Pembelajaran Ketakutan Sebelum Membolehkan Asimilasi Pantas Kenangan Ketakutan Baharu Terus Ke Rangkaian Kortikal Bahagian 3

Reka bentuk eksperimen

Kebolehulangan data dinilai dengan replika yang berbeza (Jadual S1). Eksperimen penyahaktifan CNQX pertama dalam Te2 (Rajah 1A-1C) telah dilakukan dalam bilangan replika yang lebih tinggi kerana ia adalah eksperimen pertama yang kami jalankan dan berkhidmat untuk menguji hipotesis utama kajian kami. Haiwan adalah priori yang diberikan kepada kumpulan tingkah laku yang berbeza dengan cara yang seimbang berat. Haiwan jantan daripada induk yang sama diberikan secara rawak kepada setiap kumpulan eksperimen. Kami mula-mula menangani hipotesis utama kajian kami, iaitu, ketidakaktifan kortikal mungkin berbeza mempengaruhi penyatuan ingatan ketakutan baru dalam tikus eksperimen naif dan haiwan yang telah mempelajari peristiwa ketakutan sebelumnya.

Haiwan jantan mempunyai ingatan yang sangat kuat kerana mereka mempunyai naluri kelangsungan hidup yang lebih kuat dan keinginan untuk membiak. Haiwan yang masih hidup di alam liar perlu mengingati banyak maklumat geografi, jenis makanan, jejak pemangsa dan lokasi ahli kumpulan untuk menyesuaikan diri dengan persekitaran dan melindungi kehidupan dengan lebih baik.

Sebagai contoh, singa jantan perlu mengingati status seluruh wilayah, hubungan keahlian, dan lokasi pesaing untuk melindungi wilayah dan status mereka. Kuda belang jantan perlu mengingati lokasi sumber air dan makanan di padang rumput untuk terus hidup dan membiak. Sebuah syarikat soda pernah menyiarkan iklan yang menunjukkan bahawa seekor beruang kutub jantan dapat mengingati seorang penyelam dan baunya yang unik supaya dia dapat mengenal pastinya pada kali berikutnya mereka melihatnya.

Oleh itu, haiwan jantan perlu mempunyai ingatan yang kuat dari segi melindungi wilayah mereka, menyediakan makanan yang mencukupi, dan membiak anak. Ini juga menjadikan mereka subjek penting dalam penyelidikan manusia, contohnya, untuk meneroka penyakit seperti gangguan ingatan dan penyakit Alzheimer.

Dalam dunia manusia, kita juga boleh mengambil inspirasi daripada ingatan haiwan jantan. Pendedahan berterusan kepada perkara baharu, pembelajaran berterusan dan pemikiran boleh meningkatkan ingatan dan kebolehsuaian kita, serta meningkatkan taraf hidup dan kecekapan kerja kita. Oleh itu, marilah kita belajar daripada haiwan jantan, terus mengumpul pengetahuan dan pengalaman, mempunyai naluri kelangsungan hidup yang kuat dan keinginan reproduktif, dan mencipta masa depan yang lebih baik. Dapat dilihat bahawa kita perlu meningkatkan daya ingatan. Cistanche deserticola boleh meningkatkan daya ingatan dengan ketara kerana Cistanche deserticola ialah bahan perubatan tradisional Cina dengan banyak kesan unik, salah satunya adalah untuk meningkatkan daya ingatan. Keberkesanan daging cincang berasal dari pelbagai bahan aktif yang terkandung di dalamnya, termasuk asid, polisakarida, flavonoid, dll. Bahan-bahan ini boleh menggalakkan kesihatan otak dalam pelbagai cara.

Klik tahu cara untuk meningkatkan fungsi otak

Dalam kes perbezaan statistik antara kumpulan ini, kami akhirnya melakukan kumpulan kawalan tambahan melalui suntikan garam. Pendekatan yang sama digunakan untuk eksperimen optogenetik, di mana kumpulan kawalan AAV dilakukan hanya selepas perbezaan statistik antara tikus naif dan terlatih sebelum ini dikesan. Jadual percubaan ini membolehkan kami mengelakkan kumpulan kawalan yang tidak perlu dan penggunaan haiwan yang tidak perlu, isu utama dalam perundangan Eropah dan Itali mengenai eksperimen haiwan (prinsip 3 Rs).

Prosedur tingkah laku

Semua eksperimen dijalankan semasa fasa cahaya hari (8 pagi hingga 4 petang). Haiwan diangkut secara tunggal dari kemudahan ke bilik eksperimen dalam baldi telus kecil yang berbeza bergantung pada permintaan eksperimen.

