untuk maklumat lanjut:ali.ma@wecistanche.com

Bahagian: II Manifestasi Ginjal dan Buah Pinggang Tambahan dalam Model Sistinosis Ikan Zebra Dewasa

2.3.5. Ctns−/− Ikan Zebra Hadir Peningkatan Ketebalan Kornea

Sistinosismenjejaskan mata yang mengakibatkan pengumpulan sistin dalam beberapa tisu, seperti iris, konjunktiva, dan epitelium retina, bagaimanapun, kornea adalah bahagian yang paling terjejas akibat pengumpulan sistin [19] dan menunjukkan peningkatan ketebalan [20]. Dengan menggunakan pewarnaan H&E, kami mendapati bahawa ctns−/−zebrafish menunjukkan peningkatan ketebalan lapisan stroma kornea berbanding dengan jenis liar (Rajah10A, B, E)zebrafish. Walau bagaimanapun, kami tidak mendedahkan keabnormalan yang jelas dalam epitelium retina ctns−/−zebrafish (Rajah 10C, D).

Rajah 9. Purata kelajuan berenang dalam jenis liar dan ctns−/−zebrafish. Kelajuan purata berkurangan dalam ctns−/−zebrafish berbanding dengan jenis liar dalam kedua-dua jantina. Purata kelajuan berenang diukur dalam piksel/saat. Setiap titik mewakili satu ikan zebra, untuk sejumlah n=6 jenis liar dan n=6 ctns−/−18-ikan zebra berumur sebulan. ANOVA dua hala dengan ujian perbezaan paling ketara (PLSD) Fisher: ** p <>

Rajah 10. Histologi mata dalam jenis liar dan ctns−/− ikan zebra. (A, B) Imej perwakilan kornea jenis liar (A) dan ctns−/− (B) 18-ikan zebra berumur sebulan. Lapisan stroma kornea (anak panah hitam dan garis hitam). pewarnaan H&E. Bar skala mewakili 50 µm. (C, D) Imej perwakilan retina jenis liar (A) dan ctns−/− (B) ikan zebra. pewarnaan H&E. Bar skala mewakili 50 µm. (E) Kuantifikasi relatif ketebalan lapisan stromal kornea. Setiap titik mewakili satu rekaan ketebalan lapisan stroma kornea. Ujian-t tidak berpasangan dengan pembetulan Welch, dua ekor: * p <>

2.3.6. Tambahan Ctns−/− Fenotip Zebrafish

Sebagai tambahan kepada fenotip yang dinyatakan di atas, kami melakukan analisis histologi otak dan varieti tanpa menemui perbezaan antara ctn−/−dan ikan zebra jenis liar. Selain itu, kami menilai panjang badan dan berat ctns−/−dan ikan zebra jenis liar pada 18 bulan terjual dan kami mendapati berat badan meningkat inctns−/− ikan zebra manakala kami mendapati peningkatan panjang badan dalam ctns−/−ikan zebra bagi kedua-dua jantina berbanding dengan jenis Figure S1 liar (Tambahan).

3. Perbincangan

Sepanjang dekad yang lalu,cystinosistelah berubah daripada penyakit maut zaman kanak-kanak kepada gangguan metabolik yang boleh dirawat di mana pesakit boleh bertahan sehingga dewasa dan mencapai usia lanjut [21,22]. Kelangsungan hidup pesakit yang lebih lama mendedahkan fenotip penyakit novel dan menimbulkan persoalan baru mengenai patogenesis dan kesan jangka panjang terapi. Dalam hal ini, mengkaji model haiwan dewasa cystinosis menjadi lebih dan lebih relevan.

Dalam kajian semasa, kami menyiasat buah pinggang dan ekstrarenal manifestasi cystinosisinana model ikan zebra dewasa dari 18 bulan terjual, yang sepadan dengan umur manusia 40-50 tahun [23,24]. Pertama, kami mengesahkan bahawa model dewasa ctns−/− zebrafish membentangkan keseluruhan badan dan pelbagai organ pengumpulan sistin. Di dalambuah pinggang, pada peringkat histologi, kami memerhatikan tanda-tanda kerosakan PTEC yang dicerminkan oleh kehadiran banyak titisan eosinofilik seperti hyaline, vakuol sitoplasma, dan kehilangan separa sempadan berus. Tambahan pula, ikan zebra ctns−/−jantan mengalami hipertrofi glomerular. Akhir sekali, kami menunjukkan bahawa ekspresi caspase 3 yang dibelah telah meningkat dalam PTEC buah pinggang ctns−/−zebrafish, menunjukkan bahawa apoptosis terlibat dalam patogenesis cystinosis nefropati dalam ikan zebra. Sejakcystinosispesakit hadir juga extrarenal manifestasi, kami menyiasat kesan mutasi ctns−/− dalam organ lain dalam model zebrafish kami. Menariknya, kami mendapati bahawa ctns−/−mutasi menyebabkan kerosakan pada anatomi kulit dan menjejaskan kesuburan, aktiviti lokomotor dan mata.

