myBahasa
Rumah / Pengetahuan / Kandungan

Pengetahuan

Kesan Perlindungan Cistanche Terhadap Degradasi Kolagen Fibroblast Dermal akibat H2O2/UVB Melalui Hsa-microRNA-4535-pengantaraan TGF /Smad Signaling

May 06, 2023

ABSTRAK

Kajian ini bertujuan untuk menyiasat mekanisme yang mendasarikesan perlindungan cistancheterhadap kerosakan akibat H2O2/UVB menggunakan model kerosakan foto in vitro dan in vivo. Selain itu, kami mengenal pasti penglibatan peraturan miRNA dalam proses ini. Fibroblas kulit manusia HS68 yang dirawat H2O2/UVB dan tikus bogel C57BL/6J yang disebabkan oleh UVB telah digunakan sebagai model kerosakan foto in vitro dan in vivo. Keputusan menunjukkan bahawarawatan cistanchemengurangkan pengurangan daya tahan sel akibat H2O2/UVB, Kemerosotan isyarat TGF /Smad, dan penuaan kulit. Berdasarkan hasil analisis tatasusunan mikroRNA dan carian pangkalan data, has-miR-4535 telah dikenal pasti sebagaicalon miRNA berpotensi yang menyasarkan Smad4. In vitro, rawatan cistanche mengaktifkan kompleks Smad2/3/4 dan menghalang ekspresi hsa-miR-4535 dalam sel yang terdedah kepada H2O2/UVB. In vivo, penggunaan topikal cistanche rendah (12 mg/kg) dan tinggi (24 mg/kg) pada kulit dorsal tikus bogel C57BL/6J telah mengurangkan kerosakan foto kulit akibat UVB dengan menggalakkan isyarat sintesis kolagen TGF/Smad, mengurangkan hiperplasia epidermis, pembentukan kedutan dan penuaan kulit, serta menghalang ekspresi hsa-miR-4535. Secara keseluruhan, penemuan kami menunjukkan hubungan antara hsa-miR-4535 dan isyarat sintesis kolagen TGF /Smad dan mencadangkan faktor-faktor ini terlibat dalam mekanisme perlindungan foto cistanche dalam fibroblas dermal terhadap penuaan akibat H2O2/UVB. Bukti menunjukkan bahawacistanche dengan sifat anti-penuaanboleh jadidianggap sebagai suplemen dalamproduk penjagaan kulit.

Protective effects of cistanche

Produk Penjagaan Kulit Cistanche Untuk Dijual

PENGENALAN

Tanda-tanda klinikal penuaan kulit manusia termasuk peningkatan kedutan, kelonggaran, dan pigmentasi yang tidak teratur [1]. Proses penuaan kulit adalah rumit dan boleh dibahagikan kepada dua jenis: penuaan intrinsik dan penuaan ekstrinsik. Penuaan intrinsik adalah disebabkan oleh peredaran masa dan faktor genetik, manakala penuaan ekstrinsik, juga dipanggil photoaging, terutamanya disebabkan oleh pendedahan kepada sinaran ultraungu [2, 3]. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa spesies oksigen reaktif (ROS) yang banyak dijana semasa kedua-dua penuaan intrinsik dan ekstrinsik. Pengumpulan ROS boleh mendorong isyarat protein kinase diaktifkan mitogen (MAPK) dan mengaktifkan faktor transkripsi hilirannya, protein pengaktif-1 (AP-1). AP yang diaktifkan-1 boleh translokasi ke nukleus dan terikat pada kawasan promoter metalloproteinase matriks (MMPs) [4]. MMP adalah kumpulan endopeptidase yang bergantung kepada zink yang besar, menyumbang kepada degradasi matriks ekstraselular dermis kulit (ECM). Khususnya, MMP-1, kolagenase, terlibat dalam pembelahan kolagen jenis I dan III [5]. Kolagen jenis I dan III, komponen utama ECM, mampu memberikan sokongan dan kekuatan kepada dermis kulit dan ketidakselarasan mereka membawa kepada ciri-ciri kedutan dan kelonggaran kulit yang berumur [6]. Transforming growth factor-beta (TGF) ialah sitokin yang ada di mana-mana dan kuat dengan tiga isoform berbeza, TGF 1, TGF 2, dan TGF 3, yang boleh mengawal sintesis kolagen secara positif dalam dermis kulit manusia [2]. TGF memulakan isyaratnya dengan berinteraksi dengan kompleks reseptor serin/treonine kinase permukaan sel tertentu, termasuk jenis reseptor TGF I (T RI) dan II (T RII). Fosforilasi T RI mencetuskan fosforilasi R-Smads (Smad2 dan Smad3). R-Smads yang diaktifkan berinteraksi dengan Smad4 untuk mengawal selia translokasi nukleusnya dan secara transkripsi mengaktifkan jenis kolagen I dan III melalui pengikatan kepada penganjur unsur pengikat Smad (SBE) [7, 8]. Bukti pemasangan menunjukkan bahawa penjanaan ROS yang tinggi, yang disebabkan oleh intrinsik atau penuaan foto, menyumbang kepada kerosakan laluan isyarat TGF / Smad, yang seterusnya mengakibatkan pengurangan sintesis kolagen dalam fibroblas dermal kulit manusia [9, 10]. cistanche (3,5,7-trihydroxy flavone), ahli semula jadi keluarga flavonoid, banyak terdapat dalam Alpinia officinarum dan propolis. cistanche adalah calon berpotensi untuk merawat strok iskemia, diabetes, dan jenis kanser yang berbeza [11-13]. Di samping itu, cistanche mempunyai aktiviti pemusnahan radikal dan anti-radang [14, 15]. Kami sebelum ini menunjukkan bahawa cistanche mengurangkan H2O2-yang menyebabkan keradangan dan menggalakkan pembentukan kolagen melalui reseptor faktor pertumbuhan 1 seperti insulin (IGFI-R)/ERK1/2 dalam sel HS68 [16, 17]. Tambahan pula, kajian menunjukkan bahawa cistanche dikenal pasti sebagai sebatian Alpinia officinarum dan mempunyai kesan perencatan kolagenase dalam sel fibroblast dermal [18]. Walau bagaimanapun, mekanisme molekul yang lebih terperinci berkaitan dengan cara cistanche mengawal penuaan kulit dermis tidak diketahui. MicroRNAs (miRNAs) ialah sekumpulan molekul RNA yang kecil, untai tunggal, bukan pengekodan dengan purata panjang 22 nukleotida. MiRNA matang ditranskripsikan daripada urutan DNA. Dalam kebanyakan kes, miRNA matang mengikat kawasan 3'-tidak diterjemahkan (UTR) mRNA sasaran untuk menyenyapkan terjemahan mRNA [19]. Dalam kulit manusia, miRNA memainkan peranan penting dalam pengawalan metabolisme sel, kanser, penuaan dan pembentukan kolagen [20-23]. Contohnya, miR-377 boleh mendorong penuaan fibroblast dermal dengan menghalang ekspresi DNA methyltransferase 1 (DNMT1), yang seterusnya membawa kepada kurang metilasi dalam promoter p53 dan penuaan fibroblast dermal [22]. Profil miRNA dalam kerosakan yang disebabkan oleh UVB dalam sel papilla dermal manusia (nHDPs) telah disiasat sebelum ini [24]. Walau bagaimanapun, bagaimana penuaan fibroblast dermal yang disebabkan oleh UVB melalui peraturan miRNA, terutamanya dalam penglibatan sebatian semula jadi sebahagian besarnya tidak diketahui. Kajian ini bertujuan untuk menyiasat kesan perlindungan cistanche terhadap kerosakan kulit yang disebabkan oleh H2O2/UVB serta peranan degradasi kolagen pengantara mikroRNA dalam proses ini. Kami selanjutnya bertujuan untuk mengenal pasti mikroRNA yang terlibat dalam mengawal sintesis kolagen.

