Analisis Proteomik Kuantitatif Pesakit COVID-19: Fetuin-A Dan Tetranektin Sebagai Modulator Potensi Tindak Balas Imun Semula Jadi

ABSTRAK

Rawatan kes teruk penyakit koronavirus 2019 (COVID-19) adalah amat penting untuk meminimumkan kematian dan kerosakan organ akhir. Di sini kami melakukan analisis proteomik sampel plasma daripada pesakit COVID-19 yang ringan, sederhana dan teruk. Analisis mendedahkan protein yang dinyatakan secara berbeza dan sasaran potensi terapeutik berbeza yang berkaitan dengan tindak balas imun semula jadi seperti fetuin-A, vitronektin (TN) dan paraoxonase-1 (PON1). Tambahan pula, perubahan protein dalam plasma menunjukkan disregulasi pelengkap dan lata pembekuan dalam pesakit COVID-19 berbanding dengan kawalan sihat. Kesimpulannya, data proteomik kami mencadangkan fetuin-A dan TN sebagai sasaran berpotensi yang mungkin digunakan untuk diagnosis serta tandatangan untuk pemahaman yang lebih baik tentang patogenesis penyakit-19 COVID.

Organ hujung merujuk kepada tisu atau organ yang akhirnya melengkapkan fungsi tertentu dalam tubuh manusia, seperti hati, buah pinggang, dan paru-paru. Kerosakan pada organ ini boleh membawa kepada pelbagai penyakit utama, seperti penyakit buah pinggang kronik, sirosis hati, dan penyakit paru-paru obstruktif kronik. Kekebalan merujuk kepada tindak balas imun badan terhadap mikroorganisma dan tisu patogen asing. Imuniti badan kekal normal, yang boleh mencegah kejadian dan kemerosotan penyakit. Oleh itu, kerosakan organ akhir berkait rapat dengan imuniti, dan ia berinteraksi untuk menjejaskan fungsi imun badan manusia.

Kerosakan organ hujung boleh menyebabkan kerosakan kepada bilangan dan kualiti sel imun dalam badan. Sebagai contoh, pesakit dengan penyakit hati akan mengalami leukopenia, fungsi hati yang tidak normal, dan sintesis antibodi yang berkurangan, yang akan menjadikan mereka lebih terdedah kepada jangkitan selepas sakit; penurunan fungsi buah pinggang akan menyebabkan uremia. Sindrom, anemia, osteoporosis, dan penyakit lain, faktor ini juga akan menjejaskan fungsi imun badan. Sebaliknya, tindak balas imun badan juga boleh menjejaskan organ akhir, contohnya, tindak balas imun yang berlebihan boleh menyebabkan hepatitis imun atau pneumonia anaphylactic. Interaksi kerosakan organ akhir dan disfungsi imun menjadikan badan lebih mudah terdedah kepada penyakit dan memendekkan jangka hayatnya.

Oleh itu, mengekalkan fungsi organ akhir yang normal dan fungsi imun yang teguh adalah kunci untuk mengekalkan kesihatan yang baik. Orang ramai harus mencegah kerosakan organ akhir melalui gaya hidup yang baik, seperti diet yang sihat, senaman yang betul, dan relaksasi, dan mengekalkan fungsi imun yang normal melalui pencegahan dan rawatan penyakit secara aktif. Ia boleh dilihat bahawa kita perlu memberi perhatian kepada imuniti kita. Cistanche boleh meningkatkan imuniti, dan kesannya adalah baik. Polisakarida dalam daging boleh mengawal tindak balas imun sistem imun manusia, meningkatkan keupayaan tekanan sel imun, dan menguatkan sel imun. kesan bakteria.

Klik manfaat kesihatan cistanche

1. Pengenalan

Sindrom pernafasan akut yang teruk, coronavirus 2 (SARS-CoV-2), menyebabkan penyakit coronavirus 2019 (COVID-19) [1]. Penyakit COVID-19 dicirikan oleh fenotip klinikal yang berbeza daripada asimtomatik, ringan, dan sederhana kepada yang teruk atau sangat teruk, dicirikan oleh radang paru-paru yang teruk dan risiko kematian yang tinggi dalam populasi warga emas terutamanya pada pesakit yang berumur lebih dari 70 tahun [ 2,3]. Vaksin dijana lewat pada tahun 2020 dan kebanyakan orang di seluruh dunia telah divaksin dengan sekurang-kurangnya 2 dos. Di sebalik penurunan bilangan subjek yang dijangkiti serta kes teruk yang dilaporkan, masalah itu masih jauh daripada dapat diselesaikan dan punca perkembangan penyakit kepada keadaan yang teruk masih tidak diketahui. Selain itu, SARS-CoV-2 seperti virus lain berubah dari semasa ke semasa dan varian baharu mungkin mempunyai pengubahsuaian dalam sifat asal seperti penyebaran dan keterukan penyakit yang berkaitan, dan menjadi kurang (varian omikron) [4] atau lebih (delta varian) [5] teruk. Potensi kemunculan varian baharu masih mungkin dan memahami mekanisme laluan di sebalik penyakit-19 COVID adalah sangat kritikal.

Adalah diketahui umum bahawa disfungsi tindak balas imun adalah isu utama terhadap pembersihan virus dan pemulihan daripada penyakit. Di samping itu, tindak balas imun semula jadi dianggap sebagai faktor utama dalam memodulasi kemajuan penyakit ke arah fenotip klinikal asimtomatik, ringan, sederhana, teruk, atau sangat teruk [6,7]. Neutrofil dan monosit/makrofaj adalah elemen pertahanan barisan hadapan yang penting memacu tindak balas imun semula jadi semasa jangkitan [8,9]. Protein spike SARS-CoV-2 mungkin mengaktifkan makrofaj secara langsung melalui reseptor ACE2 yang terdapat dalam sel ini [10].

