Bahagian1: Pendekatan Novel Untuk Meningkatkan Potensi Penjanaan Semula Sel-sel Progenitor Endothelial yang Beredar dalam Pesakit Dengan Penyakit Buah Pinggang Peringkat Akhir

Untuk maklumat lanjut. kenalantina.xiang@wecistanche.com

Abstrak: Sel-sel progenitor endothelial (EPC) yang berasal dari sumsum tulang yang beredar memudahkan pembaikan vaskular dalam beberapa organ termasuk buah pinggang tetapi semakin berkurangan pada peringkat akhir.penyakit buah pinggang(ESKD), yang berkorelasi dengan hasil kardiovaskular dan kematian yang berkaitan. Oleh itu, kami menentukan sama ada meningkatkan kesan pembaikan tisu sel stromal mesenchymal (BM-MSC) yang berasal dari sumsum tulang manusia dengan kesan vaskulogenik relaxin manusia rekombinan (RLX) boleh menggalakkan percambahan dan fungsi EPC. CD34 plus EPC diasingkan daripada darah pesakit yang sihat dan ESKD, dibiakkan sehingga EPC lewat terbentuk, kemudian dirangsang dengan media keadaan terbitan BM-MSC(CM;25 peratus o), RLX(1 atau 10ng/mL), atau kedua-duanya rawatan digabungkan. Walaupun RLX sahaja merangsang percambahan EPC, pembentukan tiub kapilari dan penyembuhan luka secara in vitro, langkah-langkah ini lebih pantas dan dipertingkatkan dengan ketara oleh kesan gabungan CM dan RLX terbitan BM-MSC dalam EPC yang diperoleh daripada pesakit sihat dan ESKD. Penemuan ini mempunyai implikasi klinikal yang penting, setelah mengenal pasti terapi kombinasi baru yang boleh memulihkan dan meningkatkan nombor dan fungsi EPC dalam pesakit ESKD.

Kata kunci: sel progenitor endothelial; penyakit buah pinggang peringkat akhir; sel stem mesenchymal yang berasal dari sumsum tulang; relaxin; penyembuhan luka; angiogenesis; penjanaan semula

Klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut tentang cistanche untuk dijual

1. Pengenalan

Penyakit buah pinggang yang kronik(CKD) ialah masalah kesihatan global, ditakrifkan sebagai pengurangan kadar penapisan glomerular （GFR） Kurang daripada atau sama dengan 60mL/min/1.73m², yang sering membawa kepada penyakit buah pinggang (ESKD) peringkat akhir (tahap V); ditakrifkan sebagai GFR Kurang daripada atau sama dengan 15 mL/min/1.73m2)[2]. Ciri-ciri patologi CKD termasuk atrofi tiub yang dikaitkan dengan pengurangan kapilari buah pinggang dan podosit, pemusnahan sel endothelial buah pinggang, dan perkembanganfibrosis buah pinggang[3,4]. Endothelium buah pinggang terjejas semasa proses ini, yang membawa kepada gangguan angiogenesis dan fungsi buah pinggang [5]. Mengikutikerosakan buah pinggang, sel progenitor endothelial yang berasal dari sumsum tulang (EPC) direkrut ke tapak kecederaan untuk memudahkan pembaikan tisu [6]. EPC memainkan peranan penting dalam pematangan dan percambahan sel endothelial buah pinggang, integriti vaskular, dan pembaikan endothelium yang rosak. Walau bagaimanapun, nombor EPC yang beredar dikurangkan secara beransur-ansur dalam pesakit ESKD [7-9], yang berkorelasi dengan hasil kardiovaskular yang buruk [9,10] dan kematian jangka panjang.

Sel stromal mesenchymal (MSCs) telah dilaporkan menggalakkan angiogenesis dengan merangsang pengaturcaraan EPC. Walau bagaimanapun, sementara MSC telah dinilai dalam pelbagai ujian klinikal [13], keupayaan mereka untuk memudahkan penjanaan semula endothelial buah pinggang belum disiasat. Kajian terbaru dari makmal kami telah mengenal pasti potensi terapeutik yang dipertingkatkan untuk menggabungkan MSC yang diperolehi sumsum tulang(BM) manusia dengan agen anti-fibrotik, iaitu relaxin manusia (gen-2) rekombinan (serelaxin; RLX[14) dalam memulihkan kerosakan buah pinggang,keradangandan fibrosis dalam model penyakit praklinikal. Walaupun RLX sahaja boleh merangsang percambahan EPC yang berasal dari darah manusia dan pengeluaran nitrik oksida (NO) secara in vitro, dan vasculogenesis pada tikus dalam vivo[18], ia masih tidak diketahui jika kesan gabungannya dengan BM-MSC boleh mempercepatkan dan/atau meningkatkan EPC- angiogenesis yang diperolehi dan penyembuhan luka. Oleh itu, kajian ini menilai potensi terapeutik untuk menggabungkan media terkondisi (CM) terbitan RLX dan BM-MSC pada proliferasi EPC, angiogenesis dan penyembuhan luka yang sihat berbanding ESKD yang diperolehi pesakit secara in vitro.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Pengasingan dan Budaya EPC daripada Darah Periferi