Latihan auditori: Sesi tingkah laku pertama. Haiwan berhawa ketakutan pendengaran (CS1-CS2). Dalam kumpulan ini, tikus diambil perlahan-lahan dari sangkar rumah mereka dan dibawa dari bilik perumahan ke bilik kalis bunyi. Setibanya di sana, haiwan diletakkan di dalam radas penyaman udara yang terdiri daripada sangkar hitam segi empat tepat (35 × 40 cm) dilengkapi dengan grid rod keluli tahan karat (diameter 1 cm, jarak 1.5 cm di antara satu sama lain) yang disambungkan kepada persediaan penghantaran kejutan.

Tikus dibiarkan tanpa gangguan selama 1 minit. Selepas masa ini, 7 rangsangan terkondisi (CS) yang terdiri daripada nada tulen 15 kHz frekuensi (15 s tempoh setiap satu, 80 dB, 36 s selang percubaan) telah diberikan. 1 s terakhir setiap nada telah dipasangkan dengan AS yang menyakitkan (0.5 mA, 1 s). Pada akhir sesi penyaman udara, tikus dibawa pulang ke sangkar rumah mereka.

Haiwan kejutan sahaja (kejutan-CS2). Dalam kumpulan ini, tikus diletakkan sama di dalam radas penyaman yang sama. Sejurus selepas itu, setiap tikus telah mengalami 7-renjatan kaki (1 s, 0.5 mA) sejurus selepas yang lain. Pada akhir rangsangan, haiwan dibawa balik ke sangkar rumah mereka. Ketahanan masa dalam sangkar penyaman adalah kurang daripada 9 saat. Kajian terdahulu menunjukkan bahawa prosedur ini membolehkan untuk mengelakkan proses bersekutu antara rangsangan yang menyakitkan dan rangsangan deria [29,30].

Bau haiwan yang ditakuti (bau-CS2). Dalam kumpulan ini, tikus diletakkan di dalam sangkar hitam segi empat sama yang digunakan dalam kumpulan eksperimen di atas dan disambungkan kepada persediaan penghantaran kejutan. Tikus dibiarkan tanpa gangguan selama 2 minit. Selepas masa ini, 7 CS yang terdiri daripada bau vanila telah diberikan (10 s tempoh setiap satu, selang percubaan 24 saat). 1 s terakhir setiap bau telah dipasangkan dengan AS yang menyakitkan (0.5 mA, 1 s). Modul penyaman udara diletakkan berhampiran sumber pengudaraan untuk mengelakkan kegigihan rangsangan yang dihantar selepas mengimbanginya. Sangkar telah dipastikan dengan grid atas. Bau dibentangkan menggunakan olfactometer pencairan aliran. Udara bersih (1.5 L/min) diarahkan ke injap solenoid, yang apabila dikendalikan, mengalirkan udara ke botol 15 ml yang mengandungi 10 ml bau vanila.

Haiwan nada sahaja (Tone-CS2). Tikus dalam kumpulan ini diletakkan di dalam sangkar hitam yang sama dan dipersembahkan dengan 15-nada kHz (7 rangsangan, tempoh 15 saat, ITI 36 saat) yang dihantar tanpa kehadiran AS.

Haiwan pra-terdedah (Tone-CS1-CS2). Tikus diletakkan di dalam sangkar penyaman dan, 1 minit kemudian, ia dipersembahkan 20 kali dengan 15-nada kHz sahaja dan 24 jam kemudian nada yang sama dipasangkan dengan AS menjadi CS1.

Haiwan yang ketakutan bunyi bising putih (WN-CS2). Dalam kumpulan ini, tikus diletakkan di dalam sangkar hitam segi empat tepat dan dibiarkan tanpa gangguan selama 1 minit. Selepas masa ini, 7 CS yang terdiri daripada WN (15 s tempoh setiap satu, 75 dB, 36 s selang percubaan) telah diberikan. 1 s terakhir setiap nada telah digandingkan dengan AS yang menyakitkan (0.5 mA, 1 s). Pada akhir sesi penyaman udara, tikus dibawa pulang ke sangkar rumah mereka.

Pembelajaran ketakutan pendengaran: Latihan tingkah laku kedua. Dua minggu selepas prosedur yang diterangkan dalam perenggan di atas, haiwan telah dilatih dalam satu lagi tugas penyesuaian ketakutan pendengaran yang berbeza. Tikus dimasukkan ke dalam kotak pengukus standard, seperti dalam kerja kami sebelum ini [10] dan dibiarkan tanpa gangguan selama 2 minit. Selepas masa ini, 7 CS yang terdiri daripada nada tulen 3 kHz frekuensi (8 s tempoh setiap satu, 80 dB, 22 s selang antara percubaan) telah dihantar. 1 s terakhir setiap nada telah dipasangkan dengan AS yang menyakitkan (0.5 mA, 1 s). Pada akhir sesi penyaman udara, tikus dibawa pulang ke sangkar rumah mereka.

