BAHAGIAN Ⅰ: Kesan Keadaan Persekitaran Terhadap Nombor Nefron
Mar 20, 2022
untuk maklumat lanjut:ali.ma@wecistanche.com
BAHAGIAN Ⅰ: Kesan Keadaan Persekitaran terhadap Nombor Nefron: Memodelkan Penyakit Ibu dan Peraturan Epigenetik dalam Pembangunan Buah Pinggang
Lars Fuhrmann, Saskia Lindner, Alexander-Thomas Hauser, Clemens Höse & et al.
1. Pengenalan
Perkembangan janin dipengaruhi oleh persekitaran dalam rahim, dan persekitaran yang buruk boleh terdedah kepada penyakit seperti hipertensi, penyakit kardiovaskular dan penyakit buah pinggang kronik di kemudian hari [1-4]. Pelbagai gangguan intrauterin boleh mengakibatkan pengurangan endowmen nefron dan fungsi buah pinggang terjejas dalam keturunan. Dalam tikus, keadaan yang membawa kepada pengurangan bilangan nefron semasa kelahiran termasuk sekatan pertumbuhan intrauterin (IUGR), diet rendah protein ibu, ubat-ubatan (termasuk kortikosteroid atau ubat anti-radang nonsteroid), mutasi monogenetik dan tahap vitamin A yang rendah, serta diabetes ibu. dan kekurangan zat besi [5-10]. Pada manusia, pada masa ini tiada kaedah bukan invasif untuk mengukur nombor nefron. Walau bagaimanapun, kajian selepas kematian telah menunjukkan korelasi negatif antara nombor nefron dan tekanan darah [4,11]. Selain itu, keadaan intrauterin yang dikaitkan dengan pengurangan bilangan nefron seperti IUGR diketahui dikaitkan dengan peningkatan kadar hipertensi dan CKD [12].
Eksperimen in vivo di mana keadaan intrauterin yang buruk disebabkan secara buatan pada haiwan hamil telah terbukti tidak ternilai untuk pengesanan dan penerangan tentang perubahan buah pinggang yang disebabkan oleh anak. Walau bagaimanapun, sebarang campur tangan percubaan semasa kehamilan mengakibatkan perubahan yang kompleks dalam fisiologi ibu, plasenta dan janin yang mungkin menjejaskan persekitaran metanephroi yang sedang berkembang. Teknik pemodelan ex vivo mengelakkan perkara ini dengan membolehkan penyiasatan perkembangan buah pinggang dipisahkan sepenuhnya daripada pengaruh induk haiwan, plasenta atau organ janin yang lain. Kultur terpencil metanephroi pada antara muka sederhana udara pada mulanya dilakukan oleh Trowell pada tahun 1950 [13] dan kemudiannya telah ditapis dengan mengkultur buah pinggang pada membran penapis[14], menyediakan asas untuk keadaan kultur pembolehubah tunggal.
Ringkasnya, terdapat semakin banyak bukti yang menunjukkan bahawa penghinaan pranatal yang dikaitkan dengan bilangan nefron yang rendah adalah berkaitan dengan faktor risiko hipertensi dan CKD. Untuk membangunkan strategi pencegahan untuk memastikan endowmen nefron yang mencukupi semasa lahir, pemahaman mekanistik tentang faktor-faktor yang mempengaruhi perkembangan buah pinggang dan nefrogenesis adalah perlu. Dalam kerja ini, budaya organ metanephric digunakan untuk memodelkan aspek peraturan alam sekitar yang berbeza untuk mengkaji kesannya terhadap pertumbuhan buah pinggang dan kemungkinan implikasi untuk fungsi buah pinggang jangka panjang dan digunakan untuk menyaring pengawal selia epigenetik menggunakan sebatian kecil yang diluluskan oleh FDA.