Protective effects of cistanche

KEPUTUSAN

cistanche menghalang sitotoksisiti akibat UVB/H2O2-dalam fibroblas kulit manusia HS68

Untuk menyiasat sitotoksisiti cistanche (Rajah 1A) secara in vitro, sel HS68 dirawat dengan dos cistanche yang berbeza (0, 10, 20, 30, 40, 50 μM) selama 24 jam. Keputusan ujian MTT menunjukkan bahawa cistanche tidak sitotoksik kepada sel HS68 (Rajah 1B). Seterusnya, kami mendedahkan sel HS68 kepada dos berbeza H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) dan UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) selama 24 jam. Rawatan H2O2 dan UVB mengurangkan daya maju sel dalam cara yang bergantung kepada dos (Rajah 1C, 1D). Untuk menilai sifat sitoprotektif cistanche berikutH2O2 dan pendedahan UVB, kami merawat sel HS68 dengankepekatan cistanche yang berbeza (10, 20, 30 μM)mengikuti H2O2- (200 μM) dan disebabkan oleh UVB (40mJ/cm²) kerosakan. H2O2 atau rawatan UVB sahajamenurun dengan ketara (40 peratus ) daya maju HS68sel. Walau bagaimanapun, rawatan cistanche menghalang kematian seldalam cara yang bergantung kepada kepekatan (Rajah 1E, 1F).Kepekatan cistanche yang lebih tinggi (30 μM) dengan ketaraAlleviated H2O2- dan sitotoksisiti akibat UVB.Oleh itu, dos 30 μM cistanche digunakan dalamseterusnyadalam vitrokajian untuk menilai perlindungannyakesan dalam sel HS68.

Protective effects of cistanche

Rajah 1. cistanche menghalang sitotoksisiti akibat UVB/H2O2-dalam fibroblas kulit manusia HS68. (A) Struktur kimia cistanche. (B) Daya maju sel sel HS68 dirawat dengan kepekatan cistanche yang berbeza (10, 20, 30, 40, 50 µM ) selama 24 jam. (C dan D) Daya maju sel sel HS68 terdedah kepada dos berbeza H2O2 (100, 150, 200, 250, 300 µM) atau disinari dengan UVB (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2 ) selama 24 jam. (E dan F) Daya maju sel sel HS68 yang terdedah kepada H2O2 (200 µM) atau disinari dengan UVB (40 J/cm2 ) selama 1 jam dan kemudian dirawat dengan cistanche (10, 20, 30 µM) selama 23 jam. Kesan sitoprotektif cistanche ditentukan oleh ujian MTT. Sel kawalan telah diberikan daya maju 100 peratus. Nilai ditunjukkan sebagai min ± SE. Kuantifikasi keputusan ditunjukkan (n=3) *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001 berbanding sel kawalan yang tidak dirawat; ##P < 0.01, ###P < 0.001 berbanding sel yang dirawat H2O2 atau UVB.



Cistanche melemahkan H2O2-sel HS68 teraruhpenuaan dan bukannya apoptosis

Untuk menentukan sama ada penurunan daya maju sel adalah disebabkan oleh kematian sel atau perencatan pertumbuhan, kami menyemak ekspresi beberapa apoptosis dan penanda kelangsungan hidup dengan pembongkaran barat dalam sel HS68 yang terdedah kepada dos H2O2 yang berbeza (50, 100, 200, 300, 400 μM ) selama 24 jam. Kami mendapati ekspresi penanda kelangsungan hidup menurun dengan ketara, seperti p-Akt, dan peningkatan ekspresiapoptosis-related markers, such as cleaved-caspase 3 and cytochrome c, at concentrations >200 μM H2O2 (Rajah 2A). Tambahan pula, kami melakukan metrik sito aliran untuk menilai sel apoptosis menggunakan pewarnaan Annexin V dan PI dan memerhatikan hasil yang serupa. Diambil bersama, 200 μM H2O2 tidak menyebabkan apoptosis sel HS68 (Rajah 2B). Seterusnya, kami mengesan ungkapan beberapa penanda penuaan, seperti p16, p21 dan SA{11}}gal, untuk menentukan sel tua. Keputusan kami menunjukkan bahawa rawatan cistanche telah menurunkan tahap protein p16 dan p21 yang disebabkan oleh H2O dengan ketara serta bilangan sel SA- -gal-positif (Rajah 2C, 2D).