Lisosom adalah tapak pencernaan intraselular dan dianggap sebagai penyelaras penting metabolisme sel [25]. Menjadi penyakit simpanan lisosom, ciri utamacystinosisadalah pengumpulan sistin lisosom [26,27]. Menariknya, kami mendapati peningkatan 54-kali ganda sistin dalam seluruh badan18-bulan-bulancystinosiszebrafish jika dibandingkan dengan jenis liar, manakala, dalam kajian terdahulu kami [10], larva cystinosis zebrafish pada 6 hari selepas persenyawaan membentangkan 13-peningkatan kali ganda. Secara keseluruhan, data ini mencadangkan bahawa sistin terkumpul sepanjang hayat dalam cystinosis zebrafish. Kromatografi cecair dan analisis spektrometri jisim telah mengesahkan bahawa, antara semua organ,buah pinggangsare tapak pilihan untuk pengumpulan sistin. Bengkak lisosom dan titisan eosinofilik seperti hialin di dalam lisosom telah dilaporkan dalam PTEC yang dimuatkan dengan sistin [28,29] dan, dalam biopsi manusia, kristal sistin muncul sebagai ruang bentuk polimorf dalam makrofaj interstisial dan sitoplasma PTEC [27]. Dalam tisu manusia, pengumpulan dan penghabluran sistin adalah proses kumulatif yang berlaku sepanjang hayat. Sebaris, kristal sistin tidak dikesan dalam ctns−/−zebrafish pada peringkat larva [10] manakala, dalam eksperimen perintis kami, kami mendapati bahawa bentuk polimorf bagi kristal sistin muncul pada usia 3 dan 6 bulan dan boleh dilihat dengan jelas. pada usia 18-bulan, mencadangkan kemerosotan progresif kesan cystinosis dalambuah pinggang.

Klik untukKesan cistanche untuk penyakit buah pinggang

Untuk menilai perubahan histologi glomeruli, kami mengukur kawasan permukaan kapsul Bowman, jumbai glomerular, dan ruang Bowman ctns−/−zebrafish pada bahagian bernoda PAS. Kami mendapati bahawa ctns−/−zebrafish mengembangkan hipertrofi glomerular, mencadangkan penurasan hiper. Kerosakan glomerular ringan yang diperhatikan dalam ikan zebra mungkin dikaitkan dengan keupayaan penjanaan semula ikan zebrabuah pinggang, dapat menambah nefron baru, serta membaiki nefron sedia ada [30].

Sebagai tambahan kepada kerosakan histologi, pengumpulan sistin telah ditunjukkan untuk mengaktifkanproteinkinaseCtriggeringapoptosis dalam PTEC[12]. Oleh itu, kami menilai ungkapan caspase-3 yang dibelah dalam PTEC dan kami mendapati bahawa ikan ctns−/−zebrafish menunjukkan peningkatan caspase-3 dan pemecahan nuklear. Kehadiran caspase terbelah-3 terutamanya ditemui dalam sel yang mengumpul vakuol sitoplasma, menunjukkan bahawa apoptosis berlaku dalam PTEC yang cedera. Satu mekanisme tambahan yang boleh menjelaskan peningkatan apoptosis mungkin adalah kehadiran spesies oksigen reaktif akibat pengurangan glutation yang dikaitkan dengan pengumpulan sistin [31]. Walau bagaimanapun, kajian lanjut adalah perlu untuk menilai sama ada mekanisme ini berlaku juga dalam ctns−/−zebrafish.

Walaupunbuah pinggangadalah organ pertama dan paling teruk terjejas,cystinosisadalah penyakit berbilang sistemik di mana pelbagai organ, seperti kulit, gonad, mata dan otot terlibat. Daripada literatur, diketahui bahawa pesakit cystinosis sering menunjukkan penuaan kulit pramatang, rambut perang, dan warna kulit cerah [13]. Fenotip yang terakhir adalah disebabkan oleh penglibatan sistinosin pengangkut dalam peraturan sintesis melanin[32]dan dalam penyelenggaraan pigmentasi yang lebih gelap melalui pengangkut sistein yang baru ditemui MFSD12 [33]. Yang menggembirakan, model ctns−/−zebrafish dewasa kami mempersembahkan corak kulit hipopigmentasi dan berbintik-bintik dan menunjukkan taburan melanin terjejas yang tidak diperhatikan pada peringkat larva [10].

Sebagai tambahan,cystinosismenyebabkan ketidaksuburan pada lelaki, manakala wanita diketahui subur [14]. Data terkini mencadangkan bahawa ketidaksuburan mungkin disebabkan oleh degenerasi testis yang progresif, yang membawa kepada kualiti air mani yang berubah, atau disebabkan oleh halangan pada bahagian sistem perkumuhan lelaki yang tidak jelas. Struktur yang terhalang mungkin menjejaskan kualiti air mani, terutamanya di kawasan di mana saluran mempunyai diameter yang sangat kecil, contohnya, retetestis[16]. Ikan inzebra, sperma kepada proses genetik sangat serupa dengan mamalia; namun, salah satu perbezaan utama ialah spermatogenesis berlaku dalam sista [34]. Dalam kajian kami, kami mendapati peningkatan spermatozoa dalam sista spermatogenik ctns−/−zebrafish, walau bagaimanapun, kami tidak menemui tanda-tanda degenerasi testis. Oleh itu, fenotip yang diterangkan boleh mencadangkan halangan pada tahap testis yang membawa kepada kurang pembebasan spermatozoa dalam persekitaran, namun kajian lanjut diperlukan untuk mengesahkan hipotesis ini. Pada tahap kefungsian, bilangan telur yang berkurangan dan telur yang disenyawakan berkurangan nampaknya mencerminkan kemerosotan dalam kesuburan ctns−/−zebrafish.