Klik untuk produk herba Cistanche untuk fungsi buah pinggang
2. Keputusan
2.1. Penggunaan Kultur Organ Metanephric untuk Mengkaji Kesan Keadaan Persekitaran Terhadap Perkembangan Renal
Untuk memodelkan keadaan persekitaran yang buruk, buah pinggang dari hari embrio (E) 12.5 embrio telah dibiakkan pada antara muka udara sederhana (Rajah 1A). Untuk memudahkan pemantauan perkembangan nefron dan glomerular, Enam2. Cre dan Pod. Tikus wartawan dwi-pendarfluor Cre telah digunakan, masing-masing (Rajah 1B, C). Keadaan biasa semasa kehamilan ialah demam, yang menjejaskan lebih daripada 10 peratus kehamilan semasa 16 minggu pertama kehamilan [15]Haba adalah teratogen yang dicirikan dengan baik, dan hipertermia semasa kehamilan telah terbukti membawa kepada pengguguran janin, terencat pertumbuhan, dan kecacatan perkembangan, seperti agenesis buah pinggang, hipoplasia dan berat lahir rendah dalam beberapa spesies [16-21]. Untuk menilai kesan keadaan hipertermik yang berpanjangan, julat demam pada pertumbuhan buah pinggang dan pembentukan nefron, buah pinggang telah diasingkan dan dikekalkan pada 37 atau 40 darjah (Rajah 1D). Selepas 7 hari kultur, buah pinggang yang dikultur pada suhu 40C, secara purata, 18.36 peratus lebih kecil daripada buah pinggang yang dikultur di bawah keadaan fisiologi (Rajah 1E). Walau bagaimanapun, tiada perbezaan ketara dalam bilangan glomeruli setiap buah pinggang ditemui antara kumpulan (Rajah 1F). Namun begitu, penurunan pertumbuhan keseluruhan buah pinggang menunjukkan kesan negatif peningkatan suhu pada pertumbuhan metanephric.
Dengan anggaran 19 peratus wanita hamil mengalami anemia kekurangan zat besi [22], kekurangan zat besi adalah salah satu keadaan yang paling meluas yang berpotensi mengganggu perkembangan buah pinggang [23]. Data in vivo telah menunjukkan bahawa pertumbuhan buah pinggang, bilangan glomerular, dan pengambilan besi buah pinggang dikurangkan semasa kehamilan yang terjejas oleh kekurangan zat besi ibu [24]. Untuk menilai kesan pengurangan bekalan besi terikat transferrin terhadap pertumbuhan buah pinggang dan nefrogenesis, eksplan dibiakkan dalam medium yang mengandungi 50 ug/mL holo-transferrin tepu besi atau 50 ug/mL apo-transferrin yang berkurangan zat besi, masing-masing. Buah pinggang yang disekat besi kekal lebih kecil daripada buah pinggang yang cukup zat besi dan menunjukkan peningkatan apoptosis dalam tunas ureter dan mengurangkan cawangan dan percambahan tunas ureter (Rajah 1G, Rajah Tambahan S1A-F). Walaupun populasi nefron tidak terjejas secara morfologi, penurunan dalam bahagian distal nefron yang sedang berkembang, serta tubul distal, dapat dilihat (Rajah 1H, I, Rajah Tambahan S1G-J). Buah pinggang kekurangan zat besi adalah, secara purata, 47.9 peratus daripada saiz rakan kultur holo-transferrin mereka (Rajah 1) dan menunjukkan pengurangan jumlah keseluruhan glomeruli setiap buah pinggang sebanyak 69.9 peratus selepas 7 hari dalam kultur (Rajah 1K) . Oleh itu, kekurangan zat besi oleh apo-transferrin menunjukkan kesan yang teruk pada pertumbuhan buah pinggang dengan fenotip nefrogenesis semua-proksimal.