Cistanche melemahkan pengeluaran ROS intrasel/mitokondria yang disebabkan oleh UVB/H2O2-dan ketidakseimbangan MMP dalam sel HS68

Tekanan oksidatif memainkan peranan penting dalam pelbagai penyakit, dan boleh disebabkan oleh faktor endogen atau eksogen. Di sini, kami menggunakan H2O2 sebagai endogen dan UVB sebagai faktor eksogen untuk mendorong kerosakan oksidatif dan kemudian menyiasat aktiviti penghapusan ROS cistanche. Untuk mengenal pasti sumber ROS, MitoSOX dan DCFH-DA digunakan untuk menentukan ROS intrasel dan mitokondria. Keputusan pewarnaan menunjukkan bahawa rawatan H2O2 dan UVB menyebabkan pengumpulan ROS manakala rawatan cistanche mengurangkan penjanaan ROS (Rajah 3A, 3B). DalamSelain itu, kerana MMP yang tidak seimbang boleh memulakan kematian sel, kami menggunakan JC-1 untuk menentukan perubahan dalam MMP. Mitokondria biasa berpendarfluor merah (JC{1}} dimer) manakala mitokondria terjejas berfluores hijau (JC-1 monomer). Pendedahan UVB dan H2O2 menyebabkan tahap pendarfluor hijau yang tinggi. Terutama, rawatan cistanche mengalihkan pendarfluor hijau kepada merah, menunjukkan kebangkitan semula fungsi mitokondria (Rajah 3C).

Protective effects of cistanche


cistanche melemahkan H2O2-TGF /Smadkerosakan laluan sintesis kolagen dalam sel HS68

Isyarat TGF / Smad adalah kondusif untuk pembentukan kolagen dalam fibroblas dermal kulit manusia [25-27]. Oleh itu, kami menyiasat peranan sintesis inkolagen cistanche melalui laluan TGF / Smad dalam sel HS68 yang terdedah kepada H2O2. Keputusan Western blot menunjukkan bahawa cistanche meningkatkan isyarat TGF/Smad dengan ketara serta sintesis kolagen dalam H2O2-sel HS68 yang terdedah (Rajah 4A). Selain itu, kekacauan kolagen jenis I dan III adalah salah satu ciri tipikal fibroblas kulit yang berumur [28]. Memandangkan keluarga MMP telah terlibat dalam katabolisme kolagen [29], kami seterusnya mengesahkan pengaruh cistanche pada pengaktifan MMP{11}}. Kami mendapati bahawa cistanche menghalang degradasi kolagen dalam sel HS68 dengan menyekat tahap H2O2-MMP-1 yang dipertingkatkan (Rajah 4A).
Tambahan pula, kami mengenal pasti mekanisme molekul subselular yang mendasari tindakan perlindungan ini dengan membandingkan sel HS68 yang dirawat dengan H2O2 sahaja atau dirawat bersama dengan cistanche menggunakan pewarnaan imunoblotting dan imunofluoresensi. rawatan cistanche meningkatkan pengumpulan nuklear p-smad2/3 dan Smad4 yang terganggu oleh pendedahan kepada H2O2 dalam sel HS68(Rajah 4B, 4C). Penemuan ini menunjukkan bahawa cistanche boleh memperbaiki pemecahan kolagen yang disebabkan oleh H2O2-dengan mengaktifkan laluan TGF/Smad dalam sel HS68.


