RNA Bukan Pengekodan Panjang KCNQ1OT1 Mengawal Protein Kinase CK2 Melalui MiR-760 dalam Sekatan Senescence Dan Kalori Ⅱ

3. Perbincangan

Epigenetic regulation mechanisms, including microRNAs (miRNAs), nucleosome remodeling, DNA methylation, and histone modification, can change heritable phenotypes without changing the DNA sequence (26). There are two main classes of non-coding RNAs(ncRNAs): the larger long ncRNAs (IncRNAs; >200 nukleotida), dan miR.NA yang lebih kecil (21-25 nukleotida) [1-3]. KCNO10T1 pada mulanya dikenal pasti sebagai lncRNA, yang menyenyapkan beberapa gen dalam lokus kcng1 melalui pembentukan struktur kromatin tertib lebih tinggi (4 61. Baru-baru ini, lain-lainfungsi biologi KCNO1OT1telah dilaporkan termasuk yang berkaitan denganfibrosis,iskemia serebrum,aterosklerosis strok, onkogenesis, pembezaan osteogenik, penyembuhan patah tulang, danhipertrofi jantung(7-13). Walau bagaimanapun, mekanisme terperinci yang mana KCNO10T1 mengawal penuaan selular dan CR masih tidak diketahui. Oleh itu, kami cuba menjelaskan sama ada KCNO10T1 terlibat dalam penuaan dan CR. Kajian ini menunjukkan bahawa kejatuhan KCNO10T1 menyebabkan beberapa penanda penuaan selular, termasuk induksi aktiviti SA--gal, pengaktifan laluan53-21Cip1/WAF1, peningkatan trimetilasi H3K9 yang diperlukan untuk pembentukan SAHF dan faktor SASP (L{{ 13}}, IL-6 dan MMP3), dalam sel HCT116 dan MCF{17}}kanser manusia (Rajah 1 dan 2A). Oleh kerana tekanan oksidatif ialah punca penting penuaan (14,15kesan KCNO10T1 pada penjanaan ROS telah disiasat. Seperti yang dijangkakan, KCNO1OTknockdown meningkatkan ROS intraselular dalam sel HCT116 dan MCF-7 (Rajah 2B). Selain itu, tahap KCNO10T1 mRNA dikurangkan dalam sel senescent yang disebabkan oleh LPS, dan ekspresi ektopik KCNQ10T1 menindas ekspresi faktor SASP yang dimediasi LPS dalam sel-sel kanser ini (Rajah 3A, B). Tambahan pula, knockdown KCNO10T1 yang disebabkan oleh aktiviti SA-B-gal dalam fibroblast paru-paru manusia IMR{ {39}} sel dan ungkapan KCNO10T1 telah berkurangan semasa penuaan replikatif dalam sel IMR-90 (Rajah 6). Secara kolektif, keputusan ini menunjukkan bahawa KCNO10T1 bertindak sebagaireagen anti-penuaandanantioksidandalam sel-sel kanser manusia berpaut pada fibroblas.

Klik Di Sini Untuk Mengetahui Lebih Banyak Suplemen Cistanche Untuk Anti-penuaan

Sebelum ini telah ditunjukkan bahawa Ck2 knockdown mendorong penanda penuaan seperti pewarnaan SA-gal [16], pengaktifan p53-p21Cip1/WAF1pathway(generasi 171ROS [pembentukan 18SAHF (19l, dan ekspresi faktor SASP 20]. Oleh itu, hubungan antara KCNO10T1 dan CK2 telah diperiksa.Kajian ini menunjukkan bahawa overexpression CK2x memansuhkan penanda penuaan ini yang disebabkan oleh knockdown KCNO10T1 (Rajah 1, 2 dan 6B)Selain itu, knockdown KCNO10T1 menurunkan tahap protein dan mRNA CK2x,B2A CK2x(Rajah 1). ), dan KCNO10T1 (36,181-37,140) ekspresi berlebihan merangsang tahap mRNA CK2x (Rajah 4A), menunjukkan bahawa KCNQ1OT1 berfungsi sebagai pengawal selia positif CK2a dalam sel. Kajian terkini telah mendedahkan bahawa lncRNA boleh span miRNA menghalang ungkapan mRNA sasaran (1-3]. Oleh kerana kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa miR-760 berinteraksi dengan CK2a (21,22] dan KCNO10T1 [27], rangkaian isyarat KCNO10T1, CK2x dan miR{{ 47}} telah diperiksa. Kajian ini menunjukkan bahawa rawatan tambahan dengan miR-760 meniru menindas KCNQ10T1-meningkat regulasi CK2x pengantara dan rawatan tambahan dengan perencat miR-760 menindas KCNO10T1 yang dimediasi knockdown CK2 downregulation (Rajah 4). Secara konsisten, rawatan dengan LPS, yang menurunkan ekspresi KCNO10T1, meningkatkan tahap miR-760 (Rajah 3C). Oleh itu, kajian ini mencadangkan bahawa jumlah RNA KCNQ1OT1 boleh mentitrasi miR-760 dan dengan itu mengawal ketersediaan miR-760 untuk mengikat kepada mRNA CK2x. KCNO1OT1 dan CK2a boleh bercakap silang melalui keupayaan transkrip mereka untuk bersaing untuk mengikat miR{70}}.