Takut pengekalan ingatan. Pengekalan memori ketakutan pendengaran yang diperoleh baru-baru ini kepada CS2 (3 kHz) telah diuji 4 hari kemudian. Untuk eksperimen optogenetik, ujian ingatan baru-baru ini dilakukan dengan penghantaran laser 24 jam selepas pembelajaran CS2-AS dalam analogi dengan selang masa di mana kami melakukan penyahaktifan kortikal melalui pentadbiran CNQX (iaitu, 24 jam selepas latihan). Tikus telah dibiasakan dengan radas yang berbeza daripada yang digunakan untuk penyaman dan diletakkan di dalam bilik yang berbeza untuk mengelakkan tingkah laku ketakutan yang terkondisi kepada isyarat kontekstual [10,62].

Radas baharu itu terdiri daripada sangkar plastik lutsinar dengan sisi bercat hitam yang disertakan dalam kotak pelemahan bunyi yang dilengkapi dengan kipas ekzos, yang menghilangkan udara berbau dari kepungan dan memberikan bunyi latar belakang 60 dB. Haiwan dibenarkan meneroka sangkar selama 5 minit sehari semasa sesi pelaziman. Pada hari ujian pengekalan ingatan ketakutan, selepas 2 minit penerokaan percuma, kami menyampaikan 4 CS2 3 kHz (8 s—22 ITI) yang tidak diikuti oleh mana-mana AS.

Jika diperlukan oleh permintaan eksperimen, tikus kemudiannya diuji untuk pengekalan ingatan ketakutan jauh, diperoleh 2 minggu sebelum percubaan penyaman ketakutan pendengaran kedua. Untuk tujuan ini, 7 hari selepas ujian pengekalan ingatan ketakutan kepada 3-nada kHz, haiwan dimasukkan ke dalam persekitaran baharu (kandang berjalur hitam dan putih) dan kemudian dipersembahkan dengan 15-nada kHz. Empat nada dibentangkan pada selang 36s.

Latihan kontekstual: Sesi tingkah laku pertama. Kumpulan pelaziman ketakutan kontekstual (CtxA-CtxB). Dalam kumpulan ini, tikus diambil perlahan-lahan dari sangkar rumah mereka, dimasukkan ke dalam baldi, dan dibawa dari bilik perumahan ke bilik kalis bunyi. Sesampai di sana, haiwan diletakkan di dalam radas penyaman udara yang terdiri daripada sangkar hitam segi empat tepat yang disebutkan di atas, dilengkapi dengan grid rod keluli tahan karat yang disambungkan kepada persediaan penghantaran kejutan. Tikus dibiarkan tanpa gangguan selama 1 minit. Selepas masa ini, 5 AS (0.5 mA, 1 s) telah ditadbir dengan selang masa 51 saat. Pada akhir sesi, haiwan tersebut dibawa pulang ke sangkar rumah mereka.

Kumpulan kejutan sahaja (syok-CtxB). Tikus, setelah diletakkan di dalam radas penyaman udara, serta-merta menerima 5-kejutan kaki (1 s, 0.5 mA) sejurus selepas yang lain. Ketahanan masa dalam sangkar penyaman adalah kurang daripada 7 saat. Kajian terdahulu menunjukkan bahawa prosedur ini membolehkan untuk mengelakkan proses bersekutu antara rangsangan yang menyakitkan dan rangsangan deria [29,30].

Kumpulan kejutan sahaja (syok-CtxB). Tikus, setelah diletakkan di dalam radas penyaman udara, serta-merta menerima 5-kejutan kaki (1 s, 0.5 mA) sejurus selepas yang lain. Ketahanan masa dalam sangkar penyaman adalah kurang daripada 7 saat. Kajian terdahulu menunjukkan bahawa prosedur ini membolehkan untuk mengelakkan proses bersekutu antara rangsangan yang menyakitkan dan rangsangan deria [29,30].

Pengkondisian ketakutan kontekstual baharu dan pengekalan ingatan ketakutan baru-baru ini. Dua minggu selepas prosedur yang diterangkan dalam perenggan di atas, semua kumpulan telah dilatih untuk mengaitkan persekitaran kontekstual baharu (modul kotak skinner, diletakkan di dalam bilik berbeza) dengan AS yang menyakitkan (0.5 mA, 1 s) . Setiap haiwan diletakkan di dalam ruang baru dan dibiarkan tanpa gangguan selama 2 minit. Kemudian, ia didedahkan kepada 5 AS yang dipisahkan dengan selang 30 saat.

