepas permulaan kajian

KesimpulanPotensi penggunaan mitokondria sebagai modaliti rawatan telah ditunjukkan untuk meningkatkan hasil penyakit dalam pelbagai model praklinikal. Tidak seperti strategi rawatan farmakologi dan selular yang berpusat mitokondria, kajian semasa menggunakan mitokondria eksogen tidak melaporkan kesan sampingan yang buruk. Sebulat suara, salah satu batasan yang diakui oleh semua kajian ialah mitokondria eksogen mesti diasingkan, disimpan sejuk, dan digunakan dalam beberapa jam. Penggunaan mitokondria sihat berdaya maju terpencil sebagai modaliti terapeutik untuk menambah dan memperbaiki fungsi dan berpotensi menggantikan mitokondria yang rosak adalah pilihan yang berdaya maju. Mitokondria yang dilabel dan disuntik sama ada melalui suntikan tempatan atau sistemik diambil oleh pelbagai jenis sel. Daya maju mitokondria adalah penting kerana mitokondria dan produk mitokondria yang tidak boleh hidup atau rosak (DNA, RNA, protein, ATP, dan kompleks) tidak memberikan sebarang perlindungan [16]. Mitokondria yang disuntik meningkatkan tenaga sel penerima [11], mendorong biogenesis mitokondria (mengaktifkan Pgc1a, pemerhatian Bajwa yang tidak diterbitkan), meningkatkan kapasiti proliferatif [13], dan mengurangkan sitokin radang secara keseluruhan. Menariknya, beberapa soalan kritikal kekal. Bagaimanakah mitokondria eksogen masuk ke dalam sel? Dalam tetapan in vitro, penggunaan kepada perencat makropinositosis atau mekanisme seperti macropinocytosis [17] atau microtubules/tunneling nanotube atau celah simpang [18] sebahagiannya menyekat kemas kini mitokondria. Berapa lamakah mitokondria yang disuntik bertahan? Walaupun sukar, kajian ini boleh dilakukan dengan mengambil kesempatan daripada fakta bahawa mitokondria datang dengan DNA mereka sendiri, jadi menggunakan pemindahan mitokondria xenograf untuk menilai lokasi mitokondria yang disuntik secara sistemik boleh digunakan untuk menangani di mana dan berapa lama mitokondria yang disuntik bertahan. . Kajian ini juga mempunyai had tambahan kerana teknik ini hanya akan membenarkan pengesanan DNA mitokondria yang disuntik dan tidak boleh digunakan untuk menguji sama ada mitokondria yang disuntik berfungsi. Bergantung pada model penyakit, berapa kerap mitokondria perlu disuntik? Dalam keadaan akut, satu dos mitokondria nampaknya mencukupi, tetapi tiada kajian semasa telah menilai penggunaan mitokondria dalam tetapan kronik. Dos rendah mitokondria ini menghalang vasokonstriksi pulmonari yang dicetuskan oleh hipoksia akut dan melemahkan pembentukan semula vaskular yang disebabkan oleh hipoksia walaupun isyarat yang dikaitkan dengan suntikan mitokondria sistemik didapati dalambuah pinggang, hati, dan limpa. Adakah laluan suntikan penting? Dalam kebanyakan model tikus iskemik praklinikal kecuali jantung, mitokondria eksogen yang terpencil disuntik secara sistemik melalui laluan intravena. Walau bagaimanapun, penggunaan model haiwan yang lebih besar boleh diuji untuk menggunakan penghantaran setempat ke organ sasaran seperti yang ditunjukkan baru-baru ini oleh Doulamis et al. [4] menggunakan suntikan intra-arteri dalam babibuah pinggangmodel IRI AKI. Penghantaran mitokondria setempat berpotensi juga bermanfaat kerana campur tangan ini mungkin memerlukan dos mitokondria terpencil yang lebih rendah. Walaupun kajian baru-baru ini telah menambah pengetahuan semasa kami tentang bagaimana pemindahan mitokondria boleh digunakan sebagai strategi terapeutik yang berpotensi, masih banyak soalan lain. Apakah dos optimum mitokondria yang diperlukan untuk kegunaan klinikal? Adakah sumber mitokondria penting? Adakah ia mendorong tindak balas proinflamasi, autologous berbanding syngeneic berbanding allogenic berbanding xenogeneic? Semua kajian yang diterbitkan menggunakan mitokondria yang baru diasingkan dalam masa satu jam pengasingan. Bolehkah mitokondria dipelihara selepas diasingkan? Mempunyai mitokondria yang boleh didapati untuk pemindahan sebagai strategi rawatan di luar rak boleh merevolusikan cara kita menggunakannya sebagai modaliti terapeutik untuk merawat penyakit. Akhir sekali, pemindahan mitokondria sihat yang berdaya maju menyediakan pilihan rawatan terapeutik baru untuk mencegah dan merawat serta meningkatkan perkembangan penyakit dalam pelbagai model praklinikal. Pilihan rawatan ini menggunakan organel untuk meningkatkan hasil penyakit boleh memberi kesan klinikal yang ketara.

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUNGSI BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG