Bahagian 2 Mutasi ERCC1 Menghalang Pembaikan Kerosakan DNA Dan Menyebabkan Disfungsi Hati dan Buah Pinggang dalam Pesakit

Kenalan:ali.ma@wecistanche.com

Klik di sini untuk bahagian 1

Bahagian 2

Klik untuk Cistanche NZ untuk penyakit buah pinggang

Perbincangan

Satu kes baru bi-allelikERCC1mutasi Hanya dua individu dengan bi-allelikERCC1mutasi telah dilaporkan sehingga kini, kedua-duanya memaparkan ciri seperti CS. Individu yang paling teruk terjejas (165TOR) mempunyai varian tidak masuk akal (Q158X) dan varian missense F231L dalam motif (HhH)2 ERCC1 (Rajah S5 F), menunjukkan keterlambatan pertumbuhan, kegagalan perkembangan dan kontraktur, dan meninggal dunia selepas tahun pertama kehidupan akibat radang paru-paru (Jaspers et al., 2007). Individu kedua yang terjejas (CS20LO) mempunyai kontraktur, mikrosefali, dan hipertonia dan homozigot untuk varian missense F231L dan meninggal dunia pada tahun kedua kehidupan (Kashiyama et al., 2013).

Kami melaporkan dua beradik dengan bi-allelikERCC1mutations—a paternally inherited missense variant (p.R156W; c.466C>T) dan alel nul disebabkan oleh penghapusan intragenik yang diwarisi secara ibu. Semua baki protein ERCC1 yang dinyatakan dalam sel daripada pesakit ini membawa penggantian asid amino R156W, yang mengganggu jambatan garam antara residu R156 yang bercas positif dan residu D129 yang bercas negatif yang bertentangan terletak betul-betul di bawah poket pengikat XPA dalam domain pusatERCC1. Kesan penggantian ini adalah dua kali ganda: (1) ia sangat mengurangkan kestabilan keseluruhan ERCC1 dan rakan kongsi pengikatnya XPF, dan (2) ia secara khusus mempengaruhi antara tindakan dengan XPA (Rajah 9).

Mengurangkan tahap protein nuklear ERCC1 disebabkan oleh salah lipatan separa

Analisis Western blot dan immunofluorescence mendedahkan bahawa keseluruhanERCC1and XPF protein levels are dramatically reduced to below 20% of WT levels in the fibroblasts from both siblings. This effect is also recapitulated by the bi-allelic KI of the missense mutation (p.R156W; c.466C>T) dalam endogenERCC1lokus sel RPE1-hTERT. Menariknya, kehilangan lengkap ERCC1 pada tikus menyebabkan kematian dalam masa 4 minggu, sementara meningkatkan tahap protein kepada sekitar 15 peratus daripada tahap dalam tikus WT meningkatkan jangka hayat lima kali ganda (Weeda et al., 1997), menunjukkan bahawa tahap ERCC1 yang rendah. meningkatkan dengan ketara potensi untuk berdaya maju. Selaras dengan penemuan kami, kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa mutasi missense dalam domain pusatERCC1secara amnya menyebabkan ketidakstabilan (Sijbers et al., 1996b), menunjukkan bahawa rantau ini penting untuk kestabilan protein.

Struktur mikroskop elektron kriogenik yang dilaporkan baru-baru ini bagi panjang penuhERCC1-XPF heterodimer (Jones et al., 2020) mendedahkan bahawaERCC1R156sisa terletak di tepi paling heterodimer. Kami membuat spekulasi bahawa peningkatan bulkiness dan struktur elektronik yang diubah bagi penggantian arginin oleh tryptophan bukan sahaja mengganggu poket pengikat XPA tetapi juga antara muka dimerisasi antara domain pusat ERCC1 dan domain nuklease XPF, menyebabkan ketidakstabilan umum (Rajah 1). S5 F). Menariknya, varian missense XPFR799W terletak pada antara muka yang sama pada sebelah XPF (Rajah S5 F) dan juga mengakibatkan ketidakstabilan dan paras protein XPF berkurangan dengan teruk (Mori et al., 2018). Dalam satu individu yang terjejas (CALIF1010) yang dipersembahkan dengan ciri progeroid seperti CS dan segmental, varian XPFR799W diwarisi bersama-sama dengan penghapusan intergenik dalam alel XPF yang lain, mengakibatkan kecacatan NER yang kuat digabungkan dengan kecacatan pembaikan ICL yang ringan (Mori et al., 2018), serupa dengan adik-beradik yang dilaporkan dalam kajian ini.

Ekspresi ektopik versi yang boleh diinduksiERCC1R156Wselama 24 jam membolehkan kami mencapai tahap WT protein mutan ini, yang mengakibatkan mislokalisasi dalam sitoplasma, mengurangkan interaksi dengan XPF, dan meningkatkan interaksi dengan pendamping lipat protein, seperti yang dikesan oleh MS. Penemuan ini semua, memberikan sokongan kepada tanggapan bahawaERCC1R156Wsebahagiannya salah lipatan dan terdegradasi dalam sel pesakit, mengakibatkan -80 pengurangan tahap protein nuklear ERCC1. KI ERCC1R156W dalam sel RPE1-hTERT menyokong kesimpulan ini.

Apabila membandingkanERCC1dan tahap protein XPF dalam sel PV46LD dan PV50LD dengan sel-sel daripada individu yang lebih teruk terjejas (165TOR dan CS20LO), kami menyatakan bahawa tahap ini adalah setanding, atau mungkin lebih rendah, dalam sel daripada adik-beradik yang diterangkan dalam kajian ini (Rajah 3). C dan Rajah S3, E dan F; Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). Ambil perhatian bahawa CS20LO adalah homozigot untuk ERCC1F231L, manakala 165TOR adalah heterozigot dan membawa hentian pramatang tambahan pada yang lainERCC1alel (Q158X). Penemuan ini mencadangkan bahawa sebagai tambahan kepada tahap protein yang dikurangkan, kefungsian protein mutan yang masih dinyatakan dan gabungan dua alel bermutasi perlu diambil kira sebagai modulator berpotensi keterukan fenotip dan ekspresitiviti.

ERCC1R156W: Kesan berbeza pada ERCC1-laluan pembaikan DNA bergantung

Ungkapan ERCC1R156W-GFP dalam sel ERCC1-KO pada tahap yang serupa dengan ERCC1WT membolehkan kami merungkai kesan penggantian asid amino pada kestabilan protein daripada kesan ke atas fungsi protein. Walaupun protein ERCC1R156W mutan terjejas teruk dalam interaksi akibat UVnya dengan XPA dan ikan dan gagal menyetempat dengan cekap ke tapak lesi DNA akibat UV, kami masih mengesan aktiviti pembaikan yang besar (~40 peratus) dalam ujian UDS, survival klonogenik, dan ujian NER in vitro. Penemuan ini menunjukkan bahawa protein ERCC1 mutan yang hanya berinteraksi dengan sangat lemah dengan kompleks NER masih boleh menyokong tahap aktiviti NER (~40 peratus) yang besar di dalam sel. Bersama-sama, penemuan ini menunjukkan bahawa tahap ekspresi rendah ERCC1 (~ 20 peratus ) digabungkan dengan aktiviti GGR sisa protein mutan yang masih dinyatakan memberikan perlindungan yang mencukupi untuk menghalang PV46LD dan PV50LD daripada membangunkan XP yang penuh. Malah, aktiviti GGR sisa masih dikesan di bawah keadaan yang lebih sensitif dalam ujian UDS jika dibandingkan dengan fibroblas daripada pesakit XP-A yang terjejas teruk dan terdedah kepada kanser. Walau bagaimanapun, kedua-dua pesakit masih boleh berisiko untuk menghidap kanser kulit, dan perlindungan daripada cahaya matahari adalah dinasihatkan. Aktiviti sisa dalam sel PV46LD dan PV50LD sama ada serupa atau lebih rendah daripada aktiviti pembaikan yang kami kesan dalam sel 165TOR atau CS20LO (Rajah 6 J; Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). Oleh itu, keterukan klinikal tidak berkorelasi dengan aktiviti NER tetapi berkemungkinan disebabkan oleh peranan ERCC1 di luar NER yang penting semasa pembangunan.

Walaupun penemuan kami bahawa ERCC1R156W menunjukkan interaksi yang berkurangan dengan SLX4 dan juga direkrut dengan kurang cekap ke tapak induksi ICL tempatan, analisis selanjutnya mendedahkan bahawa protein mutan ERCC1R156W hanya terjejas sedikit dalam menyokong pembaikan ICL apabila dinyatakan secara ektopik dalam ERCC1- sel KO. Walau bagaimanapun, kesan ke atas pembaikan ICL adalah lebih ringan daripada kesan penggantian R156W pada NER, yang digabungkan dengan penemuan awal bahawa pembaikan ICL memerlukan lebih sedikit protein ERCC1 daripada pembaikan lesi DNA khusus NER (Jaspers et al. , 2007; Sijbers et al., 1996b), mungkin menerangkan dengan baik kesan ringan terhadap pembaikan ICL. Dalam fibroblas pesakit, yang telah mengurangkan tahap ERCC1 dengan kuat, kami mengesan sensitiviti sederhana, serta peningkatan pecah kromosom apabila terdedah kepada kompaun MMC yang mendorong ICL, walaupun lebih ringan daripada sel-sel daripada pesakit FA yang disertakan secara selari. Yang penting, baik PV46LD mahupun PV50LD tidak menunjukkan sebarang tanda jelas ciri klinikal seperti FA, menunjukkan bahawa protein mutan ERCC1R156W memberikan perlindungan yang mencukupi terhadap beban ICL endogen yang rendah dalam pesakit ini.

Kekurangan ERCC1 menyebabkan kerosakan hati dan buah pinggang

Tikus yang KO untuk sama ada ERCC1 atau XPF menunjukkan larian yang teruk (iaitu, lebih kecil dan lebih lemah daripada tikus WT) dan mati sebelum 4 minggu pertama kehidupan akibat kegagalan hati yang teruk (McWhir et al., 1993; Sijbers et al., 1996b; Tian et al., 2004; Weeda et al., 1997). Ekspresi khusus hati ERCC1 dalam tikus ini sebahagiannya membetulkan saiz yang lebih kecil dan jangka hayat yang dilanjutkan sehingga 12 minggu tetapi juga membuka topeng yang terukdisfungsi buah pinggangdan kegagalan buah pinggang sebagai punca kematian kedua (Selfridge et al., 2001). Tikus KO khusus untuk XP atau FA tidak memaparkan penyakit hati, menunjukkan bahawa fenotip ini tidak disebabkan oleh kecacatan pembaikan NER atau ICL. Ada kemungkinan bahawa redundansi separa antara kedua-dua laluan ini, yang hilang dalam ERCC1-KO tikus kekurangan kedua-dua laluan, boleh menjelaskan fenotip ini. Selaras dengan idea ini, hepatosit dansel tubulus proksimal buah pinggangmenjadi poliploid dalam tikus ERCC1-KO dan terkumpul paras tinggi p53 (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997), mencadangkan bahawa pengumpulan kerosakan DNA endogen dalam organ ini mungkin berlaku. Sifat tepat lesi DNA endogen ini, bagaimanapun, masih tidak jelas.

Menariknya, tikus dengan ketidakaktifan sendi kedua-dua pembaikan NER dan ICL tidak memaparkan disfungsi hati, menunjukkan bahawa redundansi antara laluan pembaikan DNA ini bukanlah satu-satunya penjelasan dan bahawa fungsi tambahan ERCC1-XPF di luar laluan pembaikan DNA ini menyumbang kepada kerosakan hati (Mulderrig dan Garaycoechea, 2020). Ada kemungkinan ERCC1-XPF terlibat dalam laluan pembaikan DNA tambahan yang menangani kerosakan DNA endogen. Sebagai contoh, ERCC1-XPF baru-baru ini ditunjukkan bertindak ke atas struktur DNA alternatif, seperti Z-DNA, di mana ia bekerjasama dengan protein pembaikan yang tidak sepadan dan bukannya faktor pembaikan NER atau ICL (McKinney et al., 2020). Selain itu, ERCC1-XPF telah ditunjukkan terlibat dalam sub-laluan pembaikan pengasingan asas bersama-sama dengan helikase RECQ1 (Woodrick et al., 2017).

Kedua-dua adik-beradik (PV46LD dan PV50LD) dalam kajian ini mempamerkan kegagalan untuk berkembang maju, bertubuh pendek, dan kekurangan lemak subkutan, mengingatkan saiz kecil yang diperhatikan dalam tikus ERCC1-KO (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997). Lebih-lebih lagi, adik-beradik itu mengalami gangguan hati dengan gambaran yang kebanyakannya kolestatik yang membawa kepada pemindahan hati ortotopik sebelum umur 9 tahun. Campur tangan ini jelas menghalang kematian awal tetapi tidak memperbaiki kegagalan untuk berkembang maju, seperti yang terbukti daripada pertumbuhan berat, ketinggian dan lilitan kepala selepas pemindahan jauh di bawah centile ketiga.

Menariknya, penyakit hati kolestatik dilaporkan sebagai ciri umum dalam pesakit CS Mesir, menunjukkan bahawa ini harus dipantau dengan lebih teliti dalam pesakit CS dari latar belakang etnik lain untuk melihat sama ada ini adalah ciri yang lebih biasa daripada yang diiktiraf sebelumnya (Abdel Ghaffar et al. , 2011). Walaupun tiada keabnormalan hati telah diterangkan dalam pesakit XP, terdapat beberapa kes sitolisis hepatik (pecahan sel atau pecah) dalam pesakit FA (Masserot-Lureau et al., 2012), yang mungkin berbeza daripada keabnormalan hati yang diperhatikan dalam ERCC 1- adik beradik yang kekurangan. Pemeriksaan histologi biopsi hati daripada kakak yang lebih tua (PV50LD) mendedahkan perubahan dalam morfologi hepatosit dengan pembesaran dan kebolehubahan nuklear, seperti yang dinyatakan dalam tikus kekurangan ERCC 1-(Rajah S1 D; N´uñez et al., 2000). ).

Penyebab kedua kematian dalam tikus ERCC1-KO dengan ekspresi khusus hati ERCC1 adalah terukkegagalan buah pinggang(Selfridge et al., 2001). Kedua-dua adik-beradik juga memaparkan disfungsi buah pinggang, dengan ciri-ciri yang menunjukkan disfungsi tubular proksimal yang membawa kepada progresifbuah pinggangkemerosotan nilai. Walau bagaimanapun, fungsi tiub stabil selepas pemindahan hati, tetapibuah pinggangfungsimemerlukan pemantauan berterusan. Fenotip buah pinggang tikus KO ERCC1-—dengan tubul diluaskan mengandungi bahan protein bocor yang konsisten dengan tubulopati (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997)—adalah serupa kepada pesakit yang diterangkan dalam kajian kami. Selain itu, kerosakan buah pinggang dan, dalam beberapa keadaan, kegagalan telah dilaporkan dalam gabungan XP/CS (Ben Chehida et al., 2017; Kondo et al., 2016; Kralund et al., 2013) serta CS (Funaki et al. ., 2006; Reiss et al., 1996; Sato et al., 1988), manakala persatuan antara FA dan anomali strukturbuah pingganghas also been reported (Sathyanarayana et al., 2018). The phenotype in these siblings is distinct from prior reports of individuals with biallelic ERCC1 mutations and also distinct from the known phenotypic entities, CS and XP. Neither individual had features suggestive of FA. There may be parallels between the phenotype of these siblings and a previously reported individual with biallelic ERCC1 mutations (XP2020DC; p.K266X; IVS6-26G>A) yang meninggal dunia pada usia 37 tahun (Gregg et al., 2011; Imoto, K., et al. 2007. Pesakit dengan kecacatan dalam protein pembaikan eksisi nukleotida berinteraksi ERCC1 atau XPF menunjukkan xeroderma pigmentosum dengan degenerasi neurologi yang teruk pada permulaan lewat. . [Abstrak] J. Invest.Dermatol. 127:S92). Walaupun tiada kerosakan hati dilaporkan, pesakit ini mengalami atrofi otak yang teruk pada usia 15 tahun, yang berkembang menjadi neurodegenerasi progresif dengan demensia. Atrofi otak ringan juga telah diperhatikan pada kedua-dua adik-beradik pada usia 13 dan 11, menunjukkan bahawa perkembangan neurologi kedua-dua adik-beradik perlu dipantau dengan teliti.