Sepanjang jangkitan, sel imun mengeluarkan beberapa protein, sitokin, dan mediator untuk mengawal keradangan dan mengekalkan homeostasis fisiologi badan. Proteomik berasaskan plasma ialah pendekatan praktikal untuk menganalisis profil protein dan menyusun perubahan yang berkaitan dengan keadaan patofisiologi atau perkembangan penyakit [11]. Kajian proteomik yang berbeza telah dilakukan untuk mengenal pasti dan mencirikan profil proteom dalam kohort COVID-19 yang berbeza menggunakan tisu [12,13], sel [14] atau plasma [15,16]. Oleh itu, kami menggunakan proteomik berasaskan plasma untuk mengenal pasti protein semula jadi yang berkaitan dengan sistem imun yang berkaitan dengan{10}} penyakit COVID dan perkembangan keterukan. Kami berhasrat untuk mengkaji corak ekspresi protein plasmatik dalam pesakit yang sihat dan{11}}yang dijangkiti COVID dan untuk menilai potensi interaksi dengan tindak balas imun semula jadi.

2. Keputusan

2.1. Profil proteomik plasma

Untuk menilai tindak balas hos SARS-CoV-2, analisis proteomik plasma bagi kohort pesakit COVID-19 dan kawalan sihat telah dilakukan. Dalam kajian kami, kaedah iTRAQ 4plex telah dipilih dengan teliti berbanding kaedah berlabel proteomik lain kerana kebolehulangan yang tinggi dan liputan proteom [17]. Selain itu, untuk kedalaman jumlah liputan proteom yang lebih baik, kami menggabungkan pecahan peptida pertukaran kation yang kuat kepada iTRAQ. Ilustrasi aliran kerja kajian dibentangkan dalam Rajah 1. Sebanyak 176 protein telah dikenal pasti dalam semua COVID-19 dan sampel plasma kawalan sihat dengan kadar penemuan palsu sebanyak<1% at the protein level. Nevertheless, our prime interest was to identify biomarkers and investigate the pathogenesis of COVID-19. Consequently, differentially expressed proteins analysis was performed for healthy control versus other COVID-19 groups (severe, moderate, and mild) by applying pairwise comparison. Supplementary Table S1 shows a list of differentially expressed proteins in all pairwise comparisons including 'severe v. Control', 'moderate v. Control', and 'mild v. Control'. The statistical criteria for the quantitative analysis were set with a cutoff for fold change with >1.20 untuk up-regulation dan<0.83 for down-regulation and a p-value of <0.05 (Supplementary Table S2). 

Keputusan mendedahkan bahawa bilangan protein yang diubah antara kumpulan perbandingan berbeza-beza seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2a. Keputusan perbandingan menunjukkan bahawa 27 peratus daripada ukuran protein yang dinyatakan secara berbeza bertindih dalam ketiga-tiga kumpulan (Rajah 2b). Gambar rajah Venn juga memaparkan bahawa bilangan protein unik dalam belas kasihan berpasangan ringan berbanding kawalan mempunyai bilangan yang lebih tinggi berbanding kumpulan lain. Ini tidak semestinya mencerminkan perbezaan pada tahap pengenalan protein tetapi tahap kuantitatif memandangkan kriteria statistik telah dipilih untuk perubahan lipatan dan nilai p. Untuk menilai sama ada ukuran protein yang dinyatakan secara berbeza untuk semua perbandingan boleh dibezakan antara kumpulan-19 COVID atau tidak, analisis PCA telah digunakan. Menariknya, keputusan menunjukkan bahawa terdapat perbezaan yang jelas antara kumpulan COVID-19 seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3. Tambahan pula, protein yang dinyatakan secara berbeza telah dibentangkan dengan mencipta plot gunung berapi untuk semua perbandingan berpasangan kawalan sihat berbanding COVID{{ 7}} kumpulan (Gamb. 4). Beberapa protein yang dinyatakan secara berbeza dalam set data kami telah dilaporkan sebelum ini sebagai biomarker untuk COVID-19 [16,18].

Ontologi gen dan analisis laluan menggunakan alat dalam talian 'STRING' telah dilakukan pada ukuran protein yang dinyatakan secara berbeza untuk kawalan sihat dan pesakit COVID{{0}} tanpa mengira kumpulan mereka berada. Untuk analisis pengayaan go, majoriti protein yang dinyatakan secara berbeza didapati terlibat dalam pengawalseliaan biologi, kawasan ekstraselular, dan pengatur fungsi molekul masing-masing untuk proses biologi, pelengkap selular dan fungsi molekul (bahan tambahan, Rajah S1). Tambahan pula, kami telah mengkaji protein yang dinyatakan secara berbeza dan penglibatannya dalam analisis laluan menggunakan pangkalan data KEGG. Kriteria statistik analisis pengayaan dipilih untuk menjadi p <0.01 dan pemeringkatan istilah laluan adalah berdasarkan pengayaan lipatan seperti yang ditunjukkan dalam bahan tambahan (Rajah S2). Sepanjang jangkitan, sel yang rosak dan mati memulakan tindak balas imun yang besar dan melepaskan komponen sel dan endotoksin yang berbeza yang mengaktifkan lata pembekuan darah [19]. Pengaktifan laluan sedemikian membawa kepada disfungsi endothelial dan keradangan serta rangsangan penghijrahan leukosit dan penyusupan tisu, sekali gus mencetuskan pengaktifan tindak balas tempatan imun semula jadi [20]. Dalam kajian kami, sistem pelengkap yang merupakan modulator pusat imuniti semula jadi dan laluan lata pembekuan didapati sebagai yang paling penting antara istilah laluan lain. Beberapa kajian proteomik mengenai plasma daripada pesakit COVID-19 menunjukkan bahawa lata pelengkap dan pembekuan adalah salah satu laluan yang paling diperkaya [21,22]. Walau bagaimanapun, tumpuan perbincangan kami adalah pada tiga protein fetuin-A, TN dan PON-1 sebagai sasaran baharu yang berpotensi terlibat dalam tindak balas imun semula jadi kepada jangkitan SARS-COV-2 dan tahap keterukan COVID{{ 14}} penyakit.