Satu lagi manifestasi klinikalcystinosis, secara amnya memberi kesan kepada pesakit bermula dari dekad kedua kehidupan, adalah miopati, dicirikan oleh pembaziran otot dan kelemahan [1]. Menariknya, kami mendapati bahawa ikan belang dewasa ctns−/−menurunkan aktiviti lokomotor berbanding dengan kawalan, mencadangkan fungsi otot yang terganggu. Sebagai perhatian, fenotip ini tidak terdapat dalam larva [10], menunjukkan bahawa ia memberi kesan kepada ctns−/−zebrafish semasa peringkat akhir penyakit ini. Walaupun begitu, tiada perbezaan histologi yang kelihatan dikesan dalam otot. Penurunan aktiviti lokomotor mungkin disebabkan oleh disfungsi mitokondria yang tidak dapat dikesan oleh kajian histologi rutin [35-37]. Oleh itu, pencirian menyeluruh mitokondria dalam cystinosis zebrafish memerlukan penilaian lanjut.

Selain fenotip yang disebutkan di atas, beberapa kajian telah menunjukkan bahawa pesakit cystinosis juga menunjukkan simptom okular seperti fotofobia dan blepharospasm [1], dengan kornea menjadi salah satu bahagian mata yang paling terjejas mengakibatkan pengumpulan kristal sistin dan peningkatan ketebalan [20]. Walau bagaimanapun, sedikit yang diketahui tentang punca peningkatan ketebalan kornea. Sebagai contoh, telah dicadangkan bahawa fenotip yang diterangkan adalah disebabkan oleh disfungsi subklinikal sel epitelium dan/atau endothelial yang membawa kepada tostromaledema[20]. Dalam kajian kami, kami mendapati bahawa ctns−/−adultzebrafish displayincreased ialah ketebalan lapisan stromal kornea, menunjukkan bahawa model kami menunjukkan tanda-tanda disfungsi kornea dalamcystinosis.

Cistanche untukbuah pinggangfungsi

Salah satu jurang utama yang perlu diisi untuk pemahaman yang menyeluruhcystinosisadalah kekurangan model haiwan yang menggambarkan sepenuhnya penyakit manusia. Beberapa model tetikus telah dibangunkan, menunjukkan pengumpulan sistin tetapi gagal menghasilkan semula lengkapbuah pinggangfenotip [8,26]. Secara khusus, tikus C57BL/6 membentangkan pengumpulan sistin dalam beberapa organ, yang meningkat dengan usia [8]. Selain itu, model tetikus C57BL/6 menunjukkan lesi tubular proksimal bermula dari umur 6 bulan. Begitu juga, dalam model kami, lesi tubular proksimal bertambah buruk dari semasa ke semasa. Walau bagaimanapun, pada tahap glomerular, model tetikus C57BL/6 menunjukkan fenotip biasa, manakala model zebrafish dewasa kami menunjukkan hipertrofi glomerular. Di samping itu, model tetikus C57BL/6 gagal meniru kesuburan terjejas yang diperhatikan pada manusia, manakala model ctns−/−zebrafish mempersembahkan sista spermatogenik yang diperkaya dalam spermatozoa dan mengurangkan pengeluaran telur. Pada peringkat okular, kedua-dua tetikus[38]dan model ikan zebra menampilkan kelainan sokular. Sebaliknya, pada peringkat kulit, model tetikus ini tidak menunjukkan pengeluaran melatonin terjejas [8], yang muncul dalam model ikan belang dewasa sebagai corak kulit hipopigmentasi. Akhir sekali, pada tahap tingkah laku, model ctns−/− zebrafish kami membentangkan aktiviti lokomotor yang berkurangan, yang mungkin disebabkan oleh fungsi mitokondria yang terjejas atau ia mungkin disebabkan oleh kesan sekunder daripada peningkatan berat dalamcystinosisikan zebra. Secara keseluruhannya, nampaknya model ctns−/− zebrafish kami menggambarkan semula penyakit manusia dengan lebih baik. Baru-baru ini, Shimizu et al. mewujudkan mutasi Ctnsugl konggenik novel dalam ketegangan tikus yang dibentangkanbuah pingganglesi dan hablur sistin dalam lisosombuah pinggangkorteks [7]. Walau bagaimanapun, pencirian model yang lebih terperinci masih tiada. Oleh itu, terdapat keperluan mendesak untuk membangunkan dan mencirikan model berfungsi baharu yang menyusun semula penyakit manusia.

Sebagai kesimpulan, kami menunjukkan bahawa model ctns−/− zebrafish dewasa kami menghasilkan semula beberapa fenotip manusia bagi lubang pasir sistin mungkin berguna untuk mengkaji patogenesis penyakit pada orang dewasa dan untuk menguji kesan jangka panjang ubat baru untuk membetulkan buah pinggang dan tambahan.buah pinggangmanifestasi.

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Pemeliharaan dan Pembiakan Ikan Zebra

Ikan zebra dikendalikan dan diselenggara dengan mematuhi peraturan kebajikan haiwan KU Leuven (Kelulusan etika nr.142/2019). Untuk kajian ini, kami memasukkan ctns−/−zebrafish pada usia 18 bulan dan zebrafish kawalan jenis liar dalam kedua-dua jantina. Butiran penjanaan ctns−/−zebrafish telah diterangkan dalam kajian terdahulu kami [10].

4.2. Pengukuran Cystine

Tahap sistin diukur pada ikan belang(ikan jantan jenis liar,n=3danctns−/−ikan jantan, n=3) dan jumlahnya dinyatakan sebagai protein nmol/mg. Pertama, ikan zebra telah dikorbankan dengan rendaman dalam trikain metanasulfonat MS-222 (300 mg/L), selepas itu, sampel tisu telah disonikasi dengan kehadiran 200 µL 5 mM N-ethylmaleimide (NEM, St. Louis, MO, Amerika Syarikat, Sigma-Aldrich E3876) dalam salin penampan fosfat Dulbecco (PBS), untuk maksimum 200 mg tisu untuk setiap lisat. Selepas itu, 100 µL asid sulfosalicylic (SSA) 12 peratus telah ditambah kepada setiap homogenat, dan sampel telah disentrifugasi pada 12,000 g selama 10 minit, 4◦C. Supernatan yang mengandungi sistin disimpan pada suhu−80◦C sehingga masa analisis, manakala pelet dibubarkan semalaman pada suhu 4◦C dalam 300 µL 0.1 M NaOH dan disimpan pada−80◦C sehingga protein diukur menggunakan Kit Reagen Ujian Protein Pierce BCA. Selepas itu, jumlah (nmol) sistin telah dinormalkan kepada kuantiti (mg) protein daripada setiap sampel. Seterusnya, 50 µLoftsupernatantcontainingcystine telah dicucuk dengan 50 µL larutan standard dalaman (Cystine d6) dan dipusingkan selama 5 saat; kemudian campuran itu diekstrak dengan 200 µL asetonitril, divorteks selama 30 saat, dan kemudian diempar pada 16,000 g selama 9 min. Kromatografi cecair dan analisis spektrometri jisim dilakukan oleh UHPLCAgilent1290InfinityII6470(Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA) yang dilengkapi dengan sumber ESI-JET-STREAM yang beroperasi dalam mod ion positif (ESI plus). Perisian yang digunakan untuk mengawal peralatan ini dan menganalisis data ialah MassHunter (Stesen kerja Agilent Technologies, Barcelona, ​​Sepanyol). Lajur pemisah yang digunakan ialah InfinityLab Poroshell 120 HILIC 1.9 µm 100×2.1 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

4.3. Hematoxylin dan Eosin dan Pewarnaan Asid Asid Berkala

Ikan Zebra (ikan betina jenis liar, n=3; ikan jantan jenis liar, n=3; ctns−/−ikan betina, n=3; ctns−/−ikan jantan, n=3) telah dikorbankan dengan rendaman dalam tricaine methanesulfonate MS-222 (300 mg/L), selepas itu, seluruh ikan zebra telah diikat dalam 4 peratus buffer paraformaldehyde (4 peratus PFA) pada 4 ◦C selama 1 minggu . Selepas dibasuh dengan PBS dua kali, ikan zebra dipindahkan ke larutan EDTA (100 mM, pH=8) untuk penyahkalsifikasian selama 1 minggu lagi, diikuti dengan memasukkan ke dalam parafin. Tisu ikan zebra yang dibenamkan parafin telah dipotong(4-µmthickness)onaLeicamicrotome(LeicaBiosystems,Wetzlar,Jerman). Bahagian telah diwarnai dengan H&E dan PAS mengikut protokol standard.

Untuk kajian histologi mata ikan betina(ikan betina jenis liar,n=3danctns−/−ikan betina, n=3), mata telah dienukleasi dan diikat dalam 4 peratus PFA pada suhu bilik selama 4 jam. Pembenaman berikut ke dalam medium suhu pemotongan optimum (Tissue-Tek® VIP®; Sakura Finetek, Jepun), 10-µm cryosections telah dibuat (Cryostar NX70, Thermofisher Scientific, Tokyo, Jepun). Bahagian telah diwarnai dengan H&E mengikut protokol standard. Imej dibuat dengan mikroskop medan terang Leica (Leica DM6, Wetzlar, Jerman).

4.4. Imunohistokimia (Pewarnaan Caspase{2}} Dibelah)

Bahagian dengan tisu ikan zebra yang baru dipotong telah dinyahparafin dan dihidratkan semula. Bahagian telah tertakluk kepada pengambilan semula antigen yang disebabkan oleh haba menggunakan penimbal sitrat 10 mM (pH=6). Selepas menyekat dengan 5 peratus Normal Goat Serum (NGS) dalam dPBS, bahagian tersebut diinkubasi dengan caspase anti-cleaved arnab-3 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA, pencairan 1:200) diikuti dengan anti-arnab -Envision, antibodi sekunder berlabel HRP (Produk Dako, Agilent, Santa Clara, CA, Amerika Syarikat). Sebagai kawalan negatif, serum arnab biasa digunakan. Diaminobenzidine (DAB, DAKO, Glostrup, Denmark) digunakan sebagai kromogen. Selepas itu, bahagian telah diwarnakan balas dengan H&E, dehidrasi dan dipasang.

Rawatan penyakit buah pinggang: Cistanche

4.5. Pewarnaan Biru Toluidine dan TEM

Ikan belangbuah pinggangtisu (ikan zebra jantan jenis liar, n=3 dan ctns−/−ikan betina jantan, n=3) telah dituai dan diikat dalam penampan penetapan EM (1.5 peratus glutaraldehid/1 peratus paraformaldehid) selama 24 jam . Selepas itu, tisu buah pinggang telah difiksasi selepas 2.5 peratus glutaraldehid/1.2 peratus akrolein dalam penimbal penetapan (0.1 mol/L cacodylates, 0.1 mol/L sukrosa, pH 7.4) dan 1 peratus osmium tetroksida, dan tertanam ke dalam resin. Bahagian separuh nipis (0.5-ketebalan µm) telah diwarnakan dengan biru toluidin. Bahagian ultranipis telah diwarnai dengan uranil asetat. Imej-imej dikumpul menggunakan mikroskop elektron penghantaran JEM-1200 EX (JEOL Ltd, Tokyo, Jepun) dengan pembesaran yang berbeza.

4.6. Analisis Imej Digital

Slaid berwarna telah didigitalkan menggunakan Pengimbas Ultra-Fast 1.6 RA Philips (Philips, Eindhoven, Belanda)

4.6.1. Analisis Hipertrofi Glomerular

Untuk menganalisis hipertrofi glomerular dalam ikan zebra, kawasan permukaan (µm2) kapsul Bowman, ruang Bowman, dan jumbai glomerular diukur pada slaid bernoda PAS. Semua glomeruli yang tersedia setiap bahagian dimasukkan dan diukur menggunakan perisian ImageJ. Purata ukuran daripada setiap ikan zebra digunakan untuk analisis statistik.

4.6.2. Analisis Ekspresi Caspase{3}} Dibelah

Twoobserversscoredthecleavedcaspase-3expressioninthetubulesofeachzebrafish. The semiquantitative score was conducted on the three randomized tubular fields in each zebrafish(20×magnification). Thepercentageofcaspase-3positivearearelativetothetotal area of tubules was scored as 1 (negative staining), 2 (1–10% positive staining), 3 (10%–25% positive staining), 4 (>25 peratus pewarnaan positif). Purata skor daripada setiap ikan belang digunakan untuk analisis statistik.

4.6.3. Ketebalan Analisis Stroma Kornea

Ketebalan stroma kornea ikan belang (10×pembesaran) diukur pada jarak yang sama dari tengah mata dengan menggunakan perisian ImageJ pada ikan belang. Untuk setiap gambar, n=7 ukuran di lokasi berbeza di bahagian mata (tengah, tengah, pinggir) diambil sepanjang kornea pada selang 100 µM. Purata ukuran digunakan untuk analisis statistik.

4.7. Kajian Kesuburan

Kesuburan dinilai dengan mengawan ikan betina dan ikan betina jantan (ikan jantan jenis liar, n=4 dan ikan betina jenis liar, n=6 dan ctns−/−ikan jantan, n=4 dan ctns−/−ikan betina, n=6) dalam dulang pemijahan. Pada keesokan paginya, satu jam selepas cahaya, embrio dikumpulkan dan jumlah bilangan telur yang dihasilkan direkodkan. Telur yang telah disenyawakan disaring dan dikira daripada telur yang tidak subur menggunakan mikroskop cahaya. Pembiakan dilakukan n=7 kali seminggu berturut-turut. Dua eksperimen yang menyebabkan tiada pengeluaran telur secara serentak dalam kedua-dua jenis liar dan ctns−/−zebrafish telah dikecualikan.

4.8. Aktiviti Lokomotor

Ikan Zebra (ikan betina jenis liar, n=6; ikan jantan jenis liar, n=6; ctns−/−ikan betina, n=6; ctns−/−ikan jantan, n=6) diletakkan di dalam unit perumahan biasa dan, selepas masa penyesuaian selama 5 minit, difilemkan selama 5 minit. Rakaman video telah dilaksanakan menggunakan GoPro® HERO 7 yang diletakkan di atas tangki, sekali gus menawarkan pemandangan atas ikan berenang. Resolusi dan kadar bingkai ditetapkan masing-masing kepada 1080 p (1920×1080) dan 30 fps. Video telah dianalisis denganTracker.menjejaki trajektori bagi ikan belang individu sepanjang percubaan. Trajektori kemudiannya dianalisis dengan kod python tersuai untuk memperoleh purata kelajuan lokomotor (piksel/saat) dalam setiap kumpulan [39].

Cistanche-renal

4.9. Ukuran Berat dan Panjang Badan

Ikan zebra telah didiamkan dengan rendaman dalam 300mg/Loftricainemethanesulfonate MS-222. Selepas pengesahan ketiadaan tindak balas terhadap rangsangan luar, ikan belang yang telah disingkirkan diletakkan di atas tisu kertas dan dikeringkan. Panjang ikan zebra yang telah dieutanasi telah dinilai menggunakan angkup, diukur dari hujung mulut hingga pedunkel ekor. Berat ikan zebra yang telah disingkirkan telah dinilai dengan skala analitik.

4.10. Analisis statistik

Analisis statistik dilakukan menggunakan SPSS (IBM, New York, NY, USA) dan GraphpadPrism (GraphPadSoftware, LaJolla). Dua kumpulan data dianalisis menggunakan ujian-t tidak berpasangan dengan pembetulan Welch, dua ekor. Data dua pembolehubah bebas kategori dianalisis dengan ANOVA dua hala dengan ujian perbezaan ketara terkecil (PLSD) Fisher. Perbezaan dengan p < 0.05="" dianggap="" signifikan="" secara="">

4.11. Kajian Kesuburan

Untuk perbandingan kadar pengeluaran telur antara jenis liar dan ctns−/−zebrafish, analisis regresi Poisson menggunakan Persamaan Anggaran Umum dengan ralat piawai yang teguh untuk mengambil kira korelasi kadar dengan eksperimen telah dilakukan. Untuk perbandingan kemungkinan menawarkan telur terpakai antara jenis liar dan ctns−/−zebrafishAlogistik analisis regresi menggunakan Persamaan Anggaran Umum dengan ralat piawai yang mantap untuk mengambil kira korelasi kemungkinan dalam eksperimen telah dilakukan.

Bahan Tambahan: Perkara berikut boleh didapati dalam talian di https://www.mdpi.com/article/ 10.3390/ijms22179398/s1.

Sumbangan Pengarang: Pengkonsepan, SPB, JH, LvdH, HJB, EL; metodologi, SPB, JH, LDG, HT, TN, PB, SC, BG; perisian SPB, JH, LDG, HT, TN; pengesahan, SPB, JH, LDG, PB, LvdH, HJB dan EL; analisis formal, SPB, JH, LDG, HT, TN; penyiasatan, LvdH, HJB, EL; sumber, HJB dan EL; penyusunan data, SPB, JH, LDG, LvdH, HJB, EL; penulisan—penyediaan draf asal SPB, JH; menulis—menyemak dan menyunting, LvdH, HJB, EL; visualisasi, LvdH, HJB, EL; penyeliaan, PdW, LvdH, HJB, EL; pentadbiran projek, LvdH, HJB, EL; pemerolehan pembiayaan, HJB, EL Semua pengarang telah membaca dan bersetuju dengan versi manuskrip yang diterbitkan.

Pembiayaan: Pengarang ingin mengakui dana dalaman daripadaKULeuvenC1GranttoE.L. (C14/17/113), The China Scholarship Council Grant to JH (CSC n◦ 201508500109), dan FWO postdoctoral fellowship to LDG (12I3820N).

Penyata Lembaga Kajian Institusi: Kajian telah dijalankan mengikut garis panduan Deklarasi Helsinki, dan diluluskan oleh Jawatankuasa Etika KU Leuven n.142/2019. Penghargaan: Kami ingin mengucapkan terima kasih kepada: Didier Cagnini kerana menilai histologi otak dalam kedua-dua ctns−/−dan ikan jenis liar, KathleeenLambaerts, FrédéricHendrickxandKimvanKelst atas sokongan dan bantuan berterusan mereka di kemudahan akuatik KU Leuven, sokongan teknikal Peter Neeskens daripada TEM, dan Ron Wolterbeek untuk analisis statistik.

Kepentingan Konflik: Pengarang mengisytiharkan kepentingan konflik. Pembiayaan tidak boleh digunakan dalam reka bentuk kajian; dalam pengumpulan, analisis, atau tafsiran data; dalam penulisan manuskrip, atau dalam keputusan untuk menerbitkan hasilnya.

Rujukan

1. Elmonem, MA; Veys, KR; Soliman, NA; van Dyck, M.; van den Heuvel, LP; Levtchenko, E. Cystinosis: Kajian semula. Orphanet J. Rare Dis. 2016, 11, 47. [CrossRef]

2. Jezegou, A.; Llinares, E.; Anne, C.; Kieffer-Jaquinod, S.; O'Regan, S.; Aupetit, J.; Chablis, A.; Sagne, C.; Debacker, C.; ChadefauxVekemans, B.; et al. Protein heptahel PQLC2 ialah pengeksport asid amino kationik lisosom yang mendasari tindakan cysteamine dalamcystinosisterapi. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109, E3434–E3443. [CrossRef] [PubMed]

3. Besouw, MT; Levtchenko, EN Meningkatkan prognosis cystinosis nefropati. Int. J. Nephrol. Renova. Dis. 2014, 7, 297–302. [CrossRef]

4. Brodin-Sartorius, A.; Tete, MJ; Niaudet, P.; Antignac, C.; Tetamu, G.; Ottolenghi, C.; Charbit, M.; Moyse, D.; Legendre, C.; Lesavre, P.; et al. Terapi Cysteamine melambatkan perkembangan cystinosis nefropati pada lewat remaja dan dewasa. Buah PinggangInt. 2012, 81, 179–189. [CrossRef]

5. Cherqui, S. Terapi Cysteamine: Rawatan untuk cystinosis, bukan penawar. Buah Pinggang Int. 2012, 81, 127–129. [CrossRef]

6. David, D.; Princiero Berlingerio, S.; Elmonem, MA; Oliveira Arcolino, F.; Soliman, N.; van den Heuvel, B.; Gijsbers, R.; Levtchenko, E.MolecularBasisofCystinosis: Taburan Geografi,Kesan FungsianMutasidalamCTNSGene, dan Potensi untuk Pembaikan. Nephron 2019, 141, 133–146. [CrossRef] [PubMed]

