Penanda Kualiti Herba Cistanches Berdasarkan Hubungan Kesan Spektrum Antioksidan

Abstrak

Objektif: Untuk mewujudkan kaedah penyelidikan untuk penanda kualiti (Q-marker) bagiCistanches Herba(CH) berdasarkanhubungan spektrum-kesan antioksidan, menyediakan asas untuk kajian bahan farmakologi dan kawalan kualitinya. Kaedah: Kromatografi cecair berprestasi ultra tinggi (UPLC) digunakan untuk mewujudkan profil cap jari untuk 10 kelompok CH. Model kerosakan oksidatif sel telah ditubuhkan menggunakan H2O2, dan kapasiti antioksidan CH ditentukan berdasarkan kepekatan perencatan separuh maksimum spesies oksigen reaktif, serta tahap superoksidadismutase dan katalase sebagai penunjuk farmakologi. Hubungan spektrum-kesan telah dibina melalui analisis komponen utama, analisis korelasi Pearson, dan analisis regresi kuasa dua terkecil separa. Komponen aktif tertakluk kepada pengesahan farmakologi. Keputusan: Profil cap jari untuk CH telah diwujudkan menggunakan UPLC, mengenal pasti 17 puncak biasa. Berdasarkan analisis korelasi kesan spektrum, sembilan komponen telah dipilih. Keputusan pengesahan farmakologi menunjukkan bahawa asid geniposidik, 8-asid epilognik,echinacoside, acteoside,isoacteoside, dantubuloside Amempamerkan aktiviti antioksidan dalam cara yang bergantung kepada kepekatan. Kesimpulan: Kajian ini meneroka penanda Q untuk CH berdasarkan hubungan kesan spektrum, menyediakan maklumat rujukan untuk asas bahan farmakologi dan peningkatan standard kualitinya.

Kata kunci:Cistanches Herba; Penanda Q;hubungan spektrum-kesan; antioksidan

EKSTRAK CISTANCHE ORGANIK DENGAN 30% ECHINACOSIDE DAN 12% ACTEOSIDE UNTUK FUNGSI BUAH PINGGANG

Cistancheialah batang berdaging kering dengan daun bersisik Cistanche deserticola YCMa atau Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, tumbuhan yang tergolong dalam genus Cistanche daripada keluarga Orobanchiaceae. Ia pertama kali direkodkan dalam "Materia Medica Shen Nong" dan disenaraikan sebagai gred teratas [1]. Ia bersifat hangat, rasa manis dan masin; ia kembali ke buah pinggang dan meridian usus besar; ia mempunyai kesan yang menyuburkan buah pinggang, menambah pati dan darah, melembapkan usus dan julap, dan merupakan ubat penting untuk menguatkan buah pinggang dan menambah pati [2-3]. Buah pinggang menyimpan intipati, dan intipati dan darah berasal dari sumber yang sama. Jika intipati dan darah kekurangan, ia akan menjejaskan keseluruhan aktiviti kehidupan badan manusia; sumsum penghasil pati disimpan di dalam tulang, dan otak adalah laut sumsum. Jika pati buah pinggang tidak mencukupi, tulang akan kehilangan zat makanan dan otak akan kekurangan, mengakibatkan tulang Perubahan degeneratif seperti tekstur longgar, kehilangan gigi, kehilangan ingatan, demensia dan penurunan fungsi imun [4-6]. Cistanche deserticola mengandungi phenylethanol glycosides, iridoid, lignan dan komponen struktur lain, termasuk echinaceaside, verbascoside, isorbascoside, asid genipinic dan 8-asid epistryanic. , tubulin A, dsb. [7]. Kawalan kualiti semasa Cistanche deserticola dalam "Pharmacopoeia of the People's Republic of China" edisi 2020 hanya menetapkan kandungan echinaceaside dan verbascoside, yang tidak dapat mencerminkan sepenuhnya ciri tindakan berbilang komponen dan berbilang sasaran perubatan tradisional Cina. , yang tidak kondusif untuk kawalan kualiti dan penilaiannya.

Untuk meningkatkan tahap kawalan kualiti perubatan tradisional Cina dan mengoptimumkan penilaian kualiti perubatan tradisional Cina, Ahli Akademik Liu Changxiao mencadangkan konsep baru penanda kualiti (Q-marker) perubatan tradisional Cina [8]. Antaranya, "keberkesanan" adalah elemen teras dalam "Lima Prinsip" penanda Q [9] dan juga merupakan teras penilaian kualiti ubat-ubatan tradisional Cina.