2.2. Tahap plasma TNF dikaitkan dengan simptom penyakit-19 COVID

Ribut sitokin yang disebabkan oleh Sars-CoV2 ialah satu tanda kes penyakit COVID-19 yang teruk [23]. Telah dilaporkan bahawa pelepasan berlebihan TNF dikaitkan dengan keparahan dan prognosis yang buruk bagi pesakit dengan penyakit-19 COVID [24,25]. Dalam kajian kami, pengukuran tahap plasma TNF menunjukkan peningkatan yang dijangkakan dalam kumpulan COVID-19 berbanding kawalan sihat yang disokong dengan peningkatan selanjutnya dalam sampel teruk berbanding sampel sederhana atau ringan.\

3. Perbincangan

Beberapa kajian proteomik tidak disasarkan telah digunakan untuk menyiasat perubahan dalam-19 sampel serum/plasma COVID. Bilangan protein yang dikenal pasti daripada kajian ini berbeza-beza kerana kaedah berbeza yang digunakan. Pendekatan kuantifikasi tanpa label menggunakan kaedah pemerolehan bebas data memaparkan liputan proteom plasma yang lebih tinggi [26]. Untuk pendekatan proteomik berasaskan pelabelan, kaedah kuantiti TMT berasaskan Orbitrap LC-MS/MS telah menunjukkan liputan protein plasma/serum yang lebih tinggi dengan bilangan protein yang dikenal pasti mencapai 900 [27]. Dalam kajian kami, jumlah protein yang dikenal pasti adalah 176, yang sangat hampir dengan dua kajian yang diterbitkan yang menggunakan penganalisis jisim yang sama (TripleTOF) di mana mereka mengenal pasti 179 dan 189 protein [28,29]. Protein yang diedarkan dalam plasma pesakit COVID{14}} memberikan tingkap untuk pengesanan kemajuan dan keterukan penyakit, serta tanda keradangan dan tindak balas imun semula jadi dan adaptif.

Pengeluaran dan pelepasan berlebihan sitokin proinflamasi dianggap sebagai titik utama dalam mengalihkan fenotip klinikal daripada status sederhana kepada teruk dalam-19 pesakit COVID. Semasa jangkitan, tindak balas imun semula jadi dimodulasi oleh corak molekul berkaitan kerosakan (DAMP) atau corak molekul berkaitan patogen (PAMP) [30]. Protein fasa akut (APP) seperti fetuin-A dikeluarkan secara sistematik dalam plasma untuk menyokong proses anti-radang semasa keradangan. Dalam kajian kami, kami melihat peraturan turun yang jelas bagi fetuin-A plasmatik dalam kes sederhana dan teruk berbanding dengan kawalan sihat (Rajah 4). Telah ditunjukkan bahawa fetuin-A mungkin menghalang mediator awal (TNF, IL-1, IL-6 dan INF) dan lewat (HMGB1) yang dikeluarkan oleh sel imun semula jadi seperti makrofaj [31]. Analisis TNF dalam kohort COVID{15}} kami menunjukkan trend peningkatan dalam kepekatan plasma berbanding penderma sihat yang lebih berpotensi dalam kes yang teruk (bahan tambahan, Rajah S3). Semasa keradangan, monosit/makrofaj yang diaktifkan mengeluarkan sitokin pro-radang yang dilemahkan oleh amina biogenik di mana-mana yang dipanggil spermine [32]. Walau bagaimanapun, kesan anti-radang spermine bergantung kepada fetuin-A. Oleh itu spermine tidak dapat menghalang fungsi sel kekurangan monosit/makrofaj fetuin-A [33]. Tambahan pula, penurunan tahap fetuin-A mungkin berkaitan dengan keabnormalan vaskular dan trombosis yang dikesan dalam kes-kes yang sangat teruk disebabkan oleh peningkatan dalam kalsifikasi vaskular dan disfungsi endothelial [34,35] dan tekanan oksidatif [36] yang dikaitkan dengan tahap fetuin-A. .

Selepas jangkitan virus, apoptosis sel adalah salah satu mekanisme pertahanan perumah. Walau bagaimanapun, pengumpulan berlebihan sel apoptosis atas sebab kecacatan dalam pembersihan sel apoptosis dikaitkan dengan hiperinflamasi dan autoimun [37]. Penurunan tahap plasmatik fetuin-A mungkin sekurang-kurangnya sebahagiannya terlibat dalam proses ini kerana ia meningkatkan kapasiti fagositosis untuk membersihkan sel apoptosis oleh makrofaj [38] dan vesikel oleh VSMC [39].

Baru-baru ini dilaporkan bahawa fetuin-A memainkan peranan penting bukan sahaja sebagai perencat kalsifikasi tetapi sebagai komponen pelbagai pelindung dengan mengurangkan fibrosis dan keradangan dan memodulasi polarisasi makrofaj [40].

Rudloff et al. menunjukkan bahawa fetuin-A adalah gen sasaran HIF yang mempunyai peranan perlindungan dalam disfungsi buah pinggang yang disebabkan oleh hipoksia [40]. Fetuin-A melemahkan kelebihan kalsium makrofaj akibat hipoksia. Kami baru-baru ini menunjukkan bahawa protein lonjakan coronavirus SARS-CoV-2 mengaktifkan-1-makrofaj seperti dan meningkatkan tahap kalsium intraselular [41]; Oleh itu, fetuin-A mungkin memainkan peranan sebagai penghapus kalsium untuk mengawal homeostasis sel dan memodulasi polarisasi yang mencukupi untuk tindak balas imun semula jadi yang munasabah, dengan itu mengelakkan keradangan yang berlebihan.

Sindrom disfungsi organ berbilang (MODS) atau MODS berkaitan jangkitan dianggap sebagai salah satu punca utama kematian dalam kes COVID{1}} yang teruk [42]. Hiperinflamasi dan disregulasi imun semasa jangkitan membawa kepada kerosakan organ akhir akibat kegagalan tindak balas imun semula jadi dan hipersitokinemia. Atas jangkitan sistemik, endotoksin bakteria dan RNA virus diiktiraf oleh sistem imun semula jadi yang mencetuskan ekspresi dan pembebasan sitokin awal (TNF dan INF). Tambahan pula, tindak balas imun semula jadi barisan hadapan merangsang pengeluaran mediator lewat seperti kotak kumpulan mobiliti tinggi 1 (HMGB1) [43]. Intra atau ekstraselular HMGB1 yang dinyatakan dalam kebanyakan sel adalah penggera yang dikeluarkan apabila rangsangan atau selepas kematian sel [44]. Pelepasan hiper HMGB1 mencetuskan pengeluaran sitokin seperti IL-6 [45]. Peningkatan kepekatan IL-6 dikaitkan dengan hasil yang teruk dalam sindrom keradangan berbilang sistem pada kanak-kanak (MIS-C) yang berkaitan dengan jangkitan SARS-CoV-2 [46]. IL-6 dirembeskan terutamanya oleh monosit/makrofaj khususnya apabila terpolarisasi kepada fenotip seperti M1-. Ia juga ditunjukkan bahawa HMGB1 boleh mempolarisasi makrofaj melalui reseptor seperti Toll (TLR) 4 [47].

Tetranectin (CLEC3B) ialah salah satu daripada protein pengikat HMGB1-dan interaksinya mungkin memodulasi fungsi biologi dan proses keradangan semasa jangkitan. Protein TN yang sangat disucikan menghalang pelepasan HMGB1 yang disebabkan oleh LPS yang bergantung kepada dos dalam makrofaj [48]. Disregulasi sistem imun semula jadi yang membawa kepada pengaktifan berlebihan imun ialah masa depan biasa bagi kes-19 teruk COVID dan sepsis. Telah ditunjukkan baru-baru ini bahawa kepekatan darah vitronektin berkurangan secara mendadak pada pesakit sepsis yang sangat teruk [48]. Baru-baru ini, Yuming Li et al. [49] melaporkan penurunan peraturan vitronektin dalam kes teruk pesakit COVID{10}} menggunakan kaedah proteomik kuantitatif tanpa label. Kami mengesahkan penurunan plasma yang ketara bagi protein ini dalam kajian kami (Rajah 4) dengan kumpulan yang berbeza dan berdasarkan kaedah kuantitatif label. Oleh itu, vitronektin boleh dianggap sebagai penanda potensi disregulasi imun semula jadi yang dikaitkan dengan keterukan simptom{14}} COVID.

Tetranektin terlibat dalam sistem fibrinolisis yang membawa kepada kawalan pembekuan yang tidak normal; maka downregulation TN dikaitkan dengan penyakit kardiovaskular seperti penyakit arteri koronari (CAD) [50]. Perlu diberi perhatian, banyak kes teruk pesakit yang dijangkiti SARS-COV-2 mengalami disfungsi vaskular mungkin disebabkan oleh kekurangan TN. Penurunan paras serum TN disertai dengan pengurangan paraoxonase 1 (PON1) dalam penyakit kardiovaskular yang berbeza. Dalam kajian kami, peraturan turun PON1 (Rajah 4) boleh menjadi penanda perkembangan penyakit kepada gejala yang teruk kerana dilaporkan bahawa kehadiran keradangan dan tekanan oksidatif dikaitkan dengan penurunan PON1 serum dalam penyakit kardiovaskular [51] . Tambahan pula, tahap PON1 yang rendah boleh memburukkan lagi tindak balas proinflamasi semula jadi kepada jangkitan virus kerana ia telah ditunjukkan bahawa PON1 menyekat reaksi berlebihan makrofaj dan mengekalkan keradangan dalam aterosklerosis [52]. Disregulasi TN memberi pengaruh ke atas pengesan hiliran AMPK seperti HIF1 yang mengawal selia fenotip dan fungsi sel imun semula jadi dan memodulasi polarisasi makrofaj ke arah fenotip seperti M{14}} serta kematangan DC [53,54].

Secara kolektif, regulasi rendah vitronektin, fetuin-A dan PON1 yang diperhatikan dalam kes sederhana dan teruk mungkin dikaitkan dengan disregulasi tindak balas imun semula jadi melalui disfungsi monosit/makrofaj, yang membawa kepada pelepasan berlebihan sitokin dan perkembangan COVID{{4} } penyakit kepada status yang teruk.