Rawatan Cistanche mengurangkan ekspresi terkawal teraruh H2O2- bagi hsa-miR-4535, yang diramalkan untuk menyasarkan Smad4

Analisis susunan miRNA bagidirawat dengan cistancheSel HS68 mendedahkan bahawa ekspresi hsa-miR-4535 telah dikurangkan dalam kumpulan yang dirawat cistanche berbanding dengan kumpulan kawalan (Rajah 5A). Selanjutnya, menggunakan pangkalan data miRNA, seperti miRDB dan TargetScanHuman, kami meramalkan tapak sasaran terpelihara yang diduga untuk hsa-miR-4535 dalam Smad4-3′-UTR (Rajah 5B). Selepas mengesahkan tapak sasaran, binaan wartawan Smad4-3′-UTR-WT dan Smad4-3′-UTR MT telah dipindahkan ke dalam sel HS68 untuk mengesahkan pengikatan langsung hsa-miR-4535 kepada Smad{18}}3'-UTR. Kami memerhatikan pengurangan 50 peratus dalam aktiviti luciferase antara jenis liar dan kumpulan Smad4-3′-UTR mutan mengikuti transfeksi mimik hsa-miR-4535 (Rajah 5C). Kami kemudian menilai kesan H2O2 (100,200 μM) pada pengawalan hsa-miR-4535 dan Smad 4 dalam sel HS68, dan mendapati bahawa H2O2 bergantung kepada dos meningkatkan hsa-miR-4535 dan menindas RNA Smad4 ungkapan (Rajah 6A, 6B). Selain itu, aliran dalam hsa-miR-4535 dan ekspresi Smad4 ini telah diterbalikkan berikutan rawatan cistanche, menunjukkan bahawa peraturan isyarat Smad mungkin terlibat dalam pengurangan pengantaraan cistanche bagi kerosakan sel HS68 yang disebabkan oleh H2O2-(Rajah 6C, 6D). Secara keseluruhan, keputusan ini mencadangkan bahawa cistanche melemahkan H2O2-kemerosotan laluan TGF /Smad dengan menurunkan kawal selia ekspresi hsa-miR-4535 dalam fibroblas dermal kulit manusia.


Protective effects of cistanche

Rajah 4. cistanche melemahkan H2O2-kemerosotan laluan sintesis kolagen TGF /Smad dalam sel HS68. (A) Sel HS68 telah terdedah kepada H2O2 (200 µM) selama 1 jam dan kemudian dirawat dengan cistanche (30 µM) selama 23 jam. Ekspresi protein komponen laluan berkaitan sintesis kolagen (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) dan protein berkaitan degradasi kolagen (MMP-1) telah dikesan oleh western blot. ( B ) Ekspresi protein p-smad2/3, dan Smad4 dalam pecahan nuklear dan sitosolik telah dikesan oleh pembongkaran barat. GAPDH digunakan sebagai kawalan pemuatan. Nilai ditunjukkan sebagai min ± SE. Kuantifikasi keputusan ditunjukkan (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 lwn. sel kawalan yang tidak dirawat; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001 lwn. H2O2-sel yang dirawat. (C) Anti-p-Smad2/3, antibodi Smad4 dan antibodi sekunder konjugasi FITC/PE digunakan untuk mengesan ekspresi p-Smad2/3 (hijau), dan Smad4 (merah). DAPI menunjukkan lokasi nukleus (biru). Imej telah ditangkap menggunakan mikroskop pendarfluor (200 ×).


Modulasi Smad4 oleh has-miR-4535 terlibat dalam sintesis kolagen dalam H2O2-fibroblas kulit manusia yang terdedah

