Kesan Perlindungan Cistanche Terhadap Degradasi Kolagen Fibroblast Dermal akibat H2O2/UVB Melalui Hsa-microRNA-4535-pengantaraan TGF /Smad Signaling Ⅱ

PERBINCANGAN

Dalam kajian ini, kami mengenal pasti bahawaperanan pelindung cistanchedimediasi melalui pengecilan hsa-miR- 4535 yang menyasarkan Smad4, sekali gus mengawal selia isyarat Smad2/3/4 serta sintesis kolagen dalam kulit yang terdedah kepada H2O2/Kerosakan kulit akibat UVB dalam vitrodandalam vivo. Penemuan kami boleh diringkaskan sebagai enam perkara utama: (1) cistanche dilemahkan H2O2-mengakibatkan penuaan sel HS68 tetapi tidak apoptosis pada dos 30 µM; (2) H2O2/ disebabkan oleh UVBintrasel dan mitokondrial Pembentukan ROS dan ketidakseimbangan MMP telah diterbalikkan berikutanrawatan cistanche; (3) cistanche mempertingkatkan isyarat TGF/Smad dengan ketara serta pengaktifan kompleks Samd2/3/4 dalam H2O2-sel terdedah; (4) penyelarasan hsa-miR-4535 oleh H2O2/UVB telah ditindas berikutanrawatan cistanche; (5) hsa-miR- 4535 terlibat dalam mengawal selia isyarat TGF /Smad olehmenyasarkan Smad4 kepada sintesis kolagen terjejas dalam H2O2/ sel terdedah UVB; (6)aplikasi topikal cistanchepadakulit dorsal bogeltikus dengan ketara mengurangkan akibat UVBfoto penuaan kulit,pembentukan kedutan, hiperplasia kulit, dan kemerosotanlaluan isyarat TGF / Smad.

Rajah 10. Kesan cistanche pada kerosakan foto kulit tikus bogel C57BL6/J akibat UVB. (A) Prosedur skematik eksperimen haiwan. Kulit dorsal tikus bogel C57BL6/J berumur empat minggu (n=6) ​​telah terdedah kepada sinaran UVB dan dirawat dengan cistanche dua hari sekali selama 8 minggu (B) Gambar yang menggambarkan pembentukan kedutan pada kulit dorsal bogel tikus akibat pendedahan UVB, diikuti dengan penggunaan topikal cistanche.

Klik Di Sini Untuk Mengetahui Rawatan Cistanche Untuk Mengurangkan Kulit Pkerosakan panas

Rajah 11. Aplikasi cistanche topikal melemahkan akibat UVBhiperplasia kulitdan degradasi kolagen dalam kulit dorsal tikus bogel C57BL6/J. Tisu kulit dipotong secara bersiri dan diwarnai dengan H&E, trichrome Masson, dan imunohistokimia untuk p-Smad2/3 Smad4 dan -gal. Pewarnaan H&E menunjukkan ketebalan epidermis. Anak panah merah berkepala dua menunjukkan penebalan epidermis. Pewarnaan trichrome Masson menunjukkan kandungan serat kolagen dalam lapisan kulit. Gentian kolagen kelihatan biru. LD, dos rendah; HD, dos tinggi.

Cistanchedilaporkan mempamerkan sifat anti-apoptosis dan antioksidan dalam pelbagai sel seperti keratinosit dan kardiomiosit [13, 39, 40]. Pentadbiran oral cistanche berkesan menindas kecederaan hati yang disebabkan oleh streptozotocin pada tikus diabetes dengan mengurangkan kerosakan oksidatif mitokondria dan meningkatkan isyarat antioksidan Nrf2 [13, 41]. Kajian lain telah menunjukkan bahawa cistanche memperbaiki hepatotoksisiti akibat siklofosfamid dan nefrotoksisiti yang disebabkan oleh cisplatin dengan melemahkan tekanan oksidatif dan keradangan [42, 43]. Pendedahan fibroblas dermal kepada UVB atau H2O2 mengakibatkan pengumpulan ROS dalam mitokondria, yang membawa kepada pemecahan mitokondria dan penuaan selular [44]. Kajian terdahulu menunjukkan bahawa mitokondria yang berpecah-belah menjejaskan pengeluaran kolagen [45]. Kajian kami menunjukkan bahawa cistanche mempunyai keupayaan pemusnahan radikal untuk menghalang potensi membran mitokondria yang disebabkan oleh ROS tidak seimbang dan pengumpulan ROS dalam sel yang disebabkan oleh UVB dan H2O2-. (Rajah 3A–3C). Kajian terbaru telah melaporkan bahawa fibroblas kulit bertanggungjawab untuk mengatur persekitaran yang kaya dengan ECM,