Rajah 1. Penggunaan kultur organ metanephric untuk mengkaji kesan keadaan persekitaran terhadap perkembangan buah pinggang.(A) Permatang urogenital daripada embrio tikus E12.5 (panel kiri) telah diekstrak secara mikrosurgikal (panel kedua), dan buah pinggang telah diasingkan（panel ketiga） dan diletakkan pada sisipan Transwell （panel kanan）. Bar skala∶ 1 mm （panel kiri）, 500 μm（panel ketiga）. (B)Tikus transgenik dengan dua ekspresi Tomato/EGFP digunakan untuk pelabelan bersyarat bagi Enam2-sel positif dan anak mereka menggunakan Six2. Cre atau(C) sel podocin-positif menggunakan Pod. Cre tikus. (D) Eksplan daripada embrio yang sama dibiakkan selama 7 hari pada suhu 37 atau 40 darjah . Bar skala∶ 500 μm. （E） Kawasan permukaan eksplan yang ditanam selama 7 hari pada pasangan 37 atau 40 darjah .n=40, ujian-t berpasangan, min±SD.(F) Bilangan glomeruli dalam kumpulan eksplan selepas 7 hari.n{{ 17}} pasangan, ujian-t berpasangan, min ±SD. （G） Eksplan daripada embrio yang sama dibiakkan selama 7 hari dalam medium yang mengandungi holo-Tf atau apo-Tf. Bar skala∶ 500 μm. (H) Imej luas bagi pasangan eksplan kultur holo-Tf dan apo-Tf yang diwarnakan terhadap SIX2 dan E-cadherin selepas 48 jam kultur menunjukkan kumpulan sel progenitor normal dan kecacatan pada morfologi nefron awal. Bar skala∶100 μm.（I） Imej luas bagi pasangan eksplan holo-Tf dan apo-Tfcultured yang diwarnakan terhadap WT1 dan JAG1. Bar skala∶100 μm. （） Kawasan permukaan eksplan kultur holo-Tf dan apo-Tf selepas 7 hari.n=30 pasangan, ujian-t berpasangan, min ± SD.(K) Bilangan glomeruli dalam kumpulan eksplan selepas 7 hari.n =17 pasangan, ujian-t berpasangan, min ± SD.
2.2. Ex Vio Pendedahan Glukosa Tinggi Membawa kepada Perubahan Berkaitan Nefropati Diabetik dalam Membangun Buah Pinggang
Diabetes ibu adalah satu lagi keadaan biasa semasa kehamilan, dengan kelaziman global hiperglikemia semasa kehamilan ~ 17 peratus dan lebih 20 juta kelahiran hidup setiap tahun [25]. Diabetes yang disebabkan dalam model tikus dan tikus telah ditunjukkan untuk membawa kepada keturunan dengan nombor nefron yang lebih rendah [10,26,27]. Kultur organ metanephric telah digunakan sebelum ini untuk mengkaji kesan glukosa tinggi terhadap perkembangan buah pinggang [27-29]. Sebelum ini, kami melaporkan pengurangan saiz, nombor nefron, dan metilasi DNA di bawah keadaan glukosa tinggi 55 mM [30]. Berbeza dengan data yang diterbitkan [28], tiada kesan pada saiz eksplan atau nombor glomerular dapat dilihat dalam sampel kami apabila dibiakkan dalam media glukosa 30 mM yang berbeza berbanding dengan keadaan kawalan 5 mM selepas 7 hari (Rajah Tambahan S2A, B). Tambahan pula, tiada penurunan dalam metilasi DNA di LINE-1 dan tapak satelit utama dapat dikesan (Tambahan Rajah S2C, D). Kesan glukosa tinggi 55 mM pada perkembangan buah pinggang selepas 7-kultur tempoh hari dianalisis selanjutnya, menunjukkan penurunan dalam kadar pertumbuhan bermula pada hari ke-3 dalam kultur (Rajah 2A, B). Pewarnaan imunofluoresensi tidak menunjukkan kecacatan morfologi bagi ENAM2-kolam sel progenitor positif (Rajah 2C) tetapi menunjukkan pengurangan pewarnaan podocalyxin penanda podocyte (PODXL, Rajah 2D). Glomeruli