Di samping itu, analisis proteomik kami mendedahkan pengawalseliaan APOE (bahan tambahan, Rajah S4) dalam kes yang teruk berbanding dengan kawalan yang sihat. Tahap plasma APOE diketahui memodulasi fungsi lipoprotein dan penyakit kardio-metabolik. Tambahan pula, APOE terlibat dalam proses keradangan dengan menukar polarisasi makrofaj dan menjejaskan fenotip pro-/anti-radang [55]. Selaras dengan ini, telah dilaporkan bahawa peningkatan dalam tahap APOE mungkin dikaitkan dengan keterukan COVID-19 [56].

Dalam perjalanan jangkitan, interaksi sistem pelengkap makrofaj adalah penting untuk tindak balas imun semula jadi serta modulasi fungsi pelengkap dan peralihan daripada keadaan imun semula jadi kepada penyesuaian [57]. Melengkapkan interaktiviti komponen dengan reseptor berbeza pada makrofaj memacu proses keradangan dan pengeluaran sitokin. Telah dilaporkan dalam kajian proteomik yang berbeza bahawa disregulasi lata pelengkap [58,59]dalam pesakit COVID-19 dan bahawa pengaktifan sistem pelengkap meningkatkan sitotoksisiti sel T dalam kes yang teruk [60]. Kami melaporkan peningkatan ketara bagi pelengkap 1q, 5, 6, 7 (bahan tambahan, Rajah S5) dalam pesakit COVID-19 sederhana dan teruk. Sepanjang proses pembersihan sel apoptosis, C1q mengawal polarisasi monosit/makrofaj dan menghalang aktiviti inflammasom [61]. Analisis pengayaan menunjukkan hubungan yang signifikan antara komponen pelengkap C1q, C5, C6, C7 dan lata pembekuan, di mana kami mendapati juga penglibatan sistem kallikrein-kinin melalui kininogen-1 yang memodulasi tindak balas imun semula jadi melalui laluan bradikinin.

Kajian ini mempunyai had dari segi saiz sampel. Walau bagaimanapun, keputusan kami telah menunjukkan persetujuan yang baik dengan kajian proteomik covid-19 sebelumnya di mana kami mengenal pasti biomarker yang menunjukkan ungkapan yang serupa. Ini menunjukkan bahawa pendekatan proteomik yang diikuti dalam kajian ini adalah sah, tetapi mungkin tidak optimum.

4. Kesimpulan

Semasa jangkitan SARS-COV-2, gangguan dalam tindak balas imun ialah isu utama yang mendorong peningkatan penyakit-19 COVID kepada kes yang teruk. Laluan mekanistik yang membawa kepada disfungsi imun semula jadi ialah batu kunci dalam menyelesaikan komplikasi yang berkaitan dengan jangkitan SARS-CoV-2 yang tidak terkawal. Sepanjang pengetahuan kami, ini adalah kajian pertama yang menggunakan pendekatan iTRAQ pada sampel plasma/serum COVID{5}}. Tahap serum TN, fetuin-A dan PON1 ialah penanda berpotensi yang terlibat sekurang-kurangnya sebahagiannya dalam sistem imun semula jadi, khususnya dalam pengaktifan hiper makrofaj, dan, akibatnya, boleh dianggap sebagai sasaran berpotensi untuk rawatan COVID-19.

5. Bahan dan kaedah

5.1. Reka bentuk kajian dan populasi

Kohort kajian kami merangkumi 25 subjek: Kawalan sihat (n=5) dan 20 pesakit dijangkiti SARS-COV-2 dikumpulkan mengikut keterukan penyakit (Rajah 1) kepada Ringan (n=5) , Sederhana (n=5), Teruk (n=5), dan Mati (n=5). Kumpulan mati telah dikecualikan daripada permulaan kajian kerana komorbiditi subjek yang boleh menjejaskan kekhususan kesan COVID{10}}. Kesemua pesakit telah diambil di Hospital Kanak-kanak Pakar King Abdallah (KASCH) dan Bandar Perubatan King Abdulaziz (KAMC). Persetujuan termaklum telah ditandatangani oleh semua peserta semasa mereka mengisi soal selidik tentang gejala klinikal dan data demografi.

Pengumpulan darah: 3-5 ml darah vena telah dikumpulkan daripada setiap pesakit. Tiub EDTA digunakan untuk mengumpul sampel darah; kemudian plasma diasingkan dengan sentrifugasi sebelum disimpan pada 80 ◦C untuk analisis selanjutnya.

5.2. Penyediaan sampel plasma proteomik iTRAQ

Lima sampel biologi daripada setiap kumpulan dikumpulkan dalam satu sampel. Semua sampel plasma kemudiannya tertakluk kepada kartrij Agilent Human14 Multiple Affinity Removal Spin untuk mengeluarkan 14 protein yang paling banyak daripada plasma mengikut protokol pembuatan (Agilent, USA). Selepas itu, pencernaan protein dilabelkan menggunakan 4-reagen plex iTRAQ (Sciex, Kanada) mengikut protokol pembuatan dengan pengubahsuaian kecil. Ringkasnya, 100 protein ug telah didenaturasi, dikurangkan dan dialkilasi menggunakan 8 M urea/100 mM Triethylammonium bikarbonat (TEAB), 50 mM Tris (2-carboxyethyl) fosfin (TCEP), dan metil methanethiosulfonate (MMTS) masing-masing. Sampel protein kemudiannya dicernakan kepada peptida menggunakan tripsin dengan nisbah 1:40 (trypsin kepada protein). Selepas itu, sampel peptida dilabelkan dengan 114, 115, 116, dan 117 masing-masing untuk kawalan sihat, teruk, sederhana dan ringan. Kesemua 4 sampel berlabel kemudiannya dicampur dan dikumpulkan dalam satu sampel.

5.3. Pemecahan peptida dan penyahgaraman

Sampel terkumpul iTRAQ telah dipecahkan di luar talian berdasarkan pertukaran kation menggunakan lajur putaran Pierce Strong Cation Exchange (SCX) (Thermo Scientific, USA) mengikut arahan pengilang. Secara ringkasnya, lajur putaran pertama kali dikondisikan menggunakan {{0}}.1 peratus asid formik diikuti dengan memuatkan peptida berlabel ke dalam lajur. Dua langkah mencuci telah dilakukan menggunakan 0.1 peratus asid formik. Peptida kemudiannya dicairkan kepada 22 pecahan dengan menukar nisbah 10 peratus kepekatan format Acetonitril dan Ammonium daripada 15 mM kepada 900 mM. Selepas itu, langkah penyahgaraman dan pembersihan dilakukan oleh sorben fasa terbalik polimer menggunakan Kartrij HLB Oasis (Waters, USA). Ringkasnya, kartrij telah dikondisikan dan diseimbangkan dengan Acetonitrile dan 0.1 peratus asid formik masing-masing. Peptida berlabel kemudiannya dimuatkan dan dua langkah pencucian dengan asid formik 0.1 peratus digunakan. Elusi peptida dilakukan menggunakan 70 peratus asetonitril.

5.4. NanoLC-MS/MS

Setiap pecahan (jumlah 22) telah dimuatkan pada Ekspert nanoLC 425 (Eksigent, Dublin, CA, USA), digandingkan dengan TripleTOF 5600 (Sciex, Concord, Kanada) dalam tiga kali ganda. Pemisahan peptida pada NanoLC dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [41]. MS1 dan MS/MS untuk analisis iTRAQ telah ditetapkan seperti berikut: Julat jisim TOF 250–1500 dengan masa pengumpulan 0.25 s. Kriteria IDA adalah untuk ion yang lebih besar daripada 400 m/z dengan keadaan cas 2–5. Ambang kelimpahan melebihi 200 cps. CE dilaraskan apabila parameter reagen iTRAQ telah diperiksa. Parameter sumber ion telah ditetapkan seperti berikut: gas sumber ion 1 (GS1), 25; Gas Tirai (CUR), 25; IonSpray Voltan Terapung (ISVF), 2250; Suhu Pemanas Antara Muka (HIT), 60.

5.5. analisis proteomik kuantitatif iTRAQ

Data MS iTRAQ mentah telah diproses menggunakan Perisian ProteinPilot (v 4.5, Sciex) untuk pengenalpastian dan kuantifikasi. Parameter telah ditetapkan seperti berikut: jenis sampel, iTRAQ 4plex, Cys, Alkylation, MMTS, Pencernaan, Trypsin, Faktor khas, denaturasi Urea, Spesies, Homo sapiens, Pangkalan Data, pangkalan data UniProt Proteome Humans (dimuat turun pada 29 Oktober 2019); FDR global telah disemak.

Perubahan lipatan dan nilai p dikira berdasarkan purata keamatan peptida dan ujian-t Pelajar masing-masing. Data iTRAQ MS telah disimpan dalam Konsortium ProteomeXchange (//proteomecentral.proteomexchange.org) dengan pengecam PXD037400.

5.6. Analisis bioinformatik

Analisis PCA dilakukan menggunakan fungsi 'prinsipal' dalam perisian statistik R. VolcaNoseR [62] digunakan untuk menjana plot gunung berapi. Alat dalam talian STRING [63] telah digunakan untuk pengayaan gen dan analisis laluan dengan kriteria statistik ditetapkan pada p < 0.05. Pangkalan data Ensiklopedia Gen dan Genom Kyoto (KEGG) telah digunakan untuk analisis laluan.

5.7. Pengukuran ujian imunosorben berkaitan enzim (ELISA).

Sampel disediakan seperti yang diterangkan sebelum ini [64] menggunakan Tumor necrosis factor (TNF- ) dan kit ujian ELISA (SEKH-0047, sains hayat Solarbio). Secara ringkas, 100 ul sampel atau piawaian telah ditambah kepada setiap telaga dan kemudian diinkubasi pada suhu 37 ◦C selama 1 jam 30 minit. Selepas mencuci empat kali dengan penimbal basuh, antibodi pengesanan Biotin-Conjugated (100 ul) telah ditambah sebelum pengeraman selama 1 jam pada suhu 37 ◦C. Langkah pencucian kedua (empat kali) dilakukan dan Streptavidin-HRP (100 ul) ditambah sebelum pengeraman selama 30 minit. Selepas mencuci, larutan Substrat (TMB) (100 ul) telah ditambah dan diinkubasi selama 15 minit dalam gelap sebelum menambah larutan henti, dan pengukuran penyerapan dikesan pada 450 nm.

Pembiayaan

Artikel ini disokong oleh geran daripada Pusat Penyelidikan Antarabangsa King Abdullah no. RC20/153/R dan RC20/205/R dan BioBank KAIMRC NGHA.

Kelulusan etika dan persetujuan untuk mengambil bahagian

Kajian ini telah diluluskan oleh Lembaga Kajian Institusi (LHDN) Jawatankuasa Etika Pusat Penyelidikan Perubatan Antarabangsa Raja Abdullah (KAIMRC) dengan LHDN RC20/153/R dan RC20/205/R. Persetujuan termaklum bertulis diperoleh daripada semua peserta dalam kajian.