Memandangkan status penyelidikan semasa korelasi yang lemah antara piawaian kualiti dan keberkesanan ubat, meneroka penanda-Q ubat-ubatan tradisional Cina dan mewujudkan piawaian kualiti yang lebih saintifik dan munasabah adalah sangat penting untuk meningkatkan kualiti ubat-ubatan tradisional Cina. Hubungan spektrum-kesan adalah untuk menghubungkan puncak kromatografi cap jari perubatan Cina tradisional dengan data farmakodinamik khusus untuk mencari bahan berkesan ubat tradisional Cina, dengan itu mencerminkan kualiti sedia ada ubat tradisional Cina [10]. Penubuhan model matematik kecekapan spektrum boleh menjelaskan QMarker perubatan tradisional Cina dari perspektif "pandangan holistik", memberikan lebih banyak rujukan untuk kawalan kualiti perubatan tradisional Cina kemudian, penggubalan piawaian kualiti dan pemeriksaan bahan aktif. Kajian ini menggunakan cap jari yang digabungkan dengan kadar separuh perencatan spesies oksigen reaktif (ROS IC50), kandungan superoxide dismutase (SOD) dan katalase (CAT) untuk mengkaji hubungan kesan spektrum perubatan tradisional Cina, dan menggunakan analisis komponen utama. (PCA) ), analisis korelasi Pearson (PCC) dan analisis regresi kuasa dua terkecil separa (PLS) untuk menganalisis secara komprehensif penanda-Q Cistanche deserticola untuk menyediakan asas bagi kawalan kualitinya.

1 bahan

1.1 Sampel

Cistanche deserticolatelah dituai dari Daerah Yutian, Xinjiang dan tapak penanaman Amalan Pertanian Baik (GAP) Cistanche deserticola di Mongolia Dalam. Ia telah dikenal pasti oleh penyelidik Zhang Tiejun dari Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. sebagai Cistanche tubulosa (Schenk) Wight dan Cistanche deserticola.

YC Ma, maklumat terperinci ditunjukkan dalam Jadual 1.

1.2 Uji ubat

Echinaceaside (nombor kelompok: 111670-201907, ketulenan: 91.8%) dan verbascoside (nombor kelompok: 111530-201914, ketulenan: 95.2%) kedua-duanya dibeli daripada China Institute of Food and Drug Control; isorescoside (nombor kelompok: 61303-13 -7), salidroside (nombor kelompok: 10338-51-9), 8-asid epistrychnoic (nombor kelompok: 82509-41-9), asid genipinic (nombor kelompok: Z24A10X95926) , tuberosin B (Nombor kelompok: 112516-04-08), 2-acetyl eugenol glycoside (Nombor kelompok: 94492-24-7) telah dibeli daripada Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., ketulenan Lebih besar daripada atau sama dengan 98%; Cistanche glycoside A (Nombor kelompok: MESTI -20062806, ketulenan: 98.51%) dan vasculin A (nombor kelompok: MUST19110102, ketulenan: 98.57%) telah dibeli daripada Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd.; asetonitril tulen dan asid formik secara kromatografi telah dibeli daripada Syarikat Tianjin Concord Technology Co., Ltd.; Air Tulen (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). Vitamin E (VE, V8010, Syarikat Beijing Solarbio);

Dimetil sulfoksida (DMSO, D2660-100ML, Syarikat Sigma, Amerika Syarikat); CellTiter 96® Kit pengesanan sel penyelesaian tunggal AQueous (G3580, Syarikat Promega, Amerika Syarikat); Kit pengesanan CAT (S0051), kit pengesanan aktiviti SOD S0101M ) dan kit pengesanan ROS (S0033S) telah dibeli daripada Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 Instrumen

Kromatografi cecair ultra-tinggi kelas H-PDA Waters (Waters Company, USA); Baki elektronik Sartorius BT25S (Syarikat Sartorius, Jerman); Empar desktop berkelajuan tinggi H1650 (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpectraMax M5

Pembaca plat mikro (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); WYS-41Mikroskop biologi XDY (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1.4 sel

Sel buah pinggang embrio manusia HEK 293 sel telah digunakan dalam eksperimen ini dan dibeli daripada bank sel Akademi Sains China.

2 kaedah

2.1 Penubuhan peta cap jari

2.1.1 Penyediaan penyelesaian ujian: Timbang 2 g bahan ubat Cistanche deserticola, tambah 10 kali ganda jumlah air, haba dan refluks 3 kali, 1 jam setiap kali, sentrifuge pada 1.0 ×105r·min-1 selama 15 min (jejari emparan ialah 300 mm), Satukan supernatan dan pekat untuk membuat larutan stok dengan kepekatan jisim 100 mg·mL-1, cairkannya 10 kali, dan menapisnya melalui membran penapis mikroporous 0.22 µm untuk mendapatkannya.