didapati mengandungi matriks bawah tanah glomerular yang menebal yang boleh dilihat dalam pewarnaan histologi (Rajah 2E). Penemuan yang sama dibuat dalam mikroskop elektron, menunjukkan peningkatan dalam ketebalan membran bawah tanah glomerular (Rajah 2F), salah satu penanda terawal pra-diabetes dan nefropati diabetik (DN) [31,32], dalam lima daripada enam buah pinggang dan tiada satu pun. daripada tujuh buah pinggang kawalan rakan sepah. Untuk membongkar lagi perubahan dalam transkrip, analisis ekspresi gen pembezaan berpasangan (DGE) kultur buah pinggang daripada tiga anak telah dilakukan, dengan satu buah pinggang dari setiap embrio dikultur dengan glukosa tinggi dan satu lagi dengan medium kawalan dan buah pinggang dikumpulkan untuk analisis ( n=3).DGE mengesahkan penyeliaan komponen matriks ekstraselular sebagai proses biologi terkawal utama (Jadual Tambahan S1). Gen yang dikurangkan sebahagian besarnya terlibat dalam pengaktifan sel (imun) dan eksositosis / rembesan (Jadual Tambahan S1). Ontologi fenotip mamalia menunjukkan korteks buah pinggang yang tidak normal dan morfologi corpuscle renal disebabkan oleh gen terkawal seperti Pdgfb, Podxl, Ren, Ptpro, Mafb, dan Vegfa (Jadual Tambahan S1). Ekspresi buah pinggang beberapa gen, seperti Angptl4, Spon2 (Mindin), Pappa dan Txnip, yang telah terbukti dikawal dalam nefropati diabetik [33-36], didapati meningkat dalam keadaan hiperglisemik. Untuk membandingkan profil ekspresi gen kultur buah pinggang glukosa tinggi kepada DN manusia, data DGE telah dipadankan dengan data manusia daripada glomeruli dan tubul microdissected daripada biopsi pesakit nefropati diabetik dari European Renal cDNA Bank(ERCB). Daripada 216 gen yang dikawal secara berbeza yang dipadankan selepas analisis kelompok, 94 gen telah dikawal secara berbeza dalam pecahan glomerular dan/atau tiub (Rajah 2G). Pertindihan model kami dan DNgenes manusia menunjukkan 40 daripada 95 gen yang dikawal selia dalam glomeruli dan 34 gen dalam tubulus (25 gen yang sama) (Rajah 2H). Gen kebanyakannya terlibat dalam organisasi matriks ekstraselular (COL4A5, COL4A6, COL8A2, LAMB3, LAMC3) dan lekatan sel (ITGBL1, CLDN15). Di samping itu, gen yang berkaitan dengan diabetes seperti TXNIP, SPON2, dan PAPPA telah dikawal selia. Daripada 120 gen yang dikurangkan daripada kultur buah pinggang, 22 juga dikurangkan dalam glomeruli dan 39 juga dikurangkan dalam tubul (16 dalam com-mon (Rajah 2I). Gen ini terlibat sebagai tindak balas kepada rangsangan endogen (BMP2, KLF15, JUNB, CTSB), pembangunan epitelium nefron (PTPRO, PODXL, VEGFA), dan pengawalan positif kemotaksis sel endothelial (LGMN, P2RX4, VEGFA). Selain itu, gen yang berkaitan dengan diabetes seperti RASGRP3, SIRPA, GATM dan ESM1 telah dikurangkan [ 37-39]. Gen yang dikawal secara berbeza yang tidak bertindih dengan data ERCB juga menggambarkan perubahan yang berkaitan dengan diabetes, seperti matriks ekstraselular(ANGPTL4, TNN, DPT, COL9A2) atau diabetes kehamilan (LAT2, HP, CXCL10, CD{{76} }, CD68, REN, SLC2A3, VCAM1) Oleh itu, perkembangan buah pinggang di bawah keadaan glukosa tinggi menunjukkan persamaan yang luar biasa dengan nefropati diabetik dewasa manusia.