Sumbangan penulis

BA: Mengandung dan mereka bentuk eksperimen dan menganalisis dan mentafsir data. FAM, H⋅S, KA, dan HA: Melakukan eksperimen. FA, HSA, dan MR: Menganalisis dan mentafsir data. FA, MJ, AH dan MB: Menyumbang reagen, bahan, alat analisis atau data dan menulis kertas itu. TB: Mengandung dan mereka bentuk eksperimen serta menganalisis dan mentafsir data.

Pernyataan ketersediaan data

Data yang dikaitkan dengan kajian ini telah disimpan di Data iTRAQ MS telah disimpan dalam Konsortium ProteomeXchange dengan pengecam PXD037400.

Penyata Pengisytiharan Kepentingan

Penulis mengisytiharkan bahawa mereka tidak mempunyai kepentingan kewangan yang bersaing atau hubungan peribadi yang mungkin kelihatan mempengaruhi kerja yang dilaporkan dalam kertas kerja ini.

Ucapan terima kasih

Penulis menyampaikan penghargaan mereka kepada nombor Projek Sokongan Penyelidik (RSP-2023/17) di Universiti King Saud, Riyadh, Arab Saudi.

Rujukan

[1] M. Almutlaq, et al., Sistem renin-angiotensin klasik dan kawal selia: peranan penting yang berpotensi dalam patofisiologi COVID-19, CJC Open 3 (8) (2021) 1060–1074.

[2] M. Ciccarelli, et al., Lipidomik tidak disasarkan mendedahkan profil lipid khusus dalam pesakit COVID-19 dengan tahap keparahan yang berbeza dari wilayah Campania (Itali), J. Pharm. Berbiomed. dubur. 217 (2022), 114827.

[3] Q. Zhang, et al., Penentu genetik dan imunologi manusia bagi radang paru-paru COVID{1}} kritikal, Nature 603 (7902) (2022) 587–598.

[4] TF Aiello, et al., Jangkitan dengan varian Omicron bagi SARS-CoV-2 dikaitkan dengan penyakit yang kurang teruk dalam pesakit dimasukkan ke hospital dengan COVID-19, J. Infect. 85 (5) (2022) e152–e154.

[5] CJH von Wintersdorff, et al., Jangkitan dengan SARS-CoV-2 varian Delta mempamerkan empat kali ganda peningkatan viral load di saluran pernafasan atas berbanding Alpha atau bukan varian yang membimbangkan, Sci. Rep. 12 (1) (2022), 13922.

[6] JL Schultze, AC Aschenbrenner, COVID-19 dan sistem imun semula jadi manusia, Sel 184 (7) (2021) 1671–1692.

[7] AD Lopez-Munoz, et al., Permukaan sel SARS-CoV-2 protein nukleokapsid memodulasi imuniti semula jadi dan adaptif, Sci. Adv. 8 (31) (2022) eabp9770.

[8] MS Cardoso, et al., Interaksi fizikal dengan bakteria dan parasit Protozoa mewujudkan reseptor pemulung SSC4D sebagai reseptor pengecaman corak spektrum luas, Front. Immunol. 12 (2021), 760770.

[9] X. Wei, et al., Kekurangan EDIL3 memperbaiki pengubahsuaian jantung yang buruk oleh perangkap ekstraselular neutrofil (NET)-pengantara polarisasi makrofaj, Cardiovasc. Res. 118 (9) (2022) 2179–2195.

[10] X. Cao, et al., Spike Protein of SARS-CoV-2 Mengaktifkan Makrofaj dan Menyumbang kepada Induksi Keradangan Paru-paru Akut dalam Tikus, 2020 bioRxiv.

[11] TE Angel, et al., Proteomik berasaskan spektrometri jisim: keupayaan sedia ada dan arah masa hadapan, Chem. Soc. Wahyu 41 (10) (2012) 3912–3928.

[12] T. Wang, et al., Pencirian proteomik dan metabolomik SARS-CoV-2-kera cynomolgus yang dijangkiti pada peringkat awal, Front. Immunol. 13 (2022), 954121.

[13] X. Nie, et al., Landskap proteomik berbilang organ bagi autopsi COVID-19, Sel 184 (3) (2021) 775–791 e14.

[14] DE Gordon, et al., Peta interaksi protein SARS-CoV-2 mendedahkan sasaran untuk guna semula dadah, Nature 583 (7816) (2020) 459–468.

[15] julian.knight@well.ox.ac.uk, Konsortium CO-M.-oBACEa dan CO-M.-oBA, Atlas darah COVID-19 mentakrifkan ciri keterukan dan kekhususan penyakit, Sel 185 (5) (2022) 916–938 e58.

[16] Y. Mohammed, et al., Analisis proteomik plasma membujur mendedahkan biomarker calon novel dalam COVID akut-19, J. Proteome Res. 21 (4) (2022) 975–992.

[17] TM Casey, et al., Analisis kebolehulangan liputan proteom dan kuantiti menggunakan tag jisim isobarik (iTRAQ dan TMT), J. Proteome Res. 16 (2) (2017) 384–392.

[18] T. Shu, et al., Proteomik plasma mengenal pasti biomarker dan patogenesis COVID-19, Kekebalan 53 (5) (2020) 1108–1122 e5.

[19] GY Chen, G. Nunez, Keradangan steril: penderiaan dan tindak balas terhadap kerosakan, Nat. Rev. Immunol. 10 (12) (2010) 826–837.