Rajah 12. Kesan cistanche pada isyarat TGF /Smad dan ekspresi hsa-miR-4535 dalam tikus yang disinari UVB. (A dan B) tahap mRNA hsa-miR-4535 dan Smad4 daripada kulit dorsal tikus terdedah UVB telah dikesan oleh qRT-PCR. (C) Tahap protein TGF , p-smad2/3, dan Smad4 dalam tisu kulit dorsal dikesan oleh western blotting. -tubulin digunakan sebagai kawalan pemuatan. Data dibentangkan sebagai min ± SD. Kuantifikasi keputusan ditunjukkan; *P < 0.05, **P < 0.01 berbanding kumpulan kawalan kenderaan; #P < 0.05, ##P < 0.01 berbanding kumpulan kenderaan UVB plus.

kebanyakannya terdiri daripada kolagen jenis I dan III [46]. Homeostasis kolagen jenis I dan III pada asasnya bertanggungjawab untuk mengekalkan sokongan struktur dan mekanikal untuk kulit [47]. Bukti yang muncul telah mencadangkan bahawa ROS yang banyak dihasilkan semasa penuaan, mengakibatkan kehilangan progresif berkas kolagen dalam lapisan dermis dan dengan itu, menyumbang kepada pembentukan kedutan akibat laluan TGF / Smad yang terjejas dan ekspresi MMP yang tinggi [48, 49].Cistanche-mediatedpengaktifan isyarat TGF / Smad menghasilkan kolagen yang mengekalkan integriti kulit. Walau bagaimanapun, ia mempunyai kesan yang berbeza dalam sel kanser; dalam kanser hati,rawatan cistanchemenghalang percambahan sel HepG2 dengan mengaktifkan isyarat TGF / Smad [50]. Sebaliknya, cistanche menghalang isyarat TGF / Smad serta menyahaktifkan Smad3 yang mengakibatkan perencatan pertumbuhan dalam sel-sel kanser prostat dan pankreas [51]. Walau bagaimanapun, peranan cistanche dalam TGF / Smad memberi isyarat masukfibroblas dermal kulitkekal tidak diketahui. Di sini, kami melihat bahawa cistanche mengimbangi ekspresi COL1A1 dan COL3A1 yang dikurangkan dalam sel yang dirawat H2O2 / UVB melalui pengaktifan isyarat TGF / Smad (Rajah 4A-4C, 8E, 9A). Selain itu, aruhan MMP-1 oleh H2O2/UVB telah diterbalikkan selepas rawatan cistanche (Rajah 4A, 9A). Penemuan kami menunjukkan bahawa cistanche melindungi fibroblas kulit daripada kerosakan yang disebabkan oleh H2O2/UVB dengan mengaktifkan isyarat TGF / Smad dan mendorong pengeluaran kolagen.