7. Shimizu, Y.; Yanobu-Takanashi, R.; Nakano, K.; Hamase, K.; Shimizu, T.; Okamura, T. Penghapusan dalam gen Ctns menyebabkan disfungsi tubular renal dan pengumpulan sistin dalam tikus LEA/Tohm. Mamm. Genom 2019, 30, 23–33. [CrossRef]

8. Nevo, N.; Chol, M.; Bailleux, A.; Kalatzis, V.; Morisset, L.; Devuyst, O.; Gubler, MC; Antignac, C. Fenotip buah pinggangcystinosismodel tetikus bergantung kepada latar belakang genetik. Nephrol. Dail. Pemindahan 2010, 25, 1059–1066. [CrossRef] [PubMed]

9. Elmonem, MA; Berlingerio, SP; van den Heuvel, LP; de Witte, PA; Lowe, M.; Levtchenko, EN Genetikbuah pinggangPenyakit: Peranan Model Ikan Zebra yang Muncul. Sel 2018, 7, 130. [CrossRef] [PubMed]

10. Elmonem, MA; Khalil, R.; Khodaparast, L.; Khodaparast, L.; Arcolino, FO; Morgan, J.; Pastore, A.; Tylzanowski, P.; Ny, A.; Lowe, M.; etal. Cystinosis(ctns)zebrafishmutantmenunjukkanpronephricglomerularandtubulardisfunction. Sci. Rep. 2017,7, 42583. [CrossRef]

11. Lusco,MA;Najafian,B.;Alpers,CE;Fogo,ABAJKDAtlasofRenalPathology:Sistinosis. Am. J.Buah PinggangDis. 2017,70,e23–e24. [CrossRef]

12. Park, MA; Pejovic, V.; Kerisit, KG; Junius, S.; Thoene, JG Peningkatan apoptosis dalam fibroblas sistinotik danbuah pinggangsel epitelium tubul proksimal terhasil daripada sisteinilasi protein kinase C delta. J. Am. Soc. Nephrol. 2006, 17, 3167–3175. [CrossRef]

13. Veys, KRP; Elmonem, MA; Dhaenens, F.; Van Dyck, M.; Janssen, M.; Cornelissen, EAM; Hohenfellner, K.; Reda, A.; Quatresooz, P.; van den Heuvel, B.; et al. Penuaan Kulit Intrinsik yang Dipertingkatkan dalam Sistinosis Nefropati Dinilai oleh Tomografi Koheren Optik Definisi Tinggi. J. Melabur. Dermatol. 2019, 139, 2242–2245. [CrossRef]

14. Besouw, MT; Kremer, JA; Janssen, MC; Levtchenko, EN Status kesuburan dalam pesakit cystinosis lelaki yang dirawat dengan cysteamine. Subur. Steril. 2010, 93, 1880–1883. [CrossRef]

15. Veys, KR; D'Hauwers, KW; van Dongen, A.; Janssen, MC; Besouw, MTP; Goossens, E.; van den Heuvel, LP; Wetzels, A.; Levtchenko, EN Pertama Pembuahan Berjaya Dicetuskan oleh Pesakit Cystinosis Lelaki. JIMD Rep. 2018, 38, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

16. Rohayem, J.; Haffner, D.; Cremers, JF; Huss, S.; Wistuba, J.; Weitzel, D.; Kliesch, S.; Hohenfellner, K. Fungsi testis pada lelaki dengan cystinosis nefropati bayi. Hum. Reprod. 2021, 36, 1191–1204. [CrossRef] [PubMed]

17. Blakey, H.; Proudfoot-Jones, J.; Knox, E.; Lipkin, G. Kehamilan pada wanita dengan cystinosis. Clin. Buah pinggang J. 2019, 12, 855–858. [CrossRef]

18. Dogulu, CF; Tsilou, E.; Rubin, B.; Fitzgibbon, EJ; Kaiser-Kupper, MI; Rennert, OM; Gahl, WA Hipertensi intrakranial idiopatik dalam cystinosis. J. Pediatr. 2004, 145, 673–678. [CrossRef] [PubMed]

19. Dixon, P.; Christopher, K.; Chauhan, A. Potensi peranan kolagen stromal dalam penghabluran sistin dalam pesakit cystinosis. Int. J. Pharm. 2018, 551, 232–240. [CrossRef]

20. Katz, B.; Melles, RB; Schneider, JA; Rao, NA Ketebalan kornea dalam cystinosis nefropati. Br. J. Oftalmol. 1989, 73, 665–668. [CrossRef] [PubMed]

21. Nesterova, G.; Gahl, WA Cystinosis: Evolusi penyakit yang boleh dirawat. Pediatr. Nephrol. 2013, 28, 51–59. [CrossRef] [PubMed]

22. Ariceta, G.; Giordano, V.; Santos, F. Kesan rawatan cysteamine jangka panjang pada pesakit dengancystinosis. Pediatr. Nephrol. 2019, 34, 571–578. [CrossRef] [PubMed]