[20] CT Esmon, J. Xu, F. Lupu, Imuniti dan pembekuan semula jadi, J. Thromb. Hemostasis 9 (Bekalan 1) (2011) 182–188.

[21] J. Park, et al., Analisis profil proteom darah yang mendalam mendedahkan ciri fungsi protein plasma yang berbeza antara pesakit COVID-19 yang teruk dan tidak teruk, Sci. Rep. 10 (1) (2020), 22418.

[22] CB Messner, et al., Proteomik klinikal Ultra-high-throughput mendedahkan pengelas jangkitan COVID-19, Cell Syst 11 (1) (2020) 11–24 e4.

[23] C. Huang, et al., Ciri klinikal pesakit yang dijangkiti coronavirus novel 2019 di Wuhan, China, Lancet 395 (10223) (2020) 497–506.

[24] DM Del Valle, et al., Tanda tangan sitokin radang meramalkan{1}} tahap keterukan dan kemandirian COVID, Nat. Med. 26 (10) (2020) 1636–1643.

[25] FX Danlos, et al., Tahap TNF-alpha yang tinggi pada pesakit dengan COVID-19 refraktori kepada tocilizumab, Eur. J. Kanser 149 (2021) 102–104.

[26] H. Li, et al., Pencirian proteomik plasma dan metabolomik bagi COVID-19 yang terselamat 6 bulan selepas discaj, Cell Death Dis. 13 (3) (2022) 235.

[27] B. Shen, et al., Pencirian proteomik dan metabolomik sera pesakit COVID-19, Sel 182 (1) (2020) 59–72 e15.

[28] J. Sarif, et al., Kecerunan plasma reseptor pengaktif plasminogen jenis Urokinase larut dikaitkan dengan proteom plasma patogen dan transkriptom imun dan menstratkan hasil dalam COVID yang teruk-19, Depan. Immunol. 12 (2021), 738093.

[29] M. Villar, et al., Pencirian oleh proteomik serum kuantitatif biomarker prognostik berkaitan imun untuk simptomologi COVID-19, Depan. Immunol. 12 (2021), 730710.

[30] H. Wang, AE Sama, Peranan anti-radang fetuin-A dalam kecederaan dan jangkitan, Curr. Mol. Med. 12 (5) (2012) 625–633.

[31] W. Li, et al., Protein hepatik, fetuin-A, menduduki peranan perlindungan dalam keradangan sistemik maut, PLoS One 6 (2) (2011), e16945.

[32] M. Zhang, H. Wang, KJ Tracey, Peraturan pengaktifan dan keradangan makrofaj oleh spermine: bab baru dalam cerita lama, Crit. Care Med. 28 (4 Suppl) (2000) N60–N66.

[33] H. Wang, et al., Fetuin melindungi janin daripada TNF, Lancet 350 (9081) (1997) 861–862.

[34] M. Ketteler, et al., Persatuan kepekatan fetuin-A (AHSG) rendah dalam serum dengan kematian kardiovaskular pada pesakit dialisis: kajian keratan rentas, Lancet 361 (9360) (2003) 827-833.

[35] K. Caglar, et al., Serum fetuin-a kepekatan dan disfungsi endothelial dalam penyakit buah pinggang kronik, Nephron Clin. Berlatih. 108 (3) (2008) c233–c240.

[36] NF El-Malkey, et al., Fetuin-A memberikan kesan perlindungan terhadap iskemia/reperfusi usus akibat eksperimen dengan menekan kematian sel autofagik, Exp. biol. Med. (Maywood) 246 (11) (2021) 1307–1317.

[37] IK Poon, et al., Pembersihan sel apoptosis: biologi asas dan potensi terapeutik, Nat. Rev. Immunol. 14 (3) (2014) 166–180.

[38] HP Jersmann, I. Dransfield, SP Hart, Fetuin/alpha2-Glikoprotein HS meningkatkan fagositosis sel apoptosis dan makropinositosis oleh makrofaj manusia, Clin. Sci. (Lond.) 105 (3) (2003) 273–278.

[39] JL Reynolds, et al., Peranan pelbagai fungsi untuk serum protein fetuin-a dalam perencatan kalsifikasi sel otot licin vaskular manusia, J. Am. Soc. Nephrol. 16 (10) (2005) 2920–2930.

[40] S. Rudloff, et al., Fetuin-A ialah sasaran HIF yang melindungi integriti tisu semasa tekanan hipoksik, Nat. Commun. 12 (1) (2021) 549.

[41] T. Barhoumi, et al., SARS-CoV-2 coronavirus melonjakkan tindak balas apoptosis akibat protein, keradangan dan tekanan oksidatif dalam THP-1-makrofaj serupa: peranan berpotensi enzim penukar angiotensin perencat (perindopril), Depan. Immunol. 12 (2021), 728896.

[42] C. de Roquetaillade, et al., Masa dan punca kematian dalam pesakit COVID-19 yang teruk, Crit. Penjagaan 25 (1) (2021) 224.

[43] CS Zhu, et al., Peraturan endogen dan modulasi farmakologi pelepasan dan tindakan HMGB1 yang disebabkan oleh sepsis: Kajian yang dikemas kini, Sel 10 (9) (2021).

[44] H. Yang, H. Wang, U. Andersson, Menyasarkan keradangan didorong oleh HMGB1, Front. Immunol. 11 (2020) 484.

[45] N. Kamiya, HK Kim, Peningkatan sitokin proinflamasi HMGB1 dalam cecair sinovial pesakit dengan penyakit Legg-calve-perthes dan korelasi dengan IL-6, JBMR Plus 5 (2) (2021), e10429.

For more information:1950477648nn@gmail.com