Perkembangan kolagen dermis kulitadalah proses fisiologi yang rumit, dan peraturan pengantaraan mikroRNA telah ditunjukkan menyumbang kepada pembentukan semula dan organisasi ECM [23, 52, 53]. Kolagen, elastin, dan asid hyaluronik (HA) adalah tiga protein utama yang mengekalkan integriti kulit. Bukti terkumpul menunjukkan bahawa beberapa mikroRNA terlibat dalam penuaan kulit melalui peraturan ECM. miR-181a telah dikawal selia dalam fibroblas kulit manusia senescent dan membolehkan kolagen XVI memodulasi komponen ECM [54]. Menariknya, ekspresi miR-23a-3p yang tinggi boleh menyebabkan penuaan kulit dengan menekan terus hyaluronan synthase 2, salah satu isoenzim sintase HA transmembran yang mensintesis HA [21]. Baru-baru ini, pelbagai sebatian semula jadi telah dilaporkan untuk melemahkan penuaan dermis kulit melalui peraturan mikroRNA [55-57]. Tambahan pula, cistanche dilaporkan terlibat dalam peraturan mikroRNA dalam cholangiocarcinoma dan karsinoma hepatoselular dan menyebabkan penindasan pertumbuhan sel dan metastasis [58, 59]. Setakat ini, tiada kajian telah mengenal pasti mekanisme molekul, seperti peraturan mikroRNA, dalamdirawat dengan cistanchesel fibroblas dermal kulit manusia. Di sini, kami menganalisis profil tatasusunan mikroRNA untuk mengenal pasti beberapa mikroRNA yang berbeza antara kawalan dan 30 µMdirawat dengan cistanchekumpulan (Rajah 5A). Menggunakan pangkalan data miRDB dan TargetScanHuman, kami meramalkan Smad4 sebagai hsa-miR-4535sasaran mRNA (Rajah 5B). ungkapan hsa-miR-4535 telah dikurangkan selia berikutan rawatan cistanche dalam sel yang disebabkan oleh H2O2/UVB (Rajah 6C, 9B). Sebaliknya, ekspresi sasarannya, mRNA-Smad4, telah dihalang dengan ketara dalam sel terdedah H2O2/UVB dan meningkat selepas rawatan cistanche (Rajah 6D, 9C). Pelbagai kajian menunjukkan bahawa ROS bertindak sebagai faktor transkripsi yang disebabkan oleh tekanan yang merangsang perantaraan, seperti p53, NF-κB dan HIF [60]. Oleh itu, kami membuat kesimpulan bahawa miRNA tertentu boleh dimodulasi melalui peraturan faktor transkripsi ini. Dengan menggunakan pangkalan data tapak pengikat faktor transkripsi (PROMO), kami mengenal pasti bahawa terdapat satu unsur pengikatan p53 yang diduga pada penganjur hsa-miR-4535. Kajian masa depan kami akan menumpukan pada peraturan transkrip p53 dalam promoter hsa-miR-4535. Tambahan pula, degradasi kolagen yang disebabkan oleh H2O2-tidak dapat dilemahkan dalam hsa miR-4535 sel terlampau atau si-Smad4 transfected walaupun selepas rawatan cistanche (Rajah 8C, 8E). Penemuan ini mengesahkan lagi penglibatan hsa-miR- 4535 dalam mengawal selia sintesis kolagen dengan menyasarkan Smad4.

Rajah 13. Gambarajah skematik untuk mekanisme tindakan cistanche. cistanche mempertingkatkan laluan sintesis kolagen TGF /Smad dengan mengurangkan H2O2-has-microRNA yang disebabkan-4535 untuk meningkatkan penuaan foto dalam fibroblas kulit manusia. Singkatan: ECM: matriks ekstraselular; TGF : mengubah faktor dewasa beta; T RI: reseptor TGF jenis I; T RII: reseptor TGF jenis II.

Kesimpulannya, penemuan kami menunjukkan bahawa cistanche melindungi daripada penjanaan ROS yang disebabkan oleh H2O2/UVB, ketidakseimbangan MMP, penuaan selular, dan degradasi kolagen dalam fibroblas dermal manusia. Kesan perlindungan dermo cistanche dikaitkan dengan perencatan hsa-miR-4535 dan pengaktifan kompleks Smad2/3/4 untuk meningkatkan sintesis kolagen. Pengaktifan kompleks Smad2/3/4 dikawal oleh hsa-miR-4535 melalui pengikatan kepada Smad4-3′-UTR. Oleh itu, mekanisme perlindungan cistanche terhadap kerosakan kulit akibat H2O2/UVB mungkin melibatkan perencatan sintesis Smad4/kolagen oleh hsa-miR- 4535

BAHAN DAN KAEDAH

Kultur dan rawatan sel

Fibroblas kulit manusia HS68 diperoleh daripada Pusat Pengumpulan dan Penyelidikan Bioresource (BCRC, Hsinchu, Taiwan) dan dikekalkan dalam medium penting yang diubah suai Dulbecco (DMEM, Thermo Fisher Scientific, MA, USA) yang mengandungi 10 peratus serum lembu janin (Invitrogen, CA, Amerika Syarikat). ), 2 mM L-glutamin (Sigma-Aldrich, MO, Amerika Syarikat), 100 U/mL penisilin (Sigma-Aldrich), dan 100 ug/mL streptomycin (Sigma Aldrich) pada 37 darjah dan 5 peratus CO2. Untuk menilai kesan cistanche terhadap kerosakan sel akibat H2O{12}}, sel HS68 dirawat dengan 200 μM H2O2 selama 1 jam dan kemudian dirawat bersama dengan cistanche (282200, Sigma-Aldrich) selama 23 jam. Sel telah dibasuh dengan PBS dan diletakkan dalam 1 mL PBS segar sebelum pendedahan UVB. Untuk penyinaran UVB, sel telah terdedah kepada penyambung silang (CX-2000, Upland, CA, USA) dan mentol UVB pada keamatan 40 mJ/cm2 dan kemudian dirawat dengan cistanche.

ujian MTT

Daya maju sel HS68 selepas rawatan diukur menggunakan ujian MTT. Sel HS68 telah disemai ke dalam 96-plat perigi dan dirawat dengan 200 μM H2O2 selama 1 jam atau disinari dengan 40 mJ/cm2 UVB dan kemudian diinkubasi dengan kepekatan cistanche yang berbeza (10, 20, 30 μM) selama 23 jam. Selepas 24 jam, medium kultur digantikan dengan 100 μL MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) larutan (0.5 mg/mL; larutan stok 5 mg/mL dalam PBS dicairkan dengan medium kultur hingga 0.5 mg/mL) selama 4 jam pada 37 darjah . Kemudian formazan berwarna ungu telah dilarutkan dalam 100 μL dimetil sulfoksida (DMSO) dan ketumpatan optik pada 570 nm diukur menggunakan spektrofotometer (Bio-Rad, Hercules, CA, Amerika Syarikat).

Transfeksi sementara

Analisis mikroarray

Ujian wartawan Luciferase

Sel telah ditransfeksi bersama dengan konstruk wartawan luciferase Smad4-3′-UTR-WT atau Smad4-3′-UTR-MT jenis liar dan mutan, dan plasmid luciferase kawalan dalaman. Selepas pemindahan, aktiviti luciferase dikesan oleh Sistem Ujian Dual-Glo Luciferase (Promega, Sunnyvale, CA, Amerika Syarikat) mengikut arahan pengilang. Plat dibaca pada Reporter Microplate Luminometer (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA, USA). Aktiviti luciferase relatif telah dinormalisasikan kepada Renilla luciferase.