Kerana CR menyediakan satukesan anti-penuaan(23], cara CR mengawal KCNQ1OT1 danmiR-760 telah diperiksa. Kajian ini menunjukkan bahawa keadaan CR meningkatkan ekspresi KCNO10T1 dan CK2x dan menurunkan tahap miR-760 (Rajah 5A,B). Tambahan pula , rawatan dengan miR-760 meniru penindasan CR-mediated CK2x upregulation(Rajah 5C). Secara konsisten, KCNO10T1 knockdown meningkatkan tahap miR-760, manakala syarat tambahan menindas KCNQ10T1 knockdown-mediated miR{{19} } aruhan (Rajah 5D). Akhir sekali, keadaan CR menyelamatkan ekspresi menurun KCNO1OT1 dan CK2a, yang dimediasi oleh penuaan replikatif (Rajah 6C). Secara keseluruhannya, keputusan ini mendedahkan bahawa keadaan CR merendahkan miR-760 melalui penyeliaan KCNO10T1, mengakibatkan penyelarasan CK2x dalam sel manusia. Walaupun lncRNA SNHG6 bertindak sebagai span miR-760dalam sel CRC [25], CR tidak mengubah ungkapan SNHG6 di bawah keadaan percubaan (data tidak ditunjukkan). Bagaimana CR mengawal selia KCNQ1OT1 Kumpulan lain sebelum ini telah menunjukkan bahawa faktor transkripsi NFY dan -catenin mengawal KCNO10T1 (28,29). Walau bagaimanapun, CR tidak dapat mengawal ekspresi NF-Y dan B-catenin paling sedikit di bawah keadaan eksperimen (data tidak ditunjukkan). Oleh itu, kajian tambahan diperlukan untuk mengenal pasti pengawal selia huluan khusus KCNO10T1 dalam keadaan CR.

Kesimpulannya, berdasarkan keputusan kajian ini, model untuk peranan KCNQ1OT1 dalam penuaan dan CR telah dicadangkan. KCNQ1OT1 mengimbangi CK2 dengan span miR-760. Laluan KCNQ1OT1–miR-760–CK2 terlibat dalam penuaan dan CR. Rawatan LPS dan pembahagian sel dalam fibroblas mendorong penuaan dengan merendahkan KCNQ1OT1. CR menyekat penuaan dengan mengaktifkan laluan KCNQ1OT1–miR-760–CK2 (Rajah 6D). Oleh itu, kajian ini mencadangkan KCNQ1OT1 sebagai sasaran terapeutik novel dalam penuaan dan penyakit berkaitan usia, serta rawatan alternatif yang meniru kesan CR.