A previously reported 15-yr-old boy with bi-allelic XPF mutations (XP51RO; p.R153P; c.458G>C; Jaspers et al., 2007; Niedernhofer et al., 2006) dibentangkan dengan fenotip dengan beberapa pertindihan dengan adik-beradik yang dilaporkan di sini, termasuk fotosensitiviti tanpa kanser kulit, kedudukan pendek, kekurangan lemak subkutan, kelewatan perkembangan, dan kekurangan buah pinggang (Niedernhofer et al., 2006). Berbeza daripada adik-beradik yang dilaporkan di sini, budak lelaki ini menunjukkan ciri progeroid segmen yang jelas, tetapi gambaran hati yang lebih ringan tanpa kolestasis. Adik beradik yang dilaporkan di sini menunjukkan bahawa mutasi ERCC1 dwi-allelik boleh menyebabkan spektrum fenotip, daripada yang biasanya dilihat dalam CS hingga kepada fenotip yang terdiri daripada perawakan pendek yang lebih ringan, fotosensitiviti, dan hati yang teruk danbuah pinggangkemerosotan nilai, berpotensi kerana gabungan kesan kuat pada NER dan kesan serentak pada pembaikan ICL, yang mungkin menjejaskan organ ini terutamanya.

Bahan dan kaedah

Semua prosedur yang dilakukan dalam kajian ini adalah mengikut piawaian etika dan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Manusia Hospital Kanak-Kanak Diraja, Melbourne, Victoria, Australia (HREC36291C) dan Jawatankuasa Perkhidmatan Etika Penyelidikan Kebangsaan UK North East–Newcastle dan North Tyneside 2. Pesakit telah direkrut ke dalam Program Penyakit Tidak Didiagnos untuk pesakit kanak-kanak dengan gangguan Mendelian "yatim piatu". Sampel air liur atau darah daripada pesakit dan ahli keluarga mereka dikumpul untuk pengekstrakan DNA genomik selepas persetujuan bertulis secara bertulis diberikan. Ibu bapa telah memberikan kebenaran untuk menunjukkan gambar adik-beradik yang terjejas dalam Rajah 1 A.

Next-generation sequencing (NGS) DNA extracted from the blood of both affected siblings and unaffected parents was subjected to exome capture and sequencing through Oxford Gene Technologies Ltd. Genomic data were analyzed using a custom-made in-house pipeline using an autosomal recessive disease model. A paternally inherited missense variant in NM_202001.2 (ERCC1), g.45922415G>A, c.466C>T telah dikenal pasti dalam kedua-dua individu yang terjejas dalam exon 4 daripada 8 gen ERCC1. Pada soal siasat awal data exome dalam kedua-dua individu yang terjejas, varian ini kelihatan dalam keadaan homozigot tetapi hadir dalam keadaan heterozigot pada bapa dan tiada pada ibu, mencadangkan kemungkinan pemadaman pada alel ibu. Varian missense terdapat dalam pangkalan data gnomAD pada kekerapan 0.01 peratus (22 heterozigot, tiada homozigot) dan belum pernah dilaporkan dalam individu yang terjejas. Varian missense telah disimpan dalam pangkalan data LOVD (http://www.LOVD.nl/ERCC1_000020 dan http://www.LOVD.nl/ERCC1_000021) dan pangkalan data ClinVar ( ID variasi: 978472).

Pengesanan pemadaman oleh qPCR

Untuk mengesan pemadaman, DNA genom telah diekstrak daripada limfosit / sel epitelium, dan kawasan gen ERCC1 yang berkaitan telah dikuatkan dalam qPCR. qPCR dilakukan menggunakan probe dan primer khusus (disenaraikan dalam Jadual S1) yang direka menggunakan Pusat Reka Bentuk Ujian Universal ProbeLibrary (Roche) dan disintesis oleh Sigma-Aldrich. Primer direka bentuk untuk memasukkan rantau yang dipadamkan dalam exon 4 dan rantau dalam gen yang tidak dipadamkan sebagai kawalan (exon 5). QPCR multipleks menggunakan campuran reaksi LightCycler R 480 Probes Master (Roche) telah dilakukan mengikut protokol pengilang untuk menguatkan dan mengukur rantau gen ERCC1, menggunakan gen CFTR (exon 27) sebagai standard dalaman (Jadual S1). qPCR telah dilakukan pada instrumen LightCycler R 480 (Roche), dan analisis data dilakukan menggunakan perisian LightCycler R 480 versi 1.5.0 (Roche). Garis panduan American College of Medical Genetics telah diikuti untuk tafsiran variasi urutan.

Pengesanan varian missense oleh penjujukan Sanger

DNA genom telah diasingkan dengan menggantung semula pelet sel dalam penimbal lisat seluruh sel (50 mM KCL, 10 mM Tris, pH 8.0,25 mM MgCl2, {{12} }.1 mg/ml gelatin, 0.45 peratus Tween-20 dan 0.45 peratus NP-40) mengandungi 0.1 mg/ml Proteinase K (EO0491; ThermoFisher Scientific) dan pengeraman selama 1 h pada 56 darjah diikuti oleh 10-menyahaktifkan haba min Proteinase K pada 96 darjah . Serpihan ~ 1 kb yang merangkumi mutasi missense telah dikuatkan PCR (primer penjujukan disenaraikan dalam Jadual S1) diikuti dengan penjujukan Sanger menggunakan sama ada primer ke hadapan atau belakang.

Talian sel

Garis sel fibroblast telah ditubuhkan daripada biopsi kulit daripada kedua-dua individu yang terjejas dan ibu bapa. Semua garisan sel (disenaraikan dalam jadual S2) telah dibiakkan pada 37 darjah dalam suasana 5 peratus CO2 indium (Thermo Fisher Scientific) ditambah dengan penisilin/streptomycin (Sigma-Aldrich) dan 10 peratus FBS (Bodinco BV). Semua garisan sel telah diuji secara rutin untuk jangkitan mycoplasma.

Pengabadian fibroblast dengan hTERT

Fibroblas WT (48BR) dan PV50LD telah diabadikan oleh nukleofeksi p Babe-Neo-TERT (Addgene Plasmid #1774) menggunakan Amaxa Nucleofector (program U23). Setiap elektroporasi mengandungi 400,000 fibroblas dan 2.5 µg DNA plasmid. Selepas elektroporasi, sel telah disemai dalam 25-cm2 kelalang kultur tisu yang mengandungi 5 ml DMEM dan 10 peratus FBS. Selepas 2 hari, medium kultur digantikan dengan medium yang mengandungi 20 µg/ml neomycin.

/streptomycin (Sigma-Aldrich) dan 10 peratus FBS (Bodinco BV). Semua garisan sel telah diuji secara rutin untuk jangkitan mycoplasma.

Binaan plasmid

All plasmids used in this study are listed in Table S3. The GFP gene in pERCC1-GFP-N1 (Houtsmuller et al., 1999) was replaced with m Venus (a gift of Joachim Goedhart, Amsterdam, Netherlands) using AgeI and BsrGI. The GFP-NLS gene (Luijsterburg et al., 2017) was inserted into pcDNA5-FRT-TO-Puro. The ERCC1-m Venus cassette was amplified by PCR (see Table S1 for primers) and inserted as a NheI and BspEI fragment into plenty-CW57-TO-GFP digested with NheI and AgeI to generate plenty-CW57-TO-ERCC1WT-mVenus. Overlap PCR was used to introduce the c.466C>Mutasi T dalam ERCC1. Produk PCR bertindih telah dimasukkan sebagai serpihan NheI dan AgeI untuk menjana banyak-CW57-TO-ERCC1R156W-mVenus. ERCC1WT dan ERCC1R156W telah dimasukkan sebagai serpihan NheI dan AgeI ke dalam pcDNA5-FRT-TO Puro-EGFP-N1 untuk menjana pcDNA5-FRT-TO-Puro-ERCC1WT-EGFPdan pcDNA5-FRT-TO -Puro-ERCC1R156W-EGFP. Mutagenesis terarah tapak digunakan untuk memperkenalkan mutasi titik dalam pMacro Bac-XPF-ERCC1WT menggunakan kit mutagenesis KOD-plus (Toyobo) seperti yang diterangkan dalam protokol pengilang, menggunakan pri mer yang disenaraikan dalam Jadual S1. Semua jujukan telah disahkan oleh jujukan Sanger.

Penjanaan sel KO

talian untuk menjana sel KO tunggal, U2OS(FRT) dan RPE1-hTERT (PuroR/TP53-dKO) telah ditransfeksi bersama dengan pengekodan pLV-U6g-PPB RNA panduan daripada Pusat Perubatan Universiti Leiden/Sigma -Pustaka RNA (sgRNA) panduan tunggal Aldrich (lihat Jadual S3untuk plasmid dan Jadual S4 untuk jujukan sgRNA) yang menyasarkan gen ERCC1 bersama pengekodan vektor ekspresi Cas9-2A-GFP (pX458; Addgene #48138) menggunakan Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Sel U2OS(FRT) yang ditransfeksi telah dipilih pada puromisin (1 µg/ml) selama 3 hari dan disalut pada ketumpatan rendah, selepas itu klon individu diasingkan. Sel RPE1-hTERT yang dipindahkan ialah FACS yang diisih pada BFP/GFP dan disalut pada ketumpatan rendah, selepas itu klon individu diasingkan. Klon KO telah disahkan oleh analisis blot Barat. Ketiadaan integrasi / ekspresi stabil Cas9 telah disahkan oleh Western blot.

Penjanaan garisan sel yang stabil

Satu klon ERCC1 KO dalam latar belakang U2OS(FRT) (lihat jadual S2) digunakan untuk menyatakan secara stabil ERCC1WT-GFP, ERCC1R156W-GFP atau GFP-NLS melalui cotransfection pcDNA5-FRT-TO-Puroplasmid pengekodan ini cDNA (2 µg), bersama-sama dengan pengekodan pOG44plasmid Flp recombinase (0.5 µg). Populasi sel poliklonal diperolehi selepas pemilihan pada 1 µg/ml puromycin dan 4 µg/ml blasticidin S. Ekspresi ERCC1protein bertanda GFP atau GFP-NLS telah diinduksi dengan penambahan 2 µg/ml doxycycline selama 24 jam.

Penjanaan garisan sel KI

Untuk menjana KI homozigot, sel RPE{{0}}hTERT mula-mula dirawat selama 30 minit dengan 1 µM DNA-PK inhibitor (NU7441) untuk menyekat pembaikan DSB yang terdedah kepada ralat dan meningkatkan penggunaan pembaikan bergantung kepada homologi. Selepas itu, 350,000 sel telah digantung semula dalam 20 µl penampan nukleofektor (V4XP-3032; Lonza) dengan kehadiran 4.5 µg plasmid yang mengandungi Cas9 dan sgRNA yang menyasarkan gen ERCC1 (lihat Jadual S3 untuk plasmid dan Jadual S4 forsgRNA jujukan) dan 100 µM penderma untaian tunggal DNA yang mengandungi mutasi pesakit serta mutasi senyap untuk memusnahkan tapak PAM untuk mengelakkan pemotongan semula oleh Cas9 dan mutasi senyap untuk memperkenalkan tapak sekatan HindIII untuk memudahkan pemeriksaan klon KI. Sel telah dielektroporasi menggunakan anAmaxa 4D-X Nucleofector Unit (Lonza) menggunakan program EA-104. Selepas elektroporasi, sel disalut pada ketumpatan rendah dalam medium McCoy dengan 10 peratus FBS. Keesokan harinya, medium itu digantikan dengan DMEM (10 peratus FBS dan 1 peratus penisilin/streptomisin), dan sel dibenarkan membentuk koloni. Kira-kira 400 koloni telah diasingkan dan diperluaskan. DNA genom telah diasingkan, dan serpihan termasuk mutasi yang diperkenalkan dan tapak sekatan yang diperkenalkan (HindIII) telah dikuatkan oleh PCR bersarang (lihat Jadual S1 untuk primer). Serpihan PCR dicerna dengan HindIII (NEB) selama 3 jam pada 37 darjah dan kemudian dipisahkan oleh elektroforesis gel. Klon yang mempunyai tapak sekatan HindIII yang diperkenalkan telah dianalisis dengan penjujukan Sanger (lihat Jadual S1 untuk primer). Kami memperoleh dua klon KI homozigot di antara 400 klon terpencil, yang sepadan dengan kecekapan KI ~ 0.5 peratus .

Transduksi lentiviral

untuk transduksi lentiviral, mVenus-ERCC1WT atau mVenus ERCC1R156W telah dimasukkan ke dalam vektor lentiviral pLenti-CW57-TO. HEK293T telah ditransfeksi dengan pengekodan vektor gabungan ERCC1 ini, VSV-G, RRE dan REV menggunakan JetPEI (Sigma Aldrich) untuk menghasilkan virus. Supernatan yang mengandungi virus telah dikumpulkan selepas 24 jam dan ditapis dengan 0.44-µm penapis. Fibroblas utama PV46LD dan PV50LD telah ditransduksi secara lentiviral dengan kehadiran polybrene (Sigma-Aldrich). Sel telah dipilih dengan 15 µg/ml puromycin. Ekspresi protein ERCC1 yang diberi tag mVenus telah diinduksi dengan penambahan 2 µg/ml doxycycline selama 24 jam.

Ujian survival klonogenik

Cells were trypsinized, seeded at low density, and allowed to attach. The next day, cells were either mock-treated or exposed to an increasing dose of UV light (1, 2, 3, and 4 J/m2 of UV-C 266nm), an increasing dose of IR (2, 4, 6, and 8 Gy), or increasing concentrations of MMC (2, 4, 6, and 8 ng/ml). After 7–9 d, the cells were washed with 0.9% NaCl and stained with methylene blue. Colonies of >20 sel telah dijaringkan. Eksperimen kelangsungan hidup dilakukan dalam pendua dan diulang sekurang-kurangnya dua kali.

Imunopresipitasi untuk Co-IP

Sel telah dirawat secara olok-olok atau disinari UV-C (20 J/m2) dan dituai selepas 1 jam. Pelet sel telah disaring selama 20 min pada ais dalam penimbal EBC-150 (50 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 peratus NP-40, 2 mM MgCl2 dan perencat protease koktel [Roche]) ditambah dengan 500 U/ml Benzonase Nuclease (Novagen). Lisat sel diinkubasi selama 1.5 jam pada 4 darjah dengan manik GFP-Trap A (Chromotek). Manik kemudian dibasuh enam kali dengan penimbal EBC-150 (50 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 peratus NP-40,1 mM EDTA dan koktel perencat protease) dan direbus dalam Laemmli-SDS penimbal sampel.

penghapusan Barat

Sel dipusingkan ke bawah, dibasuh dengan PBS dan direbus selama 10 min dalam penimbal Laemmli (40 mM Tris, pH 6.8, 3.35 peratus SDS, 16.5 peratus gliserol, 0.0005 peratus Bromophenol Blue dan 0.05 M dithiothreitol). Protein diasingkan pada 4 peratus –12 peratus Kriteria XT Bis-Tris gel(#3450124; Bio-Rad) dalam NuPAGE MOPSrunning buffer (NP0001-02; Thermo Fisher Scientific) dan dipadamkan pada membran polivinilidena fluorida (IPFL00010; EMD Millipore ). Membran telah disekat dengan penimbal penyekat (MB-070-003; Tanah batu) selama 1 jam pada suhu bilik. Membran kemudian disiasat dengan antibodi (disenaraikan dalam Jadual S5) seperti yang ditunjukkan. Sistem Odyssey CLx (LI-COR Biosciences) telah digunakan untuk pengesanan.

Ujian pemulihan RNA (RRS)

30,000 sel telah disemai pada 12-mm kaca penutup dalam 24-plat perigi dalam DMEM dengan 1 peratus FBS. Selepas 24 jam, sel telah disinari dengan UV-C pada dos 6 J/m2 dan diinkubasi dalam medium terkondisi untuk tempoh masa yang berbeza ({{20}} h, 3 h, dan 18 h). Selepas pengeraman, transkrip yang baru lahir dilabelkan dengan mengeram sel dengan 400 µM 5-ethynyl-uridine (CLK-N002-10; Jena Bioscience), yang kemudiannya divisualisasikan dengan campuran Click-iT yang terdiri daripada 50 Penampan mM Tris, pH 8.0, 60 µM Atto Azide (647N-101; ATTO-TEC), 4 mM CuSO4•5H2O, 10 mM L-asid askorbik (A0278; Sigma-Aldrich), dan 0.1 µg/ml DAPI (D1306; Thermo Fisher Scientific) selama 1 jam. Sel telah dibasuh tiga kali selama 5 minit dengan PBS dan dipasang pada slaid mikroskop (Thermo Fisher Scientific) menggunakan Aqua Polymount (Brunschwig).

Imunofluoresensi

Untuk pewarnaan imunofluoresen, 250,000 sel telah disemai pada 18-mm kaca penutup. Keesokan harinya, sel telah diperbaiki dengan 4 peratus paraformaldehid, diikuti dengan permeabilisasi dengan{{10}}.5 peratus Triton X-100 selama 10 min. Sel telah dirawat dengan 100 glisin dalam PBS selama 10 minit untuk menyekat kumpulan aldehid yang tidak bertindak balas, dibilas dengan PBS, dan diseimbangkan dalam penimbal basuh (PBS mengandungi 0.5 peratus BSA dan 0.05 peratus Tween-20; Sigma-Aldrich) selama 10 minit. Langkah antibodi dan cucian berada dalam penimbal pencuci. Antibodi utama diinkubasi selama 2 jam pada suhu bilik, diikuti oleh antibodi sekunder selama 1 jam dan DAPI selama 5 minit. Antibodi primer dan sekunder disenaraikan dalam JadualS5. Sel telah diinkubasi dengan 0.1 µg/ml DAPI dan dipasang menggunakan Aqua Polymount.

Pewarnaan H2AX

200,000 sel telah disemai pada 18-mm penutup kaca dalam 24-plat perigi dengan DMEM (10 peratus FBS dan 1 peratus P/S). Keesokan harinya, sel-sel telah terdedah kepada IR oleh penjana x-ray Antarabangsa YXlon (200 KV, 4 mA; kadar dos 2 Gy / min). Pada titik masa yang dinyatakan, sel telah ditetapkan dengan 3 peratus paraformaldehid dalam PBS selama 10 minit dan diwarnai untuk H2AX selama 1 jam (lihat di atas). Imej dikira menggunakan makro tersuai dalam ImageJ yang membolehkan analisis automatik dan objektif bilangan fokus setiap sel, seperti yang diterangkan sebelum ini (Typas et al., 2015).

Analisis mikroskopik sel tetap

Imej sampel tetap diperoleh pada mikroskop pendarfluor medan lebar Zeiss AxioImagerM2 atau D2 yang dilengkapi dengan objektif rendaman minyak 63× PLAN APO (1.4 apertur berangka [NA]) (Zeiss) dan lampu halida logam HXP 120 yang digunakan untuk pengujaan. Probe pendarfluor dikesan menggunakan penapis berikut untuk DAPI (penapis pengujaan: 350/50 nm; cermin dichroic: 400 nm; penapis pelepasan: 460/50 nm), Alexa 555 (penapis pengujaan: 545/25 nm; cermin dichroic: 565 nm ; penapis pelepasan: 605/70 nm), atau Alexa 647 (penapis pengujaan: 640/30 nm; cermin dichroic: 660 nm; penapis pelepasan: 690/50 nm). Imej telah dirakam menggunakan perisian ZEN 2012 dan dianalisis dalam ImageJ.

Penyinaran mikro laser UV

Sel telah ditanam pada 18-mm kuarza (UV-C) atau kaca (UV-A)liputan penutup dan diletakkan di dalam ruang magnet Chamlide CMB di mana medium pertumbuhan digantikan oleh CO2-Leibovitz L bebas{ {4}} sederhana (Thermo Fisher Scientific). Jejak laser UV-C dibuat menggunakan laser keadaan pepejal 266-mm yttrium yang dipam diod (purata kuasa 5 mW, kadar ulangan sehingga 10 kHz dan panjang nadi 1 ns). Sebelum penyinaran UV-Amikro, sel sama ada tersensitisasi dengan 6 µM trioxsalen selama 1 jam untuk menghasilkan ICL atau dengan 15 µM BrdU selama 24 jam untuk menghasilkan DSB. Jejak laser UV-A dibuat oleh laser keadaan pepejal 355-nm Yttrium Aluminium Garnet yang dipam diod (purata kuasa 14 mW dan kadar ulangan sehingga 200 Hz). Kedua-dua laser telah disepadukan ke dalam sistem UGA-42-Caliburn/2L Spot Illumination(Rapp OptoElectronic).

Penyinaran mikro digabungkan dengan pengimejan sel hidup dalam ruang persekitaran yang ditetapkan kepada 37 darjah pada mikroskop pendarfluor medan lebar semua-kuarza Zeiss Axio Observer 7, menggunakan objektif rendaman gliserol ultra-penapis 100× (1.2NA) (UV-C ) atau objektif rendaman minyak Pelan-Neoluar 63× (1.25 NA) (UV-A). Sistem laser digandingkan dengan mikroskop melalui TriggerBox dan penapis ketumpatan neutral (ND-1) menyekat 90 peratus cahaya laser. AnHXP 120-Lampu halida logam V telah digunakan untuk pengujaan. Imej diperoleh dalam Zeiss ZEN dan dikira dalam ImageJ.

Ujian pecah kromosom

2 × 1{{20}}6 fibroblas telah disemai dalam 175-cm2 kelalang kultur tisu dengan DMEM (10 peratus FBS) dan dikultur pada 37 darjah dengan ada atau tiada 50 nM MMC. Selepas 48 jam, 600 µl demecolcine (10 µg/µl) telah ditambah kepada setiap kelalang kultur, dan sel diinkubasi selama 30 minit tambahan pada 37 darjah untuk memperkayakan metafasa. Sel-sel kemudiannya ditrypsin dan digantung semula dalam 75 mM KCL dan diinkubasi selama 20 minit pada suhu bilik. Sel-sel tersebut dipusingkan ke bawah, digantung semula dalam 10 ml fiksatif (75 peratus metanol dan 25 peratus asid asetik), diinkubasi selama 30 minit pada suhu bilik, dan disentrifugasi. Pelet digantung semula dalam 10 ml fiksatif dan diinkubasi selama 5 minit pada suhu bilik. Langkah ini diulang, dan akhirnya, pelet digantung semula dalam fiksatif 0.5-1.0 ml. Suspensi sel dijatuhkan pada slaid dan dibiarkan kering. Slaid diwarnakan selama 5 minit dalam larutan Giemsa 3 peratus, dibilas dalam air paip, dan dibiarkan kering. Slaid telah dikodkan, dan daripada setiap budaya berkod, 50 metafasa diperiksa untuk kerosakan kromosom. Selepas pemarkahan, slaid telah dinyahkodkan, dan hasilnya dianalisis seperti yang dibentangkan (Stoepker et al., 2011).

UDS

180,000 sel telah disemai pada 18-mm kaca penutup dalam 12-plat perigi dalam DMEM dengan 1 peratus FBS. Selepas 24 jam, sel telah disinari secara setempat melalui penapis 5-µm dengan 30 J/m2 UV-C. Sel-sel kemudiannya dilabelkan nadi dengan 20 µM EdU (VWR) dan 1 µM5-fluoro-deoxyuridine (Sigma-Aldrich) untuk sama ada 1 jam atau 4 jam. Selepas pelabelan, sel dikejar sederhana dengan 10 µM timidin dalam DMEM tanpa suplemen selama 30 minit dan ditetapkan selama 15 minit dengan 3.7 peratus formaldehid dalam PBS. Sel telah dipermeabilkan selama 20 minit dalam PBS dengan 0.5 peratus Triton-X100 dan disekat dalam 3 peratus BSA (Thermo Fisher Scientific) dalam PBS. EdU yang diperbadankan telah digabungkan dengan Attoazide Alexa Fluor 647 menggunakan kimia Click-iT mengikut arahan pengilang (Invitrogen). Selepas gandingan, sel-sel telah dipasang dengan 2 peratus formaldehid selama 10 minit dan seterusnya disekat dengan 100 mM glisin. DNA telah didenaturasikan dengan 0.5 M NaOH selama 5 minit, diikuti dengan penyekatan dengan 10 peratus BSA selama 15 minit. Seterusnya, sel-sel diinkubasi dengan antibodi terhadap dimer pirimidin siklobutana (lihat Jadual S5) selama 2 jam, diikuti oleh antibodi sekunder selama 1 jam, dan DAPI selama 5 minit. Sel telah dipasang di Polymount (Brunschwig).

pemerolehan data MS

MS dilakukan pada asasnya seperti yang diterangkan sebelum ini (Salas Lloret et al., 2019). Semua percubaan telah dilakukan pada sistem EASY-nLC 1000 (Proxeon) yang disambungkan kepada Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) melalui sumber ion nano-electrospray. Q-Exactive telah digandingkan kepada pemancar silika 25-cm (FS360-75-15-N-5-C25; NewObjective) dalaman yang dibungkus dengan manik AQ 1.9 µm C18-(Reprospher -DE; Pur; Dr. Manish, Ammerbuch-Entringen, Jerman). Sampel dijalankan dalam 40-kecerunan kromatografi min daripada 0 peratus kepada 30 peratus asetonitril dan kemudian ditingkatkan kepada 95 peratus asetonitril sebelum penyamaan semula lajur dengan kadar alir 200 NL/min. Spektrometer jisim dikendalikan dalam mod pemerolehan bergantung kepada data dengan kaedah tujuh teratas dan julat imbasan 300–1,600 m/z. Spektrum MS imbasan penuh diperoleh pada nilai sasaran 3 × 106 dan resolusi 70,000, dan spektrum jisim tandem perlanggaran yang lebih tinggi (MS/MS) direkodkan pada nilai sasaran 105, dan dengan resolusi 35,000, tetingkap pengasingan 2.2 m/z, dan tenaga perlanggaran ternormal sebanyak 25 peratus . Sasaran kawalan keuntungan automatik minimum ialah 104. Masa suntikan MS1 ​​dan MS2 maksimum masing-masing ialah 250 dan 120 ms. Jisim ion prekursor bagi ion yang diimbas secara dinamik dikecualikan daripada analisis MS/MS selama 30 saat. Ion dengan caj 1 dan lebih tinggi daripada 6 dikecualikan daripada mencetuskan analisis MS2.

Analisis data MS Semua data mentah dianalisis menggunakan MaxQuant (versi 1.6.6.0) seperti yang diterangkan sebelum ini (Tyanova et al., 2016a). Kami melakukan carian terhadap proteom rujukan UniProt yang dicerna dalam siliko untuk Homo sapiens, termasuk jujukan kanonik dan isoform (27 Mei, 2019). Carian pangkalan data telah dilakukan mengikut tetapan standard dengan pengubahsuaian berikut. Pencernaan dengan Trypsin/P telah digunakan, membenarkan empat belahan terlepas. Pengoksidaan (M) dan asetil (protein jangka-N) dibenarkan sebagai pengubahsuaian berubah-ubah dengan bilangan maksimum tiga. Carbamido-methyl (C) telah dilumpuhkan sebagai pengubahsuaian tetap. Kuantifikasi tanpa label (LFQ) telah didayakan, tidak membenarkan LFQ Pantas. Data output Max-Quant diproses selanjutnya menggunakan platform pengiraan Perseus (v 1.6.6.0; Tyanova et al., 2016b). Nilai keamatan LFQ telah log2 diubah, dan bahan cemar dan protein yang berpotensi dikenal pasti oleh tapak sahaja atau peptida terbalik telah dikeluarkan. Sampel dikumpulkan dalam kategori eksperimen, dan protein yang tidak dikenal pasti dalam empat daripada empat replika dalam sekurang-kurangnya satu kumpulan juga dialih keluar. Nilai yang hilang telah dikira menggunakan nilai taburan normal dengan anjakan ke bawah 1.8 (log2) dan lebar rawak 0.3 (log2) dengan mengambil kira nilai keseluruhan matriks. Analisis statistik (ujian-t) dilakukan untuk menentukan protein mana yang diperkaya dengan ketara. Plot gunung berapi telah dihasilkan, dan jadual output analisis statistik diproses selanjutnya dalam Microsoft Excel. Data proteomik MS telah didepositkan ke Konsortium ProteomeXchange melalui repositori rakan kongsi PRIDE (Perez-Riverol et al., 2019) dengan pengecam set data PXD017940.

Pembersihan rekombinan ERCC1-XPF

Pengeluaran Baculovirus dilakukan seperti yang diterangkan menggunakan binaan pMacroBac-His-ERCC1/XPF-HA (Enzlin dan Sch¨ arer, 2002). ERCC1WT dan ERCC1R156W diekspresikan bersama XPFWT daripada satu baculovirus dalam sel serangga Sf9. Heterodimer telah disucikan atas pertalian nikel, pengecualian saiz, dan kromatografi heparin seperti yang diterangkan (Enzlin dan Sch¨ arer, 2002). ERCC1-XPF telah dielusi daripada lajur heparin pada sekitar 600 mM NaCl. Kepekatan protein adalah antara 0.1 hingga 0.2 mg/ml.

Ujian nuklease

Substrat gelung batang (GCCAGCGCTCGG(T)22CCGAGCGCTGGC)yang mengandungi pewarna pendarfluor Cy5 (50 pmol) pada 39 termini (IDT) telah disepuhlindapkan dalam 100-µl penimbal penyepuhlindapan (10 mM Tris, pH 7.5 dan 50 mM NaCl) dengan memanaskan pada 95 darjah selama 5 minit dan menyejukkan perlahan-lahan dalam tempoh 2 jam. 200 fmol substrat beranil digunakan dalam 20-µl tindak balas yang mengandungi 25 mM HEPES, pH8.0, 2 mM MgCl2, 10 peratus gliserol, 0.5 mM -mercaptoethanol, 0.1mg/ml BSA, 40 mM NaCl, dan 0–40 nM protein. Tindak balas telah diinkubasi pada 30 darjah selama 30 minit dan dihentikan dengan menambah 10 µl90 peratus formamide/10 mM EDTA. Selepas dipanaskan pada 95 darjah selama 5 minit dan disejukkan pada ais, 15 µl setiap sampel dimuatkan pada gel poliakrilamida penyahnatutan 15 peratus. Gel dijalankan pada 30 mA selama 30 minit dan jalur telah divisualisasikan oleh pendarfluor oleh Typhoon RGB (Amersham Biosciences).

Ujian NER in vitro

Ekstrak sel kekurangan XPF (XP2YO) dan plasmid yang mengandungi lesi dG-AAF khusus tapak telah dihasilkan seperti yang diterangkan sebelum ini (Gillet et al., 2005; Shivji et al., 1999) . Untuk setiap tindak balas, 2 µl penimbal pembaikan (2{{40}}}0 mM Hepes-KOH, 25 mM MgCl2, 2.5 mM DTT, 10 mM ATP, 110 mM phosphocreatine, dan 1.8 mg / ml BSA, pH akhir 7.8), 0.2 µl penimbal kreatin fosfokinase (2.5 mg/ml kreatin fosfokinase daripada otot arnab [Sigma Aldrich], 10 mM glisin, pH 9.0 dan 50 peratus gliserol), 3 µl sel kekurangan XPF ekstrak, NaCl (hingga kepekatan akhir 70 mM), dan protein ERCC{30}}XPF yang telah dimurnikan dalam jumlah isipadu 9 µl telah dipanaskan terlebih dahulu pada 30 darjah selama 10 minit. 1 µl plasmid yang mengandungi dG-AAF (50 ng/µl) telah ditambah pada setiap tindak balas, dan tindak balas telah diinkubasi pada 30 darjah selama 45 minit. Campuran tindak balas kemudiannya disejukkan di atas ais selama 5 minit, diikuti dengan penambahan 0.5 µl 1 µM helai pelengkap d(GGGGCATGTGGCGCCGGTAATAGC TACGTAGCTC), dan campuran tindak balas telah dinyahtutur dengan pemanasan pada 95 darjah selama 5 minit. Selepas 15 minit penyepuhlindapan pada suhu bilik, 1 µl campuran jujukan (mengandungi 0.13 U jujukan dan 2.0 µCi [ -32}P] dCTP untuk setiap tindak balas) telah ditambah. Selepas prainkubasi pada 37 darjah selama 3 minit, 1.2 µl campuran deoksiribonukleotida trifosfat (50 µM dCTP, 100 µM dTTP, 100 µM dATP, dan 100 µM dGTP) telah ditambah. Campuran tindak balas telah diinkubasi pada 37 darjah selama 12 minit, dan tindak balas dihentikan dengan menambah 8 µl pewarna pemuatan (80 peratus formamide dan 10 mM EDTA). Sampel dipanaskan pada 95 darjah selama 5 minit, disejukkan di atas ais, dan dimuatkan ke dalam gel poliakrilamida penyahnatutan 14 peratus. Gel dijalankan pada 45 W selama 2.5 jam dan jalur divisualisasikan menggunakan PhosphorImager (Typhoon RGB).

Bahan tambahan dalam talian

Rajah S1 menunjukkan nilai makmal fungsi hati dan buah pinggang dalam adik-beradik 1 dan adik-beradik 2. Rajah S2 menunjukkan data penjujukan genomik yang mengesahkan mutasi missense dan penghapusan intragenik dalam gen ERCC1. Rajah S3 menunjukkan ekspresi protein ERCC1 dan XPF dalam fibroblas pesakit. Rajah S4 menunjukkan protein ERCC1 dan XPF rekombinan tulen dan Co-IP ERCC1WT dan ERCC1R156W. Rajah S5 menunjukkan imej mikroskopi UDS, fokus H2AX dan lokasi mutasi pesakit dalam ERCC{15}}XPF. Jadual S1 mengandungi jujukan semua primer dan probe yang digunakan dalam kajian ini. Jadual S2 menyenaraikan semua talian sel yang diuji dalam kajian ini. Jadual S3 menyenaraikan semua plasmid yang terlibat dalam kajian ini. Jadual S4 menyediakan urutan sgRNA kajian dan Jadual S5 menunjukkan antibodi. Jadual S6 menyediakan bilangan sel yang digunakan untuk kuantifikasi dalam rajah. Data S1 memaparkan semua fail Western blot yang belum dipangkas.

Ucapan terima kasih

Penulis menghargai kedua-dua adik beradik dan ibu bapa mereka kerana menyumbang kepada kertas kerja ini, Sylvie Noordermeer (Pusat Perubatan Universiti Leiden [LUMC], Leiden, Belanda) untuk vektor ekspresi lentiviral thepLenti-CW57-TO-GFP dan nasihat tentang penjanaan KI sel, Joachim Goedhart (Universiti Amsterdam, Amsterdam, Belanda) untuk mVenus cDNA, Bert van derKooij (LUMC, Leiden, Belanda) untuk perencat DNA-PK, Wim Vermeulen dan Anja Rams (Erasmus MC, Rotterdam, Belanda) untuk menyediakan sel 165TOR, Tomoo Ogi (University of Nagoya, Jepun) untuk menyediakan sel CS20LO, Alan Lehman (University of Sussex, UK) untuk menyediakan sel hTERT CSL16NG dan CSL16NG, dan Joost Schimmel (LUMC, Leiden, Belanda) untuk nasihat tentang penjanaan sel KI .

Kerja ini dibiayai oleh Leiden University Medical CenterResearch Fellowship dan Nederlandse Organisatie voor We tenschappelijk Onderzoek VIDI grant (ALW.016.161.320) kepada MSLuijsterburg, sebuah geran permulaan Majlis Penyelidikan Eropah(310913) kepada ACO Vertegaal, geran Kankerbestrij Muda KWF 11367) kepada R. Gonz´alez-Prieto, geran KWF Kan kerbestrijding (VU 2013-5983) kepada MA Rooimans, dan geran daripada Institut Sains Asas Korea (IBS-R022-A1)dan National Institut Kanser (P01CA092584) kepada ODSch arer.

Sumbangan pengarang: K. Apelt menjana sel KO, sel KI dan garisan sel yang stabil; melakukan Western blot dan immunostaining untuk ekspresi ERCC1 dan XPF, transduksi lentiviral, survival klonogenik (UV, MMC, IR), eksperimen Co-IP untuk analisis Western blot, eksperimen UDS, eksperimen Co-IP untuk MS, dan pewarnaan H2AX; dan menulis kertas itu. A. Kragten melakukanUDS, RRS dan imunostaining selepas UV tempatan. Permata AP Wonder menjana sel KO dan KI dan melakukan eksperimen UDS, Western blot dan penjujukan Sanger untuk mengesahkan mutasi missense. SM White menyediakan kaunseling untuk pesakit, menganalisis data exome, melakukan biopsi, menghasilkan fibroblas primer, dan menulis penerangan pesakit klinikal. S. Lunke dan BT Wilson menjana data NGS. S. Pantaleo dan D. Flanagan melakukan qPCR untuk mengesahkan pemadaman. C.Quinlan menulis penerangan klinikal buah pinggang. W. Hardikar menulis perihalan klinikal hati. MA Rooimans dan R.MF Wolthuis menghasilkan fibroblas 48BR danPV50LD yang diabadikan hTERT dan melakukan ujian pecah kromosom yang disebabkan oleh MMC. R. Gonzalez-Prieto dan ACO Vertegaal menganalisis semua eksperimen MS. WW Wiegant dan H. vanadium melakukan kemandirian klonogenik dalam sel U2OS (IR). J.-E.Yeo dan HS Kim menulenkan protein rekombinan dan melakukan ujian nuklease dan ujian NER in vitro. OD Sch¨arer yang diselia dalam kerja NER in vitro menyumbang kepada tafsiran struktur alel R156W dan menyunting kertas itu. MS Luij sterburg menyelia projek itu dan menulis kertas kerja.

Rujukan

Abdel Ghaffar, TY, ES Elsobky, dan SM Elsayed. 2011. Kolestasis pada pesakit dengan sindrom Cockayne dan mencadangkan kriteria yang diubah suai untuk diagnosis klinikal. Anak YatimJ. Rare Dis. 6:13. -1172-6-13

Abdullah, UB, JF McGouran, S. Brolin, D. Ptchelkine, AH El-Sagheer, T. Brown, dan PJ McHugh. 2017. RPA mengaktifkan endonuklease XPF-ERCC1 untuk memulakan pemprosesan pautan silang antara untaian DNA. EMBO J. 36: 2047–2060.

Adair, GM, RL Rolig, D. Moore-Faver, M. Zabelshansky, JH Wilson, dan RS Nairn. 2000. Peranan ERCC1 dalam penyingkiran ekor panjang yang tidak homolog semasa penggabungan semula homolog yang disasarkan. EMBO J. 19:5552–5561.

Ahmad, A., AR Robinson, A. Duensing, E. van Drunen, HB Beverloo, DB Weisberg, P. Hasty, JH Hoeijmakers, dan LJ Niedernhofer. 2008. ERCC1-Endonuclease XPF memudahkan pembaikan pecah rantai dua DNA. Mol. sel. biol. 28:5082–5092.

Ahmad, A., JH Enzlin, NR Bhagwat, N. Wijgers, A. Raams, E. Appledoorn, AF Theil, JH J Hoeijmakers, W. Vermeulen, NG J Jaspers, et al. 2010. Penyetempatan salah nuklease XPF-ERCC1 menyumbang kepada pengurangan pembaikan DNA dalam pesakit XP-F. Genet PLoS. 6:e1000871.

Auerbach, AD 2009. Anemia Fanconi dan diagnosisnya. Mutat. Res. 668:4–10.

Ben Chehida, A., N. Ghali, R. Ben Abdelaziz, F. Ben Moussa, dan N. Tebib. 2017. Penglibatan Buah Pinggang Dalam 2 Adik Beradik Menghidap Sindrom Cockayne. Iran. J. Buah Pinggang Dis. 11:253–255.

Biggerstaff, M., DE Szymkowski, dan RD Wood. 1993. Pembetulan bersama ERCC1, ERCC4, dan xeroderma pigmentosum kumpulan F kecacatan pembaikan DNA secara in vitro. EMBO J. 12:3685–3692.

-2075.1993.tb06043.xBogliolo, M., B. Schuster, C. Stoepker, B. Derkunt, Y. Su, A. Raams, JP Trujillo, J. Minguillón, MJ Ramı´rez, R. Pujol , et al. 2013. Mutasi dalam ERCC4, pengekodan endonuclease XPF pembaikan DNA, menyebabkan anemia Fanconi. Am. J. Hum. Genet. 92:800–806.

Ceccaldi, R., P. Sarangi, dan AD D'Andrea. 2016. Laluan anemia Fanconi: pemain baharu dan fungsi baharu. Nat. Rev. Mol. Biol Sel. 17: 337–349.

de Laat, WL, E. Appeldoorn, NG Jaspers, dan JH Hoeijmakers. 1998a. Elemen struktur DNA diperlukan untuk aktiviti endonuklease ERCC1-XPF. J. Biol. Kimia. 273:7835–7842.

de Laat, WL, AM Sijbers, H. Odijk, NG Jaspers, dan JH Hoeijmakers. 1998b. Pemetaan domain interaksi antara protein pembaikan manusia ERCC1 dan XPF. Asid Nukleik Res. 26:4146–4152.

nar/26.18.4146

de Vries, A., CT van Oostrom, FM Hofhuis, PM Dortant, RJ Berg, FR de Gruijl, PW Wester, CF van Kreijl, PJ Capel, H. van Steeg, dan SJ Verbeek. 1995. Peningkatan kerentanan kepada ultraviolet-B dan karsinogen tikus yang tidak mempunyai gen pembaikan eksisi DNA XPA. alam semula jadi. 377:169–173.

DiGiovanna, JJ, dan KH Kraemer. 2012. Menyinari xeroderma pigmentosum. J. Melabur. Dermatol. 132:785–796.

Enzlin, JH, dan OD Schrer. 2002. Tapak aktif endonuklease pembaikan DNA XPF-ERCC1 membentuk motif nuklease yang sangat terpelihara. EMBO J. 21:2045–2053.

Funaki, S., S. Takahashi, H. Murakami, K. Harada, dan H. Kitamura. 2006. Sindrom Cockayne dengan nefritis tubulointerstitial akut berulang. Pathol. Int. 56:678–682.

.02029.x

Gillet, LC, J. Alzeer, dan OD Schrer. 2005. Penggabungan khusus tapak bagi N- (deoxyguanosine-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) ke dalam oligonukleotida menggunakan sintesis DNA 'ultra-ringan' yang diubah suai. Asid Nukleik Res. 33:1961–1969.

Gregg, SQ, AR Robinson, dan LJ Niedernhofer. 2011. Akibat fisiologi kecacatan dalam ERCC1-Endonuklease pembaikan DNA XPF. Pembaikan DNA (Amst.). 10:781–791.

Guo, C., Y. Nakazawa, L. Woodbine, A. Bjorkman, M. Shimada, H. Fawcett, N. Jia, K. Ohyama, TS Li, ​​Y. Nagayama, et al. 2015. Kekurangan XRCC4 dalam subjek manusia menyebabkan fenotip neurologi yang ketara tetapi tiada kekurangan imun yang jelas. J. Klin Alahan. Immunol. 136:1007–1017.

Helfricht, A., PE Thijssen, MB Rother, RG Shah, L. Du, S. Takada, M. Rogier, J. Moritz, H. IJspeert, C. Stoepker, et al. 2020. Kehilangan ZBTB24 menjejaskan penggabungan akhir bukan homolog dan penggabungan suis kelas pada pesakit dengan sindrom ICF. J. Exp. Med. 217:e20191688.

Houtsmuller, AB, S. Rademakers, AL Nigg, D. Hoogstraten, JH Hoeij- pembuat, dan W. Vermeulen. 1999. Tindakan pembaikan DNA endonuclease ERCC1/XPF dalam sel hidup. Sains. 284:958–961. h

sains.284.5416.958

Jaspers, NG, A. Raams, MC Silengo, N. Wijgers, LJ Niedernhofer, AR Robinson, G. Giglia-Mari, D. Hoogstraten, WJ Kleijer, JH Hoeij- pembuat, dan W. Vermeulen. 2007. Pesakit pertama yang dilaporkan dengan kekurangan ERCC1 manusia mempunyai sindrom Cerebro-oculofacio-skeletal dengan kecacatan ringan dalam pembaikan eksisi nukleotida dan kegagalan perkembangan yang teruk. Am. J. Hum. Genet. 80:457–466.

Joenje, H., AB Oostra, M. Wijker, FM di Summa, CG van Berkel, MA Rooimans, W. Ebell, M. van Weel, JC Pronk, M. Buchwald, dan F. Arwert. 1997. Bukti untuk sekurang-kurangnya lapan gen anemia Fanconi. Am. J. Hum. Genet. 61:940–944.

Jones, M., F. Beuron, A. Borg, A. Nans, CP Earl, DC Briggs, AP Snijders, M. Bowles, EP Morris, M. Linch dan NQ McDonald. 2020. Struktur Cryo-EM endonuklease XPF-ERCC1 mendedahkan cara penglibatan simpang DNA mengganggu konformasi yang dihalang secara automatik. Nat. Commun. 11: 1120.

Karikkineth, AC, M. Scheibye-Knudsen, E. Fivenson, DL Croteau, dan VA Bohr. 2017. Sindrom Cockayne: Ciri klinikal, sistem model dan laluan. Penuaan Res. Wahyu 33:3–17.002

Kashiyama, K., Y. Nakazawa, DT Pilz, C. Guo, M. Shimada, K. Sasaki, H. Fawcett, JF Wing, SO Lewin, L. Carr, et al. 2013. Kepincangan fungsi nuklease ERCC1-XPF mengakibatkan manifestasi klinikal yang pelbagai dan menyebabkan sindrom Cockayne, xeroderma pigmentosum dan anemia Fanconi. Am. J. Hum. Genet. 92:807–819.