Rajah 2. Pendedahan glukosa tinggi ex vivo membawa kepada perubahan yang berkaitan dengan nefropati diabetik pada buah pinggang yang sedang berkembang.(A) Buah pinggang embrio daripada Pod.Cre; Haiwan tomato/EGFP yang dikultur selama 7 hari dalam keadaan glukosa rendah (LG,5.5 mM -D-glukosa, 55 mM manitol) atau glukosa tinggi (HG, 55 mM -D-glukosa). Bar skala: 500 um.(B)Kawasan permukaan buah pinggang keadaan HG dan LG.*,p=0.0474;*,p=0.0052;*,p<0.0001.paired t-test,="" mean="" ±="" sd.(c)="" confocal="" immunofluorescent="" stainings="" of="" day="" 7="" kidney="" cultures="" against="" six2="" and="" (d)="" podocalyxin="" with="" pan-cytokeratin="" and="" hoechst.scale="" bar:="" 100="" um.="" (e)="" stainings="" of="" 6="" um="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" scale="" bar:="" 20="" um.="" (f)transmission="" electron="" microscopy="" of="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" glomerular="" basement="" membranes="" are="" thickened="" in="" kidneys="" exposed="" to="" high="" glucose="" conditions.="" left="" column:="" magnification="" showing="" podocyte="" foot="" processes.="" scale="" bars:="" 500="" nm="" (left="" panels),100="" nm="" (right="" panels).(g)="" fold="" change="" of="" rna-seq="" data="" from="" hg="" compared="" to="" lg="" kidneys="" and="" ercb="" diabetic="" nephropathy="" (dn)patient="" microarray="" data="" from="" microdissected="" glomeruli="" and="" tubules="" showing="" differentially="" expressed="" genes.="" (h)="" genes="" upregulated="" in="" the="" kidney="" cultures(kc)overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="" highlighted.="" (i)genes="" downregulated="" in="" the="" kidney="" cultures="" (kc)="" overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="">
2.3. Pengaruh Pendedahan Glukosa Tinggi Ex Vivo kepada Pembentukan Ingatan Jangka Panjang melalui Metilasi DNA
Untuk lebih memahami perubahan molekul yang dimediasi oleh persekitaran hiperglisemik, kultur buah pinggang ditanam pada keadaan glukosa tinggi selama 3.5 hari dan kemudian ditukar kepada keadaan glukosa rendah untuk jumlah masa yang sama (Rajah 3A). Hebatnya, pengeraman di bawah keadaan fisiologi selepas tempoh inkubasi yang lebih pendek dalam medium glukosa tinggi tidak membalikkan pengurangan pertumbuhan selepas 7 hari dalam kultur dengan kultur berkembang pada kadar yang sama seperti di bawah rawatan glukosa tinggi yang berterusan (Rajah 3B). Tambahan pula, metilasi DNA menunjukkan hipometilasi unsur LINE-1 dan lokus satelit utama (Rajah 2C, D), serta hipermetilasi DNA yang berterusan bagi penganjur Ppargcla, di bawah kedua-dua keadaan glukosa tinggi dan terbalik (Rajah 3E), yang menunjukkan pembentukan memori metabolik melalui metilasi DNA disebabkan oleh keadaan persekitaran yang buruk sebelum ini sebagai cara pengaturcaraan janin.
Rajah 3. Pendedahan glukosa tinggi ex vivo mempengaruhi pembentukan ingatan jangka panjang melalui metilasi DNA.(A) Pengimejan E12.5buah pinggang embrio dari hari 0 hingga hari ke-7 dalam medium glukosa rendah (5.5 mM), sederhana glukosa tinggi (55 mM), atau sederhana glukosa tinggi selama 3.5 hari dan berbalik kepada sederhana glukosa rendah untuk hari yang tinggal.Bar skala:500 um. (B) Luas permukaan buah pinggang selama 7 hari. Min ± SD. n{11}} buah pinggang. LG, rawatan glukosa rendah; HG, rawatan glukosa tinggi; HG ke LG,3.5 hari tinggi dan 3.5 hari rawatan glukosa rendah.***,LG-HG (ujian-t tidak berpasangan):p=0.0004;**,LG-HG ke LG (ujian-t berpasangan ): hlm<0.0001.(c) analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" line-1="" and(d)major="" satellite="" loci="" shows="" continuous="" dna="" hypomethylation="" in="" high="" glucose="" treated="" conditions.**,p-value="0.0022.*,p-value=0.0357.(E)" analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" the="" ppargcla="" locus="" shows="" continuous="" dna="" hypermethylation="" in="" high="" glucose="" conditions.="" mean="" ±="" sd.="" *,p-value="">