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Bahan

4.2. Kultur Sel dan CR

Sel IMR-90 fibroblas diploid manusia diperoleh daripada Koleksi Budaya Jenis Amerika (ATCC, Manassas, VA, Amerika Syarikat) pada tahap penggandaan populasi (PDL) sebanyak 24. Sel MCF-7 kanser payudara manusia, kanser kolon sel HCT116 (ATCC) dan sel IMR-90 telah dibiakkan dalam medium Eagle yang diubah suai Dulbecco yang mengandungi 10 peratus (v/v) serum lembu janin dan 1 peratus (v/v) penisilin-streptomisin, dalam suasana yang lembap daripada 95 peratus (v/v) udara dan 5 peratus (v/v) CO2 pada 37 ◦C. PDL sel IMR-90 dikira menggunakan formula PD=log(Nf/Ni)/log2, dengan Nf ialah nombor sel akhir dan Ni ialah bilangan awal sel berbiji. Untuk kebuluran sel (sekatan kalori), sel-sel dengan garam penampan fosfat dibasuh dua kali dan dikultur dalam larutan garam seimbang Earle (Thermo Fisher, Waltham, MA, Amerika Syarikat), dengan 5.5 mM glukosa, tanpa asid amino, selama tujuh jam.

4.3. Pengekstrakan RNA dan PCR Masa Nyata Kuantitatif miRNA

4.4. Transfeksi DNA dan Gangguan RNA

4.5. SA- -gal Activity Assay

Sel-sel dalam kultur sub-konfluen dibasuh dengan garam penimbal fosfat (PBS) ais sejuk, difiksasi dengan 3 peratus (v/v) formaldehid dalam PBS selama 10 min pada suhu bilik, dan kemudian diinkubasi dengan pewarnaan. larutan yang mengandungi 1 mg/mL 5-bromo-4-kloro-3-indolyl -D galactoside, 40 mM asid sitrik-natrium fosfat (pH 6.0), 5 mM kalium ferricyanide, 5 mM kalium ferrocyanide, 150 mM NaCl, dan 2 mM MgCl2 selama 24 jam pada 37 ◦C. Sel bernoda biru dikira dalam sekurang-kurangnya sepuluh medan pada pembesaran 400 × dan dinyatakan sebagai peratusan sel positif.

4.6. Pengukuran Tahap ROS Intraselular

Probe pendarfluor sensitif pengoksidaan CM-H2DCFDA digunakan untuk menilai tahap ROS. Sel telah dirawat dengan 5 µM CM-H2DCFDA selama 20 minit pada 37 ◦C dalam gelap,dipisahkan dengan trypsinization, dan kemudian dibasuh dengan PBS. Keamatan pendarfluor telah menghalangdilombong menggunakan Coulter Elite ESP Cell Sorter (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA). Thepintu serakan ke hadapan dan sisi ditetapkan untuk mengecualikan sebarang sel mati daripada analisis; sekurang-kurangnya10,000 peristiwa dalam get telah diperolehi setiap sampel.

4.7. Transkripsi Songsang (RT)-PCR

4.8. Immunoblotting

4.9. Analisis statistik

Analisis sehala bagi ujian varians data telah dijalankan menggunakan program pakej SPSS (IBM, Armonk, NY, USA). Keputusan dianggap signifikan jika nilai p adalah<0.05. Duncan's multiple range test was conducted if the differences between the groups were identified as α = 0.05. 

Bahan Tambahan: Maklumat sokongan berikut boleh dimuat turun di:

Sumbangan Pengarang: Y.-SB menyusun dan mereka eksperimen, YL melakukan eksperimen dan Y.-SB menulis kertas kerja. Semua pengarang telah membaca dan bersetuju dengan versi manuskrip yang diterbitkan.

Pembiayaan: Penyelidikan ini disokong oleh Program Penyelidikan Sains Asas, melalui Yayasan Penyelidikan Kebangsaan Korea (NRF) yang dibiayai oleh Kementerian Sains, ICT dan Perancangan Masa Depan (NRF-2019R1A2C1005219).

Penyata Lembaga Semakan Institusi: Tidak berkenaan.

Kenyataan Persetujuan Termaklum: Tidak berkenaan.

Pernyataan Ketersediaan Data: Tidak berkenaan.

Konflik Kepentingan: Pengarang mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.