23. Gilbert, MJ; Zerulla, TC; Tierney, KB Zebrafish (Danio rerio) sebagai model untuk kajian penuaan dan senaman: Keupayaan fizikal dan kebolehlatihan menurun dengan usia. Exp. Gerontol. 2014, 50, 106–113. [CrossRef] [PubMed]

24. Gerhard, GS; Kauffman, EJ; Wang, X.; Stewart, R.; Moore, JL; Kasales, CJ; Demidenko, E.; Cheng, KC Life span dan fenotip senescent dalam dua strain Zebrafish (Danio rerio). Exp. Gerontol. 2002, 37, 1055–1068. [CrossRef]

25. Saftig, P.; Klumperman, J. Biogenesis lisosom dan protein membran lisosom: Pemerdagangan memenuhi fungsi. Nat. Rev. Mol. Biol Sel. 2009, 10, 623–635. [CrossRef]

26. Cherqui, S.; Sevin, C.; Hamard, G.; Kalatzis, V.; Sich, M.; Pequignot, MO; Gogat, K.; Abitbol, ​​M.; Broyer, M.; Gubler, MC; et al. Pengumpulan sistin intralysosomal pada tikus yang tidak mempunyai cystinosis, protein yang rosak dalam cystinosis. Mol. sel. biol. 2002, 22, 7622–7632. [CrossRef]

27. Raggi, C.; Luciani, A.; Nevo, N.; Antignac, C.; Terryn, S.; Devuyst, O. Dedifferentiation, dan penyimpangan petak endolisosomal mencirikan peringkat awal cystinosis nefropati. Hum. Mol. Genet. 2014, 23, 2266–2278. [CrossRef]

28. Hard, GC Beberapa bantuan kepada pengiktirafan histologi nefropati titisan hialin dalam kajian ketoksikan sembilan puluh hari. Toksik. Pathol. 2008, 36, 1014–1017. [CrossRef]

29. Sakarca, A.; Timmons, C.; Baum, M. Taburan intraselular sistin dalam tubul proksimal yang dimuatkan sistin. Pediatr. Res. 1994, 35, 447–450. [CrossRef]

30. Kroeger, PT, Jr.; Wingert, RA Menggunakan zebrafish untuk mengkaji genesis podocyte semasa pembangunan dan penjanaan semula buah pinggang. Kejadian. 2014, 52, 771–792. [CrossRef]

31. Sumayao, R.; McEvoy, B.; Newsholme, P.; McMorrow, T. Pengumpulan cystine lysosomal menggalakkan depolarisasi mitokondria dan induksi gen sensitif redoks dalam sel tubular proksimal buah pinggang manusia. J. Physiol. 2016, 594, 3353–3370. [CrossRef]

32. Chiaverini, C.; Sillard, L.; Flori, E.; Ito, S.; Briganti, S.; Wakamatsu, K.; Fontas, E.; Berard, E.; Cailliez, M.; Sembang, P.; et al. Cystinosin adalah protein melanosomal yang mengawal sintesis melanin. FASEB J. 2012, 26, 3779–3789. [CrossRef]

33. Adelmann,CH;Traunbauer,AK;Chen,B.;Condon,KJ;Chan,SH;Kunchok,T.;Lewis,CA;Sabatini,DMMFSD12mengantara pengimportan sistein ke dalam melanosom dan lisosom. Alam Semula Jadi 2020, 588, 699–704. [CrossRef]

34. Leal, MC; Cardoso, ER; Nobrega, RH; Batlouni, SR; Bogerd, J.; Franca, LR; Schulz, RW Penilaian histologi dan stereologi spermatogenesis ikan zebra (Danio rerio) dengan penekanan pada generasi spermatogonial. biol. Reprod. 2009, 81, 177–187. [CrossRef] [PubMed]

35. Sansanwal, P.; Sarwal, MM Autophagy mitokondria yang tidak normal dalam nefropaticystinosis. Autophagy 2010, 6, 971–973. [CrossRef] [PubMed]

36. Bellomo, F.; Signorile, A.; Tamma, G.; Ranieri, M.; Emma, ​​F.; De Rasmo, D. Kesan tahap kitaran-AMP mitokondria atipikal dalam cystinosis nefropati. sel. Mol. Life Sci. 2018, 75, 3411–3422. [CrossRef] [PubMed]

37. De Rasmo, D.; Signorile, A.; De Leo, E.; Polishchuk, EV; Ferretti, A.; Raso, R.; Russo, S.; Polishchuk, R.; Emma, ​​F.; Bellomo, F. MitokondriaDinamikSel Epitelium Tubular Proksimal dalamSistinosis Nefropati. Int. J.Mol. Sci. 2019,21,192. [CrossRef]

38. Kalatzis, V.; Serratrice, N.; Hippert, C.; Payet, O.; Arndt, C.; Cazevieille, C.; Maurice, T.; Hamel, C.; Malecaze, F.; Antignac, C.; et al. Anomali okular dalam model haiwan cystinosis meniru patogenesis penyakit. Pediatr. Res. 2007, 62, 156–162. [CrossRef]

39. Romero-Ferrero, F.; Bergomi, MG; Hinz, RC; Heras, FJH; de Polavieja, GG idtracker.ai: Menjejaki semua individu dalam kumpulan kecil atau besar haiwan tidak bertanda. Nat. Kaedah 2019, 16, 179–182. [CrossRef]