2.4.Skrin Kompaun Kecil Ex Vivo mengenal pasti Pengawal Selia Epigenetik Pembangunan Renal
Hasil kerja ini serta kerja-kerja terdahulu mencadangkan bahawa mekanisme epigenetik memainkan peranan dalam pembangunan buah pinggang [30, A40-45]. Oleh itu, kami ingin menilai secara sistematik kesan modulator epigenetik kelas enzim yang berbeza pada perkembangan buah pinggang. Untuk ini, kami memilih perpustakaan 22 sebatian kecil yang diluluskan oleh FDA dengan aktiviti perencatan yang ditunjukkan [46-56](Rajah 4A). Menggunakan tikus Six2.Cre-reporter untuk menilai perkembangan nefron, struktur buah pinggang telah dibiakkan selama 3 hari dengan perencat dalam medium. Saiz meningkat dari semasa ke semasa berbanding dengan organ kawalan sampah, dan morfologi telah diperiksa untuk keabnormalan dalam pembangunan (Rajah 4B). Beberapa perencat boleh ditunjukkan untuk mengganggu perkembangan buah pinggang ex vivo yang normal. Entinostat perencat HDAC, perencat deacetylase histon benzamide dengan pertalian tinggi untuk HDAC1,2 dan 3 [57], menunjukkan pengurangan pertumbuhan yang konsisten dan kekurangan pembezaan dan percambahan selepas 3 hari (Rajah 4C). TH39 dibangunkan sebagai perencat HDAC8 terpilih (IC50). HDAC8 88 nM, 26-kali ganda selektif terhadap HDAC1,28-kali ganda selektif terhadap HDAC6[56]), menunjukkan perencatan pertumbuhan yang sama teruk berbanding dengan organ kawalan sampah. Tambahan pula, chelator besi dan perencat JmJC deferasirox dan deferoxamine menunjukkan pengurangan pertumbuhan yang serupa dengan medium kekurangan zat besi. Selain itu, cyproheptadine inhibitor SET7/9 [58,59] menunjukkan pengurangan pertumbuhan dan kekurangan pembezaan dan percambahan berbanding dengan buah pinggang kawalan (Rajah 4D) tetapi juga seolah-olah mengganggu isyarat Wnt (Tambahan Rajah S3). Perencat HDAC, HAT, HDM dan HMT yang lain serta perencat DNMT 5-azacytidine tidak menunjukkan pengurangan pertumbuhan atau anomali perkembangan dalam jangka masa yang diukur (Rajah 4A).
Rajah 4. Skrin kompaun kecil ex vivo mengenal pasti modulator perkembangan buah pinggang.(A) Senarai sebatian kecil, sasaran epigenetiknya dan kepekatan yang digunakan menunjukkan pengurangan pertumbuhan buah pinggang dengan entinostat, TH39, deferasirox, deferoxamine, dan cyproheptadine dalam Lebih daripada atau sama dengan 3 eksperimen bebas selepas 3 hari dalam kultur. Budaya kawalan dirawat dengan DMSO. ***, nilai-p<0.0001. (b)examples="" of="" two="" sets="" of="" embryonic="" kidney="" cultures="" with="" pictures="" taken="" from="" day="" 0="" until="" day="" 3="" showing="" growth="" reduction="" and="" morphological="" differences="" in="" kidneys="" treated="" with="" th39,="" deferasirox,="" and="" deferoxamine="" compared="" to="" littermate="" control="" kidneys.="" scale="" bar∶="" 500="" μm.="" (c）entinostat="" showed="" growth="" reduction="" at="" 5="" and="" 10="" μm="" concentrations,="" no="" nephron="" differentiation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" (d)cvproheptadine="" showed="" growth="" reduction="" at="" 100="" and="" 50="" μm="" concentrations,="" lack="" differentiation,="" ureter="" dilation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" in="" culture.="" scale="" bar:="" 500="" um.="" panck,="" pan-cytokeratin.="" cc3,="" cleaved="" caspase-3.="" pcna,="" proliferating="" cell="" nuclear="">