Analisis Western blot

Sel-sel telah dibasuh menggunakan 1× phosphate-buffered saline (PBS) dan dilisekan dalam buffer lisis (50 mM Tris-base (pH7.5), {{10}}.5 M NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 1 mM -mercaptoethanol, 1 peratus NP-40, 1 peratus gliserol dan tablet koktel perencat protease (Roche Molecular Biochemicals, Upper Bavaria, Jerman) selama 30 minit di atas ais dan kemudian disentrifugasi pada 12,000 × g selama 10 minit pada 4 darjah . Supernatan dikumpulkan dalam tiub mikrosentrifuge 1.5 mL. Kepekatan protein dalam supernatan ini ditentukan oleh kaedah Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Sampel yang mengandungi jumlah protein yang sama (20 ug) diasingkan melalui 6 peratus –12 peratus kecerunan elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida (SDS-PAGE) dan kemudian dipindahkan ke membran polivinilidena difluorida (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, Amerika Syarikat). Membran disekat menggunakan penimbal penyekat (5 peratus susu kering tanpa lemak, 20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, dan 0.1 peratus Tween 20) selama 1 jam di RT. Kemudian, membran diinkubasi dengan antibodi primer (1: 1,000 pencairan) terhadap TGF 1 (sc-31609, Santa Cruz, CA, USA), p-smad2/3 (sc- 11769, Santa Cruz), Smad4 (sc{{ 50}}, Santa Cruz),COL1A1 (sc-28657, Santa Cruz), COL3A1 (sc-271249,Santa Cruz), p16 (10883-1-AP, Proteintech), p21 (sc{ {60}}, Santa Cruz), MMP-1 (sc-1731, Santa Cruz), GAPDH (sc-32233, Santa Cruz) dan Histone H1 (sc-10806 , Santa Cruz) semalaman pada 4 darjah . Kemudian, mereka diinkubasi dengan antibodi sekunder yang sesuai (pencairan 1:80,000), antiarnab (A0545), antitikus (A9044) atau antigoat (A5420) IgG (Santa Cruz Biotechnology) selama 1 jam di RT. Imunoblot telah dikesan dengan substrat chemiluminescence (ECL)horseradish peroxidase (HRP) (Millipore) yang dipertingkatkan menggunakan ImageQuant LAS4000 mini (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK).

Pengekstrakan protein nuklear

Pengekstrakan RNA dan qRT-PCR

Jumlah RNA diekstrak menggunakan kit komersial MiniPrep RNA Direct-zol™ (Zymo Research Corporation, CA, USA) mengikut protokol pengilang [65, 66]. miRNA telah ditranskripsikan secara terbalik kepada cDNA menggunakan kit sintesis cDNA miRNA (Takara, Shiga, Jepun) seperti yang diterangkan sebelum ini [16, 67]. ungkapan hsa-miR-4535 dan Smad4 telah dikesan oleh PCR masa nyata dalam LightCycler 96 Systems (Roche, Basel, Switzerland) menggunakan protokol Induk LightCycler 480 SYBR Green I standard. Tindak balas 10 μL PCR termasuk 2 μL cDNA, 5 μL 2× SyberGreen PCR Mix, 0.5 μL primer hadapan (10 μM), 0.5 μL primer terbalik (10 μM) dan 2 μL ddH2O. Semua tindak balas dijalankan dalam tiga kali ganda. Untuk pengesanan mRNA, kitaran ambang (Ct) ditentukan untuk setiap gen dan ekspresi setiap gen berbanding dengan GAPDH dikira sebagai 2ΔCt di mana ΔCt =(Cttarget gen – CtGAPDH). Untuk pengesanan miRNA, Ct ditentukan untuk setiap gen dan ekspresi setiap gen berbanding dengan U6 rRNA dikira sebagai 2ΔCt di mana ΔCt=(Cthsa-miR-4535 – CtU6 rRNA). Primer hadapan (F) dan belakang (R) yang digunakan untuk mengesan ekspresi miRNA dan mRNA ialah: hsa-miR-4535 (3′-CAGGG TCGGUCCA5′); manusia-Smad4 (F′-TGACCCAAA CATCACCTTCA, R′- ATACGTGGACCCTTCTG GA); manusia-GAPDH (F′-ACCCAGAAGACTGTGGA TGG, R′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT); tetikus-Smad4 (''-GTGGAAGCCACAGGAATGTT, R′-CCCA CTGAAGGACATTCGAT); tetikus-GAPDH (F′-CCTT CCACAATGCCAAAGTT, R′-GGGTGTGAACCA CGAGAAAT).

Analisis imunofluoresensi