Pengekalan ingatan ketakutan kontekstual telah diuji 4 hari selepas prosedur penyaman ketakutan dengan meletakkan tikus sekali lagi di dalam ruang kotak Skinner selama 3 minit. Untuk eksperimen optogenetik, ujian ingatan baru-baru ini dilakukan dengan penghantaran laser 24 jam selepas pembelajaran CtxB-US dalam analogi dengan selang masa di mana kami melakukan inaktivasi kortikal melalui pentadbiran CNQX (iaitu, 24 jam selepas latihan). Jika diperlukan oleh permintaan eksperimen, tikus kemudiannya diuji untuk pengekalan ingatan ketakutan jauh dengan meletakkan haiwan dalam konteks yang dipasangkan ke AS 2 minggu sebelum persatuan baharu.

Haiwan dibawa dalam 2 baldi berbeza ke bilik penyaman mengikut prosedur kontekstual yang berbeza.

Ukuran pembekuan. Dalam semua prosedur eksperimen, penilaian pengekalan ingatan ketakutan ditentukan sebagai tindak balas beku [10], dianalisis sebagai ketiadaan lengkap mobiliti somatik kecuali untuk pergerakan pernafasan. Bagi setiap haiwan, jumlah masa (dalam saat) yang dibelanjakan dalam pembekuan diukur di luar talian oleh 2 pemerhati bebas yang buta terhadap kumpulan haiwan.

Prosedur pembedahan

Untuk mentadbir bahan terpilih di tapak sasaran, tikus telah dibius dengan isoflurane: Induksi dilakukan pada 4% [vol/vol] dalam 2 L/min udara perubatan dan dilanjutkan kepada pendedahan berterusan pada 2% [vol/vol]) apabila tikus dipasang dalam radas stereotaxic.

Senggatan tengkorak dibuat, dan lubang burr kecil telah digerudi untuk membolehkan penembusan 28-jarum infusi tolok. Picagari 10-ul Hamilton yang dipasang pada pam infusi digunakan untuk menghantar bahan. Selepas infusi, jarum dibiarkan di tempatnya selama 3 minit tambahan. Insisi kemudiannya ditutup dengan klip luka keluli tahan karat, dan haiwan itu diberi suntikan subkutaneus ketoprofen analgesik/anti-radang (2 mg/kg berat badan), dan haiwan itu disimpan dalam keadaan hangat dan di bawah pemerhatian sehingga pulih daripada bius.

Seperti dalam kajian terdahulu [10,32-34], kanulasi haiwan tidak diperlukan, dengan sebatian aktif secara langsung diberikan secara stereotaksis. Prosedur ini berfaedah kerana trauma pembedahan yang wujud pada prosedur kanulasi kekal dielakkan, dengan itu mengehadkan trauma kepada penembusan jarum tunggal [10,32-34]. Malah, anestesia am tidak menjejaskan penyatuan memori dengan ketara [10,32-34]. Untuk memastikan bahawa masa pentadbiran sebatian yang berkaitan dengan percubaan pembelajaran adalah tepat supaya tikus menerima sebatian terpilih sekitar 1 jam dan sekitar 1 hari selepas latihan, anestesia isoflurane diinduksi 5 minit sebelum masa suntikan yang dirancang, contohnya, pada 55 min dalam tikus dirawat 60 minit selepas latihan dan 23 jam dan 55 minit dalam haiwan yang disuntik pada 24 jam selepas latihan. Setiap tikus dikondisikan dan kemudian dikendalikan secara berasingan. Haiwan yang tergolong dalam kumpulan tingkah laku yang berbeza telah dimanipulasi dengan cara bersilang.

Perencat selektif bagi reseptor glutamat AMPA/kainate CNQX ({{0}}Cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] telah dilarutkan dalam larutan garam steril (NaCl, 0.9%) dan dilaraskan kepada pH 7.4 dengan HCl. Perencat sintesis protein anisomycin (Merck, 125 ug/ul) telah dibubarkan dalam HCl equimolar, dicairkan dengan garam steril, dan diselaraskan kepada pH 7.4 dengan NaOH. Salin steril (0.9% NaCl) digunakan sebagai kawalan kenderaan. Bahan-bahan ini disuntik secara dua hala pada kadar 0.1 ul/min dan isipadu 0.5 ul setiap tapak pada koordinat stereotaksik berikut yang diambil dari atlas Paxinos dan Watson [26], dengan medan kortikal Te2 diadili ke atlas Zilles [25]:

Korteks pendengaran sekunder (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Korteks cingulate anterior (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

Isipadu suntikan (0.5 ul setiap tapak) telah dipilih berdasarkan kajian terdahulu di mana sebatian aktif disuntik dalam Te2 [10,34] dan ACC [55,63] pada tikus dewasa.

Untuk menyahaktifkan hippocampus dorsal, sebatian aktif disuntik pada volum 0.6 ul setiap tapak pada koordinat stereotaksik berikut:

Dorsal Hippocampus: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Luka-luka yang tidak dapat dipulihkan pada hippocampal dorsal telah diinduksi dengan pemberian NMDA (Tocris, 18 ug/ul, dilarutkan dalam larutan garam steril, 0,4 ul setiap tapak) pada kadar 0.1 ul/ min pada titik pada koordinat yang dinyatakan di atas. Koordinat yang sama digunakan untuk kawalan suntikan garam dan haiwan yang dikendalikan secara palsu.

Red Retrobeads (Lumafluor, pencairan 1:2 dalam salin, 0.6 ul) telah disuntik dalam BLA mengikut koordinat berikut: AP: −2.8; L: ±5.4; DV: −8.3.

Pada akhir eksperimen, jejak jarum dalam kes CNQX, anisomycin, atau suntikan garam atau lanjutan lesi dalam kes suntikan NMDA telah disahkan secara histologi. Tikus telah dibius secara mendalam dan diperas secara intrakardi dengan 4% formaldehid. Otak mereka dipotong pada 30 μm pada cryostat. Bahagian bersiri bernoda Nissl telah disediakan menggunakan prosedur konvensional dan bahagian tersebut telah disahkan secara histologi di bawah mikroskop yang diperbesarkan pada 2.5 ×.

Eksperimen optogenetik

Suntikan virus. Virus yang berkaitan dengan adeno AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-ceri dan vektor kawalan AAV5:CaMKII -cherry diperolehi daripada University of North Carolina Vector Core (Chapel Hill, North Carolina, Amerika Syarikat). Ayat Viraltiterwas5:8 Titer virus ialah 5.8 × 10^12 vg/ml untuk kedua-dua virus. Penggunaan promoter CaMKII membolehkan ekspresi transgen yang memihak kepada neuron piramida. Virus disimpan dalam peti sejuk −80˚C. Infusi virus yang menyasarkan Te2 atau ACC dilakukan pada koordinat stereotaksik di atas pada volum 0.5 ul untuk setiap lubang. Virus itu disuntik pada kadar 0.1 ul/min, dan jarum dibiarkan di tempatnya selama 5 minit tambahan. Suntikan virus dilakukan 4 minggu sebelum eksperimen optogenetik.

Pencahayaan.

Gentian optik (Plexon, teras 200/230 μm; panjang 10 mm) telah ditanam secara dua hala dalam BLA (AP=−2.8, L=± 5.4, V=−8.2 mm daripada bregma). Perencatan optogenetik unjuran Te2 ke BLA atau unjuran ACC ke BLA diperoleh dengan menggunakan Sistem Rangsangan Optogenetik PlexBright yang digabungkan dengan diod laser (Laserglow Technologies). Cahaya kuning (589 nm) dijana dan melalui gentian optik. Ketumpatan kuasa yang dianggarkan pada hujung gentian optik ialah 10 hingga 15 mW untuk pencahayaan tapak unjuran. Semasa pengekalan ingatan ketakutan, pelepasan cahaya dimulakan 4 saat sebelum permulaan nada, berterusan sepanjang nada, dan dihentikan 4 saat selepas pengimbangan nada. Haiwan yang tergolong dalam kumpulan penyaman ketakutan kontekstual menerima rangsangan ringan semasa keseluruhan penerokaan konteks (3 min). Tikus telah dibiasakan dengan kord tampalan selama 2 hari sebelum percubaan pengekalan ingatan.

Imunohistokimia. Setelah selesai eksperimen optogenetik, tikus telah dibius secara mendalam dan diserap secara intrakardial dengan 4% PAF untuk memeriksa penyebaran virus. Otak telah dibedah, disimpan semalaman pada suhu 4˚C, dan akhirnya dipindahkan kepada 30% sukrosa. Bahagian koronal (30 μm) dipotong pada cryostat dan dikumpulkan dalam PBS. Bahagian terapung bebas diinkubasi dalam larutan penyekat selama 1 jam di RT. Kemudian, mereka diinkubasi dalam antibodi tetikus monoklonal primer anti mCherry (pencairan 1:500, Abcam) dalam larutan penyekat semalaman di RT. Selepas itu, bahagian telah dibasuh dengan PBS dan diinkubasi selama 1 jam di RT dengan antibodi anti-tikus AlexaFluor{9}} sekunder (1:600, Invitrogen) yang dicairkan dalam PBS. Bahagian telah dibasuh dalam PBS, dipasang dengan media pelekap yang mengandungi DAPI (Vektor), dan penutupnya tergelincir.

Otak tikus yang menjalani suntikan NMDA juga dikumpulkan. Bahagian terapung bebas, selepas beberapa kali bilas, diinkubasi dengan antibodi anti-Neun tetikus monoklonal primer (1:1,000 pencairan, Merck) dalam larutan penyekat semalaman pada suhu bilik. Selepas itu, bahagian telah dibasuh dengan PBS dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu bilik dengan antibodi anti-tikus kuda terbiotinilasi (pencairan 1:200, Vektor). Kompleks avidin-biotin (kompleks ABC 1:100, Vektor, 2 jam dan separuh pengeraman) digandingkan dengan diaminobenzidine (0.03%, Merck) untuk mengotorkan Neun. Bahagian kemudiannya dibilas dalam PBS dan dipindahkan ke slaid bersalut gelatin, dehidrasi, dan ditutup dengan penutup.

Bahagian Te2 tikus yang disuntik manik retro menjalani pengeraman dengan antibodi anti-Fos arnab poliklonal primer (1:2,000, Isyarat Sel) dalam larutan penyekat semalaman di RT. Selepas itu, kepingan telah dibasuh dengan PBS dan diinkubasi selama 1 jam di RT dengan anti-arnab Alexa 488 (1:1,000, Invitrogen, dalam PBS). Akhirnya, bahagian imunolabel dibasuh dalam PBS, dipasang pada slaid bersalut gelatin, dan ditutup dengan medium pelekap yang ditambah DAPI.

Mikroskopi

Pelabelan mCherry telah diperiksa dengan menggunakan mikroskop confocal Zeiss Airyscan: Dua laser telah digunakan (405 dan 561 nm), masing-masing sepadan dengan spektrum pelepasan puncak untuk DAPI (noda Nissl untuk nukleus sel) dan Alexa 568 (mCherry ), masing-masing. Untuk menganalisis penyebaran virus di tapak suntikan, mikrograf Te2 dan ACC diperoleh sebagai imej mozek (setiap tunggal diperoleh dengan menggunakan objektif 10 ×). Terminal akson ke dalam BLA dianalisis dengan menggunakan objektif 40× sebagai timbunan z 10 bahagian, jarak 1 μm (159 μm persegi; pecahan zum, 1.0).

Untuk haiwan yang disuntik retrobeads yang menjalani immunolabeling cFos, imej telah diperoleh pada pembesaran 40× (159 μm persegi; pecahan zum, 1.0) dengan 3 laser berbeza, sepadan dengan spektrum pelepasan puncak untuk DAPI (noda Nissl untuk nukleus sel), AlexaFluor 488 (cFos), dan Texas Red (Retrobeads), masing-masing. Bahagian 0.7 μm diperoleh di sepanjang timbunan z 10-μm. Bilangan nukleus yang menyatakan cFos, berlabel manik, dan positif berganda (manik cFos+ berlabel) dikira untuk setiap haiwan di rantau Te2 pada koordinat anteroposterior dari 6.7 hingga 7.3 mm dari bregma [10]. Data kemudiannya dipuratakan untuk menghasilkan min setiap haiwan dan hasilnya dibandingkan secara statistik. Imej bahagian dengan pewarnaan DAB Neun dianalisis menggunakan perisian Neurolucida yang disambungkan ke mikroskop melalui kamera CCD warna [10].

Analisis data dan kriteria pengecualian

N untuk setiap kumpulan telah ditubuhkan priori mengikut kajian terdahulu kami [10,16,17], karya yang diterbitkan sebelum ini dalam bidang (lihat sebagai rujukan untuk ACC [6,22,55] dan Te2 [10,59]), dan melalui anggaran kuasa G, mengikut jadual berikut (Jadual 1):

Untuk setiap analisis, kami menganggarkan bilangan min akhir 8 hingga 10 haiwan untuk setiap kumpulan. Kumpulan dijalankan dengan kawalan dalaman dalam sesi percubaan yang sama (Jadual S1). Memandangkan kebolehubahan prosedur pembedahan dan tingkah laku, kami memasukkan lebih banyak subjek eksperimen (sehingga 15% lebih banyak) yang dalam beberapa kes memenuhi kriteria eksperimen dan dimasukkan, dengan itu mengelakkan pengecualian sewenang-wenangnya. Dalam kes kajian hippocampal, untuk menilai kesan suntikan NMDA dan CNQX pada selang masa yang berbeza, kami mengimbangi jumlah haiwan kawalan antara kenderaan dan tikus yang dikendalikan secara palsu di kalangan kumpulan yang berbeza.

Analisis tingkah laku, pemeriksaan histologi, dan kiraan sel dilakukan secara membuta tuli. Haiwan dengan penyetempatan jejak jarum yang tidak mencukupi atau lesi dalam kes lesi tidak dapat dipulihkan NMDA telah dikecualikan daripada analisis data (Jadual S1). Dalam kajian farmakologi, kami mengecualikan 57 haiwan ke atas sejumlah 465 haiwan kerana penempatan jarum yang salah (22/255 untuk Te2, 31/179 untuk ACC, dan 4/31 untuk hippocampus). Dalam kajian mengesan, pada 21 haiwan, kami menghapuskan 3 subjek di mana suntikan retrobeads terlepas BLA. Dalam kajian optogenetik Te2, lebih daripada 30 haiwan, kami mengecualikan 1 tikus kerana penempatan gentian optik tidak melebihi kawasan sasaran, 1 tikus. Lagipun, virus itu tiada dalam Te2, dan 2 ekor tikus kerana penyebaran virus masing-masing kurang daripada 4.7% dan 5.3% daripada kawasan Te2 di tapak suntikan. Dalam tikus yang termasuk dalam analisis statistik, penyebaran virus yang minimum ialah 39.6% pada koordinat stereotaxic yang lebih anterior dan 50.2% pada koordinat stereotaxic yang lebih posterior.

Begitu juga, dalam eksperimen optogenetik ACC, lebih daripada 32 haiwan, 2 tikus telah dihapuskan kerana penempatan gentian optik tidak melebihi kawasan sasaran. Dua ekor tikus dikecualikan kerana virus dalam ACC tiada, 1 haiwan kerana virus itu masuk ke dalam korteks motor sekunder bersebelahan, dan 1 tikus kerana penyebaran virus kurang daripada 2.3% daripada kawasan ACC di tapak suntikan. Dalam tikus yang tinggal, penyebaran virus yang minimum ialah 33.3% pada koordinat stereotaksik yang lebih anterior dan 42.2% pada koordinat yang lebih posterior.

Dalam kajian lesi NMDA, lesi kebanyakannya menyasarkan kawasan CA1 hippocampus dorsal. Sambungan minimum (merah) dan maksimum (merah jambu) lesi hippocampal di seluruh kawasan hippocampus dorsal masing-masing adalah 23.2% dan 53.5% pada koordinat stereotaxic yang lebih anterior dan 28.3% dan 62.3% pada koordinat yang lebih posterior. Lebih daripada 73 haiwan, 4 ekor tikus telah disingkirkan kerana lesi tidak hadir, manakala 3 haiwan tambahan telah dibuang kerana lanjutan lesi kurang daripada 5.0% (iaitu 4.8%, 4.3%, 3.1 %) mengenai kawasan hippocampal pada 2 koordinat.

Analisis kontur kawasan dilakukan melalui pemeriksaan visual dan kuantifikasi manual menggunakan alat kontur wilayah bagi perisian ZEN 3.0. Nilai kawasan kemudiannya dinormalisasi pada jumlah kawasan di rantau ini. Koordinat stereotaksik Te2, ACC, dan hippocampus adalah berdasarkan atlas Paxinos [26] dan, dalam kes Te2, dengan medan kortikal diadili ke atlas Zilles [25].

Analisis statistik

Semua data dibentangkan sebagai min ± SEM. Semua data lulus ujian Levene untuk kesamaan varians. Oleh itu, statistik parametrik telah digunakan sepanjang semua eksperimen. Data daripada 2 kumpulan telah dibandingkan menggunakan 2-ujian t Pelajar tidak berpasangan berekor. Perbandingan berbilang kumpulan dinilai menggunakan 1-ujian ANOVA cara dengan ujian post hoc Tukey. Untuk menangani perbezaan antara dan dalam kumpulan, kami mengira model ANOVA reka bentuk campuran 3 × 2 dengan kumpulan (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) sebagai antara- pembolehubah dan keadaan subjek (sebelum dan selepas pelaziman +suntikan baru-baru ini) sebagai pembolehubah dalam-subjek. Di mana interaksi keadaan kumpulan × adalah penting, kami melakukan analisis kesan utama yang mudah dan kami melaraskan setiap nilai p dengan pembetulan Bonferroni. Untuk setiap model ANOVA campuran, kami menilai andaian Sphericity melalui Ujian Sphericity Mauchly.