Setelah menerima borang kebenaran pesakit yang ditandatangani, sekitar {{0}} mL darah daripada kawalan lelaki yang sihat telah dikumpulkan daripada Perkhidmatan Darah Palang Merah Australia. Sebaliknya, hanya ~5 mL maksimum darah pesakit ESKD lelaki telah diambil dari Pusat Perubatan Monash kerana keadaan kesihatan mereka. Semua sampel darah diproses dalam masa 24 jam dari masa pengumpulan. Semua sampel darah telah dicairkan dengan 1× larutan garam seimbang Hank (HBSS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kepada jumlah isipadu 20 mL. Kemudian, darah disaring dengan teliti pada 15 mL Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) ke dalam tiub Falcon 50 ml (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) dan disentrifugasi pada 400× g selama 40 minit pada suhu bilik untuk memisahkan lapisan buffy dari komponen lain dengan menggunakan kaedah pemisahan kecerunan ketumpatan seperti yang diterangkan sebelum ini [19,20]. Berikutan pemisahan kecerunan, lapisan atas yang mengandungi plasma dan platelet telah dikeluarkan dengan memasukkan pipet serologi dengan berhati-hati, meninggalkan lapisan buffy yang mengandungi sel mononuklear daripada darah periferi (PBMC) tidak terganggu, yang terdiri daripada sel progenitor endothelial (EPC). Pelet itu digantung semula dalam 2 ml Endothelial Cell Growth Media (EGM)-2 Microvascular (MV)Bullet Kit (product #CC-3162, Lonza, Hayward, CA, USA); ditambah dengan 5 peratus serum lembu janin (FBS), 0.04 peratus hidrokortison, 0.4 peratus faktor pertumbuhan fibroblas manusia (hFGF), dan 0.1 peratus faktor pertumbuhan endothelial vaskular (VEGF), R3-faktor pertumbuhan seperti insulin (IGF). )-1, asid askorbik, faktor pertumbuhan epidermis manusia(hEGF) dan gentamicin sulfate/amphotericin(GA-1000), kepada kultur EPC terpencil. Sel-sel telah dikira menggunakan Kaunter Sel Automatik CountessM (Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Syarikat) sebelum ia disemai pada plat/kelalang kultur bersalut fibronektin.

The yield of EPC varied significantly between the uncomplicated control and ESKD patients. More specifically EPC yield was significantly lower in ESKD patient samples compared to control and this observation was consistent with previous studies reported in our laboratory[19]. EPCs isolated from healthy controls were directly seeded into T-75 flasks(1-10 × 10'cells per sample), which were supplemented with 10 mL of pre-warmed endothelial growth media-2(EGM-2).In contrast, due to the low yield of EPCs from the ESKD patient samples, the cells were seeded at a density of 1 × 10°cells per well into 12 well plates, with the addition of pre-warmed EGM-2, giving a total volume of 2 mL per well. Due to the large variability in the yield of EPCs isolated from ESKD patients, cells were plated in one well of a 12-well plate if the cell yield was less than 1 ×10°cells. The media was changed every second day until outgrowth endothelial cells (OECs, also known as late EPCs) were observed. These late EPCs were identified by their cobble-stone appearance under light microscopy (Olympus CK-X41, USA). A maximum period of 30 days was allowed for late EPCs to be detected, which were further cultured until~80% confluency was reached. The cells were then passaged 1-2 times to obtain the desired number of cells for all functional assays including proliferation, tube formation, and wound-healing assays as detailed below. Cellular morphological characteristics were further assessed by the ability of the EPC cultures in both control and ESKDpatients to form a number of colonies (>50 sel/koloni) menggunakan ujian unit pembentuk koloni (CFU).

2.2. Penyediaan Conditioned Media(CM) daripada Cultured BM-MSC

Oleh kerana penambahan BM-MSC kepada budaya EPC akan menjejaskan titik akhir yang berkaitan dengan EPC untuk diukur, diputuskan bahawa adalah lebih baik untuk menganalisis kesan CM yang diperolehi BM-MSC pada fungsi EPC, seperti yang digunakan sebelum ini untuk analisis daripada titik akhir yang lain [19]. Secara ringkas, BM-MSC ditanam dalam Alpha-Minimum Essential Media(-MEM; Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia), ditambah dengan 16 peratus serum lembu janin (FBS) dan 1 peratus 200 mM L-glutamin, dan 1 peratus penisilin/streptomisin. Setelah sel mencapai ~80 peratus pertemuan, BM-MSC selanjutnya disubkultur dan disalut ke dalam 12-plat perigi pada ketumpatan ~0.5×10 darjah setiap perigi dan dikekalkan dalam kultur selama 24-48 jam untuk memastikan lampiran selular. Untuk menyediakan media terkondisi (CM) daripada BM-MSC, secara ringkas sel-sel telah dibasuh tiga kali dengan 1 mL 1 × HBSS yang telah dipanaskan terlebih dahulu. Mengikuti langkah mencuci, 500 μL serum dan media basal sel endothelial bebas faktor pertumbuhan（EBM; Produk #CC-3121.Lonza, Hayward, CA, USA) telah ditambahkan pada sel dan dikekalkan dalam kultur pada 5 peratus CO, 37 darjah selama 24 jam lagi. Pada penghujung tempoh inkubasi ini, CM kemudiannya dikumpul dan disentrifugasi pada 400×g selama 10 minit untuk mengeluarkan sebarang serpihan selular. CM dalam 500 μL aliquot disimpan pada -80 darjah sehingga penggunaan masa hadapan.

2.3. Ujian Fungsian

2.3.1. Rawatan EPC Lewat Berbudaya

Sebaik sahaja EPC yang lewat dituai, ujian berfungsi dilakukan. Semua percubaan telah dijalankan dalam petikan 3-6. Ujian fungsional dilakukan untuk menyiasat kesan (i)25 peratus media terkondisi terbitan BM-MSC(25 peratus CM)[20];(ii)1 [RLX-1] atau 10 [RLX-10 ]ng/mL [18] RLX(mewakili tahap peredaran H2 relaxin yang terdapat pada wanita hamil [21]); atau(i) kesan gabungan 25 peratus CM dan 1 atau 10 ng/mL RLX;(iv)20 peratus FBS digunakan sebagai kawalan positif ke atas potensi pembiakan dan pembentukan tiub(angiogenik) EPC lewat yang diperoleh daripada pesakit kawalan . Kumpulan rawatan dibandingkan dengan sel yang tidak dirawat.

2.3.2.Ujian Daya maju dan Proliferasi

Daya maju dan potensi proliferatif EPC lewat ditentukan dengan menggunakan {{0}}(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5- ujian diphenyl tetrazolium bromide (MTT) mengikut arahan pengilang (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Australia). Secara ringkasnya,~5×103 sel setiap telaga telah disemai dalam 96-plat perigi(BD Falcon, North Ryde, NSW, Australia), berikutan itu, sel-sel tersebut dirawat dengan CM yang diperolehi BM-MSC, RLX(10 ng/ mL), atau gabungan CM dan RLXat 1 atau 10ng/mL selama 24 jam. Pada penghujung tempoh pengeraman, 10 μL reagen pelabelan MTT telah ditambah （0.5 mg/mL, Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Australia) dan diinkubasi pada 37 darjah Cand 5 peratus CO2 selama 4 jam lagi. Sel-sel telah dilarutkan dengan penambahan 100 μL larutan Pelarutan （Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC Australia), dan potensi percambahan EPC lewat ditentukan dengan mengukur penyerapan setiap sampel pada 590 nm menggunakan plat Mikro. pembaca(Bio-strategi, Balwyn North, VIC, Australia) dan dianalisis dengan perisian SoftMax Pro untuk Windows OS (Ver. 7.3, Molecular Devices LLC, CA, USA). Setiap kumpulan rawatan telah dilakukan dan dianalisis dalam enam ulangan.

2.3.3. Ujian Pembentukan Tiub

Kesan pelbagai rawatan untuk menggalakkan potensi angiogenik EPC lewat, menggunakan ujian pembentukan tiub ditentukan menggunakan ujian μ-angiogenesis （Abidi, Fitchburg, WI, Amerika Syarikat）. Secara ringkas, 10 μL faktor pertumbuhan dikurangkan（GFR） Matrigel （Produk #356231, Corning, Tewksbury, MA, Amerika Syarikat） telah ditambah ke dalam telaga dalam μ-Slide kit ujian angiogenesis (Abidi, Fitchburg, WI, Amerika Syarikat). ). Kultur konfluen EPC akhir telah disemai pada sel bersalut dan dirawat dengan CM yang diperolehi BM-MSC, RLX(10 ng/mL), atau gabungan CM dan RLX pada 10 ng/mL. Jumlah keseluruhan 50 μL penggantungan sel yang mengandungi ~ 1 × 104 sel telah digunakan pada setiap telaga. Imej telah ditangkap serta-merta dan dilabelkan sebagai 0-titik masa jam. Keupayaan sel di bawah pelbagai rawatan untuk

tiub bentuk telah diperhatikan dan imej telah ditangkap pada 2-24 h pembenihan pasca sel menggunakan mikroskop cahaya. Bilangan tiub, panjang tiub, dan bilangan titik cawangan ditentukan dengan menggunakan perisian ImageJ.

2.3.4.Ujian Penyembuhan Luka

Kesan pelbagai rawatan terhadap potensi regeneratif EPC yang lewat telah ditentukan menggunakan ujian penyembuhan luka. Untuk melakukan ujian, ~ 1 × 10 sel telah digantung dalam media pertumbuhan 50 μL dan disemai ke dalam 2 silikon telaga dalam hidangan 35 mm untuk ujian penyembuhan luka (Abidi Inc., Fitchburg, WI, Amerika Syarikat). Luka buatan di dalam pinggan dibuat dengan mengeluarkan perigi silikon secara perlahan menggunakan penjepit steril(jarak jurang=500±100μm）. Pinggan mangkuk telah diisi semula dengan 2 mL 50 peratus EGM-2, dengan penambahan pelbagai rawatan termasuk CM yang diperolehi BM-MSC, RLX(10 ng/mL), atau gabungan CM dan RLX pada 1 atau 10ng/mL. Bilangan sel yang berhijrah untuk menutup luka dinilai dengan menggunakan mikroskop cahaya. Photomicrographs of the sel yang dipindahkan telah ditangkap pada 0-24 h selepas rawatan. Peratusan kawasan penutupan jurang ditentukan menggunakan perisian Image].

2.3.5.Analisis Imej

Semua analisis imej untuk ujian berfungsi telah dilakukan menggunakan ImageJ untuk MacOS (Ver. 1.8, Institut Kesihatan Kebangsaan, Bethesda, MD, Amerika Syarikat). Untuk potensi pembentukan tiub EPC lewat, imej dianalisis menggunakan pemalam ujian angiogenesis, dan empat parameter berbeza telah direkodkan termasuk jumlah panjang, bilangan jerat, bilangan simpang, dan bilangan cawangan. Untuk ujian penyembuhan luka, kawasan penutupan luka dianalisis dengan menandakan secara manual kawasan bebas sel pada setiap titik masa. Semua pengukuran dilakukan sekurang-kurangnya 3 kali untuk mengawal variasi.

2.3.6. Imunofluoresensi

Relaxin Family Peptide Receptor 1(RXFP1; penyetempatan protein reseptor RLX serumpun) dalam EPC lewat kultur ditentukan menggunakan pewarnaan imunofluoresensi. Pertama sekali, ~1× 1{{2{29}}}} sel darjah yang ditanam pada penutup kaca 13 mm (disalut dengan poli-D-lisin) dalam 12-plat telaga telah ditetapkan dalam 4 peratus PFA untuk 15 min pada suhu bilik. Sel tetap telah disekat untuk pengikatan protein tidak spesifik menggunakan 1 peratus Bovine serum albumin (BSA) selama 60 minit pada suhu bilik. Pada akhir tempoh inkubasi, sel-sel telah dibasuh dalam PBS selama 5 minit (3 kali) dan diinkubasi dengan antibodi RXFP1 poliklonal arnab (aa 609-624; A 9227;1:2000; Immunodiagnostic AG, Bensheim, Jerman )dalam 0.01 peratus BSA semalaman pada 4 darjah . Sel-sel telah dibasuh dengan PBS dan diinkubasi dengan antibodi sekunder Alexa-fluor 594 kambing-anti-arnab (1:500; Invitrogen, Scoresby, Victoria, Australia) dalam 0.01 peratus BSA selama 2 jam pada suhu bilik. Pewarnaan balas nuklear dilakukan dengan menambahkan 40 μL DAPI dalam medium pelekap Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) dan ditutup. Protein RXFP1 imunoreaktif telah divisualisasikan menggunakan mikroskop pendarfluor pada pembesaran × 40 (Olympus BX51) dan imej telah digabungkan menggunakan perisian ImageJ.

2.4. Analisis Statistik

Semua data ditunjukkan sebagai min ± SEM dan semua analisis statistik dilakukan menggunakan GraphPad Prism'M(Ver. 9; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Cara-ANOVA digunakan untuk membandingkan kesan pelbagai rawatan terhadap potensi percambahan (ujian MTT) dan angiogenik (ujian pembentukan tiub) EPC lewat, diikuti dengan ujian post-hoc Tukey untuk membolehkan banyak perbandingan antara kumpulan rawatan. Satu ukuran berulang-dua hala-ANOVA digunakan untuk membandingkan kesan pelbagai rawatan pada penutupan luka oleh EPC lewat dari masa ke masa, diikuti dengan ujian post-hoc Tukey untuk membandingkan setiap kumpulan rawatan. Nilai-p kurang daripada 0.05 dianggap signifikan secara statistik.