Untuk menentukan lebih lanjut mekanisme has-miR-4535 memberikan kesannya pada ekspresi Smad4 dan isyarat hilirannya dalam sel HS68, kami mengalihkan sel HS68 dengan mimik atau perencat hsa-miR-4535 dan mengukur Smad4 dan ekspresi kolagen hilirannya. Keputusan menunjukkan bahawa perencatan hsa-miR-4535 oleh perencat hsa-miR-4535 dengan ketara membalikkan regulasi rendah mRNA Smad4 dan ekspresi protein dalam sel HS68 yang dirawat H2O2-(Rajah 7A–7C) . Selain itu, penindasan hsa-miR-4535 memulihkan sebahagian H2O2-mengakibatkan kemerosotan COL1A1 dan COL3A1 dalam sel HS68 yang dirawat H2O2-(Rajah 7C). Sebaliknya, ungkapan hsa-miR-4535 yang dipertingkatkan hasil daripada pemindahan mimik hsa-miR-4535 menyekat penyelarasan pengantara cistanche bagi Smad4 dalam sel HS68 yang terdedah kepada H2O2 (Rajah 7D–7F). Ekspresi berlebihan hsa-miR-4535 dikurangkan sebahagiannya disebabkan cistanche COL1A1

dan tahap COL3A1 (Rajah 7F). Ekspresi berlebihan hsa-miR-4535 (Rajah 8A–8C) atau perencatan Smad4 oleh siRNA (Rajah 8D, 8E) mengakibatkan pengurangan sintesis kolagen di bawah rawatan cistanche berikutan pendedahan H2O2. Yang menghairankan, kami mendapati bahawa kedua-dua pembungkaman Smad4 terus dan rawatan dengan hsa-miR{14}} meniru sintesis kolagen terbalik akibat cistanche dalam H2O2- merawat sel HS68. Secara keseluruhan, kami membuat kesimpulan bahawa cistanche mengawal sintesis kolagen, berpotensi melalui penurunan tahap hsa-miR-4535 untuk meningkatkan isyarat Smad4 dalam sel HS68 yang terdedah kepada H2O2.

KSL30


cistanche meningkatkan laluan sintesis kolagen TGF /Smad dan melemahkan penuaan kulit serta perencatan ekspresi has-miR-4535 dalam sel HS68 yang terdedah kepada UVB

Memandangkan cahaya UV memainkan peranan penting dalam pelbagai gangguan dermis kulit, termasuk keradangan, imunosupresi, kanser, dan penuaan pramatang [30-32], kami mengkaji kesan cistanche pada isyarat berkaitan sintesis kolagen dalam sel HS68 yang terdedah kepada sinaran UVB. Tahap protein komponen laluan TGF / Smad dan COL1A1 dan COL3A1 hiliran telah menurun dalam sel HS68 yang dirawat UVB tetapi dikawal secara berkesan selepas rawatan cistanche (Rajah 9A). Keputusan western blotting mengesahkan bahawa cistanchemenyekat ekspresi MMP-1 UVB yang dipertingkatkan dalam sel HS68 (Rajah 9A). Selain itu, kami menjelaskan kesan anti-penuaan cistanche dalam sel HS68 yang tertakluk kepada pendedahan UVB dengan menunjukkan bahawa cistanche mengurangkan ketinggian yang disebabkan oleh UVB pada tahap p16 dan p21 (Rajah 9A). Untuk menilai sama ada cistanche boleh melemahkan pecahan kolagen akibat UVB melalui perencatan hsa-miR{12}} yang menyasarkan Smad4, kami menyiasat tahap has-miR-4535 dan Smad4 dalam sel UVB dan cistanche yang dirawat bersama menggunakan qPCR. Kami mendapati ungkapan has-miR-4535 itutelah dikawal dengan ketara dalam sel terdedah UVB tetapi menurun selepas rawatan cistanche. Sebaliknya, ekspresi Smad4 telah ditindas oleh pendedahan UVB dan penindasan ini telah diterbalikkan dengan ketara oleh rawatan cistanche (Rajah 9B, 9C). Secara kolektif, penemuan kami mencadangkan bahawa cistanche memberikan kesan yang sama seperti H2O2 untuk memulihkan penurunan yang disebabkan oleh UVB dalam pembentukan kolagen dengan menekan tahap hsa-miR-4535 supaya menggalakkan isyarat Smad4 dalam sel HS68.

Protective effects of cistanche


Penggunaan topikal cistanche melemahkan hiperplasia kulit akibat UVB dan degradasi kolagen serta meningkatkan isyarat TGF / Smad pada kulit dorsal tikus bogel C57BL6/J

Untuk menjelaskan kesan perlindungan foto cistanche pada kecederaan kulit akibat UVB dalam vivo, kami menilai tahap mikroRNA-4535, Smad4 dan perubahan tisu kulit. Rajah 10A menunjukkan skema untuk reka bentuk eksperimen dan garis masa untuk aplikasi topikal cistanche berikutan penyinaran UVB pada kulit dorsal tikus bogel C57BL6/J. Pembentukan kedutan diperhatikan pada bahagian kulit dorsal tikus C57BL/6J dalam kumpulan terdedah UVB. Penggunaan topikal cistanche mengurangkan pembentukan kedutan dengan ketara, menunjukkan peningkatan kandungan kolagen yang dimediasi cistanche untuk mengekalkan integriti kulit (Rajah 10B). Selain itu, analisis histologi lapisan dermis menunjukkan bahawa kandungan kolagen dan ketumpatan dalam kulit
adalah jauh lebih rendah dalam kumpulan sinaran UVB berbanding kumpulan kawalan kenderaan. Walau bagaimanapun, penggunaan topikal cistanche (12 mg/kg dan 24 mg/kg)


Protective effects of cistanche


Rajah 6. cistanche mengawal selia ekspresi Smad4 dengan mengurangkan tahap hsa-miR-4535. (A, B) Sel HS68 telah dirawat dengan kepekatan H2O2 yang berbeza (0, 100, 20{{30}} µM ) selama 24 jam. (C, D) Sel HS68 terdedah kepada H2O2 (200 µM) selama 1 jam dan kemudian dirawat dengan cistanche (30 µM) selama 23 jam. Ungkapan hsa-miR-4535 dan Smad4 telah dikesan oleh qRT-PCR. Nilai ditunjukkan sebagai min ± SE. Kuantifikasi keputusan ditunjukkan (n=3) *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001 vs sel kawalan yang tidak dirawat; ##P < 0.01, ###P < 0.001 lwn H2O2-sel yang dirawat.


digalakkan meningkatkan kandungan dan ketumpatan kolagen dalam cara yang bergantung kepada dos berbanding dengan tikus yang tertakluk kepada penyinaran UVB (Rajah 11). Morfologi kulit dinilai dengan pewarnaan H&E. Pendedahan UVB meningkatkan ketebalan epidermis berbanding dengan kumpulan kawalan kenderaan. Walau bagaimanapun, penggunaan topikal cistanche mengurangkan dengan ketara akibat UVBhiperplasia epidermis (Rajah 11). Di samping itu, pewarnaan imunohistokimia -gal menunjukkan aplikasi cistanche mengurangkan ekspresi gal tinggi dalam kulit yang disinari UVB (Rajah 11). Untuk menentukan sama ada cistanche boleh memperbaiki kolagen yang disebabkan oleh UVB

Protective effects of cistanche

Rajah 7. Ekspresi berlebihan atau perencatan hsa-miR-4535 mengawal sintesis kolagen dalam sel HS68. Sel HS68 (A–C) telah ditransfeksi dengan perencat hsa-miR-4535 (40 nM) atau perencat NC (40 nM) selama 1 jam dan kemudian dirawat dengan H2O2 (2 00 μM) selama 23 jam. (D–F) HS68 sel telah dialihkan dengan hsa-miR-4535 mimik (10 nM) atau meniru NC (10 nM) selama 1 jam dan kemudian dirawat bersama dengan cistanche (30 μM) selama 23 jam. tahap hsa-miR-4535 telah dikesan oleh qPCR untuk memastikan pemindahan berjaya. Tahap protein Smad4, COL1A1, dan COL3A1 dianalisis dengan pembongkaran barat. GAPDH digunakan sebagai kawalan pemuatan. Nilai ditunjukkan sebagai min ± SE. Kuantifikasi keputusan ditunjukkan (n=3) *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001 berbanding sel kawalan yang tidak dirawat; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001 lwn. H2O2 atau sel yang dirawat cistanche.