Rujukan

1. Ulitsky, I.; Bartel, DP lincRNAs: Genomik, evolusi dan mekanisme. Sel 2013, 154, 26–46. [CrossRef] [PubMed]

2. Esteller, M. RNA bukan pengekodan dalam penyakit manusia. Nat. Rev. Genet. 2011, 12, 861–874. [CrossRef] [PubMed]

3. Quinn, JJ; Chang, HY Ciri unik biogenesis dan fungsi RNA bukan pengekodan yang panjang. Nat. Rev. Genet. 2016, 17, 47–62. [CrossRef] [PubMed]

4. Mancini-Dinardo, D.; Steele, SJ; Levorse, JM; Ingram, RS; Tilghman, SM Pemanjangan transkrip Kcnq1ot1 diperlukan untuk pencetakan genomik gen jiran. Genes Dev. 2006, 20, 1268–1282. [CrossRef] [PubMed]

5. Pandey, RR; Mondal, T.; Mohammad, F.; Enroth, S.; Redrup, L.; Komorowski, J.; Nagano, T.; Mancini-Dinardo, D.; Kanduri, C. Kcnq1ot1 RNA bukan pengekodan antisense mengantara pembungkaman transkripsi khusus keturunan melalui peraturan peringkat kromatin. Mol. Sel 2008, 32, 232–246. [CrossRef]

6. Kanduri, C. Kcnq1ot1: RNA pengawal selia kromatin. Semin. sel. Dev. biol. 2011, 22, 343–350. [CrossRef]

7. Yang, F.; Qin, Y.; Lv, J.; Wang, Y.; Che, H.; Chen, X.; Jiang, Y.; Li, A.; Matahari, X.; Yue, E.; et al. Menyenyapkan RNA Kcnq1ot1 tanpa pengekodan yang panjang mengurangkan pyroptosis dan fibrosis dalam kardiomiopati diabetik. Kematian Sel Dis. 2018, 9, 1000. [CrossRef]

8. Yu, S.; Yu, M.; Dia, X.; Wen, L.; Bu, Z.; Feng, J. KCNQ1OT1 menggalakkan autophagy dengan mengawal selia laluan miR-200a/FOXO3/ATG7 dalam strok iskemia serebrum. Sel Penuaan 2019, 18, e12940. [CrossRef]

9. Yu, XH; Deng, WY; Chen, JJ; Xu, XD; Liu, XX; Chen, L.; Shi, MW; Liu, QX; Tao, M.; Ren, K. LncRNA kcnq1ot1 menggalakkan pengumpulan lipid dan mempercepatkan aterosklerosis melalui berfungsi sebagai ceRNA melalui paksi miR-452-3p/HDAC3/ABCA1. Kematian Sel Dis. 2020, 11, 1043. [CrossRef]

10. Cagle, P.; Qi, Q.; Niture, S.; Kumar, D. KCNQ1OT1: RNA bukan pengekodan panjang onkogenik. Biomolekul 2021,

11, 1602. [CrossRef] 11. Wang, JL; Wei, X.; Wang, AG; Bai, Y.; Wu, XJ KCNQ1OT1 mengawal pembezaan osteogenik hBMSC oleh paksi miR-320a/Smad5. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2020, 24, 2843–2854. [PubMed]

12. Chen, L.; Xiong, Y.; Yan, C.; Zhou, W.; Endo, Y.; Xue, H.; Hu, Y.; Hu, L.; Leng, X.; Liu, J.; et al. LncRNA KCNQ1OT1 mempercepatkan penyembuhan patah melalui memodulasi paksi miR-701-3p/FGFR3. FASEB J. 2020, 34, 5208–5222. [CrossRef] [PubMed]

13. Chen, Y.; Zhang, Z.; Zhu, D.; Zhao, W.; Li, F. Knockdown KCNQ1OT1 melemahkan hipertrofi jantung melalui modulasi paksi miR-2054/AKT3. J. Thorac. Dis. 2020, 12, 4771–4780. [CrossRef] [PubMed]

14. Kanak-kanak, BG; Durik, M.; Baker, DJ; van Deursen, JM Penuaan selular dalam penuaan dan penyakit berkaitan usia: Dari mekanisme kepada terapi. Nat. Med. 2015, 21, 1424–1435. [CrossRef]

15. McHugh, D.; Gil, J. Senescence dan penuaan: Punca, akibat, dan jalan terapeutik. J. Biol Sel. 2018, 217, 65–77. [CrossRef]

16. Ryu, SW; Woo, JH; Kim, YH; Lee, YS; Park, JW; Bae, YS Downregulation protein kinase CKII dikaitkan dengan penuaan selular. FEBS Lett. 2006, 580, 988–994. [CrossRef]

Minta lebih lanjut:

E-mel:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: tambah 86 15292862950