2.1.2 Penyediaan larutan rujukan campuran

Ambil 8-asid epistrychnic, salidroside, echinaceaside, cistanche glycoside A, asid genipinic, verbascoside, anthocyanoside A, isorbascoside dan 2'-acetyl eugenol. Bahan rujukan Glikosida dan angiosida B diukur dalam jumlah yang sesuai dan ditimbang dengan tepat. Tambah larutan metanol 50% untuk melarutkan dan sediakan larutan bahan rujukan campuran dengan kepekatan jisim 20 µg·mL–1.

2.1.3 Keadaan kromatografi

ACQUITY UPLC®BEH C18 lajur (100 mm × 2.1 mm, 1.7 µm); fasa mudah alih ialah asetonitril (A) ~ 0.1% larutan asid format (B), program elusi kecerunan (0 ~ 6 min, 5% ~ 8% A ; 6~10 min, 8%~15%A ; 10~13 min, 15%~19%A, 13~20 min, 19%~25%A); panjang gelombang pengesanan ialah 237 nm; kadar aliran ialah 0.4 mL·min –1; suhu lajur ialah 40 darjah; isipadu suntikan ialah 3 µL.

2.1.4 Pemilihan puncak rujukan

Dalam kromatogram kromatografi cecair ultra-prestasi (UPLC) Cistanche deserticola, puncak dengan nisbah kawasan puncak terbesar, masa pengekalan sederhana dan pengasingan yang baik telah dipilih sebagai puncak rujukan spektrum cap jari.

2.1.5 Kajian semula metodologi

Ujian ketepatan: Ambil sampel T1 dan sediakan penyelesaian ujian mengikut kaedah di bawah 2.1.1. Suntikan sampel 6 kali secara berterusan dan rekod cap jari. Keputusan menunjukkan bahawa kawasan puncak relatif RSD bagi setiap puncak ialah 0.10%~4.61%, dan masa pengekalan relatif RSD Ia adalah 0.08%~1.32%, menunjukkan bahawa instrumen mempunyai baik ketepatan.

Ujian kebolehulangan: Ambil sampel T1 dan sediakan 6 sampel larutan ujian secara selari mengikut kaedah di bawah 2.1.1, dan suntikan sampel secara berterusan. Keputusan menunjukkan bahawa RSD kawasan puncak relatif bagi setiap puncak kromatografi ialah 1.35%~4.80%, dan masa pengekalan relatif RSD ialah 0.10%~1.80%, yang memenuhi keperluan cap jari dan menunjukkan bahawa kebolehulangan instrumen adalah baik.

Ujian kestabilan: Ambil sampel T1 dan sediakan penyelesaian ujian mengikut kaedah di bawah 2.1.1, suntik sampel untuk ujian pada 0, 2, 4, 8 dan 12 jam, dan rekod cap jari. RSD yang dikira bagi kawasan puncak relatif bagi setiap puncak kromatografi ialah 0.53%~4.82% dan RSD bagi masa pengekalan relatif ialah 0.09%~2.17%, yang memenuhi keperluan cap jari dan menunjukkan bahawa produk ujian adalah stabil dalam masa 12 jam.

2.2 Penyelidikan tentang kesan antioksidan Cistanche deserticola

2.2.1 Penyediaan minuman keras ibu Cistanche deserticola

Ambil minuman keras ibu di bawah perkara 2.1.1, tapis dan sterilkannya, dan cairkan dengan medium kultur kepada kepekatan yang diperlukan sebelum digunakan.

2.2.2 Cistanche deserticola dan kawalan positif

Kesan VE pada daya maju sel HEK 293 ditetapkan sebagai kumpulan biasa (penggantungan sel), kumpulan pentadbiran Cistanche deserticola (25, 50, 100, 200, 400 µg·mL–1), kumpulan VE (20, 40, 60 , 80, 100 µmol·L–1), tetapkan 6 telaga pendua untuk setiap kepekatan, kultur selama 24 jam, tambah 20 µL reagen larutan tunggal CellTiter 96® Aqueous pada setiap telaga untuk mengesan daya maju sel, teruskan kultur selama 2 jam, dan gunakan pembaca plat mikro untuk mengesan daya maju sel pada 490 nm Nilai penyerapan (OD) setiap telaga digunakan untuk mengira kadar kemandirian sel mengikut formula (1). Kadar kemandirian (%)=(kumpulan eksperimen OD/kumpulan kosong OD) × 100% (1)

2.2.3 Cistanche deserticola pada aruhan H2O2

Kesan ROS pada sel HEK 293. Sel-sel dibahagikan kepada kumpulan normal (penggantungan sel) dan kumpulan pentadbiran Cistanche deserticola (6.25, 12.5, 25, 50, 100 µg·mL–1 Cistanche deserticola dan 60 µm·L–1 H2O2), dan dikultur 24h. Ikuti langkah-langkah kit pengesanan ROS untuk operasi seterusnya, amati terus pewarnaan sel melalui mikroskop, dan gunakan pembaca plat mikro untuk mengesan keamatan pendarfluor setiap kumpulan. Tetapan parameter menggunakan panjang gelombang pengujaan 488 nm dan panjang gelombang pelepasan 525 nm. Eksperimen diulang tiga kali.

2.2.4 Sepasang cistanche deserticola

Kesan H2O2 pada SOD dalam sel HEK 293. Sel-sel dibahagikan kepada kumpulan normal (penggantungan sel), kumpulan model (60 µm·L–1 H2O2), kumpulan VE (60 µm·L–1 VE dan 60 µm·L–1 H2O2), kumpulan pentadbiran Cistanche deserticola (100 µg·mL–1 Cistanche deserticola dan 60 µm·L–1 H2O2), kumpulkan sel selepas 24 jam kultur, tambah larutan penyediaan sampel SOD untuk melisiskan sel dan sentrifuge pada 4 darjah dan 12000 r·min{{22} } min (jejari sentrifugasi ialah 300 mm), ambil supernatan sebagai sampel untuk diuji, dan ikuti langkah-langkah kit pengesanan SOD untuk operasi seterusnya. Eksperimen diulang tiga kali.

2.2.5 Cistanche deserticola pada aruhan H2O2

Kesan CAT pada sel HEK 293 telah dirawat mengikut kaedah dalam 2.2.4 dan dikumpulkan ke dalam kumpulan. Selepas rawatan, tambah larutan lisis, sentrifuge pada 4 darjah dan 12000 r·min-1 selama 10 minit (jejari emparan ialah 300 mm), ambil supernatan dan ikuti Ikut langkah kit pengesanan CAT untuk operasi seterusnya . Eksperimen diulang tiga kali.

2.2.6 Analisis statistik

Perisian SPSS 26.0 telah digunakan untuk analisis statistik. Setiap kumpulan data diwakili oleh (±±(). Analisis varians sehala dilakukan ke atas data yang menepati taburan normal. Jika varians adalah sama, kaedah Perbezaan Kurang Ketara digunakan. Jika varians adalah tidak sekata, kaedah T3 Dunnett digunakan untuk GraphPad Prism 8 digunakan untuk membuat grafik, dan P<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Analisis korelasi kesan spektrum bagi antioksidan Cistanche deserticola

2.3.1 PCA Kawasan puncak puncak biasa 10 kelompok Cistanche deserticola yang mempunyai cap jari telah dinormalkan oleh nilai Z dan dijadikan matriks data pesanan 10×17, yang diimport ke dalam perisian SPSS 26.0 untuk PCA.

2.3.2 PCC

SPSS 26.0 telah digunakan untuk menjalankan analisis bivariat untuk mengkaji hubungan kecekapan spektrum antara cap jari Cistanche deserticola dan antioksidan. Ujian kepentingan dilakukan menggunakan ujian dua sisi (T), dengan P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS

Import hasil percubaan kawasan puncak piawai dan antioksidan Cistanche deserticola ke dalam perisian SIMCA-P 14.1, tetapkan kawasan puncak sebagai pembolehubah X dan tetapkan indeks farmakodinamik sebagai pembolehubah Y untuk melaksanakan PLS.

2.4 Pengesahan aktiviti antioksidan penanda-Q Cistanche deserticola

2.4.1 Penyediaan larutan ibu bahan aktif. Timbang dengan tepat jumlah asid genipinik, 8-asid epistriknik, echinaceaside, verbascoside, isorebascoside dan anthocyanoside A dan tambah DMSO untuk melarutkannya ke dalam larutan rujukan 10 mmol·L-1.

2.4.2 Kesan bahan aktif terhadap sitotoksisiti HEK 293.

Selepas mengeram sel HEK 293 selama 24 jam, tambahkan kepekatan larutan bahan aktif yang berbeza di bawah 2.4.1 pada setiap telaga (0.781, 1.563, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 µmol·L–1 ) 100 µL, rangsangan berterusan

Selepas sel diinkubasi selama 24 jam, reagen larutan tunggal CellTiter 96® AQueous telah ditambah untuk mengesan daya maju sel.

2.4.3 Kesan kerosakan anti-oksidatif bahan aktif pada H2O2-sel HEK 293 yang disebabkan.

Sel-sel dikumpulkan seperti berikut: kumpulan normal, kumpulan model, dan kumpulan VE dikumpulkan mengikut 2.2.4. Kumpulan eksperimen (0.781, 1.563, 3.125 µm·L–1 komposisi aktiviti dan 60 µm·L–1 H2O2), dikultur selama 24 jam. Tentukan tahap ROS intraselular, kandungan enzim SOD dan CAT mengikut kaedah di bawah 2.2.3, 2.2.4 dan 2.2.5 masing-masing.

Perkhidmatan Sokongan Wecistanche

E-mel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Beli Untuk Butiran Spesifikasi Lebih Lanjut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop