Penyediaan Dan Penggunaan Cistanche Glycoside Dengan Kaedah Hidrolisis Enzimatik

Abstrak: Meneroka penyediaan Cistanche glycoside oleh hidrolisis enzimatik dan penyelidikan aplikasinya. Menggunakan kadar pengekstrakan glikosida Cistanche sebagai penunjuk penilaian, kaedah hidrolisis enzimatik digunakan untuk mengekstrak glikosida Cistanche, dan ia ditentukan menggunakan kromatografi cecair berprestasi tinggi (HPLC). Dengan membina tikus model penuaan, glikosida Cistanche deserticola yang disediakan oleh hidrolisis enzimatik digunakan pada tikus model penuaan, dan kebolehan pembelajaran dan ingatan tikus model penuaan diperhatikan, serta pengesanan tahap pengoksidaan tisu otak. Keputusan menunjukkan bahawa keadaan optimum untuk eksperimen ortogonal hidrolisis enzimatik ialah: apabila nisbah bahan kepada cecair adalah 1:10, masa pengekstrakan adalah 3 kali, suhu pengekstrakan ialah 80 darjah, dan masa pengekstrakan ialah 1 minit, kadar pengekstrakan Cistanche deserticola glycosides adalah yang tertinggi. Berbanding dengan kumpulan kawalan, kesan Cistanche glycoside pada tikus model penuaan dengan ketara meningkatkan keupayaan pembelajaran dan ingatan mereka (P<0.05); After treatment with cistanche glycoside, the content of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in brain tissue of aging model mice increased significantly (P<0.05), while the content of malondialdehyde (MDA) decreased significantly (P<0.05). In this study, the preparation method of Cistanche glycosides was optimized and the anti-aging ability of Cistanche glycosides was tested. This study laid a theoretical and practical foundation for the further development and clinical application of Cistanche glycosides in the future.  

Phenylethanol glycoside adalah komponen aktif utama Cistanche deserticola

Kata kunci: kaedah hidrolisis enzimatik; Glikosida cistanche; Tikus model penuaan; Antioksida; penyelidikan aplikasi

1 Bahagian eksperimen

1.1 Bahan utama, reagen dan instrumen

Tikus ICR jantan yang sihat, Beijing Huizhi Heyuan Biotechnology Co., Ltd; Cistanche glycoside, Anyang Yishoutang Pharmaceutical Chain Co., Ltd; Piawaian Cistanche glikosida (ketulenan Lebih daripada atau sama dengan 99.0 peratus ), Wuhan Huashun Biotechnology Co., Ltd; Inner Mongolia Beiqi, Shanxi Beiqi, Inner Mongolia Cistanche glycoside gred khas, Inner Mongolia Cistanche glycoside kelas pertama, Inner Mongolia Cistanche glycoside kelas kedua, Shanxi Heipi Qi AA gred, Shanxi Heipi Qi A gred, Gansu Cistanche glycoside, semuanya dibeli dari farmasi tempatan; Metanol, etanol, alkohol analisis, Nanjing Datang Chemical Co., Ltd; Kit SOD, MDA dan CAT, Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd.

DFY400 Mengayun Pengisar Perubatan Tradisional Cina Berkelajuan Tinggi, Zhejiang Wenling Dade Perubatan Cina Tradisional Machinery Co., Ltd; Pam vakum air edaran SHZ-D, Gongyi Yuhua Instrument Co., Ltd; 101-1Ketuhar pengeringan inframerah Y, Kilang Alat Makmal Hangzhou Lantian; U2001 Ultraviolet-Visible Spectrophotometer, Hitachi, Jepun; Aglient 1100 LC Kromatografi Cecair Berprestasi Tinggi, Agilent Technologies, Amerika Syarikat; 6511 pembancuh elektrik, Kilang Model Spesimen Shanghai; PHS-3C Acidity Meter, Shanghai Ridao Scientific Instrument Co., Ltd; DF{10}} mesin pengering beku, Baokun Vacuum Technology Co., Ltd.

Serbuk ekstrak cistanche

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche

【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

1.2 Kaedah eksperimen

1. 2. 1. Rawatan dan Pengekstrakan Sampel Glikosida Cistanche

Dengan menggunakan kadar pengekstrakan glikosida Cistanche sebagai indeks penilaian, reka bentuk eksperimen ortogon L9 (34) digunakan untuk penyiasatan. Reka bentuk skema khusus ditunjukkan dalam Jadual 1.

Tab. 1 Jadual aras faktor

Timbang dengan tepat 100.0 g sampel Cistanche glikosida, keringkan dalam ketuhar pengering, hancurkan, lalui penapis 60 mesh dan ekstrak Cistanche glycoside daripada hidrolisis enzim diri Scutellaria baicalensis mengikut skema reka bentuk eksperimen ortogon dalam Jadual 1 [13,14].

1. 2. 2. Penentuan kandungan glikosida Cistanche

Gunakan spektrofotometer boleh dilihat UV untuk menentukan kandungan glikosida Cistanche. Sukat dengan tepat 0.5 mL ekstrak Cistanche glikosida dan campurkan dengan 4.5 mL air ultratulen. Tambah 0.5 mL larutan natrium nitrit 5 peratus dan biarkan selama 5 minit. Kemudian, tambah 0.5 mL 10 peratus larutan aluminium nitrat. Campurkan perlahan-lahan dan biarkan selama 6 minit. Kemudian, tambah 4 mL larutan natrium hidroksida 1.0 mol/L. Campurkan perlahan-lahan dan biarkan selama 15 minit. Ukur pada panjang gelombang 510 nm antara ultraungu dan cahaya nampak.

Percubaan Cistanche deserticola

1. 2. 3 Analisis HPLC

Menggunakan lajur Kromasil C18 (250 mm × 4.6 mm,5 μ m) Suhu bilik, isipadu suntikan 20 μ L. Kadar alir 1 mL/min, air fasa A, asetonitril fasa B. Prosedur elusi: 0-5 minit, 5 peratus fasa B, 95 peratus fasa A; 5-8 minit, 5 peratus -8 peratus fasa B, 95 peratus -92 peratus fasa A; 8-15 minit, 20 peratus fasa B, 80 peratus fasa A; 15~18 minit, 20 peratus ~30 peratus fasa B, 80 peratus ~70 peratus fasa A; 18-35 minit, 30 peratus -45 peratus fasa B, 70 peratus -55 peratus fasa A; 35~38 minit, 45 peratus ~80 peratus fasa B, 55 peratus ~20 peratus fasa A. Panjang gelombang pengesanan ialah 254 nm.

1. 2. 4 Pengumpulan dan pentadbiran haiwan

72 tikus ICR lelaki yang sihat telah dipilih dan dibahagikan secara rawak kepada 4 kumpulan, dengan 18 tikus dalam setiap kumpulan: kumpulan kawalan (kumpulan Con), kumpulan model (kumpulan Mod), kumpulan kawalan positif (kumpulan PC), dan kumpulan glikosida cistanche (kumpulan HQ). ). Tikus kumpulan kawalan menerima pentadbiran oral air suling berganda dan suntikan subkutaneus salin isotonik; Tikus dalam kumpulan model diberi secara lisan dengan air suling berganda dan disuntik secara hipodermik dengan 400 mg/kg D-neneneba galaktosa; Dalam kumpulan kawalan positif, 800 mg/kg piracetam diberikan secara lisan dan 400 mg/kg D-neneneba galaktosa disuntik secara subkutan; Tikus dalam kumpulan glikosida cistanche diberi 400 mg/kg astragaloside (dos ditentukan dalam eksperimen awal; Shanxi Beiqi) secara lisan, dan 400 mg/kg D-neneneba galaktosa disuntik secara subkutan. Semua tikus eksperimen diberikan secara lisan dan subkutan selama 10 minggu berturut-turut. Timbang setiap tetikus setiap minggu dan pantau dengan teliti keadaan fizikal setiap kumpulan tikus. Pada minggu ke-9, selepas pentadbiran oral dan suntikan subkutan selama 30 minit, setiap kumpulan tikus telah menjalani ujian lompat platform dan mengelakkan kegelapan. Pada minggu ke-10, ujian maze air Morris dilakukan ke atas setiap kumpulan tikus. Pada minggu ke-11, tisu otak setiap kumpulan tikus telah diambil untuk menentukan kandungan superoxide dismutase (SOD), katalase (CAT), dan malondialdehyde (MDA) dalam tisu otak.

1. 2. 5 Pengukuran Keupayaan Pembelajaran dan Ingatan dalam Penuaan Tikus

1) Eksperimen mengelak

Sebelum eksperimen, tikus diletakkan di atas instrumen dan disesuaikan selama 3 minit. Selepas menyesuaikan diri sepenuhnya dengan instrumen dan persekitaran gelap, tikus diletakkan semula ke dalam sangkar pembiakan. Seterusnya, tikus tersebut terkena renjatan elektrik berterusan semasa berdiri di atas lantai. Selepas kejutan berlaku, tikus secara naluri melarikan diri dari lantai ke platform, dan keseluruhan proses latihan berlangsung selama 5 minit. Selepas percubaan selesai, jumlah bilangan kali tikus menerima renjatan elektrik telah dikira, iaitu bilangan ralat mengelakkan gelap.

cistanche hidup padang pasir

2) Percubaan platform melompat

Peranti eksperimen platform melompat ialah 45 cm × 35 cm × Kotak kaca organik 25 cm dengan sekatan di dalam, dan pad getah dengan diameter 9.5 cm dan ketinggian 4.5 cm diletakkan di sebelah kiri kiri dan kanan. grid. Bahagian bawah kotak ditutup dengan grid tembaga sebagai elektrod rangsangan. Apabila terkena rangsangan kejutan elektrik, tetikus akan melarikan diri ke platform yang selamat dan kemudian melompat dari platform. Apabila kaki tetikus bersentuhan dengan grid elektrik dan menerima kejutan elektrik, ia adalah tindak balas ralat. Catatkan bilangan ralat dan kependaman tetikus dalam masa 3 minit. Selepas 24 jam, ujian sekali lagi mengukur kebolehan pembelajaran dan ingatan tikus berdasarkan bilangan ralat dan kependaman.

3) Percubaan labirin air

Sebelum eksperimen, tikus diletakkan di dalam alat maze air dan dibenarkan berenang bebas selama 2 minit untuk menyesuaikan diri dengan persekitaran.

Percubaan navigasi penentududukan [15]: Catatkan masa apabila tetikus menemui platform.

Eksperimen penerokaan angkasa lepas [16]: rekod masa tikus melintasi platform.

1. 2. 6 Penentuan kandungan antioksidan dalam tisu otak 6 tikus penuaan

Selepas mengasingkan tisu otak tikus mengikut kaedah konvensional, kandungan SOD, MDA, dan CAT dalam tisu otak setiap kumpulan tikus diukur mengikut langkah operasi kit SOD, MDA, dan CAT.

1.3 Statistik dan Analisis Data

Dalam kajian ini, semua data dianalisis secara statistik menggunakan hamparan Excel dan perisian SPSS19.0 dan perbezaan antara kumpulan telah dinilai menggunakan ujian-t berpasangan. Apabila P<0.05, it indicates statistical significance; When P<0.01, it indicates significant statistical significance.

2 Keputusan dan Perbincangan

2.1 Eksperimen ortogon

Jadual 2 menunjukkan keputusan eksperimen ortogon bagi glikosida Cistanche. Dari Jadual 2 dapat dilihat bahawa proses pengekstrakan yang optimum ialah A3B1C2D3, dengan suhu pengekstrakan 80 darjah, masa pengekstrakan 1 minit, nisbah pepejal-cecair 1:10, dan tiga kali pengekstrakan. Kadar pengekstrakan tertinggi bagi Cistanche glycosides dicapai.

Tab. 2 Eksperimen ortogonal Cistanche glycoside

2.2 Penentuan kandungan glikosida Cistanche

Spektrofotometri boleh dilihat UV digunakan untuk mengesan ekstrak 8 sampel glikosida cistanche. Keputusan ditunjukkan dalam Rajah 1, dan terdapat perbezaan yang ketara dalam kandungan glikosida cistanche di antara kawasan atau varieti yang berbeza. Antaranya, Shanxi Beiqi mempunyai kandungan glikosida cistanche yang paling tinggi, manakala Shanxi Heipi Qi mempunyai kandungan glikosida cistanche gred AA yang paling rendah.

Rajah 1 Penentuan pelbagai jenis Cistanche glycoside

2.3 Pengesanan HPLC glikosida Cistanche

Mengikut keadaan kromatografi yang ditentukan dalam Bahagian 1.2.3, gambar rajah HPLC bagi glikosida Cistanche ditunjukkan dalam Rajah 2. Masa pengekalan glikosida Cistanche ialah 10.64 minit, dan kepekatan jisim ialah 1.{{ 7}}.0 μ G/mL, dengan kelinearan yang baik dan nilai R 0.999 8.

Rajah 2 rajah HPLC bagi Cistanche glycoside

2.4 Ketepatan dan kestabilan

Ambil kumpulan yang sama larutan ujian Cistanche glikosida dan suntikan 6 kali berturut-turut untuk menentukan kawasan puncak glikosida Cistanche. Keputusan menunjukkan bahawa RSD kejituan glikosida Cistanche adalah kurang daripada 2.5 peratus (n=6), menunjukkan ketepatan glikosida Cistanche yang baik.

Ambil kumpulan yang sama larutan ujian Cistanche glikosida dan ukur kawasan puncak glikosida Cistanche pada {{0}}, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, dan 24 jam masing-masing. Keputusan menunjukkan bahawa RSD kestabilan glikosida Cistanche adalah kurang daripada 2.0 peratus (n=6), menunjukkan bahawa glikosida Cistanche mempunyai kestabilan yang baik dalam masa 24 jam.

2. 5 Kesan Cistanche glycoside pada berat badan tikus model penuaan

Rujukan [17-19] mendapati bahawa dos glikosida Cistanche yang digunakan dalam kajian ini tidak menghasilkan ketoksikan sistemik pada tikus. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3, berat semua kumpulan tikus meningkat sebelum minggu ke-6. Berbanding dengan kumpulan kawalan, berat tikus kumpulan model menurun dengan ketara dalam tempoh yang sama (P<0.01), while the weight of the positive control group and astragalus group mice slightly decreased. After the 6th week, the weight of the control group mice continued to increase, while the weight of the model group mice no longer increased. The positive control group and the Cistanche glycoside group slightly increased.

Rajah 3 Kesan Cistanche glycoside pada berat badan tikus model penuaan

2.6 Keputusan Eksperimen Tingkah Laku

2. 6. Pemerhatian Kesan Cistanche Cistanche Glycoside terhadap Penuaan Model Tikus melalui Eksperimen Pengelakan Kegelapan

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4A, tempoh latensi tikus dalam setiap kumpulan dipanjangkan pada hari kedua berbanding hari pertama. Berbanding dengan kumpulan kawalan, masa latensi tikus kumpulan model telah dikurangkan dengan ketara (P<0.05); Compared with the model group, the latency time of mice in the positive control group and the Cistanche glycoside group was significantly increased (P<0.05). As shown in Figure 4B, the number of errors in each group of mice decreased on the second day compared to the first day. Compared with the control group, the number of errors in the model group mice significantly increased (P<0.05); Compared with the model group, the positive control group and the Cistanche glycoside group significantly reduced the number of errors in mice (P<0.05).

2. 6. Pemerhatian Kesan Cistanche Cistanche Glycoside terhadap Penuaan Model Tikus melalui Eksperimen Platform Dua Langkah

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5, masa latensi platform melompat dalam setiap kumpulan tikus dilanjutkan pada hari kedua berbanding hari pertama. Berbanding dengan kumpulan kawalan, masa peringkat melompat tikus kumpulan model telah dikurangkan dengan ketara (P<0.05); Compared with the model group, the latency time of the jumping platform in the positive control group and the Cistanche glycoside group of mice was significantly increased (P<0.05). As shown in Figure 4B, the number of errors in each group of mice decreased on the second day compared to the first day. Compared with the control group, the number of errors in the model group mice significantly increased (P<0.05); Compared with the model group, the positive control group and the Cistanche glycoside group significantly reduced the number of errors in mice (P<0.05).

Berbanding dengan kumpulan kawalan, P<0.05; Compared with the control group, P<0.01; Compared with the model group, the '#' is P<0.05; Compared with the model group, P<0.01, the same below

Rajah 4 Eksperimen pengelakan gelap untuk memerhati kesan glikosida Cistanche pada tikus model penuaan. Masa kependaman （A）; Bilangan ralat （B）

Rajah 5 Kesan Cistanche glycoside pada tikus model penuaan yang diperhatikan oleh eksperimen lompat platform. Masa kependaman （A）; Bilangan ralat

2. 6. 3 Eksperimen maze air Morris untuk memerhati kesan glikosida Cistanche ke atas tikus model penuaan

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6, apabila bilangan hari latihan bertambah, masa untuk setiap kumpulan tikus mencari platform secara beransur-ansur berkurangan. Berbanding dengan kumpulan kawalan, masa untuk tikus kumpulan model mencari platform meningkat dengan ketara (P<0.05), while the time for the positive control group and the Cistanche glycoside group mice to find the platform slightly increased.

Berbanding dengan kumpulan kawalan, P<0.05

Rajah 6 Kesan Cistanche glycoside pada tikus model penuaan yang diperhatikan dengan eksperimen navigasi kedudukan

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 7, apabila bilangan hari latihan meningkat, bilangan kali setiap kumpulan tikus melintasi platform secara beransur-ansur meningkat. Berbanding dengan kumpulan kawalan, bilangan kali tikus kumpulan model melintasi platform menurun dengan ketara (P<0.05), while the number of times the positive control group and the Cistanche glycoside group mice crossed the platform slightly decreased.

Rajah 7 Kesan Cistanche glycoside pada tikus model penuaan yang diperhatikan oleh eksperimen penerokaan angkasa lepas

2. 7 Kesan Cistanche Glycosides pada tahap antioksidan dalam tisu otak tikus model yang semakin tua

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 8, berbanding dengan kumpulan kawalan, aktiviti enzim SOD dan CAT dalam tisu otak tikus kumpulan model telah dikurangkan dengan ketara (P<0.05). The SOD and CAT enzyme activities in the brain tissue of the positive control group and the Cistanche glycoside group mice were slightly increased, while the MDA content in the brain tissue of the model group mice was significantly increased (P<0.05). The MDA content in the brain tissue of the positive control group and the Cistanche glycoside group mice was slightly reduced.

cistanche herba cina

3 Kesimpulan

Kajian ini menggunakan kadar pengekstrakan Cistanche glycoside sebagai penunjuk penilaian dan ekstrak Cistanche glycoside menggunakan kaedah hidrolisis enzimatik. Kandungan Cistanche glycoside ditentukan oleh HPLC. Kesimpulan berikut telah dibuat:

1) Apabila nisbah bahan kepada cecair ialah 1:1{{10}}, kekerapan pengekstrakan ialah 3 kali, suhu pengekstrakan ialah 80 darjah dan reagen pengekstrakan ialah 1 minit , kadar pengekstrakan Cistanche glycosides adalah yang tertinggi. Kandungan glikosida cistanche dalam 8 jenis berbeza ditentukan menggunakan spektrofotometer boleh dilihat UV. Keputusan menunjukkan perbezaan yang ketara dalam kandungan cistanche glycoside di antara kawasan atau varieti yang berbeza. Antaranya, Shanxi Beiqi mempunyai kandungan glikosida cistanche tertinggi, manakala Shanxi Heipi Qi mempunyai kandungan glikosida cistanche yang paling rendah dalam gred AA. Untuk mewujudkan lagi sistem pengasingan dan penulenan untuk Cistanche glycoside, cap jari Cistanche glycoside telah ditubuhkan oleh HPLC. Keputusan menunjukkan bahawa masa pengekalan glikosida Cistanche ialah 10.64 minit, kepekatan jisim ialah 1.0~40.0 μ G/mL, dengan kelinearan yang baik dan nilai R 0.999 8, dan kaedah HPLC mempunyai kestabilan yang baik dan ketepatan.

2) Kesan Cistanche deserticola glycoside yang disediakan oleh hidrolisis enzimatik pada tikus model penuaan, memerhati kebolehan pembelajaran dan ingatan tikus model umur dan mengesan tahap pengoksidaan tisu otak. Keputusan menunjukkan bahawa berbanding dengan kumpulan kawalan, Cistanche glycosides secara signifikan meningkatkan kebolehan pembelajaran dan ingatan tikus model umur selepas rawatan (P<0.05); Compared with the control group, the activity of SOD and CAT enzymes in the brain tissue of aging model mice significantly increased (P<0.05) after treatment with Cistanche glycosides, while the content of MDA significantly decreased (P<0.05).

rujukan:

［1 ］ Wang Xiaoju. Pengekstrakan, pengasingan dan kajian aktiviti komponen aktif Cistanche glycoside ［D］. Xi'an: Universiti Shanxi, 2005.

［ 2 ］ Wang Guangzhong, Hu Di, Chen Jingbing. Reka bentuk ortogon untuk mengoptimumkan proses pengekstrakan jumlah flavonoid dan jumlah saponin Cistanche glycoside ［J］. Perubatan Paten Cina, 2004, 26（10）: 3-4.

［ 3 ］ Liu Jinhua, Chen Jingran, You Guangfu. Kemajuan dalam penyelidikan farmakologi mengenai perlindungan miokardium Astragalus ［J］. Perubatan Paten Cina, 2002, 24（8）: 623-626.

［ 4 ］ Guo Wei. Gambaran keseluruhan penyelidikan farmakologi dan klinikal perubatan tradisional CinaCistanche glycoside ［J］. Perubatan Tradisional Cina Shanxi, 2011, 27（11）: 52-54.

［ 5 ］ Lu Yanqi, He Xueli. Kajian semula juzuk kimia dan kesan farmakologi Cistanche glycoside ［J］. Jurnal Maktab Perguruan Baoding, 2004, 17（4）: 40-42.

［ 6 ］ Li Qin, Liu Hong. Kesan farmakologi dan aplikasi klinikal Cistanche glycoside ［J］. Perubatan Cina Perubatan Tradisional Cina, 2004, 10（10）: 633-635.

［7 ］ Jin Jizi. Kemajuan penyelidikan mengenai kesan farmakologi dan aplikasi klinikal Cistanche glycoside ［J］. Perubatan Cina Perubatan Tradisional Cina, 2008, 17（20）: 134-135. ［ 8 ］ Chen Jianzhen, Lv Guiyuan, Ye Lei. Kemajuan penyelidikan mengenai juzuk kimia dan kesan farmakologi flavonoid Cistanche glikosida ［J］. Medical Herald, 2009, 28（10）: 1314-1316.

［ 9 ］ Liang Liansheng, Yu Jing. Kesan farmakologi flavonoid dalam Cistanche glycoside ［J］. Journal of Integrative Chinese and Western Medicine Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases, 2005, 3（12）: 1085-1087.

［10］ Zhang Dongqing, Wang Deqing. Kemajuan penyelidikan mengenai aktiviti biologi jumlah flavonoid Cistanche glycoside ［J］. Jurnal Penting China, 2010, 35（2）: 253-256.

［11］ Li Y, Guo S, Zhu Y, Yan H, et al. Bunga Cistanche glycoside membranaceus var. mongholicus sebagai produk keluaran berpotensi tinggi baru: pencirian fitokimia dan aktiviti antioksidan ［J］. Molekul, 2019, 24（3）: 434.

［12］ Butkutė B, Dagilytė A, Benetis R, et al. Profil mineral dan fitokimia dan aktiviti antioksidan bahan herba daripada dua spesies glikosida Cistanche sederhana ［J］. Berbiomed. Res. Int., 2018.

［13］ Sharifi-Rad M, Pohl P, Epifano F, et al. Sintesis hijau nanopartikel perak menggunakan Cistanche glycoside tribuloides delile. Ekstrak akar: pencirian, antioksidan, aktiviti antibakteria dan anti-Radang ［J］. Bahan Nano （Basel）, 2020, 10（12）: 2383.

［14］ Wang D, Zhuang Y, Tian Y, et al. Kajian tentang kesan jumlah flavonoid daripada Cistanche glycoside pada pembentukan aterosklerosis dan mekanisme potensi ［J］. Oksida. Med. sel. Longev., 2012.