kehilangan gentian melalui hsa-miR-4535 downregulation untuk meningkatkan Smad4 in vivo, ekspresi RNAnya dinilai dalam sampel kulit dorsal yang dipotong oleh qRT-PCR. ekspresi hsa-miR-4535 dinaikkan dalam kulit yang disinari UVB tetapi ditekan dengan ketara dalamkulit yang dirawat dengan cistanchepada dos rendah dan tinggi. Tambahan pula, tahap rendah ekspresi RNA Smad4 dalam kulit yang disinari UVB telah dipulihkan dengan rawatan cistanche (Rajah 12A, 12B)


Protective effects of cistanche

Rajah 8. Perencatan Smad4 oleh siRNA atau hsa-miR-4535 meniru membalikkan peningkatan sintesis kolagen yang dimediasi cistanche dalam fibroblas kulit. (A–C) Sel HS68 telah ditransfeksi dengan hsa-miR-4535 mimik (10} nM) atau meniru NC (10 nM) selama 1 jam diikuti dengan cotreatment dengan cistanche (3 {{40}} μM) dan H2O2 (200 μM) selama 23 jam. Tahap Hsa-miR-4535 (A) dan Smad4 (B) telah dikesan oleh qPCR untuk memastikan pemindahan berjaya. (D-E) HS68 sel telah ditransfeksi dengan siRNA Smad4 (20} nM) atau siRNA NC (20 nM) selama 1 jam diikuti dengan cotreatment dengan cistanche (30 μM) dan H2O2 (200 μM) selama 23 jam. Tahap Smad4 dikesan oleh qPCR untuk memastikan pemindahan berjaya (D). Tahap protein Smad4, COL1A1 dan COL3A1 dianalisis oleh western blotting (C, E). GAPDH digunakan sebagai kawalan pemuatan. Nilai yang ditunjukkan ialah min ± SE. Kuantifikasi keputusan ditunjukkan (n=3) *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001 berbanding sel kawalan yang tidak dirawat; #P < 0.05, ##P < 0.01, lwn. H2O2-sel yang dirawat; $$P < 0.01, $$$P < 0.001 lwn. H2O2 serta sel yang dirawat cistanche

Di samping itu, aplikasi cistanche menyelamatkan ekspresi protein TGF , p smad2/3, dan Smad4 dalam tisu kulit yang rosak UVB (Rajah 12C). Penemuan kami menunjukkan bahawa cistanche berpotensi melindungi kulit daripada kerosakan akibat UVB dengan menghalang hsa miR-4535 untuk meningkatkan ekspresi Smad4 untuk pengaktifan P- smad2/3 untuk akhirnya menggalakkan sintesis kolagen (Rajah 13)


image

Rajah 9. cistanche meningkatkan laluan sintesis kolagen TGF /Smad dan melemahkan penuaan kulit serta perencatan ekspresi hsa-miR-4535 dalam sel HS68 yang terdedah kepada UVB. Sel HS68 telah terdedah kepada UVB (40 mJ/cm2 ) dan kemudian dirawat dengan cistanche (30 µM) selama 23 jam. (A) Ekspresi protein komponen laluan berkaitan sintesis kolagen (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), protein berkaitan degradasi kolagen (MMP{{20}}), dan senescence- penanda yang berkaitan (p16 dan p21) telah dikesan oleh western blot. GAPDH digunakan sebagai kawalan pemuatan. (B dan C) Ekspresi RNA hsa-miR-4535 dan Smad4 telah dikesan oleh qRT-PCR. Nilai ditunjukkan sebagai min ± SE. Kuantifikasi keputusan ditunjukkan (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, berbanding sel kawalan yang tidak dirawat; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs sel terdedah UVB.

Minta lebih lanjut:

E-mel:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: tambah 86 15292862950


Anda mungkin juga berminat