Parameter statistik (iaitu, nilai tepat n untuk setiap kumpulan, SEM, ujian statistik, saiz kesan dan nilai p yang tepat) dilaporkan dalam legenda. Untuk saiz sampel yang sama, saiz kesan untuk ujian-t tidak berpasangan ditentukan dengan mengira Cohen's d atau Glass's d mengikut persamaan SD manakala, untuk saiz sampel yang berbeza, Hedges'g. Korelasi antara kiraan sel dan pembekuan dikira menggunakan pekali Pearson. Untuk menentukan sama ada data memenuhi andaian pendekatan statistik, kami menolak hipotesis nol pada tahap P < 0.05. Semua analisis statistik dilakukan menggunakan SPSS Statistics 22 (IBM).

Maklumat sokongan

S1 Rajah. Pembesaran jejak jarum Te2 (A) dan korteks ACC (B) yang disuntik dengan CNQX, dipilih sebagai contoh. (C) Apabila diwakili dengan konteks yang sama 2 minggu selepas prosedur, haiwan kejutan sahaja menunjukkan tindak balas ketakutan yang rendah, menunjukkan bahawa prosedur itu tidak menimbulkan pembekuan terkondisi dalam konteks di mana kejutan dihantar. (D) Keputusan yang sama seperti dalam Rajah 1 diperoleh dengan mengimbangi 2 nada yang digunakan sebagai CS (CS1, 3 kHz dan CS2, 15 kHz) (Ujian t pelajar, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, Glass's d=4.14). (E) Dalam tikus terkondisi bau-CS yang membekukan bau, 2 minggu selepas penyaman, adalah tinggi walaupun diuji dalam persekitaran yang berbeza berkaitan konteks pelaziman, dengan itu menunjukkan bahawa ketakutan dikaitkan secara khusus dengan penghantaran isyarat ini. Bar skala, 300 μm. ��P < 0.01. Semua data adalah min dan SEM. Data ringkasan untuk S1 Fig boleh didapati dalam maklumat sokongan dalam fail bernama S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S2 Rajah. Suntikan CNQX menjejaskan pengekalan ingatan ketakutan pendengaran baru-baru ini pada tikus di mana generalisasi ketakutan diturunkan dengan pra-pendedahan nada sahaja atau dengan menggunakan nada hingar putih sebagai CS1. ANOVA reka bentuk campuran 3 × 2 (kesan utama kumpulan: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0. 236, kesan utama keadaan: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, kumpulan × interaksi keadaan F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) menunjukkan bahawa pembekuan kepada nada 3 kHz sebelum kaitannya dengan AS adalah lebih rendah dalam haiwan yang menerima pra-pendedahan nada 15 kHz sebelum gandingan 15 kHz-AS (n=10, p=0.001) atau dalam tikus yang dikondisikan kepada bunyi putih (n=13 , p=0.008) berbanding CS1-haiwan CS2 (n=22) yang menunjukkan tindak balas generalisasi ketakutan berubah-ubah. Walau bagaimanapun, selepas pembelajaran CS-US dan suntikan cnqx dalam korteks Te2, ingatan ketakutan baru-baru ini telah terjejas dalam semua kumpulan (p> 0.05). Kesan utama mudah dalam kumpulan (sebelum dan selepas pembelajaran CS-US diikuti dengan suntikan cnqx): CS1-CS2, p=0.025; Nada-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P < 0.05, �P < 0.01. Semua data adalah min dan SEM. Data ringkasan untuk S2 Fig boleh didapati dalam Maklumat sokongan dalam fail bernama Data Rajah Sokongan S1. (TIF)

S3 Rajah (A) Contoh rawak suntikan retrobeads yang menyasarkan BLA. (B dan C) Contoh peletakan gentian optik di atas BLA haiwan yang disuntik dengan vektor AAV dalam Te2 (B) dan korteks ACC (C). Bar skala, 500 μm.

Ucapan terima kasih

Kami berterima kasih kepada Dr. E. Manassero atas sokongan dan nasihat berterusan mereka.

Sumbangan Pengarang

Pengkonsepan: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Penyusunan data: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Analisis formal: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Pemerolehan pembiayaan: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Siasatan: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Metodologi: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Penyeliaan: Benedetto Sacchetti.

Pengesahan: Benedetto Sacchetti.

Penulisan – draf asal: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Penulisan – ulasan & penyuntingan: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Rujukan
1. Frankland PW, Bontempi B. Organisasi kenangan baru-baru ini dan jauh. Nat Rev Neurosci. 2005; 6:119–130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. Neurobiologi penyatuan, atau, sejauh manakah engram itu stabil? Annu Rev Psychol. 2004; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Squire LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Penyatuan ingatan. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Alvarez P, Squire LR. Penyatuan memori dan lobus temporal medial: model rangkaian mudah. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91:7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Mengapa terdapat sistem pembelajaran pelengkap dalam hippocampus dan neokorteks: pandangan daripada kejayaan dan kegagalan model pembelajaran dan ingatan sambungan. Psychol Rev. 1995; 102:419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com